Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jako klasyczny model systemu biologii embrionalnej, zarodek kurczaka został wykorzystany do zbadania rozwoju i różnicowania embrionalnego. Dostarczanie materiałów egzogennych do zarodków kurcząt ma ogromne zalety w badaniu funkcji genów, hodowli transgenicznej i przygotowywania chimer podczas rozwoju embrionalnego. Tutaj pokazujemy metodę iniekcji donaczyniowej in ovo, za pomocą której materiały egzogenne, takie jak wektory plazmidowe lub zmodyfikowane pierwotne komórki rozrodcze (PGC), mogą być przenoszone do zarodków kurcząt dawców we wczesnych stadiach rozwoju. Wyniki pokazują, że wstrzyknięcie donaczyniowe przez aortę grzbietową i głowę umożliwia dyfuzję wstrzykniętego materiału do całego zarodka przez układ krążenia krwi. W przedstawionym protokole określono skuteczność wprowadzenia egzogennego plazmidu i wektora lentiwirusowego oraz kolonizację wstrzykniętych egzogennych PGC w gonadę biorcy, obserwując fluorescencję w zarodkach. W artykule opisano szczegółowe procedury tej metody, zapewniając tym samym doskonałe podejście do badania funkcji genów, biologii zarodków i rozwoju oraz produkcji kurcząt chimerycznych gonad. Podsumowując, artykuł ten pozwoli naukowcom na przeprowadzenie in ovo dodonaczyniowego wstrzykiwania materiałów egzogennych do zarodków kurczaków z dużym sukcesem i powtarzalnością.
Wprowadzenie
Embriony kurczaka są powszechnie używane od wieków w zastosowaniach rozwojowych, immunologicznych, patologicznych i innych biologicznych1,2,3. Mają wiele nieodłącznych zalet w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi w badaniach toksykologii i biologii komórki4. Zarodki kurze są łatwo dostępne i można nimi manipulować in vitro oraz bezpośrednio obserwować na każdym etapie rozwoju, co zapewnia poręczny system modeli badań nad zarodkami.
Ogólnie, obecne metody dostarczania zarodków kurzych, takie jak elektrotransfekcja i wstrzyknięcie do jamy podzarodkowej, mają ograniczenia, takie jak wymóg specjalistycznego sprzętu i zaprojektowanego programu oraz nieefektywność wynikająca z obecności żółtka i białka5,6,7. W tym miejscu pokazujemy prostą i wydajną metodę dostarczania materiałów egzogennych do zarodków kurczaków. Może to być potężne narzędzie wykorzystywane w badaniach biologii rozwoju. Wstrzyknięte materiały rozprzestrzeniają się do całego zarodka poprzez krążenie krwi. We wczesnym okresie rozwoju zarodków kurcząt PGC mogą migrować przez krew, kolonizować grzbiet narządów płciowych, a następnie przekształcać się w gamety, które stanowią cenną możliwą ścieżkę dostarczania materiałów egzogennych8. Obecnie metoda ta jest szeroko stosowana w badaniach nad funkcją genów, biologią zarodków i rozwoju oraz chimeryczną i transgeniczną produkcją kurczaków9,10,11.
Wstrzyknięcie donaczyniowe in ovo w zarodkach kurcząt jest dobrze znaną i powszechnie stosowaną metodą12,13,14. W tym artykule przedstawiamy kompleksowy opis tego protokołu, w tym materiały do wstrzykiwań, miejsca, dawkowanie i reprezentatywne wyniki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury związane z opieką i użytkowaniem zwierząt były zgodne z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych (NIH Pub. No. 85-23, poprawione w 1996 roku), a protokoły dotyczące zarodków kurczaków zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zarządzania Zwierzętami Laboratoryjnymi i Etyki Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Yangzhou, Chiny (nr 201803124).
1. Pobieranie i przygotowanie zapłodnionych jaj
UWAGA: W przeciwieństwie do ssaków, kurczak ma miliony pęcherzyków w jednym jajniku, ale tylko kilka z tych pęcherzyków jest wystarczająco dojrzałych, aby owulować. Każdy pęcherzyk zawiera jedną komórkę jajową lub komórkę rozrodczą. Gdy tylko pęcherzyk dojrzeje i uwolni żółtko, jest on wbudowywany do lejka jajowodu. Gdy pęcherzyk dostaje się do brzucha szyjnego jajowodu, nasienie wiąże się z jajem w ciele kury, a wapń w ciele kury tworzy skorupkę, która otacza zapłodnione jajo, tworząc w ciele jajo o miękkiej skorupce. Skorupa wapniowa stopniowo gęstnieje, aż do wyprodukowania jaja.
