Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

Nadezhda Podoplelova; Polina Soloveva; Andrei Garzon Dasgupta; Aleksandra Filkova; Mikhail Panteleev

doi:10.3791/63459

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63459

⸱

6 kwietnia 2022

Nadezhda Podoplelova¹^,² , Polina Soloveva¹^,⁴ , Andrei Garzon Dasgupta¹^,²^,³ , Aleksandra Filkova¹^,² , Mikhail Panteleev¹^,²^,³^,⁴

¹Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, ²National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, ³Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, ⁴Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.

Streszczenie

W ludzkim ciele większość głównych reakcji fizjologicznych związanych z odpowiedzią immunologiczną i krzepnięciem krwi zachodzi na błonach komórkowych. Ważnym pierwszym krokiem w każdej reakcji zależnej od błony jest wiązanie białka na błonie fosfolipidowej. Opracowano podejście do badania interakcji białek z błonami lipidowymi przy użyciu białek znakowanych fluorescencyjnie i cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na badanie oddziaływań białko-błona z wykorzystaniem żywych komórek i naturalnych lub sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych. Zaletą tej metody jest prostota i dostępność odczynników oraz sprzętu. W tej metodzie białka są znakowane za pomocą barwników fluorescencyjnych. Można jednak stosować zarówno samodzielnie wyprodukowane, jak i dostępne na rynku, znakowane fluorescencyjnie białka. Po koniugacji z barwnikiem fluorescencyjnym białka inkubuje się ze źródłem błony fosfolipidowej (mikropęcherzykami lub komórkami), a próbki analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej. Uzyskane dane można wykorzystać do obliczenia stałych kinetycznych i równowagi K_d. Ponadto możliwe jest oszacowanie przybliżonej liczby miejsc wiązania białek na błonie fosfolipidowej za pomocą specjalnych kulek kalibracyjnych.

Wprowadzenie

Biomembrany oddzielają wewnętrzną zawartość komórek zwierzęcych od przestrzeni pozakomórkowej. Należy pamiętać, że błony otaczają również mikropęcherzyki powstałe podczas cyklu życia komórki i organelle. Błona komórkowa składa się głównie z lipidów i białek. Białka błonowe pełnią funkcje sygnalizacyjne, strukturalne, transportowe i adhezyjne. Jednak dwuwarstwa lipidowa jest również niezbędna do wzajemnego powiązania komórki zwierzęcej z przestrzenią zewnątrzkomórkową. W pracy zaproponowano metodę badania obwodowych oddziaływań białek zewnętrznych z błoną lipidową.

Najbardziej uderzającym przykładem reakcji zachodzących na zewnętrznej warstwie błony komórki zwierzęcej jest reakcja krzepnięcia krwi. Ważną cechą krzepnięcia krwi jest to, że wszystkie główne reakcje zachodzą na błonach fosfolipidowych komórek i mikropęcherzykach powstających z tych komórek, a nie w plazmie1^,²^,³. Reakcje błonozależne obejmują proces rozpoczęcia krzepnięcia (na błonach komórkowych śródbłonka, śródbłonka w stanie zapalnym lub aktywowanych komórkach odpornościowych, z udziałem czynnika tkankowego), wszystkie reakcje głównej kaskadowej aktywacji czynników IX, X, protrombiny; aktywacja czynnika XI przez trombinę (na błonach aktywowanych płytek krwi, erytrocytów, lipoprotein i mikropęcherzyków); reakcje szlaku białka C; inaktywacja enzymów krzepnięcia (na błonach komórek śródbłonka z udziałem kofaktorów trombomodulinowych, receptora białka C śródbłonka, siarczanu heparanu); oraz reakcje szlaku kontaktowego (na błonach płytek krwi i niektórych mikropęcherzykach z udziałem nieznanych kofaktorów). W związku z tym niemożliwe jest zbadanie krzepnięcia krwi bez zbadania interakcji różnych białek osocza z błoną komórek krwi.

