Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

Summary

Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.

Abstract

W ludzkim ciele większość głównych reakcji fizjologicznych związanych z odpowiedzią immunologiczną i krzepnięciem krwi zachodzi na błonach komórkowych. Ważnym pierwszym krokiem w każdej reakcji zależnej od błony jest wiązanie białka na błonie fosfolipidowej. Opracowano podejście do badania interakcji białek z błonami lipidowymi przy użyciu białek znakowanych fluorescencyjnie i cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na badanie oddziaływań białko-błona z wykorzystaniem żywych komórek i naturalnych lub sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych. Zaletą tej metody jest prostota i dostępność odczynników oraz sprzętu. W tej metodzie białka są znakowane za pomocą barwników fluorescencyjnych. Można jednak stosować zarówno samodzielnie wyprodukowane, jak i dostępne na rynku, znakowane fluorescencyjnie białka. Po koniugacji z barwnikiem fluorescencyjnym białka inkubuje się ze źródłem błony fosfolipidowej (mikropęcherzykami lub komórkami), a próbki analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej. Uzyskane dane można wykorzystać do obliczenia stałych kinetycznych i równowagi K_d. Ponadto możliwe jest oszacowanie przybliżonej liczby miejsc wiązania białek na błonie fosfolipidowej za pomocą specjalnych kulek kalibracyjnych.

Introduction

Biomembrany oddzielają wewnętrzną zawartość komórek zwierzęcych od przestrzeni pozakomórkowej. Należy pamiętać, że błony otaczają również mikropęcherzyki powstałe podczas cyklu życia komórki i organelle. Błona komórkowa składa się głównie z lipidów i białek. Białka błonowe pełnią funkcje sygnalizacyjne, strukturalne, transportowe i adhezyjne. Jednak dwuwarstwa lipidowa jest również niezbędna do wzajemnego powiązania komórki zwierzęcej z przestrzenią zewnątrzkomórkową. W pracy zaproponowano metodę badania obwodowych oddziaływań białek zewnętrznych z błoną lipidową.

Najbardziej uderzającym przykładem reakcji zachodzących na zewnętrznej warstwie błony komórki zwierzęcej jest reakcja krzepnięcia krwi. Ważną cechą krzepnięcia krwi jest to, że wszystkie główne reakcje zachodzą na błonach fosfolipidowych komórek i mikropęcherzykach powstających z tych komórek, a nie w plazmie1^,2,3. Reakcje błonozależne obejmują proces rozpoczęcia krzepnięcia (na błonach komórkowych śródbłonka, śródbłonka w stanie zapalnym lub aktywowanych komórkach odpornościowych, z udziałem czynnika tkankowego), wszystkie reakcje głównej kaskadowej aktywacji czynników IX, X, protrombiny; aktywacja czynnika XI przez trombinę (na błonach aktywowanych płytek krwi, erytrocytów, lipoprotein i mikropęcherzyków); reakcje szlaku białka C; inaktywacja enzymów krzepnięcia (na błonach komórek śródbłonka z udziałem kofaktorów trombomodulinowych, receptora białka C śródbłonka, siarczanu heparanu); oraz reakcje szlaku kontaktowego (na błonach płytek krwi i niektórych mikropęcherzykach z udziałem nieznanych kofaktorów). W związku z tym niemożliwe jest zbadanie krzepnięcia krwi bez zbadania interakcji różnych białek osocza z błoną komórek krwi.

Ten artykuł opisuje metodę opartą na cytometrii przepływowej do charakteryzowania interakcji białek z błonami lipidowymi komórek lub mikropęcherzyków. Podejście to zostało początkowo zaproponowane do zbadania interakcji osocza krwi z płytkami krwi i sztucznymi pęcherzykami fosfolipidowymi. Co więcej, większość badanych białek oddziałuje bezpośrednio z ujemnie naładowanymi fosfolipidami błonowymi, szczególnie z fosfatydyloseryną^4,5. Dodatkowo istnieją białka, w których interakcji z błoną pośredniczą specjalne receptory⁶.

