Tutaj dostępny jest protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze znanego testu kolorymetrycznego, który można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar zawartości żelaza niehemowego w tkankach za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie batofenantroliny
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Żelazo jest niezbędnym mikroelementem. Zarówno przeciążenie, jak i niedobór żelaza są bardzo szkodliwe dla ludzi, a poziom żelaza w tkankach jest precyzyjnie regulowany. Wykorzystanie eksperymentalnych modeli zwierzęcych przeciążenia lub niedoboru żelaza odegrało zasadniczą rolę w pogłębieniu wiedzy na temat mechanizmów zaangażowanych w ogólnoustrojową i komórkową regulację homeostazy żelaza. Pomiar całkowitego poziomu żelaza w tkankach zwierzęcych jest zwykle wykonywany za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej lub testu kolorymetrycznego opartego na reakcji żelaza niehemowego z odczynnikiem batofenantroliny. Od wielu lat test kolorymetryczny jest stosowany do pomiaru zawartości żelaza niehemowego w szerokim zakresie tkanek zwierzęcych. W przeciwieństwie do atomowej spektroskopii absorpcyjnej wyklucza udział żelaza hemowego pochodzącego z hemoglobiny zawartej w czerwonych krwinkach. Co więcej, nie wymaga wyrafinowanych umiejętności analitycznych ani bardzo drogiego sprzętu, dzięki czemu można go łatwo wdrożyć w większości laboratoriów. Wreszcie, test kolorymetryczny może być oparty na kuwecie lub dostosowany do formatu mikropłytki, co pozwala na większą przepustowość próbki. Niniejsza praca dostarcza dobrze ugruntowanego protokołu, który jest odpowiedni do wykrywania zmian w poziomach żelaza w tkankach w różnych eksperymentalnych modelach zwierzęcych przeciążenia lub niedoboru żelaza.
Wprowadzenie
Żelazo jest niezbędnym mikroelementem, niezbędnym do funkcjonowania białek biorących udział w kluczowych procesach biologicznych, takich jak transport tlenu, produkcja energii czy synteza DNA. Co ważne, zarówno nadmiar, jak i niedobór żelaza są wysoce szkodliwe dla zdrowia człowieka, a poziom żelaza w tkankach jest precyzyjnie regulowany. Nieprawidłowe wchłanianie żelaza w diecie, diety ubogie w żelazo, powtarzające się transfuzje krwi i przewlekłe stany zapalne są częstymi przyczynami zaburzeń związanych z żelazem, które dotykają miliardy ludzi na całym świecie1,2,3.
Eksperymentalne modele zwierzęce przeciążenia lub niedoboru żelaza odegrały zasadniczą rolę w poszerzeniu naszej wiedzy na temat mechanizmów związanych z systemową i komórkową regulacją homeostazy żelaza4. Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w ciągu ostatnich dwóch dekad, wiele kluczowych aspektów pozostaje nieuchwytnych. W nadchodzących latach dokładny pomiar całkowitego poziomu żelaza w tkankach zwierzęcych pozostanie kluczowym krokiem w kierunku postępu badań w dziedzinie biologii żelaza.
Większość laboratoriów określa ilościowo żelazo tkankowe za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej (AAS), spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS), czy też testu kolorymetrycznego opartego na reakcji żelaza niehemowego z odczynnikiem batofenantroliny. Ta ostatnia opiera się na oryginalnej metodzie opisanej przez Torrance'a i Bothwella ponad 50 lat temu5,6. Chociaż wariant tej metody został następnie opracowany z wykorzystaniem ferrozyny jako alternatywy dla bathophenanthroline7, ten ostatni pozostaje najczęściej cytowanym odczynnikiem chromogennym w literaturze.