Ten artykuł opisuje metodę opartą na cytometrii przepływowej do charakteryzowania interakcji białek z błonami lipidowymi komórek lub mikropęcherzyków. Podejście to zostało początkowo zaproponowane do zbadania interakcji osocza krwi z płytkami krwi i sztucznymi pęcherzykami fosfolipidowymi. Co więcej, większość badanych białek oddziałuje bezpośrednio z ujemnie naładowanymi fosfolipidami błonowymi, szczególnie z fosfatydyloseryną⁴^,⁵. Dodatkowo istnieją białka, w których interakcji z błoną pośredniczą specjalne receptory⁶.

Ważną umiejętnością cytometrii przepływowej jest rozróżnianie wolnych i związanych ligandów bez dodatkowego rozdzielania. Ta cecha cytometrii umożliwia badanie wiązania równowagi ligandów w punkcie końcowym i pomaga w wykonywaniu ciągłych pomiarów kinetycznych. Technika ta jest niewyrafinowana i nie wymaga skomplikowanego przygotowania próbki. Cytometria przepływowa jest aktywnie wykorzystywana do ilościowego badania dynamiki interakcji między fluorescencyjnymi peptydami, receptorami i białkami G w nienaruszonych i przepuszczalnych dla detergentów neutrofilach⁷. Podejście to ma również zastosowanie do badania interakcji białko-DNA i kinetyki aktywności endonukleazy w czasie rzeczywistym⁸. Z biegiem czasu metoda ta została wykorzystana do ilościowego badania interakcji białko-białko o wysokim powinowactwie z oczyszczonymi pęcherzykami lipidowymi⁹ lub, bardziej ogólnie, z białkami błonowymi ulegającymi ekspresji w wysoce wydajnym systemie ekspresji komórek Sf9¹⁰. Opisano również metody ilościowe charakteryzujące interakcje białko-liposom za pomocą cytometrii przepływowej dla białek transbłonowych¹¹.

Ta technika wykorzystuje samodzielnie wykonane koraliki kalibracyjne, aby uniknąć używania dostępnych na rynku koralików⁷. Kulki kalibracyjne używane wcześniej⁷ były przeznaczone do pracy z fluoresceiną, co znacznie ograniczało asortyment dostępnych ligandów fluorescencyjnych na białkach. Ponadto artykuł ten oferuje nowy sposób pozyskiwania i analizowania danych kinetycznych w celu uzyskania rozsądnej rozdzielczości czasowej. Chociaż metoda ta jest opisana dla sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych, nie ma oczywistych ograniczeń co do jej zdolności adaptacyjnych do komórek, naturalnych pęcherzyków lub sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych o innym składzie lipidowym. Opisana tu metoda pozwala na oszacowanie parametrów oddziaływania (k_on, k_off) i równowagi (K_d) oraz ułatwia ilościową charakterystykę liczby miejsc wiązania białek na błonie. Należy zauważyć, że ta technika zapewnia przybliżone oszacowanie liczby miejsc wiązania. Zaletami metody są jej względna prostota, dostępność i zdolność adaptacji do komórek natywnych oraz naturalnych i sztucznych mikropęcherzyków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Markowanie białek fluorescencyjnych

Przygotowanie materiałów
1. Przygotować bufor wodorowęglanowy 1 M, pH 9,0, przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu jednego tygodnia.
2. Bezpośrednio przed użyciem przygotować bufor chlorku hydroksyloaminy 1,5 M, pH 8,5.
3. Przygotować roztwór barwnika fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów) o stężeniu 10 mg/mL w dimetylosulfotlenku.
  UWAGA: Roztwór ten można przechowywać przez miesiąc w temperaturze -20 °C w ciemności.
4. Przygotować roztwory oczyszczonych przeciwciał lub innych białek o stężeniu 1-10 mg/mL.
  UWAGA: Należy unikać buforów zawierających jony amonowe lub aminy pierwszorzędowe. Bufory zawierające Tris lub glicerol należy zastąpić roztworem soli w soli fizjologicznej (PBS) poprzez dializę. Ani azydek sodu (≤3 mM), ani tiomersal (≤1 mM) nie wpłyną znacząco na reakcję koniugacji.
5. Inkubować medium do filtracji żelowej (patrz Tabela materiałów) do oczyszczania białek w PBS przez noc w temperaturze pokojowej lub przez 2 h w temperaturze 60 °C. Nanieść medium do filtracji żelowej na kolumny spinowe z membranami 0,2 µm.
Obliczyć ilość barwnika reaktywnego do użycia w każdej reakcji zgodnie ze stężeniem białka do znakowania, korzystając z równania (1).

