Artykuł metodologiczny

Pomiar zawartości żelaza niehemowego w tkankach za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie batofenantroliny

DOI:

10.3791/63469

⸱

31 stycznia 2022

 , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2Basic and Clinical Research on Iron Biology, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 3Iron and Innate Immunity, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj dostępny jest protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze znanego testu kolorymetrycznego, który można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żelazo jest niezbędnym mikroelementem. Zarówno przeciążenie, jak i niedobór żelaza są bardzo szkodliwe dla ludzi, a poziom żelaza w tkankach jest precyzyjnie regulowany. Wykorzystanie eksperymentalnych modeli zwierzęcych przeciążenia lub niedoboru żelaza odegrało zasadniczą rolę w pogłębieniu wiedzy na temat mechanizmów zaangażowanych w ogólnoustrojową i komórkową regulację homeostazy żelaza. Pomiar całkowitego poziomu żelaza w tkankach zwierzęcych jest zwykle wykonywany za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej lub testu kolorymetrycznego opartego na reakcji żelaza niehemowego z odczynnikiem batofenantroliny. Od wielu lat test kolorymetryczny jest stosowany do pomiaru zawartości żelaza niehemowego w szerokim zakresie tkanek zwierzęcych. W przeciwieństwie do atomowej spektroskopii absorpcyjnej wyklucza udział żelaza hemowego pochodzącego z hemoglobiny zawartej w czerwonych krwinkach. Co więcej, nie wymaga wyrafinowanych umiejętności analitycznych ani bardzo drogiego sprzętu, dzięki czemu można go łatwo wdrożyć w większości laboratoriów. Wreszcie, test kolorymetryczny może być oparty na kuwecie lub dostosowany do formatu mikropłytki, co pozwala na większą przepustowość próbki. Niniejsza praca dostarcza dobrze ugruntowanego protokołu, który jest odpowiedni do wykrywania zmian w poziomach żelaza w tkankach w różnych eksperymentalnych modelach zwierzęcych przeciążenia lub niedoboru żelaza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żelazo jest niezbędnym mikroelementem, niezbędnym do funkcjonowania białek biorących udział w kluczowych procesach biologicznych, takich jak transport tlenu, produkcja energii czy synteza DNA. Co ważne, zarówno nadmiar, jak i niedobór żelaza są wysoce szkodliwe dla zdrowia człowieka, a poziom żelaza w tkankach jest precyzyjnie regulowany. Nieprawidłowe wchłanianie żelaza w diecie, diety ubogie w żelazo, powtarzające się transfuzje krwi i przewlekłe stany zapalne są częstymi przyczynami zaburzeń związanych z żelazem, które dotykają miliardy ludzi na całym świecie1,2,3.

Eksperymentalne modele zwierzęce przeciążenia lub niedoboru żelaza odegrały zasadniczą rolę w poszerzeniu naszej wiedzy na temat mechanizmów związanych z systemową i komórkową regulacją homeostazy żelaza4. Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w ciągu ostatnich dwóch dekad, wiele kluczowych aspektów pozostaje nieuchwytnych. W nadchodzących latach dokładny pomiar całkowitego poziomu żelaza w tkankach zwierzęcych pozostanie kluczowym krokiem w kierunku postępu badań w dziedzinie biologii żelaza.

Większość laboratoriów określa ilościowo żelazo tkankowe za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej (AAS), spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS), czy też testu kolorymetrycznego opartego na reakcji żelaza niehemowego z odczynnikiem batofenantroliny. Ta ostatnia opiera się na oryginalnej metodzie opisanej przez Torrance'a i Bothwella ponad 50 lat temu5,6. Chociaż wariant tej metody został następnie opracowany z wykorzystaniem ferrozyny jako alternatywy dla bathophenanthroline7, ten ostatni pozostaje najczęściej cytowanym odczynnikiem chromogennym w literaturze.