Ważną umiejętnością cytometrii przepływowej jest rozróżnianie wolnych i związanych ligandów bez dodatkowego rozdzielania. Ta cecha cytometrii umożliwia badanie wiązania równowagi ligandów w punkcie końcowym i pomaga w wykonywaniu ciągłych pomiarów kinetycznych. Technika ta jest niewyrafinowana i nie wymaga skomplikowanego przygotowania próbki. Cytometria przepływowa jest aktywnie wykorzystywana do ilościowego badania dynamiki interakcji między fluorescencyjnymi peptydami, receptorami i białkami G w nienaruszonych i przepuszczalnych dla detergentów neutrofilach⁷. Podejście to ma również zastosowanie do badania interakcji białko-DNA i kinetyki aktywności endonukleazy w czasie rzeczywistym⁸. Z biegiem czasu metoda ta została wykorzystana do ilościowego badania interakcji białko-białko o wysokim powinowactwie z oczyszczonymi pęcherzykami lipidowymi⁹ lub, bardziej ogólnie, z białkami błonowymi ulegającymi ekspresji w wysoce wydajnym systemie ekspresji komórek Sf9¹⁰. Opisano również metody ilościowe charakteryzujące interakcje białko-liposom za pomocą cytometrii przepływowej dla białek transbłonowych¹¹.

Ta technika wykorzystuje samodzielnie wykonane koraliki kalibracyjne, aby uniknąć używania dostępnych na rynku koralików⁷. Kulki kalibracyjne używane wcześniej⁷ były przeznaczone do pracy z fluoresceiną, co znacznie ograniczało asortyment dostępnych ligandów fluorescencyjnych na białkach. Ponadto artykuł ten oferuje nowy sposób pozyskiwania i analizowania danych kinetycznych w celu uzyskania rozsądnej rozdzielczości czasowej. Chociaż metoda ta jest opisana dla sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych, nie ma oczywistych ograniczeń co do jej zdolności adaptacyjnych do komórek, naturalnych pęcherzyków lub sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych o innym składzie lipidowym. Opisana tu metoda pozwala na oszacowanie parametrów oddziaływania (k_on, k_off) i równowagi (K_d) oraz ułatwia ilościową charakterystykę liczby miejsc wiązania białek na błonie. Należy zauważyć, że ta technika zapewnia przybliżone oszacowanie liczby miejsc wiązania. Zaletami metody są jej względna prostota, dostępność i zdolność adaptacji do komórek natywnych oraz naturalnych i sztucznych mikropęcherzyków.

Protocol

1. Znakowanie białek fluorescencyjnych

1. Przygotowanie materiału
   1. Przygotować 1 M bufor wodorowęglanowy o pH 9,0, przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia.
   2. Przygotować 1,5 M bufor chlorowodorku hydroksyloaminy o pH 8,5 bezpośrednio przed użyciem.
   3. Przygotować 10 mg/ml roztworu barwnika fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) w dimetylosulfotlenku.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać przez miesiąc w temperaturze -20 °C w ciemności.
   4. Przygotować roztwory oczyszczonych przeciwciał lub innych białek w stężeniu 1-10 mg/ml.
      UWAGA: Unikaj zawierających jony amonowe lub aminy pierwszorzędowe. Zastąpić zawierające Tris lub glicerol solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą dializy. Ani azydek sodu (≤3 mM), ani tiomersal (≤1 mM) nie wpłyną znacząco na reakcję koniugacji.
   5. Inkubować żelowe podłoże filtracyjne (patrz tabela materiałów) w celu oczyszczania białek w PBS przez noc w temperaturze pokojowej lub przez 2 godziny w temperaturze 60 °C. Nakładać żelowe podłoże filtracyjne na kolumny wirowe z membranami 0,2 μm.
2. Obliczyć ilość barwnika reaktywnego, która ma być użyta w każdej reakcji, w zależności od stężenia białka, które ma być znakowane, za pomocą równania (1).
   