Gdzie V_dye to objętość roztworu zapasowego barwnika; C_pr, V_pr i MW_pr to odpowiednio stężenie, objętość i masa molowa białka; MW_dye to masa molowa barwnika; 100 to współczynnik konwersji jednostek; MR to stosunek molowy barwnika do białka w mieszaninie reakcyjnej.
UWAGA: Dla reakcji znakowania IgG zaleca się następujące wartości MR: MR = 40, jeśli stężenie przeciwciał wynosi 1-3 mg/mL lub MR = 30, jeśli stężenie przeciwciał wynosi 4-10 mg/mL. W przypadku czynników krzepnięcia zazwyczaj stosuje się MR = 5.
Reakcja koniugacji
1. W probówce reakcyjnej zmieszać roztwór białka z 10-krotnie mniejszą objętością 1 M roztworu wodorowęglanowego.
2. Przy ciągłym mieszaniu dodać wymaganą ilość barwnika fluorescencyjnego (patrz krok 1.2).
3. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez około 1 h, chroniąc przed światłem i przy ciągłym mieszaniu.
4. Na każde 200 µL roztworu białka dodać 5 µL 1,5 M chlorku hydroksyloaminy.
5. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez około 30 min, chroniąc przed światłem i przy ciągłym mieszaniu.
Przygotowanie kolumny spinowej.
1. Dodać 500 µL medium do filtracji żelowej do oczyszczania białek do kolumny. Wirować kolumnę przez 3 min przy 1 000 × g.
2. Wylać bufor z probówki zbiorczej. Jeśli kolumna nie jest pełna, dodać więcej medium do filtracji żelowej i wirować kolumnę przez 3 min przy 1 000 × g. Powtarzać ten krok do momentu wypełnienia kolumny.
Oczyszczanie
1. Wirować mieszaninę reakcyjną (z kroku 1.3.5) przez 5 min przy 17 000 × g i usunąć osad.
2. Przenieść nadsącz do kolumny spinowej z medium do filtracji żelowej. Pozostawić roztwór do czasu wchłonięcia go przez warstwę żelu.
3. Użyć pustej probówki zbiorczej dla kolumny spinowej i wirować ją przez 5 min przy 1 000 × g. Po odwirowaniu zebrać znakowane białko z probówki zbiorczej.
Wyznaczenie stopnia znakowania
1. Skorygować udział barwnika w absorbancji przy A₂₈₀, mierząc absorbancję wolnego barwnika przy 280 nm (A₂₈₀) oraz przy λ_max dla barwnika (A_max) (patrz równanie (2)).
  (2)
2. Zmierzyć absorbancję koniugatu białko-barwnik przy 280 nm (A₂₈₀) oraz przy λ_max dla barwnika (A_max) i obliczyć stężenie białka, korzystając z równania (3).
  $Wzór na stężenie białka, $C_{\text{protein}} = \frac{A_{280} - A_{\text{max}} \times CF}{\varepsilon_M} \times d$, równanie.$ (3)
  Gdzie ε_M to molowy współczynnik ekstynkcji białka przy 280 nm; d to długość drogi optycznej podczas pomiaru absorbancji; CF to udział barwnika w absorbancji przy A₂₈₀ (krok 1.6.1).
3. Obliczyć stopień znakowania (DOL), korzystając z równania (4).
  (4)
  Gdzie ε_M _dye to molowy współczynnik ekstynkcji barwnika przy λ_max nm; d to długość drogi optycznej podczas pomiaru absorbancji; C_protein to stężenie białka (krok 1.6.2).

