Method Article

Wykrywanie akumulacji i naprawy luk poreplikacyjnych w komórkach ludzkich za pomocą testu włókien DNA

DOI:

10.3791/63448

⸱

February 3rd, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy dwie modyfikacje testu włókien DNA w celu zbadania jednoniciowych luk w DNA podczas replikacji DNA po indukcji zmiany. Test włókien S1 umożliwia wykrycie luk poreplikacyjnych za pomocą endonukleazy S1 specyficznej dla ssDNA, podczas gdy test wypełniania luk umożliwia wizualizację i ilościowe określenie naprawy luki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test włókien DNA jest prostą i solidną metodą analizy dynamiki widełek replikacyjnych, opartą na immunodetekcji analogów nukleotydów, które są włączane podczas syntezy DNA w komórkach ludzkich. Jednak ta technika ma ograniczoną rozdzielczość kilku tysięcy kilobaz. W związku z tym luki w jednoniciowym DNA po replikacji (ssDNA) tak małe, jak kilkaset zasad, nie są wykrywalne przez standardowy test. Tutaj opisujemy zmodyfikowaną wersję testu włókien DNA, który wykorzystuje nukleazę S1, enzym, który specyficznie rozszczepia ssDNA. W obecności postreplikacyjnych luk ssDNA, nukleaza S1 będzie celować i rozszczepiać luki, generując krótsze odcinki, które można wykorzystać jako odczyt luk ssDNA na trwających widełkach. Te postreplikacyjne luki ssDNA powstają, gdy uszkodzone DNA jest replikowane w sposób nieciągły. Można je naprawić za pomocą mechanizmów oddzielonych od replikacji genomu, w procesie znanym jako wypełnianie luk lub naprawa po replikacji. Ponieważ mechanizmy wypełniania luk obejmują syntezę DNA niezależną od fazy S, zmiany w schemacie znakowania włókien DNA można również wykorzystać do monitorowania zdarzeń wypełniania luk. Podsumowując, te modyfikacje testu włókien DNA są potężnymi strategiami pozwalającymi zrozumieć, w jaki sposób w genomie komórek ludzkich powstają i wypełniane są luki po replikacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przełomowe prace dostarczyły dowodów na nagromadzenie postreplikacyjnych luk jednoniciowych (ssDNA) po leczeniu czynnikami uszkadzającymi DNA w bakteriach1 i komórkach ludzkich2,3. Podczas replikacji uszkodzonych matryc DNA maszyneria syntezy DNA może ominąć zmiany chorobowe poprzez zastosowanie specyficznych polimeraz DNA syntezy translezji lub poprzez mechanizmy przełączania matryc. Alternatywnie, replikom może również po prostu pominąć zmianę, pozostawiając lukę w ssDNA, która zostanie później naprawiona. Niedawne badanie wyraźnie wykazało, że leczenie środkami genotoksycznymi prowadzi do luk w ssDNA u eukariontów poprzez wykorzystanie mikroskopii elektronowej do wizualizacji specyficznej struktury produktów pośrednich replikacji4. Początkowo proponowano, że powstawanie tych regionów luk postreplikacyjnych jest prostym wynikiem półnieciągłego trybu replikacji DNA2. W tym przypadku uszkodzenie opóźnionej nici może blokować wydłużenie fragmentu Okazaki, ale postęp widełek jest naturalnie ratowany przez następny fragment Okazaki, pozostawiając lukę w ssDNA. Jednak dalsze badania wykazały, że tworzenie się luk na nici wiodącej jest również możliwe, co po raz pierwszy wykazano w przypadku bacteria5. U eukariontów wykazano, że PRIMPOL, unikalna polimeraza DNA o aktywności prymazowej, jest w stanie wznowić syntezę DNA po zmianie blokującej replikację poprzez swoją aktywność reprimingową6,7,8,9,10,11. Tak więc aktywność prymazy PRIMPOL może wyjaśniać powstawanie postreplikacyjnych luk ssDNA w nici wiodącej po leczeniu czynnikiem uszkadzającym DNA w komórkach ludzkich12. Niemniej jednak, wykrywanie tych luk, jak również naprawa luk, do niedawna wymagało pośrednich lub czasochłonnych podejść, takich jak mikroskopia elektronowa4 lub testy plazmidowe13. Zastosowanie specyficznej dla ssDNA nukleazy S1 do wykrywania luk w komórkach ludzkich zostało zapoczątkowane przez wczesne badania ponad czterdzieści lat temu, przy użyciu technik gradientu sacharozy2,3. Niedawno nasza grupa zastosowała użycie tej nukleazy do wykrywania ssDNA w replikacji DNA (luki poreplikacyjne) przy użyciu innych metod, takich jak testy włókien DNA i komet14. Te nowe podejścia utorowały drogę do obecnego wzrostu liczby badań nad lukami postreplikacyjnymi. W tym miejscu opisujemy strategię wykorzystania nukleazy S1 do wykrywania postreplikacyjnych luk ssDNA za pomocą testu włókien DNA i wyjaśniamy, w jaki sposób zróżnicowany schemat znakowania w protokole włókien DNA może umożliwić badanie naprawy tych luk.