   gdzie_barwnik V jest objętością roztworu podstawowego barwnika; C_pr, V_pr i MW_pr oznacza stężenie, objętość i masę molową białka; _Barwnik MW to masa molowa barwnika; 100 to jednostkowy współczynnik konwersji; MR to stosunek molowy barwnika do białka w mieszaninie reakcyjnej.
   UWAGA: W reakcjach znakowania IgG zalecane są następujące MR: MR = 40, jeśli przeciwciało ma 1-3 mg/ml lub MR = 30, jeśli przeciwciało ma 4-10 mg/ml. W przypadku czynników krzepnięcia zwykle stosuje się MR = 5.
3. Reakcja koniugacji
   1. W probówce reakcyjnej wymieszać roztwór białka z 10 razy mniejszą objętością 1 M roztworu wodorowęglanu.
   2. Dodać wymaganą ilość barwnika fluorescencyjnego (patrz krok 1.2), ciągle mieszając.
   3. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę, chroniąc przed światłem i ciągle mieszając.
   4. Na każde 200 μl roztworu białkowego dodać 5 μl 1,5 M chlorowodorku hydroksyloaminy.
   5. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze pokojowej przez około 30 minut, chroniąc przed światłem i ciągle mieszając.
4. Przygotuj kolumnę wirowania.
   1. Dodać do kolumny 500 μl żelowej pożywki filtracyjnej do oczyszczania białka. Odwirować kolumnę przez 3 minuty w temperaturze 1 000 × g.
   2. Wyrzucić bufor z probówki zbiorczej. Jeśli kolumna nie jest pełna, dodać więcej żelowego medium filtracyjnego i odwirować kolumnę przez 3 minuty w temperaturze 1 000 × g. Powtarzaj ten krok, aż kolumna będzie pełna.
5. oczyszczanie
   1. Odwirować mieszaninę reakcyjną (z etapu 1.3.5) przez 5 minut przy 17 000 × g i usunąć osad.
   2. Przenieść supernatant do kolumny wirowej z żelowym medium filtracyjnym. Poczekaj, aż roztwór wchłonie się w łożu żelowym.
   3. Użyj pustej probówki zbiorczej do kolumny wirowej i odwiruj ją przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g. Po odwirowaniu zebrać znakowane białko z probówki zbiorczej.
6. Określenie stopnia oznakowania
   1. Skorygować udział barwnika w absorbancji przy A₂₈₀, mierząc absorbancję wolnego barwnika przy 280 nm (A₂₈₀) i _{λ max} dla barwnika (A_max) (patrz równanie (2)).
      (2)
   2. Zmierzyć absorbancję koniugatu białko-barwnik przy 280 nm (A₂₈₀) i _{λ max} dla barwnika (A_max) i obliczyć koncentrację białka za pomocą Eq (3).
      (3)
      gdzie_{ε M} jest molowym współczynnikiem ekstynkcji białka przy 280 nm; d oznacza długość drogi optycznej podczas pomiaru absorbancji; CF to udział barwnika w absorbancji przy A₂₈₀ (krok 1.6.1).
   3. Oblicz stopień etykietowania (DOL) za pomocą korektora (4).
      (4)
      gdzie ε_{M barwnik} jest molowym współczynnikiem ekstynkcji barwnika przy_{λ max} nm; d oznacza długość drogi optycznej podczas pomiaru absorbancji; _Białko C jest stężeniem białka (krok 1.6.2).