2. Przygotowanie pęcherzyków fosfolipidowych

Przygotowanie i przechowywanie mieszaniny lipidowej
1. Połączyć lipidy w odpowiednim stosunku (fosfatydyloseryna/fosfatydylocholina w stosunku 20 mol% do 80 mol%).
2. Wysuszyć mieszaninę lipidową po liofilizacji lub odparowaniu i przechowywać ją w atmosferze obojętnej w szklanych ampułkach.
Produkcja filmu lipidowego
1. Otworzyć ampułkę i resuspender mieszaninę lipidową w niewielkiej ilości (~100 µL) chloroformu.
  UWAGA: Nie należy używać zbyt dużo chloroformu, ponieważ nie odparowuje on całkowicie.
2. Dodać DiIC16(3) w etanolu w stężeniu 0,2 mol%. Przenieść mieszaninę lipidową do kolby okrągłodennej. Rozłożyć cienką warstwą mieszaninę na ściankach kolby poprzez jej obracanie. Suszyć mieszaninę lipidową przez 30 min w strumieniu argonu.
Hydratacja mieszaniny lipidowej
1. Do kolby z filmem lipidowym dodać odpowiednio ogrzany (~55 °C) bufor wodny (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) w objętości odpowiadającej oczekiwanej koncentracji lipidów. Inkubować mieszaninę z mieszaniem w wortexie w temperaturze 55 °С przez 30 min do pełnej hydratacji.
2. Umieścić probówkę z próbką w zamrażarce lub ciepłym termostacie, aby zawiesina lipidowa przeszła 3-5 cykli zamrażania i rozmrażania.
Tworzenie pęcherzyków lipidowych metodą ekstruzji
1. Przygotować ekstruder zgodnie z instrukcjami producenta. Rozgrzać wszystkie elementy ekstrudera do temperatury przejścia fazowego mieszaniny lipidowej.
2. Napełnić jedną z strzykawek ekstrudera hydratowaną mieszaniną lipidową. Odczekać 5-10 min, aż temperatura zawiesiny lipidowej wyrówna się z temperaturą ekstrudera.
3. Przecisnąć mieszaninę lipidową przez membranę co najmniej 10 razy. Przy końcowej ekstruzji umieścić zawiesinę lipidową w drugiej strzykawce i obserwować zmianę wyglądu roztworu z lekko mętnego na klarowny.
4. Przechowywać otrzymaną mieszaninę pęcherzyków lipidowych w temperaturze 4 °C, najlepiej w obojętnej atmosferze argonu lub azotu, przez 3-4 dni. Nie zamrażać.

3. Izolacja płytka krwi z krwi pełnej

Pobrać krew pełną od zdrowych dawców do probówek zawierających 3,2% cytrynianu sodu.
Do krwi dodać prostaglandynę E1 (PGE1) (1 µM) oraz apyrazę (0,1 U/mL), a następnie odwirować w temperaturze pokojowej przy 100 × g przez 8 min.
Po wirowaniu pobrać osocze bogate w płytki krwi i dodać roztwór cytrynianu sodu (106 mM, pH 5,5) w stosunku osocze/cytrynian 3:1. Odwirować osocze w temperaturze pokojowej przy 400 × g przez 5 min.
Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 300 µL buforu Tyrode'a bez BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glukozy, pH 7,4). Oczyścić płytki krwi z białek osocza za pomocą chromatografii żelowej na medium do filtracji żelowej przeznaczonym do oczyszczania płytek krwi (patrz Tabela materiałów).