- Odbierz zapłodnione jaja od lokalnego sprzedawcy lub instytucji, które można przechowywać w temperaturze 16°C przez 1 tydzień.
UWAGA: Wysoka temperatura przechowywania pomoże zarodkowi się rozwijać, podczas gdy niska temperatura zmniejszy żywotność zarodka. Zarodki nie rozwiną się, jeśli czas przechowywania będzie zbyt długi. - Delikatnie i powoli wyszoruj skorupkę jajka 75% etanolem przed przeniesieniem jaj do inkubatora.
- Ułóż jaja bokiem, starannie na stojaku w inkubatorze w temperaturze 37,8 °C i wilgotności 60%. Po 60 godzinach inkubacji (HH stage 17) na zarodkach pojawią się widoczne naczynia krwionośne, a serce zacznie bić15.
UWAGA: Po 2 dniach inkubacji pojawiają się małe pierwotne kropki, wczesne stadium serca. Ten proces nazywa się wiśniowym beadingiem. Po ~2,5 dnia serce i inne segmenty ciała są uformowane z widocznymi naczyniami.
2. Przygotowanie przed wstrzyknięciem
- Przygotuj szklane naczynia włosowate, które będą używane jako igły. Przed iniekcją należy za pomocą ściągacza wyciągnąć kapilary szklane o średnicy 90 mm i średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,6 mm. Odłamać końcówki za pomocą kleszczyków (kąt nachylenia szklanej kapilary wynosi zwykle 45°) i sterylizować naczynia włosowate w świetle UV przez 2 godziny.
- Przygotuj materiały egzogenne, takie jak plazmidy, pakowane lentiwirusy i PGC.
- Delikatnie wymieszaj plazmid pEGFP-N1 (plazmid o zwiększonej ekspresji GFP, 1 μg / μl) z liposomem w stosunku 1:3 (m/v). Dodać wodę, aby uzyskać końcowe stężenie DNA 10 ng/μl. Pozostawić mieszaninę DNA w temperaturze 37 °C na 20 minut przed wstrzyknięciem.
- Rozmrozić wirusy na lodzie przed wstrzyknięciem. Miano lentiwirusa używanego do wstrzykiwań powinno wynosić ponad 5 x 106 Tu/ml.
- Rozcieńczyć rodzicielskie lub zmodyfikowane gonady PGC (E4.5, HH stopień 24) do 2,000-5,000 komórek/μL.
UWAGA: Tutaj pokazaliśmy procedurę wstrzykiwania za pomocą błękitu trypanowego.
3. Okienka
- Przed wystawieniem zarodków należy je wysterylizować, delikatnie i miękko przecierając powierzchnię skorupek jaj 75% alkoholem za pomocą wacika, upewniając się, że dokładnie wysterylizowano krawędź jaj.
- Po sterylizacji delikatnie postukaj kleszczami w koniec, aby utworzyć małe okienko (0,5 cm x 0,5 cm) na powierzchni skorupki jajka, aby odsłonić zarodek. Usuń błonę zarodka, a następnie umieść jajo na uchwycie pod mikroskopem preparacyjnym .
4. Wtrysk
- Poszukaj naczyń krwionośnych pod mikroskopem i dostosuj ostrość mikroskopu preparacyjnego, aby zlokalizować zarodek, a następnie znajdź naczynie krwionośne gotowe do wstrzyknięcia.
- Napełnij szklaną igłę roztworem egzogennym (plazmid, lentiwirus lub PGC) za pomocą pipety powoli, unikając pęcherzyków powietrza w igle.
- Skierować igłę z roztworem egzogennym na naczynie krwionośne, tak aby igła była ustawiona równolegle do wstrzykiwanego naczynia krwionośnego.