2. Przygotowanie pęcherzyków fosfolipidowych

1. Przygotowanie i przechowywanie mieszaniny lipidów
   1. Połączyć lipidy w odpowiednim stosunku (fosfatydyloseryna/fosfatydylocholina w stosunku od 20 mol% do 80 mol.).
   2. Wysuszyć mieszaninę lipidów po liofilizacji lub odparowaniu i przechowywać w obojętnej atmosferze w szklanych ampułkach.
2. Produkcja filmu lipidowego
   1. Otwórz ampułkę i ponownie zamieszaj mieszaninę lipidów w niewielkiej ilości (~100 μL) chloroformu.
      UWAGA: Nie używaj zbyt dużej ilości chloroformu, ponieważ nie odparowuje on całkowicie.
   2. Dodać DiIC16(3) w etanolu o stężeniu 0,2% mol%. Przenieść mieszaninę lipidów do kolby okrągłodennej. Rozprowadzić mieszaninę cienko po bokach kolby, obracając ją. Suszyć mieszaninę lipidów przez 30 minut pod strumieniem argonu.
3. Uwodnienie mieszaniny lipidowej
   1. Do kolby z filmem lipidowym dodać odpowiednio ciepły (~55 °C) bufor wodny (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) w objętości odpowiadającej oczekiwanemu stężeniu lipidów. Inkubować mieszaninę z wirowaniem w temperaturze 55 °С przez 30 minut, aby uzyskać pełne nawodnienie.
   2. Umieszczenie probówki z próbką w zamrażarce lub ciepłym termostacie, aby zawiesina lipidowa przeszła 3-5 cykli zamrażania i rozmrażania.
4. Tworzenie pęcherzyków lipidowych przez ekstruzję
   1. Przygotuj ekstruder zgodnie z instrukcjami producenta. Rozgrzej wszystkie elementy ekstrudera do temperatury przemiany fazowej mieszaniny lipidów.
   2. Napełnij jedną ze strzykawek ekstrudera uwodnioną mieszaniną lipidów. Odczekaj 5-10 minut, aż temperatura zawiesiny lipidowej zrówna się z temperaturą ekstrudera.
   3. Wytłacz mieszaninę lipidów przez membranę co najmniej 10 razy. W celu ostatecznego wytłoczenia umieść zawiesinę lipidową w alternatywnej strzykawce i poszukaj zmiany w wyglądzie z lekko mglistego na klarowny roztwór.
   4. Powstałą mieszaninę pęcherzyków lipidowych należy przechowywać w temperaturze 4 °C, najlepiej w obojętnej atmosferze argonu lub azotu, przez 3-4 dni. Nie zamrażać.

3. Izolacja płytek krwi z krwi pełnej

1. Krew pełną należy pobrać od zdrowych dawców do probówek zawierających 3,2% cytrynianu sodu.
2. Dodać prostaglandynę E1 (PGE1) (1 μM) i apyrazę (0,1 U/ml) do krwi, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej 100 × g przez 8 min.
3. Po odwirowaniu pobrać osocze bogatopłytkowe i dodać roztwór cytrynianu sodu (106 mM, pH 5,5) do stosunku osocza/cytrynian 3:1. Odwirować osocze w temperaturze pokojowej o natężeniu 400 × g przez 5 minut.
4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl buforu Tyrode'a bez BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glukozy, pH 7,4). Oczyścić płytki krwi z białek osocza metodą chromatografii żelowej na pożywce filtracyjnej w żelu w celu oczyszczenia płytek krwi (patrz tabela materiałów).