Wybór metody często zależy od dostępnej wiedzy specjalistycznej i infrastruktury. Podczas gdy AAS i ICP-MS są bardziej czułe, test kolorymetryczny pozostaje szeroko stosowany, ponieważ ma następujące ważne zalety: i) wyklucza udział żelaza hemowego pochodzącego z hemoglobiny zawartej w czerwonych krwinkach; ii) nie wymaga zaawansowanych umiejętności analitycznych ani bardzo drogiego sprzętu; oraz iii) oryginalny test oparty na kuwecie można dostosować do formatu mikropłytki, co pozwala na większą przepustowość próbki. Podejście kolorymetryczne przedstawione w tej pracy jest rutynowo stosowane do ilościowego określania zmian w poziomach żelaza niehemowego w tkankach w różnych eksperymentalnych modelach zwierzęcych przeciążenia lub niedoboru żelaza, od gryzoni po ryby i muszki owocowe. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze ugruntowanego testu kolorymetrycznego, który większość laboratoriów powinna uznać za łatwy do wdrożenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C57BL/6 myszy zostały zakupione komercyjnie, a myszy z hepcidin-null (Hamp1−/−) na tle C57BL/68 były miłym prezentem od Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francja). Zwierzęta były trzymane w obiekcie dla zwierząt i3S w określonych warunkach wolnych od patogenów, w środowisku o kontrolowanej temperaturze i oświetleniu, ze swobodnym dostępem do standardowej karmy dla gryzoni i wody. Labraks europejski (Dicentrarchus labrax) zakupiono z komercyjnej hodowli ryb i trzymano w obiekcie dla zwierząt ICBAS, w środowisku o kontrolowanej temperaturze i oświetleniu, a następnie karmiono codziennie ad libitum standardową paszą dla labraksa. Wszystkie procedury z udziałem kręgowców zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Zwierząt i3S oraz krajowy organ Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Informacje o komercyjnych odczynnikach, sprzęcie i zwierzętach są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie roztworu

UWAGA: Proszę obchodzić się ze wszystkimi odczynnikami i roztworami za pomocą szkła bez żelaza lub jednorazowego plastiku. Nie dopuszczaj do kontaktu metalowych materiałów laboratoryjnych (np. szpatułek ze stali nierdzewnej) z jakimkolwiek odczynnikiem lub roztworem, ze względu na ryzyko zanieczyszczenia żelazem. Upewnij się, że wszelkie naczynia szklane wielokrotnego użytku nie zawierają żelazka. Umyć materiały odpowiednim detergentem laboratoryjnym przez 30-60 min, spłukać wodą dejonizowaną, namoczyć przez noc w 37% roztworze kwasu azotowego rozcieńczonym 1:3 wodą dejonizowaną, ponownie spłukać wodą dejonizowaną i pozostawić do wyschnięcia.

  1. Mieszanina kwasów: Dodać 10 g kwasu trichlorooctowego do 82,2 ml 37% kwasu solnego w szklanej butelce, dokładnie rozpuścić i dostosować końcową objętość do 100 ml wodą dejonizowaną. Wstrząśnij przed użyciem. Alternatywnie, użyj tylko 37% kwasu solnego do trawienia tkanek.
    UWAGA: Roztwór jest stabilny przez co najmniej 2 miesiące, gdy jest przechowywany w ciemnobrązowych szklanych butelkach z odczynnikami.
    UWAGA: Kwas solny i kwas trichlorooctowy są, a skoncentrowane formy uwalniają toksyczne kwaśne opary. Podczas pracy z kwasami należy nosić odzież ochronną, rękawice odporne na chemikalia i okulary przeciw rozpryskom chemikaliów. Unikaj ich wdychania i zawsze dotykaj kwasów pod wyciągiem.
  2. Nasycony octan sodu: Dodaj 228 g bezwodnego octanu sodu do 400 ml wody dejonizowanej w szklanej butelce i mieszaj przez noc w temperaturze pokojowej. Pozwól roztworowi odpocząć i wytrącić się przez jeden dzień. Jeśli nie wystąpi wytrącanie się, kontynuuj dodawanie niewielkich ilości octanu sodu. Roztwór należy przechowywać w szklanej butelce.
  3. Odczynnik chromogenowy: Aby przygotować 1 ml odczynnika chromogenowego, dodać 1 mg soli disodowej kwasu 4,7-difenylo-1,10-fenantrolinowego do 500 μl wody dejonizowanej i 10 μl stężonego (100%) kwasu tioglikolowego i dokładnie rozpuścić. Uzupełnić końcową objętość do objętości 1 ml wodą dejonizowaną.
    UWAGA: Przygotuj tyle odczynnika chromogenowego, ile potrzeba. Roztwór jest stabilny przez 1 miesiąc, gdy jest chroniony przed światłem.
  4. Roboczy odczynnik chromogenowy (WCR): Dodaj 1 objętość odczynnika chromogenowego do 5 objętości nasyconego octanu sodu i 5 objętości wody dejonizowanej.
    UWAGA: Roztwór ten należy przygotować na świeżo w dniu użycia.
  5. Podstawowy roztwór wzorcowy żelaza: Aby przygotować 20 mM podstawowego roztworu żelaza, umieść 111,5 mg proszku karbonylowo-żelazowego w kolbie miarowej o pojemności 250 ml zawierającej 5,480 μl 37% kwasu solnego. Pozostaw do rozpuszczenia na noc w temperaturze pokojowej (lub inkubuj we wrzącej łaźni wodnej). Następnie uzupełnić roztwór do końcowej objętości 100 ml wodą dejonizowaną.
    UWAGA: Roztwór wzorcowy może być przechowywany przez czas nieokreślony, jeśli jest przechowywany w szczelnie zamkniętym naczyniu.
  6. Roboczy roztwór wzorcowy żelaza (WISS): Dodać 13,5 μl 37% kwasu solnego do 500 μl wody dejonizowanej. Dodać 10 μl podstawowego roztworu wzorcowego żelaza i uzupełnić końcową objętość do 1 ml wodą dejonizowaną (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; mierzone za pomocą AAS).
    UWAGA: Roztwór roboczy należy przygotować świeżo w dniu użycia.