4. Detekcja oddziaływań białko-lipid za pomocą cytometrii przepływowej

Eksperymenty z kinetyką wiązania
1. Rozcieńczyć pęcherzyki fosfolipidowe (z kroku 2.4.4) w buforze Tyrode'a (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glukozy, 0,5% BSA, pH 7,4) do stężenia 1 µM i całkowitej objętości 250 µL.
2. Wymieszać znakowany fluorescencyjnie czynnik krzepnięcia X (fX-fd) z kroku 1 o stężeniu 500 nM z pęcherzykami fosfolipidowymi z kroku 4.1.1 w stosunku 1:1 (końcowe stężenie pęcherzyków 0,5 µM, stężenie fX-fd wynosi 250 nM fX) do całkowitej objętości 500 µL.
3. Natychmiast wstrzyknąć 500 µL zmieszanej zawiesiny (~20 min dla analizy przy niskim przepływie) do cytometru przepływowego. Stosować niski przepływ i upewnić się, że próg dla kanału FL2 (wzbudzenie 488 nm, filtr emisji 585/42 nm) jest ustawiony na wartość 200. Zmierzyć średnią fluorescencję w kanale FL4 (wzbudzenie 633 nm, filtr emisji 660/20) dla barwnika fluorescencyjnego z Tabeli materiałów.
  UWAGA: Wybrać cytometr bez autosamplera. Przyspieszy to proces wstrzykiwania próbki do komory pomiarowej.
4. Po osiągnięciu nasycenia wiązania (brak znaczącego wzrostu fluorescencji w ciągu 5 min), szybko rozcieńczyć próbkę 20-krotnie buforem Tyrode'a i monitorować dysocjację aż do osiągnięcia fluorescencji bazowej (całkowita dysocjacja) lub do osiągnięcia plateau (brak znaczącego spadku fluorescencji w ciągu 5 min).
  UWAGA: Jako kontrolę dodać 10 µM EDTA i monitorować całkowitą dysocjację przez 5 min.
Eksperymenty z wiązaniem równowagowym
UWAGA: Wykorzystać krzywą kinetyczną wiązania, aby określić czas osiągnięcia nasycenia; czas nasycenia dla fX-fd i sztucznych pęcherzyków wynosi 20 min.
1. Inkubować sztuczne pęcherzyki fosfolipidowe (5 µM) do analizy wiązania z różnymi stężeniami fX-fd (od 0 do 1 000 nM) w buforze Tyrode'a przez 20 min.
2. Rozcieńczyć każdą próbkę z kroku 4.2.1 20-krotnie do końcowej objętości 200 µL buforem Tyrode'a. Rozcieńczoną próbkę natychmiast poddać analizie cytometrii przepływowej w ciągu 30 s. Stosować ustawienia z kroku 4.1.3.
  UWAGA: Jako kontrolę wiązania niespecyficznego stosować analogiczne próbki z EDTA (10 µM) i inkubować je przez 5 min.

5. Analiza danych z cytometrii przepływowej

Eksportuj eksperymenty w formacie FSC z oprogramowania do akwizycji danych cytometrycznych do oprogramowania cytometrycznego do analizy danych (patrz na Tabela materiałów). Wybrać Plik | Eksportuj | pliki FCSOtwórz pliki FSC w oprogramowaniu cytometru w celu analizy danych, wybierając pliki na komputerze i przeciągając je do obszaru roboczego programu.