4. Wykrywanie interakcji białko - lipid za pomocą cytometrii przepływowej

1. Eksperymenty z wiązaniami kinetycznymi
   1. Rozcieńczyć pęcherzyki fosfolipidowe (od kroku 2.4.4) w buforze Tyrode'a (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glukozy, 0,5% BSA, pH 7,4) do stężenia 1 μM i całkowitej objętości 250 μL.
   2. Zmieszać znakowany fluorescencyjnie czynnik krzepnięcia X (fX-fd) z etapu 1 o stężeniu 500 nM z pęcherzykami fosfolipidowymi z kroku 4.1.1 w stosunku 1:1 (końcowe stężenie pęcherzyków 0,5 μM, stężenie fX-fd wynosi 250 nM fX) do całkowitej objętości 500 μl.
   3. Natychmiast wstrzyknąć 500 μl zmieszanej zawiesiny (~20 min w przypadku analizy przy niskim natężeniu przepływu) do cytometru przepływowego. Stosować niskie natężenie przepływu i upewnić się, że próg dla kanału FL2 (ekscytacja 488 nm, filtr emisyjny 585/42 nm) wynosi wartość 200. Zmierzyć średnią fluorescencję w kanale FL4 (ekscytacja 633 nm, filtr emisyjny 660/20) dla barwnika fluorescencyjnego z tabeli materiałów.
      UWAGA: Wybierz cytometr bez automatycznego podajnika próbek. Przyspieszy to proces wstrzykiwania próbki do celi pomiarowej.
   4. Po osiągnięciu nasycenia wiązania (brak znaczącego wzrostu fluorescencji w ciągu 5 minut), szybko rozcieńczyć próbkę 20-krotnie buforem Tyrode'a i monitorować dysocjację aż do osiągnięcia podstawowej fluorescencji (całkowita dysocjacja) lub do osiągnięcia plateau (brak znaczącego spadku fluorescencji w ciągu 5 minut).
      UWAGA: Jako kontrolę, dodaj 10 μM EDTA i monitoruj całkowitą dysocjację przez 5 minut.
2. Eksperymenty z wiązaniem równowagowym
   UWAGA: Użyj krzywej kinetycznej wiązania, aby określić czas do osiągnięcia nasycenia; czas wysycenia dla fX-fd i sztucznych pęcherzyków wynosi 20 min.
   1. Inkubować sztuczne pęcherzyki fosfolipidowe (5 μM) do testu wiązania z różnymi stężeniami fX-fd (od 0 do 1 000 nM) w buforze Tyrode'a przez 20 minut.
   2. Rozcieńczyć każdą próbkę od kroku 4.2.1 20-krotnie do końcowej objętości 200 μl za pomocą buforu Tyrode'a. Rozcieńczoną próbkę należy natychmiast przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej w ciągu 30 sekund. Użyj ustawień z kroku 4.1.3.
      UWAGA: Jako kontrolę niespecyficznego wiązania należy użyć podobnych próbek z EDTA (10 μM) i inkubować je przez 5 minut.