2. Suszenie próbki

  1. Wytnij próbkę tkanki o wadze 10-100 mg za pomocą ostrza skalpela. Zważ go dokładnie na wadze analitycznej/precyzyjnej na małym kawałku parafilmu (świeża masa).
  2. Za pomocą plastikowej pęsety umieść kawałek chusteczki na 24-dołkowej płytce (bez pokrywki, aby umożliwić odparowanie wody) i pozostaw do wyschnięcia w standardowym inkubatorze w temperaturze 65 °C przez 48 godzin.
  3. Alternatywnie można użyć laboratoryjnej kuchenki mikrofalowej do wytrawiania próbek tkanek. Za pomocą plastikowej pęsety umieść zważony kawałek chusteczki w teflonowym kubku bez żelazka i wysusz go w kuchence mikrofalowej. Ustaw parametry pracy zgodnie z instrukcją obsługi przyrządu.
    UWAGA: Jako odniesienie, parametry operacyjne suszenia próbek wątroby przy użyciu specjalnego pieca do wytrawiania (patrz tabela materiałów) przedstawiono w tabeli 1.
  4. Za pomocą plastikowej pęsety umieść każdy wysuszony kawałek tkanki na małym kawałku parafilmu wewnątrz wagi analitycznej/precyzyjnej i dokładnie go zważ (sucha masa).

3. Próbka kwaśnego trawienia

  1. Za pomocą plastikowej pęsety przenieś każdy wysuszony kawałek tkanki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodać 1 ml mieszaniny kwasów i zamknąć probówkę mikrowirówki. Przygotuj ślepą próbę kwasową w ten sam sposób, z wyjątkiem tego, że tkanka jest pominięta.
    UWAGA: Mieszanina kwasów jest i uwalnia toksyczne opary. Podczas pracy z mieszaniną kwasów należy nosić odzież ochronną, rękawice odporne na chemikalia i okulary ochronne przed rozpryskami chemikaliów. Unikaj wdychania go i zawsze obchodź się z nim pod wyciągiem.
  3. Trawić tkanki przez inkubację probówek do mikrowirówek w inkubatorze w temperaturze 65 °C przez 20 godzin.
  4. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej przenieść 500 μl klarownego (żółtego) ekstraktu kwasowego (supernatantu) do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety wyposażonej w plastikowe końcówki. Jeżeli nie jest możliwe uzyskanie klarownego supernatantu, należy przeprowadzić krótkie wirowanie wirowania.
    UWAGA: Supernatant jest silnie kwaśny. Podczas pracy z supernatantami należy nosić odzież ochronną, rękawice odporne na chemikalia i okulary ochronne przed rozpryskami substancji chemicznych. Zawsze należy obchodzić się z nimi pod wyciągiem.
    UWAGA: W tym momencie ekstrakty kwasowe można natychmiast użyć do testu kolorymetrycznego lub zamrozić w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Całkowicie rozmrozić zamrożone próbki do temperatury pokojowej i zawirować je przed użyciem.

4. Rozwój kolorów

  1. Przygotować reakcje chromogenowe, jak wskazano w tabeli 2, w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml lub, w celu zwiększenia przepustowości, bezpośrednio do płaskiego, 96-dołkowego, przezroczystego, nieobrobionego mikropłytki polistyrenu. Przygotować wszystkie reakcje (ślepa próba kwasowa, wzorzec i próbka) co najmniej dwukrotnie.
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

5. Odczyt absorbancji

  1. Zmierzyć absorbancję próbki w spektrofotometrze lub czytniku płytek przy długości fali 535 nm w stosunku do wody odniesienia dejonizowanej. Tabliczki można odczytywać bez pokrywy lub z pokrywką. W obudowie z pokrywą usuń kondensację powstałą w wyniku uwolnienia oparów kwasu z pokrywy tuż przed pomiarem, aby uniknąć możliwych zakłóceń w odczycie absorbancji.
    UWAGA: Absorbancja optyczna ślepej próby kwasowej odczytanej w stosunku do wody dejonizowanej (odniesienie) powinna być mniejsza niż 0,015; Absorbancja optyczna wzorca i próbek powinna wynosić od 0,100 do 1,000. W przypadku próbek o bardzo wysokiej lub bardzo niskiej zawartości żelaza może być konieczne dostosowanie objętości ekstraktu kwasowego (supernatantu) i diH2O (tabela 2): jeżeli absorbancja jest większa niż 1,0, należy użyć mniejszej objętości próbki (supernatantu); Gdy absorbancja jest mniejsza niż 0,1, należy użyć większej objętości supernatantu. Objętość próbki (Vsmp) jest brana pod uwagę przy obliczaniu zawartości żelaza w tkankach każdej próbki (zob. krok 6).