W celu wyznaczenia bramkowania mikro pęcherzyków, zidentyfikuj obszar mikro pęcherzyków na podstawie fluorescencji lipofilowego barwnika DiIC₁₆(3). Użyć poleceń z menu lub wykres przycisk w arkuszu do tworzenia wykresu kropkowego SSC z FL2 (barwnik DilC)₁₆(3)) w współrzędnych logarytmicznych. Wybierz Bramka prostokątna przycisk do wyznaczenia obszaru bramkowania w taki sposób, aby zdarzenia z próbki bez pęcherzyków nie były włączone do tego obszaru (Rysunek 1B,C).
Przeanalizuj eksperymenty kinetyczne.
1. Utwórz wykres punktowy (dot-plot), wykorzystując współrzędne fluorescencji (FL4) w czasie dla obszaru pęcherzyków (dwukrotnie kliknij w obszarze pęcherzyków w kroku 5.2)
2. Wyeksportuj dane dotyczące zmiany fluorescencji w czasie w formacie csv. Wybierz próbkę | Kliknij prawym przyciskiem myszy | Eksportuj | Wybierz FL4 i Czas w parametrach | Wybierz katalog zapisu | Wybierz format CSV | Eksportuj.
3. Otwórz plik CSV w dowolnym programie statystycznym (patrz: Tabela materiałów). Oblicz prostą średnią kroczącą fluorescencji i czasu dla każdych 1 000 zdarzeń.
4. Przybliżenie wykresu zależności prostej średniej ruchomej fluorescencji od czasu przy założeniu zależności wykładniczej (Analiza > Dopasowanie >Nieliniowe dopasowanie krzywej) i wykorzystaj je do obliczenia stałej asocjacji kinetycznej zgodnie z równaniem (5).
  (5)
  Gdzie [X^B] stężenie czynnika związanego w każdym momencie czasu (jednostki zdefiniowane przez użytkownika) zgodnie z prostą średnią kroczącą z kroku 5.3.3; Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. jest stężeniem dodanego czynnika; Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia._maksymalny jest maksymalnym stężeniem czynnika związanego; k jest stałą asocjacji; t jest czas.
5. Powtórz ten sam zestaw czynności (5.3.1-5.3.4), aby obliczyć stałą kinetyczną dysocjacji za pomocą równania (6).
  (6)
  Gdzie [X^B] jest stężeniem czynnika związanego w każdym momencie czasu; Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o wprowadzenie treści do przetłumaczenia.₀ jest stężeniem czynnika związanego w początkowym momencie czasowym; k jest stałą dysocjacji; t nadszedł czas.
Analiza wiązania w stanie równowagi
1. Wyznaczyć średnią fluorescencję fX-fd w obszarze pęcherzyków dla każdego wybranego stężenia fX-fd.
2. Przybliżono zależność fluorescencji czynnika związanego od stężenia dodanego czynnika przy założeniu prostego wiązania jednowidokowego. Obliczono średnie parametry wiązania, korzystając z równania (7z co najmniej trzech niezależnych powtórzeń.
  (7)
  Gdzie [X^B] jest stężeniem czynnika związanego; [X] to stężenie dodanego czynnika; n^x jest pozorną liczbą miejsc wiązania na pęcherzyk; K_djest pozorną stałą dysocjacji.