5. Analiza danych cytometrii przepływowej

1. Eksport eksperymentów w formacie FSC z oprogramowania do akwizycji danych cytometrycznych do oprogramowania cytometru w celu analizy danych (patrz tabela materiałów). Wybierz pozycję Plik | Eksport | Pliki FCS. Otwórz pliki FSC w oprogramowaniu cytometru do analizy danych, wybierając pliki na komputerze i przeciągając je do obszaru roboczego programu.
2. W przypadku bramkowania mikropęcherzyków należy zidentyfikować obszar mikropęcherzyków za pomocą fluorescencji barwnika lipofilowego DiIC₁₆ (3). Użyj poleceń menu lub przycisku kreślenia w arkuszu, aby utworzyć wykres punktowy SSC z FL2 (barwnik DilC₁₆(3)) we współrzędnych dziennika. Wybierz przycisk Bramka prostokątna, aby narysować obszar bramkowania, tak aby zdarzenia z próbki bez pęcherzyków nie były uwzględniane w tym regionie ( Rysunek 1B, C).
3. Przeanalizuj eksperymenty kinetyczne.
   1. Utwórz wykres kropkowy, używając współrzędnych fluorescencji (FL4) w czasie dla obszaru pęcherzyków (kliknij dwukrotnie obszar pęcherzyków w kroku 5.2)
   2. Eksportuj dane dotyczące zmiany fluorescencji w czasie w formacie csv. Wybierz pozycję Próbka | Kliknij prawym przyciskiem myszy | Eksport | Wybierz FL4 i czas w Parametrach | Wybierz katalog do zapisania | Wybierz format CSV | Eksport.
   3. Otwórz plik CSV w dowolnym oprogramowaniu statystycznym (patrz Spis materiałów). Oblicz prostą średnią ruchomą fluorescencji i czasu dla każdych 1,000 zdarzeń.
   4. Przybliżyć wykres zależności prostej fluorescencji średniej ruchomej od czasu przy założeniu zależności wykładniczej (Analiza dopasowania > dopasowania >dopasowanie krzywej nieliniowej) i użyć go do obliczenia stałej asocjacji kinetycznej za pomocą równania (5).
      (5)
      gdzie [X^B] oznacza stężenie czynnika związanego w każdym momencie czasu (jednostki zdefiniowane przez użytkownika) zgodnie z prostą średnią ruchomą z kroku 5.3.3; [X] oznacza stężenie dodanego czynnika; [X]_max jest maksymalnym stężeniem czynnika granicznego; k jest stałą asocjacyjną; t to jest czas.
   5. Powtórzyć ten sam zestaw czynności (5.3.1-5.3.4) w celu obliczenia stałej dysocjacji kinetycznej za pomocą równania (6).
      (6)
      gdzie [X^B] jest stężeniem czynnika związanego w każdym momencie czasu; [X]₀ jest stężeniem czynnika związanego w początkowym momencie czasu; k jest stałą dysocjacji; t to jest czas.
4. Równowagowy test wiązania
   1. Określić średnią fluorescencję fX-fd w obszarze pęcherzyków dla każdego wybranego stężenia fX-fd.
   2. Przybliżyć zależność fluorescencji czynnika związanego od stężenia dodanego czynnika przy założeniu prostego wiązania w jednym miejscu. Obliczyć średnie parametry wiązania za pomocą korektora (7) z trzech niezależnych powtórzeń przy minimum.
      (7)
      Gdzie [X^B] jest stężeniem czynnika granicznego; [X] oznacza stężenie dodanego czynnika; n^x oznacza pozorną liczbę miejsc wiązania na pęcherzyk; K_d jest pozorną stałą dysocjacji.

6. Przeliczanie intensywności fluorescencji na średnią liczbę miejsc wiązania

1. Przygotuj skalibrowane koraliki.
   1. Inkubować płytki krwi przefiltrowane żelem (patrz krok 3.3) z A23187 (10 μM) w obecności CaCl₂ (2,5 mM) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Do aktywowanych płytek krwi dodać różne stężenia fX-fd (od 0 do 1 000 nM). Dodać 2% v/v formaldehydu i inkubować przez 1 godzinę. Zatrzymaj reakcję, inkubując płytki krwi z 3 M glicyną i 5% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Oczyść mieszaninę z nieprzereagowanego barwnika. Odwirować płytki krwi przez 5 minut w stężeniu 400 × g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze Tyrode'a (zawierającym 0,5% masy ciała).
      UWAGA: Powtórz krok 6.1.3 trzy razy.
2. Zmierzyć poziom fluorescencji kulek kalibracyjnych w każdej próbce najpierw za pomocą spektrofluorometru (dla barwnika fluorescencyjnego z tabeli materiałów, wzbudzenie 633 nm, emisja 670 nm), a następnie za pomocą cytometru przepływowego (w kanale FL4: wzbudzenie 633 nm, filtr emisyjny 660/20). Za pomocą licznika komórek określ liczbę koralików w każdej próbce.
3. Przelicz intensywność fluorescencji każdej odpowiedniej próbki kulki na stężenie rozpuszczalnego barwnika fluorescencyjnego za pomocą spektrofluorometru. Przelicz stężenie barwnika fluorescencyjnego dla liczby cząsteczek fluoroforu za pomocą Eq (8).
   (8)
   Gdzie N_x jest liczbą cząsteczek fluoroforu; C oznacza stężenie barwnika fluorescencyjnego; N_A jest stałą Avogadro; N_A = 6,02214076×10²³ mol ^-1.
4. Za pomocą dowolnego oprogramowania statystycznego należy utworzyć wykres zależności średniej fluorescencji kulek w cytometrze przepływowym (krok 6.2) od liczby cząsteczek fluoroforu (patrz krok 6.3) dla każdej próbki, korzystając z dowolnego oprogramowania statystycznego (patrz tabela materiałów). Przybliżyć tę zależność za pomocą proporcjonalności linii (Analiza | Dopasowanie | Dopasowanie liniowe). Z przybliżenia w Eq (9) obliczyć współczynnik konwersji średniej fluorescencji do miejsc wiązania.
   (9)
   Gdzie MF oznacza średnią fluorescencję kulek metodą cytometrii przepływowej; Nx to liczba cząsteczek fluoroforu na koralik; CF reprezentuje współczynnik konwersji średniej fluorescencji na miejsca wiązania. CF i b uzyskuje się z wyników dopasowania wykresu za pomocą proporcjonalności liniowej.
5. Obliczyć pozorną liczbę miejsc wiązania na bańkę będącą przedmiotem zainteresowania, korzystając z Eq (10).
   (10)
   Gdzie nx jest pozorną liczbą miejsc wiązania na bańkę będącą przedmiotem zainteresowania; MF oznacza średnią fluorescencję badanych pęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej; CF i b są współczynnikami konwersji z równania (8).

Results

Metoda cytometrii przepływowej opisana tutaj jest używana do scharakteryzowania wiązania białek krzepnięcia osocza z aktywowanymi płytkami krwi. Ponadto jako układ modelowy zastosowano pęcherzyki fosfolipidowe PS:PC 20:80. W niniejszej pracy skupiono się głównie na przykładzie sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych. Parametry cytometru, w szczególności napięcie lampy fotopowielacza (PMT) i kompensacja, muszą być dobrane dla każdego konkretnego urządzenia, przedmiotu badań (komórki, sztuczne lub naturalne mikropęcherzyki)...

Discussion

Proponowana metoda może być dostosowana do przybliżonej charakterystyki oddziaływania białek z błonami fosfolipidowymi z różnych źródeł i składów. Opisana tutaj ilościowa cytometria przepływowa poddaje się powierzchniowemu rezonansowi plazmonowemu (SPR) w kilku parametrach. W szczególności ma niższą czułość i rozdzielczość czasową oraz wymaga znakowania fluorescencyjnego białek. Znakowanie fluorescencyjne może prowadzić do zmiany konformacji i utraty aktywności wielu białek i dlatego wymaga starannej kontroli. Jednak ta ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester sukcynimidylu)	Thermo Fisher Scientific	A37573	barwnik fluorescencyjny
Apyraza z ziemniaków	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
albumina surowicy bydlęcej	VWR Nauki przyrodnicze AMRESCO	Am-O332-0.1
Chlorek wapnia, bezwodny, w proszku, ≥ 97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Spektrometr fluorescencyjny Cary Eclipse	Agilent
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanonine)	Thermo Fisher Scientific	D384
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
Sól disodowa EDTA	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	BD Bioscience		oprogramowanie do pozyskiwania danych cytometrycznych
cytometru	FlowJo	Tree Star
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Badania enzymów ludzkiego czynnika X		HFX 1010
Chlorowodorek hydroksyloaminy	Panreac	141914.1209
L-&alfa;-fosfatydylocholina (mózg, świnia)	Avanti Polar Lipids	840053P
L-&alfa;-fosfatydyloseryna (mózg, świnia) (sól sodowa)	Avanti Polar Lipids	840032P
Chlorek magnezu	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-ekstruder	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		Oprogramowanie statystyczne
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), klasa biotechnologiczna	VWR Nauki przyrodnicze AMRESCO	97062-732
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandyna E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	żelowe medium filtracyjne do oczyszczania białek
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	żelowe medium filtracyjne do oczyszczania płytek
krwi Wodorowęglan sodu	Corning	61-065-RO
Chlorek sodu	Sigma	Aldrich S3014-500G
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma Aldrich	S3139-250G
Kolumny wirowe z membraną 0,2 i mikro; m	Sartorius	VS0171
Cytrynian trisodowy dwuwodny	Sigma Aldrich	S1804-1KG