6. Obliczanie zawartości żelaza w tkankach

  1. Oblicz zawartość żelaza w tkankach niehemowych za pomocą następującego równania:
    Żelazo tkankowe (μg/g suchej tkanki) = figure-protocol-1
    AT = absorbancja badanej próbki
    AB = absorbancja ślepej próby kwasowej
    AS = absorbancja wzorca
    Fes = stężenie żelaza w WISS (μg Fe/ml)
    W = masa suchej tkanki (g)
    Vsmp = objętość próbki (zmienna objętość supernatantu w tabeli 2 przeliczona na ml)
    Vf = końcowa objętość mieszaniny kwasów po całonocnej inkubacji w temperaturze 65 °C (odpowiadająca objętości kwasu plus objętości suchej tkanki w ml; jeżeli masa próbki nie różni się znacząco, przyjąć stałą objętość ≈ 1 ml)
    Vstd = standardowa objętość żelaza (objętość WISS w tabeli 2 przeliczona na ml)
    Vrv = końcowa objętość reakcyjna (całkowita objętość w tabeli 2 przeliczona na ml)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównanie kuwety z 96-dołkową mikropłytką
Pomiar tkankowego żelaza niehemowego w reakcji z odczynnikiem batofenantroliny pierwotnie opisanym przez Torrance'a i Bothwella5,6 opiera się na użyciu spektrofotometru do odczytu absorbancji. W związku z tym objętości stosowane w reakcji chromogenu są zgodne z rozmiarem zwykłej kuwety spektrofotometru. W niniejszej pracy opisano adaptację metody, w której reakcje chromogenowe są przygotowywane bezpo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, wykorzystujący adaptację testu kolorymetrycznego opartego na batofenantrolinie, pierwotnie opisanego przez Torrance'a i Bothwella 5,6. Krytycznymi etapami metody są suszenie próbki tkanki; denaturacja białek i uwalnianie żelaza nieorganicznego w procesie hydrolizy kwasowej; redukcja żelaza (Fe3+) do stanu żelaza (Fe2+) w obecności czynnika redukującego kwas ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Fundusze Krajowe przez FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., w ramach projektu UIDB/04293/2020.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa przezroczysta płytka UVSarstedt82.1581.001
Waga analitycznaKernABJ 220-4M
Bezwodny octan soduMerck106268
Satofenantroliny sulfonian (kwas dissulfonowy 4,7-difenylo-1,10-fenantroliny)Sigma-AldrichB1375
C57BL/6 myszy (Mus musculus)Charles River Laboratories
Karbonylowy proszek żelaza, ≥ 99.5%Sigma-Aldrich44890
Kuwety jednorazowe z polimetakrylanu metylu (PMMA)VWR634-0678P
Podwójnie destylowana, sterylna wodaB. Braun0082479E
fluorescencyjnychBioTek InstrumentsFLx800
Kwas solny, 37%Sigma-Aldrich258148
Kuchenka mikrofalowa do trawienia i białe kubki teflonoweCEMMDS-2000
Kwas azotowyFisher Scientific15687290
OvenBinderED115
Karma dla gryzoniHarlan Laboratories2014STeklad Global 14% Białko Dieta pielęgnacyjna dla gryzoni zawierająca 175 mg/kg żelaza
Okoń morski (Dicentrarchus labrax)Sonrionansa
Karma dla okonia morskiegoSkrettingL-2 Alterna 1P
Spektrofotometr UV-Vis z pojedynczą wiązkąShimadzuUV mini 1240
Kwas tioglikolowyMerck100700
Kwas trichlorooctowyMerck100807
Czytnik mikropłytek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
  2. Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).
  3. Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
  4. Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).
  5. Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
  6. Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
  7. Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
  8. Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
  9. Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297(2010).
  10. Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
  11. Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
  12. Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zawarto elaza w tkankachmetoda z batofenantrolinmodele przeci enia elazemmodele niedoboru elazatest w mikrop ytcetrawienie kwasoweczytnik p ytekmyszy z nokautem hepcydyny

Powiązane artykuły