Test włókien DNA to potężna technika, która jest używana przez coraz większą liczbę laboratoriów i dostarcza cennych informacji na temat dynamiki widełek replikacyjnych i mechanizmów reakcji na stres replikacyjny. Krótko mówiąc, technika ta opiera się na sekwencyjnym włączaniu analogów nukleotydów (takich jak CldU-5-chloro-2'-deoksyurydyno-i IdU-5-jodo-2'-deoksyurydyna) w replikującym DNA. Po pobraniu komórki są poddawane lizie, a cząsteczki DNA rozprowadzane są na szkiełku z dodatnią powłoką. CldU i IdU są następnie wykrywane przez specyficzne przeciwciała, które można uwidocznić w mikroskopie fluorescencyjnym jako dwukolorowe włókna. Na koniec mierzy się długości dróg IdU i CldU w celu zidentyfikowania wszelkich zmian w dynamice replikacji DNA w wyniku indukcji uszkodzenia DNA. Technika ta może być wykorzystana do badania różnych zjawisk, takich jak przeciąganie wideł, spowalnianie wideł, powstająca degradacja DNA i zmiany częstotliwości początkowego odpalania15,16.

Jednym z ograniczeń testu włókien DNA jest jego rozdzielczość kilku kilozasad. Ponieważ postreplikacyjne luki ssDNA mogą znajdować się w zakresie setek zasad, niemożliwe jest wizualizacja tych luk bezpośrednio za pomocą standardowego protokołu włókien DNA. Obecność luk w ssDNA w replikacji DNA w komórkach ludzkich poddanych działaniu środków genotoksycznych była już wcześniej pośrednio związana z tą chorobą. Na przykład obserwacja ssDNA oceniana przez rekrutację białka wiążącego ssDNA, białka replikacji A (RPA), w komórkach poza fazą S lub tworzenie ssDNA wykryte przez odwijanie alkalicznego DNA w połączeniu z brakiem długotrwałego zatrzymywania widełek przez test włókien DNA12,17,18,19,20,21 przypisano nagromadzeniu luk w ssDNA. Ponadto postreplikacyjne luki ssDNA indukują zależny od ATR punkt kontrolny fazy G2/M i zatrzymują komórki potraktowane truciznami replikacyjnymi18,19,20,21,22.

Nukleaza S1 rozkłada jednoniciowe kwasy nukleinowe, uwalniając mono- lub oligonukleotydy 5'-fosforylowe i ma 5-krotnie większe powinowactwo do ssDNA w porównaniu do RNA. Dwuniciowe kwasy nukleinowe (DNA:DNA, DNA:RNA lub RNA:RNA) są odporne na nukleazę S1, z wyjątkiem sytuacji, gdy są stosowane w ekstremalnie wysokich stężeniach. Nukleaza S1 rozszczepia również dwuniciowy DNA w regionie jednoniciowym spowodowanym nacięciem, przerwą, niedopasowaniem lub pętlą. Nukleaza S1 jest zatem endonukleazą specyficzną dla ssDNA, zdolną do rozcinania luk w ssDNA, ostatecznie generując dwuniciowe pęknięcia23,24. W ten sposób dodanie etapów trawienia nukleazy S1 do protokołu włókien DNA pośrednio umożliwia wykrycie postreplikacyjnych luk w ssDNA. W obecności luk, traktowanie odsłoniętych jąder nukleazą S1 przed rozprzestrzenianiem się DNA spowoduje powstanie krótszych odcinków w wyniku rozszczepienia S1 ssDNA naturalnie obecnego w lukach14. W związku z tym skracanie dróg pokarmowych jest odczytem luk w ssDNA przy użyciu tego podejścia. W porównaniu ze standardowym protokołem włókien DNA, włókno DNA z nukleazą S1 wymaga tylko dwóch dodatkowych etapów: ekspozycji jąder (przepuszczalność komórek) i leczenia nukleazą S1. Należy zauważyć, że obowiązkowe są odpowiednie kontrole, takie jak próbki poddane działaniu czynnika genotoksycznego, ale bez nukleazy S1 oraz próbki poddane działaniu nukleazy S1 bez czynnika genotoksycznego. Sam protokół, w tym włączenie analogów, leczenie S1 i rozsiewanie, może być wykonany w ciągu jednego dnia i nie wymaga wyjątkowego materiału. Wymaga jedynie analogów tymidyny, oczyszczonej nukleazy S1, odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych oraz mikroskopu fluorescencyjnego. Ogólnie rzecz biorąc, włókno DNA wykorzystujące nukleazę S1 wykrywa luki w ssDNA na trwających widełkach replikacyjnych przy użyciu stosunkowo prostego podejścia.