6. Przeliczanie intensywności fluorescencji na średnią liczbę miejsc wiązania

Przygotuj kalibrowane kuleczki.
1. Inkubuj płytki krwi po filtracji żelowej (patrz krok 3.3) z A23187 (10 µM) w obecności CaCl₂ (2.5 mM) przez 10 min w temperaturze pokojowej.
2. Dodaj do aktywowanych płytek różne stężenia fX-fd (od 0 do 1 000 nM). Dodaj 2% v/v formaldehydu i inkubuj przez 1 h. Zatrzymaj reakcję, inkubując płytki z 3 M glicyną i 5% BSA przez 30 min w temperaturze pokojowej.
3. Oczyść mieszaninę z nieprzereagowanego barwnika. Centryfuguj płytki przez 5 min przy 400 × g, usuń supernatant i resuspenduj osad w buforze Tyrode'a (zawierającym 0.5% BSA).
  UWAGA: Powtórz krok 6.1.3 trzykrotnie.
Zmierz poziom fluorescencji kuleczek kalibracyjnych w każdej próbce najpierw za pomocą spektrofluorometru (dla barwnika fluorescencyjnego z Tabeli materiałów, wzbudzenie 633 nm, emisja 670 nm), a następnie za pomocą cytometru przepływowego (w kanale FL4: wzbudzenie 633 nm, filtr emisyjny 660/20). Za pomocą licznika komórek określ liczbę kuleczek w każdej próbce.
Przelicz intensywność fluorescencji każdej odpowiedniej próbki kuleczek na stężenie rozpuszczalnego barwnika fluorescencyjnego za pomocą spektrofluorometru. Oblicz ponownie stężenie barwnika fluorescencyjnego dla liczby cząsteczek fluoroforu, korzystając z równania (8).
$Wzór na ilość substancji chemicznej, $N_x = C \times V \times N_A$, równanie do obliczania ilości substancji.$ (8)
Gdzie N_x to liczba cząsteczek fluoroforu; C to stężenie barwnika fluorescencyjnego; N_A to stała Avogadra; N_A = 6.02214076×10²³ mol ^-1.
Stwórz wykres zależności średniej fluorescencji kuleczek w cytometrze przepływowym (krok 6.2) od liczby cząsteczek fluoroforu (patrz krok 6.3) dla każdej próbki, korzystając z dowolnego oprogramowania statystycznego (patrz Tabela materiałów). Przybliż tę zależność linią proporcjonalności (Analiza | Dopasowanie | Dopasowanie liniowe). Z przybliżenia w równaniu (9) oblicz współczynnik konwersji średniej fluorescencji na miejsca wiązania.
(9)
Gdzie MF to średnia fluorescencja kuleczek w cytometrii przepływowej; Nx to liczba cząsteczek fluoroforu na kuleczkę; CF to współczynnik konwersji średniej fluorescencji na miejsca wiązania. CF i b uzyskuje się z wyników dopasowania wykresu do proporcjonalności liniowej.
Oblicz pozorną liczbę miejsc wiązania na badaną pęcherzykową strukturę, korzystając z równania (10).
(10)
Gdzie nx to pozorna liczba miejsc wiązania na badaną pęcherzykową strukturę; MF to średnia fluorescencja badanych struktur pęcherzykowych w cytometrii przepływowej; CF i b to współczynniki konwersji z równania (8).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana tutaj metoda cytometrii przepływowej jest stosowana do charakteryzacji wiązania białek krzepnięcia osocza do aktywowanych płytek krwi. Dodatkowo, jako system modelowy zastosowano pęcherzyki fosfolipidowe PS:PC 20:80. Niniejsza praca skupia się głównie na sztucznych pęcherzykach fosfolipidowych jako przykładzie. Parametry cytometru, w szczególności napięcie fotopowielacza (PMT) oraz kompensacja, muszą być dobrane do każdego konkretnego urządzenia, badanego obiektu (komórki, sztuczne lub naturalne mikropęcherzyki) ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Proponowana metoda może być dostosowana do przybliżonej charakterystyki oddziaływania białek z błonami fosfolipidowymi z różnych źródeł i składów. Opisana tutaj ilościowa cytometria przepływowa poddaje się powierzchniowemu rezonansowi plazmonowemu (SPR) w kilku parametrach. W szczególności ma niższą czułość i rozdzielczość czasową oraz wymaga znakowania fluorescencyjnego białek. Znakowanie fluorescencyjne może prowadzić do zmiany konformacji i utraty aktywności wielu białek i dlatego wymaga starannej kontroli. Jednak ta ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy byli wspierani przez grant Rosyjskiej Fundacji Naukowej 20-74-00133.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester sukcynimidylu)	Thermo Fisher Scientific	A37573	barwnik fluorescencyjny
Apyraza z ziemniaków	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
albumina surowicy bydlęcej	VWR Nauki przyrodnicze AMRESCO	Am-O332-0.1
Chlorek wapnia, bezwodny, w proszku, ≥ 97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Spektrometr fluorescencyjny Cary Eclipse	Agilent
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanonine)	Thermo Fisher Scientific	D384
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
Sól disodowa EDTA	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	BD Bioscience		oprogramowanie do pozyskiwania danych cytometrycznych
cytometru	FlowJo	Tree Star
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Badania enzymów ludzkiego czynnika X		HFX 1010
Chlorowodorek hydroksyloaminy	Panreac	141914.1209
L-&alfa;-fosfatydylocholina (mózg, świnia)	Avanti Polar Lipids	840053P
L-&alfa;-fosfatydyloseryna (mózg, świnia) (sól sodowa)	Avanti Polar Lipids	840032P
Chlorek magnezu	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-ekstruder	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		Oprogramowanie statystyczne
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), klasa biotechnologiczna	VWR Nauki przyrodnicze AMRESCO	97062-732
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandyna E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	żelowe medium filtracyjne do oczyszczania białek
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	żelowe medium filtracyjne do oczyszczania płytek
krwi Wodorowęglan sodu	Corning	61-065-RO
Chlorek sodu	Sigma	Aldrich S3014-500G
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma Aldrich	S3139-250G
Kolumny wirowe z membraną 0,2 i mikro; m	Sartorius	VS0171
Cytrynian trisodowy dwuwodny	Sigma Aldrich	S1804-1KG

Oprogramowanie do analizy danych

Bibliografia

Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).
Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
De Franceschi, N., et al. ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oddziaływanie białek z błonami dynamika wiązania ligandów kinetyczne eksperymenty wiązania test wiązania równowagowego kuleczki kalibracyjne aktywacja płytek krwi analiza spektrofluorometryczna

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej