Tutaj opisujemy dwie modyfikacje testu włókien DNA w celu zbadania jednoniciowych luk w DNA podczas replikacji DNA po indukcji zmiany. Test włókien S1 umożliwia wykrycie luk poreplikacyjnych za pomocą endonukleazy S1 specyficznej dla ssDNA, podczas gdy test wypełniania luk umożliwia wizualizację i ilościowe określenie naprawy luki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie akumulacji i naprawy luk poreplikacyjnych w komórkach ludzkich za pomocą testu włókien DNA
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test włókien DNA jest prostą i solidną metodą analizy dynamiki widełek replikacyjnych, opartą na immunodetekcji analogów nukleotydów, które są włączane podczas syntezy DNA w komórkach ludzkich. Jednak ta technika ma ograniczoną rozdzielczość kilku tysięcy kilobaz. W związku z tym luki w jednoniciowym DNA po replikacji (ssDNA) tak małe, jak kilkaset zasad, nie są wykrywalne przez standardowy test. Tutaj opisujemy zmodyfikowaną wersję testu włókien DNA, który wykorzystuje nukleazę S1, enzym, który specyficznie rozszczepia ssDNA. W obecności postreplikacyjnych luk ssDNA, nukleaza S1 będzie celować i rozszczepiać luki, generując krótsze odcinki, które można wykorzystać jako odczyt luk ssDNA na trwających widełkach. Te postreplikacyjne luki ssDNA powstają, gdy uszkodzone DNA jest replikowane w sposób nieciągły. Można je naprawić za pomocą mechanizmów oddzielonych od replikacji genomu, w procesie znanym jako wypełnianie luk lub naprawa po replikacji. Ponieważ mechanizmy wypełniania luk obejmują syntezę DNA niezależną od fazy S, zmiany w schemacie znakowania włókien DNA można również wykorzystać do monitorowania zdarzeń wypełniania luk. Podsumowując, te modyfikacje testu włókien DNA są potężnymi strategiami pozwalającymi zrozumieć, w jaki sposób w genomie komórek ludzkich powstają i wypełniane są luki po replikacji.
Wprowadzenie
Przełomowe prace dostarczyły dowodów na nagromadzenie postreplikacyjnych luk jednoniciowych (ssDNA) po leczeniu czynnikami uszkadzającymi DNA w bakteriach1 i komórkach ludzkich2,3. Podczas replikacji uszkodzonych matryc DNA maszyneria syntezy DNA może ominąć zmiany chorobowe poprzez zastosowanie specyficznych polimeraz DNA syntezy translezji lub poprzez mechanizmy przełączania matryc. Alternatywnie, replikom może również po prostu pominąć zmianę, pozostawiając lukę w ssDNA, która zostanie później naprawiona. Niedawne badanie wyraźnie wykazało, że leczenie środkami genotoksycznymi prowad....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ponieważ w badaniu wykorzystano ludzkie komórki, praca została zatwierdzona przez Komitet Etyki Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo (ICB-USP, numer zatwierdzenia #48347515.3.00005467) do badań na próbkach ludzkich.
UWAGA: Opisane tutaj protokoły były używane w poprzednich publikacjach z niewielkimi modyfikacjami14,16,28. W tym przypadku nacisk kładziony jest na wykorzystanie światła ultrafioletowego C (UVC) jako czynnika uszkadzającego DNA. Jednak inne czynniki uszkadzające DNA, takie jak cisplatyna i hydroksymocznik, również zost....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W analizie włókien S1, jeśli traktowanie agentem genotoksycznym prowadzi do powstania polireplikacyjnych przerw w jednoniciowym DNA (ssDNA), całkowita długość włókien DNA z jąder traktowanych nukleazą S1 będzie krótsza po wywołaniu uszkodzeń DNA w porównaniu z próbkami nietraktowanymi, a także z próbkami traktowanymi agentem genotoksycznym, które nie zostały poddane trawieniu nukleazą S1 (Rycina 1).
Alternatywnie, jeśli traktowanie nukleazą S1 nie wpływa znacząco .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytyczne etapy standardowego protokołu oznaczania włókien DNA zostały omówione w poprzedniej publikacji32. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowane wersje standardowego testu włókien DNA w celu zbadania obecności postreplikacyjnych luk ssDNA, a także ich naprawy przez wypełnianie luk, początkowo opisanych w14. W kontekście obecności postreplikacyjnej luki ssDNA, zastosowanie nukleazy S1 w protokole S1 Fiber byłoby najprawdopodobniej odpowiednie po ekspozycji na czynnik genoto.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca w laboratorium C.F.M.M. jest wspierana przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brazylia, Granty #2019/19435-3, #2013/08028-1 i 2017/05680-0) w ramach Międzynarodowej Współpracy Badawczej FAPESP i Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO, Holandia); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazylia, Grants # 308868/2018-8] oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazylia, Kod Finansowy 001).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas octowy, Synteza lodowcowa | 64-19-7 | Alternatywnie, BSA - Biosura - REF PM-T1725/100 | |
| Wodorotlenek amonu | Synth | 1336-21-6 | Lub podobny |
| Przeciwciało anty-mysie IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005-Przeciwciało | |
| anty-szczur Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470-Przeciwciało | |
| Mysz anty-BrdU | Becton Disckson | 347580-Przeciwciało | |
| Szczura anty-BrdU | Abcam | Ab6326-Kaptur | |
| bezpieczeństwa biologicznego | Pachane | PA 410 | Użyj kaptura obecnego w laboratorium |
| BSA (albumina surowicy bydlęcej) | Sigma-Aldrich | A3294 | lub podobny |
| Skrobak do komórek | Thermo Scientific | 179693 | Lub podobny |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891-Kwas | |
| klorydrynowy | Synth | 7647-01-0 | Lub podobny |
| konfokalny Zeiss LSM Series (7, 8 lub 9) | Zeiss-Or | podobne | |
| Szkło nakrywkowe (lub szkiełka nakrywkowe) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatywnie, Olen - Szkło nakrywkowe Kasvi (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - Wysoka zawartość glukozy | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Należy używać pożywek hodowlanych specyficznych dla użytej linii komórkowej. |
| EDTA (dihydrat soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego) | Sigma-Aldrich | E5314 | Lub podobny |
| mikroskop epifluorescencyjny Axiovert 200 | Zeiss-Lub | podobny | |
| FBS (płodowa surowica bydlęca) | Gibco | 12657-029 | Lub podobny |
| Inkubator CO2 z płaszczem wodnym Forma Series II | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Użyj inkubatora komórkowego obecnego w laboratorium |
| Szklany słoik szkiełkowy | Sigma-Aldrich | S5516 | Lub podobny |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Lub podobny |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125-Syntezator | |
| chlorku magnezu | 7791-18-6 | Lub podobny | |
| Metanol | Merck | 67-56-1 | Lub podobne |
| Szkiełka mikroskopowe | Denville | M1021 | Alternatywnie, Olen - Szkiełka mikroskopowe Kasvi - K5-7105 OR Linia do szkła precyzyjnego - 7105-1 |
| MOPS (Á cido 3-morfolinopropano 1-sulfô nico) | Synth | 1132-61-2 | Lub podobny |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9-PBS | |
| (Bufor fosforanowy Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Lub podobny |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140122 | Lub podobny |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Dowolny roztwór przeciwblaknięcia dla Można zastosować immunofluorescencję |
| Nukleazę S1 oczyszczoną z Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Wstępnie rozcieńczyć nukleazę S1 (1/100 - 1/200) w buforze rozcieńczającym nukleazę S1 dostarczonym przez producenta, podać podasumowanie i przechowywać w temperaturze -20 ° C; C |
| SDS (Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Lub podobny |
| Trójwodny octan sodu | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Lub podobny |
| Syntezator | chlorku sodu | 7647-14-5 | Lub podobny |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Lub podobny |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Lub podobny |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Lub podobny |
| Trypsyna | Gibco | 25200072 | Lub podobny |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Lub podobna |
| lampa UVC | Niespecyficzne-niezbędne | : długość emisji 254 nm | |
| VLX-3W UV Radiometr | Vilber Loumart-Or | podobny | |
| Octan | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Lub podobny |
Bibliografia
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