Postreplikacyjne luki w ssDNA, powstałe w wyniku mechanizmów reakcji na stres replikacyjny, mogą być naprawiane (lub wypełniane) przez różne mechanizmy, w tym syntezę DNA translezji lub zmianę szablonu, w procesie zwanym wypełnianiem luk lub naprawą po replikacji (PRR)25. Procesy te zachodzą za rozwijającymi się widełkami, obejmując niezależną od replikacji syntezę DNA14,26,27. Na podstawie tych ustaleń można przeprowadzić schemat etykietowania różniący się od standardowego testu włókien DNA w celu bezpośredniej wizualizacji zdarzeń wypełniania luk w fazie G214,16,26,28. W szczególności jeden analog tymidyny może być użyty do znakowania widełek replikacyjnych w czasie leczenia genotoksycznego i tworzenia się luki po replikacji ssDNA, podczas gdy inny analog tymidyny może być użyty do znakowania zdarzeń wypełniających lukę. W tym protokole komórki są znakowane pierwszym analogiem tymidyny (na przykład IdU) natychmiast po lub jednocześnie z leczeniem genotoksycznym przez 1 godzinę, tak aby powstające DNA było znakowane w momencie tworzenia się luki. Nokodazol dodaje się po leczeniu przez okres od 12 do 24 godzin w celu zatrzymania komórek w G2/M, zapobiegając następnej fazie S. Przez ostatnie 4 godziny leczenia nokodazolem drugi analog tymidyny (na przykład CldU) jest dodawany do pożywki, która ma być włączona podczas wypełniania luki. Co ważne, test ten może być stosowany tylko do wykrywania zdarzeń wypełniania luk w G2, ponieważ nie można odróżnić sygnału wypełniającego lukę z CldU od sygnału spowodowanego włączeniem CldU do replikującego się DNA w fazie S. Dlatego, aby zminimalizować sygnał tła, czas włączenia CldU po indukcji uszkodzenia powinien pokrywać się z momentem, w którym większość populacji komórek wchodzi w fazę G214. Dlatego ten czas będzie się różnił w zależności od linii komórkowej i warunków leczenia. Zaleca się optymalizację progresji cyklu komórkowego przed zastosowaniem tego testu. Współbarwienie tych analogów tymidyny umożliwia wizualizację dróg wypełniających luki (PRR) (łaty CldU) na powstającym DNA (odcinki IdU) zsyntetyzowanych podczas leczenia genotoksycznego, gdy wygenerowano luki w ssDNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ w badaniu wykorzystano ludzkie komórki, praca została zatwierdzona przez Komitet Etyki Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo (ICB-USP, numer zatwierdzenia #48347515.3.00005467) do badań na próbkach ludzkich.

UWAGA: Opisane tutaj protokoły były używane w poprzednich publikacjach z niewielkimi modyfikacjami14,16,28. W tym przypadku nacisk kładziony jest na wykorzystanie światła ultrafioletowego C (UVC) jako czynnika uszkadzającego DNA. Jednak inne czynniki uszkadzające DNA, takie jak cisplatyna i hydroksymocznik, również zostały z powodzeniem zastosowane28. Protokół ten może być wykonywany w szeregu linii komórkowych, w tym U2OS, HEK293T, ludzkich fibroblastach i innych14,28,29. Konieczne jest określenie pytania eksperymentalnego przed wykonaniem tego protokołu. Test włókien DNA z nukleazą S1 (zwaną dalej włóknem S1) służy do wykrywania obecności postreplikacyjnych luk ssDNA, podczas gdy test wypełniania luk (lub PRR) jest wykonywany w celu ilościowego określenia zdarzeń wypełniania luk w fazie G2. Tak więc, jeśli analizujesz obecność postreplikacyjnych luk w ssDNA, badacz powinien wykonać sekcję 2 (konfiguracja eksperymentalna włókna S1) i przejść bezpośrednio do sekcji 4 (przygotowanie włókien DNA przez rozprowadzanie) protokołu. W przypadku analizowania zdarzeń związanych z wypełnianiem luk, badacz powinien przejść bezpośrednio do sekcji 3 (Konfiguracja eksperymentalna wypełniania luk (PRR)).

1. Odczynniki i konfiguracja

  1. Analogi tymidyny: Zawiesić 5-jodo-2'-deoksyurydynę (IdU) i 5-chloro-2'-deoksyurydynę (CldU) w 1 N NH4OH do końcowego stężenia 100 mM. Przefiltrować analogi przez sterylny filtr strzykawkowy (0,2 μm), podwielokrotność, i przechowywać je w temperaturze -20 C.
  2. Przeciwciała: Pierwszorzędowe - anty-BrdU szczur (Biorad) i anty-BrdU mysz (BD); Wtórne - anty-szczurzy Alexa Fluor 488 i anty-mysz Alexa Fluor 594.
  3. Bufor przepuszczalności komórkowej CSK100 dla włókna S1: Dodaj 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7,2], 300 mM sacharozy i 0,5% Triton X-100 w destylowanymH2O.
  4. Bufor nukleazy S1 [pH 4,6]: Dodać 30 mM octanu sodu [pH 4,6], 10 mM octanu, 50 mM NaCl i 5% glicerolu w H2O.
    UWAGA: Bufor nukleazy S1 musi mieć końcowe pH 4,6, ponieważ aktywność S1 spada o 50% przy pH > 4,9.
  5. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C nukleazę S1 oczyszczoną z A. oryzae, wstępnie rozcieńczoną w buforze do rozcieńczania nukleazy S1 dostarczonym przez producenta.
  6. Rozpuścić nokodazol w DMSO do końcowego stężenia 2 mM w celu wypełnienia luki. Test.
  7. Bufor do lizy: Dodać 200 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM EDTA i 0,5 % SDS w H2O.
  8. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  9. Przygotuj PBS-T, dodając 0,1% Tween-20 do PBS.
  10. Przygotować 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
  11. Przygotuj 0,1% BSA w PBS.
  12. Przygotuj PBS-T-BSA, dodając 1% BSA do PBS-T.
    UWAGA: Do wykrywania zielonej fluorescencji (wykrywanej w zakresie od 510 do 560 nm) oraz filtra emisyjnego GFP (FITC, Alexa Fluor 488) o długości fali 624 nm i szerokości pasma 40 nm należy używać mikroskopu epifluorescencyjnego z lampą rtęciową lub ksenonową o długości fali 488 nm (niebieskiej) o długości fali 488 nm i filtra emisyjnego GFP (FITC, Alexa Fluor 488) oraz lasera liniowego (żółtego) o długości fali 624 nm i szerokości pasma 40 nm ( wykrywane w zakresie od 575 do 680 nm). Obiektyw immersyjny (40x, 63x lub 100x).

2. Eksperymentalna konfiguracja S1 Fiber (2 dni)

  1. Dzień 1: Płytka 4 dołki dla każdej linii komórkowej: ± nukleazy UVC i ± S1 z komórkami o zbiegu 70-90%.
    UWAGA: Eksperyment można przeprowadzić w formacie tak małym, jak płytka 12-dołkowa. W takim przypadku wszystkie roztwory stosuje się w dawce 0,5 ml/studzienkę.
  2. Dzień 2: Przygotować świeże IdU w 20 μM i CldU w 200 μM we wstępnie ogrzanych (37 °C) pożywkach do hodowli komórkowych.
  3. Odessać pożywkę hodowlaną i natychmiast dodać pożywkę z 20 μM IdU i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (inkubator komórek) dokładnie przez 20 minut.
  4. Szybko umyj komórki dwukrotnie podgrzanym (37 °C) PBS.
  5. Naświetlić ogniwa promieniowaniem UVC o stężeniu 20 J/m2. Używaj nieleczonych komórek jako kontroli.
  6. Natychmiast dodać pożywkę z 200 μM CldU i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (inkubator komórek) dokładnie przez 60 min.
    UWAGA: Znakowanie IdU i CldU można zamieniać, ale stężenie drugiego analogu powinno być 5-10 razy wyższe niż pierwszego analogu. Czas inkubacji analogu może być dostosowany do użytego czynnika genotoksycznego, ale czas drugiej inkubacji analogu powinien być wystarczająco długi, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na utworzenie luki14,16. Jeśli używasz leku uszkadzającego DNA, dodaj lek razem z CldU28,29,30.
  7. Umyj komórki dwukrotnie podgrzanym (37 °C) PBS.
  8. Przepuszczalność komórek za pomocą buforu CSK100 przez 8-10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Pomyślną przepuszczalność można sprawdzić pod mikroskopem jasnego pola, gdzie powinny być widoczne tylko jądra
  9. Ostrożnie umyj jądra PBS (wlej 0,5 ml na bok każdej studzienki, tylko przez kilka sekund).
  10. Ostrożnie przemyć jądra buforem S1 (wlać 0,5 ml po bokach każdej studzienki, tylko przez kilka sekund).
  11. Inkubować jądra z buforem S1 z nukleazą S1 (20 U/ml) lub bez (jako kontrola) przez 30 minut w temperaturze 37 °C (inkubator komórkowy).
  12. Odessać bufor S1 i dodać 0,1% BSA do PBS.
  13. Zeskrobać jądra i przenieść je do odpowiednio opisanej probówki o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj probówki na lodzie przez cały czas.
    UWAGA: Pomyślne oderwanie jąder można sprawdzić pod mikroskopem w jasnym polu.
  14. Osadzanie jąder: wirować przy ~4600 x g przez 5 min, w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W odróżnieniu od standardowego testu włókien DNA, jąder nie można policzyć, więc należy wziąć pod uwagę początkową liczbę platerowanych komórek. Alternatywnie, dodatkowa studzienka, która nie została poddana przenikaniu, może być użyta do oszacowania liczby komórek za pomocą hemocytometru lub licznika komórek.
  15. Ponownie zawiesić granulki w PBS w stężeniu ~1500 komórek/μl, umieścić probówki na lodzie i natychmiast przystąpić do przygotowania włókien DNA przez rozprowadzenie (sekcja 4) protokołu

3. Eksperymentalna konfiguracja wypełniania luk (PRR) (3 dni)

  1. Dzień 1: Płytka 2 dołki dla każdej linii komórkowej: ± UVC z komórkami o konfluencji ~70
    2. %.
  2. Dzień 2: Przygotuj świeże IdU w temperaturze 20 μM we wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywce do hodowli komórkowych.
  3. Naświetlić ogniwa promieniowaniem UVC o stężeniu 20 J/m2.
  4. Natychmiast dodać pożywkę z 20 μM IdU i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (inkubator komórek) dokładnie przez 60 minut.
  5. Umyj komórki dwukrotnie podgrzanym (37 °C) PBS.
  6. Natychmiast dodać pożywkę o stężeniu 200 ng/ml nokodazolu i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (inkubator komórek) przez 12-24 godziny (czas wykonania tego etapu musi być spójny między eksperymentami).
    UWAGA: Może być konieczne dostosowanie stężenia nokodazolu w zależności od użytej linii komórkowej. Jeśli używasz leku genotoksycznego, inkubuj komórki za pomocą IdU ± lek28.
  7. Dzień 3: Odessać pożywkę hodowlaną, dodać pożywkę z 20 μM CldU + nokodazol i inkubować przez ostatnie 4 godziny leczenia nokodazolem, w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (inkubator komórkowy).
  8. Umyj komórki wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS.
  9. Dodać trypsynę i inkubować przez 1-2 minuty w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (inkubator komórek) w celu odłączenia komórek.
  10. Dodaj taką samą objętość pożywki do hodowli komórkowych i zbierz komórki (pożywka + trypsyna) w odpowiednio opisanej probówce o pojemności 1,5 ml. Trzymaj rurki na lodzie przez cały czas.
  11. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek.
  12. Osadzać komórki: wirować przy ~350 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
  13. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w PBS w temperaturze ~1500 komórek/μL. Utrzymuj komórki na lodzie i rozpocznij przygotowanie włókien DNA poprzez natychmiastowe rozprowadzenie protokołu (dzień 3 lub 4).

4. Przygotowanie włókna DNA przez rozprowadzanie (~1 h na 12 preparatów)

  1. Opisz szkiełka mikroskopowe ołówkiem węglowym i umieść je płasko na tacy.
  2. Postukaj w spód probówki, aby zapewnić homogenizację.
  3. Dodać 2 μl komórek na wierzchu odpowiedniego szkiełka.
    UWAGA: Można dodać dwie krople, jedną na górze zjeżdżalni, a drugą na środku zjeżdżalni.
  4. Dodać 6 μl buforu do lizy i poddać komórki lizie, pipetując w górę iw dół około 5 razy (unikać tworzenia pęcherzyków).
  5. Pociągnij kroplę nieco w kierunku dolnej części szkiełka za pomocą końcówki pipety (aby wskazać ścieżkę rozlewania się kropli).
  6. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy jąder.
    UWAGA: Objętość buforu do lizy i czas lizy można regulować, jeśli lizat wysycha zbyt szybko lub, alternatywnie, nie wysycha wystarczająco. Objętość buforu do lizy może wynosić od 5-7 μl, a czas może wynosić od 4 do 10 minut.
  7. Przechyl suwak pod kątem około 20-40° i pozwól, aby kropla rozprzestrzeniła się na dno zjeżdżalni ze stałą, niską prędkością.
  8. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w temperaturze RT w ciemności (10-15 min).
  9. Świeżo przygotuj roztwór utrwalający: Wymieszaj metanol: lodowaty kwas octowy w stosunku 3:1.
  10. Zanurzyć szkiełka w słoiku zawierającym roztwór utrwalający i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia DNA na szkiełkach.
    UWAGA: Metanol jest wysoce toksyczny i powinien być przechowywany pod maską chemiczną. Wyrzuć do odpowiedniego pojemnika.
  11. Szkiełka należy suszyć w temperaturze pokojowej w ciemności i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu zabrudzenia.

5. Barwienie immunologiczne włókien DNA (~6 h)

  1. Umyć szkiełka preparatem PBS dwukrotnie przez 5 minut.
  2. denaturacja DNA za pomocą świeżo przygotowanego 2,5 M HCl przez 40-60 min w temperaturze RT.
    UWAGA: Aby przygotować 2,5 M HCl, wlej kwas do wody i nigdy odwrotnie. Jest to reakcja egzotermiczna, więc lekko się rozgrzeje.
  3. Umyć szkiełka preparatem PBS trzykrotnie przez 5 minut.
  4. Blok z 5% BSA (może być przechowywany w temperaturze 20 °C do trzech zastosowań) uprzednio ogrzewany w temperaturze 37 °C przez 30-60 min w temperaturze 37 °C.
  5. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek, delikatnie stukając w papier.
  6. Dodać 30 μl przeciwciał pierwszorzędowych (mysiego anty-BrdU 1/20 (dla IdU) i szczurzego anty-BrdU 1/100 (dla CldU) rozcieńczonych w PBS-T-BSA) do szkiełek stopniowo i umieścić na nich szkiełko nakrywkowe. Inkubować przez 1-1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemnej, wilgotnej komorze.
  7. Umieść szkiełka w słoiku z PBS na 1-2 minuty, a następnie ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe.
  8. Umyj PBS-T w słoiku trzy razy przez 5 minut, a następnie umieść szkiełka w PBS.
  9. Usuń nadmiar płynu, delikatnie stukając w papier.
  10. Dodać kroplami 30 μl przeciwciał drugorzędowych (anty-mysi Alexa Fluor 594 i anty-szczurzy Alexa Fluor 488 rozcieńczone w stosunku 1/75 w PBS-T-BSA.) do szkiełek i umieścić na nich szkiełko nakrywkowe. Inkubować przez 45-60 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej, wilgotnej komorze.
  11. Umieść szkiełka w słoiku z PBS na 1-2 minuty, a następnie ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe.
  12. Umyj PBS-T w słoiku trzy razy przez 5 minut, a następnie umieść szkiełka w PBS.
  13. Usuń nadmiar płynu, delikatnie stukając w papier.
  14. Dodać kroplami 20 μl odczynnika montażowego do szkiełek i umieścić na nich szkiełko nakrywkowe. Unikaj bąbelków.
  15. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie przechowuj w temperaturze 4 °C (lub -20 °C w celu dłuższej konserwacji).

6. Akwizycja i analiza obrazu (~1 h na próbkę)

UWAGA: Mikroskop epifluorescencyjny może być używany do obu protokołów. Jednak w przypadku testu wypełniania luk (PRR) zdecydowanie zaleca się użycie mikroskopu konfokalnego w celu zwiększenia rozdzielczości obrazów.

  1. Umieść kroplę olejku immersyjnego (specyficznego dla mikroskopu) w pobliżu górnej części szkiełka, w którym komórki zostały poddane lizie, i znajdź ostrość za pomocą zielonego kanału, wyszukując zielone kropki w tle (można używać obiektywów 40x, 63x i 100x).
  2. Znajdź główne stężenie włókien i przejdź do krawędzi, aby znaleźć dobrze rozłożone, nienakładające się na siebie pojedyncze włókna, używając tylko jednego kanału, aby wybrać obszary do zdjęć i uniknąć potencjalnej stronniczości.
  3. Zrób około 15-20 zdjęć na szkiełku wzdłuż całego szkiełka w kanałach zielonym i czerwonym i połącz dwa kanały, aby uzyskać dwukolorowe włókna DNA.
    UWAGA: Jeśli używasz mikroskopu konfokalnego, rób zdjęcia w wysokiej rozdzielczości (1024 x 1024 piksele) i używaj wartości otworkowych bliskich 1 zarówno dla czerwonej, jak i zielonej fluorescencji.
  4. Użyj ImageJ (bezpłatne oprogramowanie dostarczone przez NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) do pomiarów długości dróg IdU i CldU.
    1. Otwórz obraz, przeciągając go do pola ImageJ.
    2. Użyj podziałki wygenerowanej przez oprogramowanie mikroskopu (odpowiednio skalibrowanej), aby przeliczyć długość na mikrometry. Użyj narzędzia Linia prosta, wybierając piątąikonę od lewej do prawej w polu ImageJ, aby zmierzyć pasek skali na dostarczonym obrazie mikrometrów i uzyskać pomiar w pikselach. Kliknij Analizuj > ustaw skalę i zamień "odległość w pikselach" na odpowiednią liczbę i "jednostkę długości" na μm.
    3. W polu ImageJ wybierz narzędzie Linia segmentowana, klikając lewym przyciskiem myszypiątą ikonę od lewej do prawej, a następnie wybierając drugą opcję od góry do dołu.
    4. Narysuj dokładną ścieżkę czerwonego (IdU) lub zielonego (CldU) traktu, klikając lewym przyciskiem myszy i zatrzymaj rysowanie, klikając prawym przyciskiem myszy. Naciśnij przycisk M na klawiaturze, aby zmierzyć długość.
    5. W przypadku światłowodu S1 analizuj tylko włókna czerwono-zielone (dwukolorowe)16. Zmierz długości czerwonych i zielonych odcinków z co najmniej 150 włókien z różnych zdjęć, śledząc pomiary czerwonych i zielonych odcinków dla każdego włókna z osobna.
    6. W przypadku testu wypełniania luk zmierz tylko długość odcinków IdU (czerwonych), które zawierają co najmniej 1 plamę CldU (zieloną), ale nie ma ciągłego barwienia CldU. Zdobądź co najmniej 10-15 odcinków IdU z różnych zdjęć za pomocą co najmniej 1 plastra CldU.
      UWAGA: Do analiz można użyć innego oprogramowania, takiego jak Zeiss LSM Image Browser.
  5. W przypadku włókien S1 wykreśl długość odcinków IdU, długość odcinków CldU i proporcje (CldU/IdU lub odwrotnie) na osobnej grafice jako wykresy punktowe z medianami.
  6. Zmierz zdarzenia wypełniania luk jako jednostki "gęstości na kilozasadę", podziel całkowitą liczbę plam CldU (PRR, zielony) na danej długości odcinka IdU (czerwonego) przez całkowitą długość czerwonego szlaku w kilozasadach (biorąc pod uwagę 1 μm = 2,59 kilozasad31). Następnie wykreśl dane jako wykresy punktowe z medianami.
  7. W obu eksperymentach należy przeprowadzić analizę statystyczną między dwiema próbkami za pomocą testu Manna-Whitneya (test nieparametryczny) i między więcej niż dwiema próbkami za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a następnie test wielokrotnych porównań Dunna.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W teście włókien S1, jeśli leczenie czynnikiem genotoksycznym prowadzi do postreplikacyjnych luk ssDNA, całkowita długość włókien DNA z jąder traktowanych S1 będzie krótsza po leczeniu z uszkodzeniem DNA w porównaniu do próbek nietraktowanych, jak również do próbek, które były traktowane czynnikiem genotoksycznym, ale nie zostały poddane rozszczepieniu S1 (Rysunek 1).

Alternatywnie, jeśli leczenie nukleazą S1 nie wpływa znacząco na długość włókien DNA w porównaniu d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne etapy standardowego protokołu oznaczania włókien DNA zostały omówione w poprzedniej publikacji32. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowane wersje standardowego testu włókien DNA w celu zbadania obecności postreplikacyjnych luk ssDNA, a także ich naprawy przez wypełnianie luk, początkowo opisanych w14. W kontekście obecności postreplikacyjnej luki ssDNA, zastosowanie nukleazy S1 w protokole S1 Fiber byłoby najprawdopodobniej odpowiednie po ekspozycji na czynnik genoto...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium C.F.M.M. jest wspierana przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brazylia, Granty #2019/19435-3, #2013/08028-1 i 2017/05680-0) w ramach Międzynarodowej Współpracy Badawczej FAPESP i Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO, Holandia); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazylia, Grants # 308868/2018-8] oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazylia, Kod Finansowy 001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas octowy, Synteza lodowcowa64-19-7Alternatywnie, BSA - Biosura - REF PM-T1725/100
Wodorotlenek amonuSynth1336-21-6Lub podobny
Przeciwciało anty-mysie IgG1 Alexa Fluor 594InvitrogenA11005-Przeciwciało
anty-szczur Alexa Fluor 488InvitrogenA21470-Przeciwciało
Mysz anty-BrdUBecton Disckson347580-Przeciwciało
Szczura anty-BrdUAbcam  Ab6326-Kaptur
bezpieczeństwa biologicznegoPachanePA 410Użyj kaptura obecnego w laboratorium
BSA (albumina surowicy bydlęcej)Sigma-AldrichA3294lub podobny
Skrobak do komórekThermo Scientific179693Lub podobny
CldUMillipore-SigmaC6891-Kwas
klorydrynowySynth7647-01-0Lub podobny
konfokalny Zeiss LSM Series (7, 8 lub 9)Zeiss-Orpodobne
Szkło nakrywkowe (lub szkiełka nakrywkowe)Thermo Scientific152460Alternatywnie, Olen - Szkło nakrywkowe Kasvi (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - Wysoka zawartość glukozyLGC/GibcoBR30211-05/12100046Należy używać pożywek hodowlanych specyficznych dla użytej linii komórkowej.
EDTA (dihydrat soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego)Sigma-AldrichE5314Lub podobny
mikroskop epifluorescencyjny Axiovert 200Zeiss-Lubpodobny
FBS (płodowa surowica bydlęca)Gibco12657-029Lub podobny
Inkubator CO2 z płaszczem wodnym Forma Series IIThermo Scientific 311013-998-074Użyj inkubatora komórkowego obecnego w laboratorium
Szklany słoik szkiełkowySigma-AldrichS5516Lub podobny
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5Lub podobny
IduMillipore-SigmaI7125-Syntezator
chlorku magnezu7791-18-6Lub podobny
MetanolMerck67-56-1Lub podobne
Szkiełka mikroskopoweDenvilleM1021Alternatywnie, Olen - Szkiełka mikroskopowe Kasvi - K5-7105 OR Linia do szkła precyzyjnego - 7105-1
MOPS (Á cido 3-morfolinopropano 1-sulfô nico)Synth1132-61-2Lub podobny
NocodazoleSigma-Aldrich31430-18-9-PBS
(Bufor fosforanowy Saline)Life Thechnologies3002Lub podobny
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122Lub podobny
ProLong Gold AntiFade MountantInvitrogenP36930Dowolny roztwór przeciwblaknięcia dla Można zastosować immunofluorescencję
Nukleazę S1 oczyszczoną z Aspergillus oryzaeInvitrogen18001-016Wstępnie rozcieńczyć nukleazę S1 (1/100 - 1/200) w buforze rozcieńczającym nukleazę S1 dostarczonym przez producenta, podać podasumowanie i przechowywać w temperaturze -20 ° C; C
SDS (Dodecyl Sulfate)BioRad161-0302Lub podobny
Trójwodny octan soduSigma-Aldrich6131-90-4Lub podobny
Syntezatorchlorku sodu  7647-14-5Lub podobny
SacharozaSigma-Aldrich57-50-1Lub podobny
Tris BaseWest Lab ResearchBP152-1Lub podobny
Triton X-100Synth9002-93-1Lub podobny
TrypsynaGibco25200072Lub podobny
Tween 20Sigma-AldrichP1379Lub podobna
lampa UVCNiespecyficzne-niezbędne: długość emisji 254 nm
VLX-3W UV RadiometrVilber Loumart-Orpodobny
OctanSigma-Aldrich557-34-6Lub podobny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
  3. Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
  4. Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
  5. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
  6. Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
  7. García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
  8. Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
  9. Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
  10. Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
  11. Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
  12. Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
  13. Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  14. Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
  15. Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  16. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  17. Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
  18. Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
  19. Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
  20. Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071(2014).
  21. Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
  22. Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
  23. Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
  24. Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
  25. Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
  26. Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
  27. Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
  28. Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
  29. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  30. Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
  31. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  32. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255(2011).
  33. Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
  34. Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
  35. Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
  36. Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
  37. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  38. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833(2016).
  39. Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Fiber AssayReplication Fork DynamicsPost Replicative GapsS1 NucleaseSingle Stranded DNAGap Filling AssayDNA Replication StressGenome IntegrityImmunodetection MethodDNA Damage Repair

Related Articles