- Delikatnie włóż napełnioną igłę do naczynia i włącz pompę, aby wyrzucić roztwór (zwykle wstrzyknięta objętość wynosi ~1-5 μL) pod mikroskopem. Ciśnienie pompy powietrza powinno być wystarczająco niskie, aby zapobiec zniszczeniu naczyń, ponieważ zbyt wysokie ciśnienie powietrza uszkodziłoby naczynia krwionośne, prowadząc do przepływu z dużą prędkością.
- Po wstrzyknięciu roztworu egzogennego do naczynia upewnij się, że kolor naczynia zmieni się w kolor roztworu i powróci do czerwieni w ciągu 2-5 sekund, co oznacza, że roztwór egzogenny został pomyślnie dostarczony do naczynia. W tym momencie roztwór dostaje się do tętnicy i wraz z biciem serca krąży z powrotem do zarodka przez tętnicę, a następnie do żyły.
UWAGA: Istnieją dwa miejsca wstrzyknięcia do wstrzyknięcia naczyniowego (Ryc. 1B): jedno to głowa, w której roztwór egzogenny jest wstrzykiwany z żyły w głowie zarodka i do serca przez przepływ krwi, a następnie krąży do całego zarodka z bijącym sercem (Rysunek 1B, strzałka 1). Innym jest aorta grzbietowa krwi zarodka; roztwór egzogenny jest wstrzykiwany i rozprzestrzenia się na cały zarodek ( Ryc. 1B. Strzałka 2) z biciem serca embrionalnego.
- Po wstrzyknięciu roztworu egzogennego do naczynia upewnij się, że kolor naczynia zmieni się w kolor roztworu i powróci do czerwieni w ciągu 2-5 sekund, co oznacza, że roztwór egzogenny został pomyślnie dostarczony do naczynia. W tym momencie roztwór dostaje się do tętnicy i wraz z biciem serca krąży z powrotem do zarodka przez tętnicę, a następnie do żyły.
- Po wstrzyknięciu należy wyjąć komórkę jajową z mikroskopu stereoskopowego i wrzucić 200 μl roztworu penicyliny do wnętrza skorupki jajka. Wytnij kawałek taśmy medycznej o długości 3 cm i uszczelnij okno. Delikatnie zeskrob taśmę nożyczkami, aby wycisnąć wszelkie pęcherzyki powietrza, a następnie odetnij kolejny kawałek, aby uszczelnić otwór w poprzek.
- Oznaczyć i umieścić wstrzyknięte jajo z powrotem w inkubatorze i inkubować do wymaganego etapu rozwojowego lub wylęgu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prezentujemy tutaj metodę wstrzykiwania domyślnego w naczynia krwionośne zarodków kurzych in ovo. Schematyczny przebieg iniekcji wewnątrznaczyniowej przedstawiono na Rysunku 1; w naszym badaniu wykorzystaliśmy różne roztwory egzogenne, aby przetestować i zweryfikować proces wstrzykiwania.
Aby lepiej zwizualizować wstrzyknięte materiały, jako znacznik do zarodka wstrzyknięto błękit trypanowy (0,4%). Zaobserwowano, że znacznik (niebieski) rozprzestrzenia si...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda iniekcji donaczyniowej in ovo zarodków kurczaków jest zoptymalizowana pod kątem transferu materiałów egzogennych (wektorowych, wirusowych lub PGC) do zarodka. W oparciu o tę metodę skonstruowaliśmy modele zarodków kurzych ze stabilną nadekspresją lub interferencją genów (SpinZ, JUN, UBE2I itp.) 17,18,19. Te dobrze ugruntowane modele dowodzą wykonalności tego podejścia. Ponadto nie tylko przenieśliśmy izolowane PG...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31972547). Doceniamy redakcję Jing Wang i głos Malika Donlica z Washington State University, USA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Makromikroskop fluorescencyjny | OLYMPUS | MVX10 | |
| Szklane kapilary | Narishige | G1 | |
| Lipofectamina 2000 | liposomu | ||
| pEGFP-N1 | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Zestaw łącznika komórek czerwonej fluorescencji | Sigma | PKH26GL | |
| wektor lentiwirusa pLVX-EGFP | Addgene | 128652 | |
| Mikrowtryskiwacz pneumatyczny | Narishige | IM-11-2 | |
| Ściągacz | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
Bibliografia
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034(2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408(2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792(2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628(2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827(2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521(2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