Wybór metody często zależy od dostępnej wiedzy specjalistycznej i infrastruktury. Podczas gdy AAS i ICP-MS są bardziej czułe, test kolorymetryczny pozostaje szeroko stosowany, ponieważ ma następujące ważne zalety: i) wyklucza udział żelaza hemowego pochodzącego z hemoglobiny zawartej w czerwonych krwinkach; ii) nie wymaga zaawansowanych umiejętności analitycznych ani bardzo drogiego sprzętu; oraz iii) oryginalny test oparty na kuwecie można dostosować do formatu mikropłytki, co pozwala na większą przepustowość próbki. Podejście kolorymetryczne przedstawione w tej pracy jest rutynowo stosowane do ilościowego określania zmian w poziomach żelaza niehemowego w tkankach w różnych eksperymentalnych modelach zwierzęcych przeciążenia lub niedoboru żelaza, od gryzoni po ryby i muszki owocowe. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze ugruntowanego testu kolorymetrycznego, który większość laboratoriów powinna uznać za łatwy do wdrożenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Myszy C57BL/6 zostały zakupione komercyjnie, natomiast myszy z niedoborem hepcydyny (Hamp1−/−) na tle C57BL/68 zostały otrzymane w prezencie od Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francja). Zwierzęta przebywały w zwierzęceniu i3S w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, w środowisku z kontrolowaną temperaturą i oświetleniem, z wolnym dostępem do standardowej karmy dla gryzoni i wody. Bass europejski (Dicentrarchus labrax) został zakupiony z komercyjnej hodowli ryb i przebywał w zwierzęceniu ICBAS, w środowisku z kontrolowaną temperaturą i oświetleniem, będąc karmionym codziennie ad libitum standardową karmą dla bassa. Wszystkie procedury z udziałem kręgowców zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt i3S oraz organ krajowy, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Informacje na temat odczynników komercyjnych, sprzętu i zwierząt znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie roztworów
UWAGA: Wszystkie odczynniki i roztwory należy przygotowywać i przenosić przy użyciu szkła wolnego od żelaza lub jednorazowych wyrobów plastikowych. Ze względu na ryzyko zanieczyszczenia żelazem należy dopilnować, aby metalowe materiały laboratoryjne (np. szpatułki ze stali nierdzewnej) nie miały kontaktu z żadnym odczynnikiem ani roztworem. Należy upewnić się, że każde szkło wielorazowego użytku jest wolne od żelaza. Materiały należy myć odpowiednim detergentem laboratoryjnym przez 30-60 min, płukać wodą dejonizowaną, moczyć przez noc w 37% roztworze kwasu azotowego rozcieńczonym 1:3 wodą dejonizowaną, ponownie płukać wodą dejonizowaną i pozostawić do wyschnięcia.
- Mieszanina kwasów: do szklanej butelki należy dodać 10 g kwasu trichlorooctowego do 82,2 ml 37% kwasu solnego, dokładnie rozpuścić i uzupełnić końcową objętość do 100 ml wodą dejonizowaną. Przed użyciem wstrząśnąć. Alternatywnie, do trawienia tkanek można użyć wyłącznie 37% kwasu solnego.
UWAGA: Roztwór jest stabilny przez co najmniej 2 miesiące, jeśli jest przechowywany w ciemnobrązowych szklanych butelkach na odczynniki.
OSTROŻNIE: Kwas solny i kwas trójchlorooctowy są substancjami żrącymi, a ich stężone formy wydzielają toksyczne opary kwasowe. Podczas pracy z kwasami należy przez cały czas nosić odzież ochronną, rękawice odporne na działanie chemikaliów oraz gogle ochronne przeciwodpryskowe. Należy unikać wdychania oparów i zawsze pracować z kwasami pod wyciągiem (dygestorium). - Nasycony octan sodu: do szklanej butelki z 400 ml wody dejonizowanej dodać 228 g bezwodnego octanu sodu i mieszać przez noc w temperaturze pokojowej. Pozostawić roztwór na dobę w celu ustabilizowania i wytrącenia osadu. Jeśli osad nie powstanie, dodawać niewielkie ilości octanu sodu. Roztwór przechowywać w szklanej butelce.
- Odczynnik chromogenny: Aby przygotować 1 ml odczynnika chromogennego, należy dodać 1 mg soli disodowej kwasu 4,7-difenylo-1,10-fenantrolino-disulfonowego do 500 µL wody dejonizowanej i 10 µL skoncentrowanego (100%) kwasu tioglikolowego i dokładnie rozpuścić. Dopełnić końcową objętość do 1 ml wodą dejonizowaną.
UWAGA: Należy przygotować taką ilość odczynnika chromogennego, jaka jest potrzebna. Roztwór jest stabilny przez 1 miesiąc w warunkach ochrony przed światłem. - Gotowy odczynnik chromogenny (WCR): do 1 objętości odczynnika chromogennego dodać 5 objętości nasyconego octanu sodu oraz 5 objętości wody dejonizowanej.
UWAGA: Roztwór ten należy przygotować na świeżo w dniu użycia. - Roztwór wzorcowy żelaza: Aby przygotować 20 mM roztwór wzorcowy żelaza, należy umieścić 111,5 mg proszku żelaza karbonylowego w kolbie miarowej o pojemności 250 mL zawierającej 5,480 µL 37% kwasu solnego. Pozostawić do rozpuszczenia przez noc w temperaturze pokojowej (lub inkubować w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia). Następnie uzupełnić roztwór dejonizowaną wodą do końcowej objętości 100 ml.
UWAGA: Roztwór wzorcowy może być przechowywany bezterminowo w szczelnie zamkniętym naczyniu. - Roboczy roztwór wzorcowy żelaza (WISS): Dodać 13.5 µL 37% kwasu solnego do 500 µL wody dejonizowanej. Dodać 10 µL roztworu wzorcowego żelaza i uzupełnić końcową objętość do 1 ml wodą dejonizowaną (11.169 µg Fe/ml, 200 µM; zmierzone za pomocą AAS).
UWAGA: Roztwór roboczy należy przygotować na świeżo w dniu użycia.
2. Suszenie próbki
- Za pomocą ostrza skalpela odciąć próbkę tkanki o masie 10-100 mg. Zważyć ją dokładnie na wadze analitycznej/precyzyjnej na małym kawałku parafilmu (Masa Świeża).
- Używając plastikowej pęsety, umieścić fragment tkanki w płytce 24-dołkowej (bez przykrycia, aby umożliwić odparowanie wody) i pozostawić do wyschnięcia w standardowym inkubatorze w temperaturze 65 °C przez 48 h.
- Alternatywnie można zastosować laboratoryjny mikrofalowy system mineralizacji do suszenia próbek tkanek. Używając plastikowej pęsety, umieścić zważony fragment tkanki w naczyniu teflonowym wolnym od żelaza i wysuszyć w mikrofalówce. Parametry pracy ustawić zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia.
UWAGA: Jako punkt odniesienia, w Tabeli 1 przedstawiono parametry pracy dla suszenia próbek wątroby przy użyciu konkretnego urządzenia do mineralizacji (patrz Tabela Materiałów). - Używając plastikowej pęsety, umieścić każdy wysuszony fragment tkanki na małym kawałku parafilmu na wadze analitycznej/precyzyjnej i zważyć go dokładnie (Masa Sucha).
3. Kwaśne trawienie próbek
- Za pomocą plastikowej pęsety przenieść każdy wysuszony fragment tkanki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
- Dodać 1 mL mieszaniny kwasów i zamknąć probówkę do mikrocentryfugi. W ten sam sposób przygotować próbę ślepą z kwasem, z pominięciem tkanki.
UWAGA: Mieszanina kwasów jest żrąca i wydziela toksyczne opary. Podczas pracy z mieszaniną kwasów należy stosować odzież ochronną, rękawice odporne na działanie chemikaliów oraz gogle ochronne. Unikać wdychania oparów i zawsze pracować pod wyciągiem. - Przeprowadzić trawienie tkanek poprzez inkubację probówek do mikrocentryfugi w inkubatorze w temperaturze 65 °C przez 20 h.
- Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej przenieść 500 µL klarownego (żółtego) ekstraktu kwasowego (nadanidu) do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, używając mikropipety z plastikowymi końcówkami. Jeśli nie udaje się uzyskać klarownego nadanidu, przeprowadzić krótkie wirowanie.
UWAGA: Nadanid jest silnie kwasowy. Podczas pracy z nadanidami należy stosować odzież ochronną, rękawice odporne na działanie chemikaliów oraz gogle ochronne. Zawsze pracować pod wyciągiem.
UWAGA: Na tym etapie ekstrakty kwasowe można bezpośrednio wykorzystać do analizy kolorymetrycznej lub zamrozić w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. Przed użyciem zamrożone próbki należy całkowicie rozmrozić do temperatury pokojowej i wymieszać w wortexie.
4. Rozwój barwy
- Przygotować reakcje chromogenne zgodnie z treścią Tabeli 2 w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL lub, w przypadku większej przepustowości, bezpośrednio w przezroczystych, niepowlekanych polistyrenowych mikropłytkach 96-dołkowych o płaskim dnie. Wszystkie reakcje (próba ślepa kwasowa, wzorzec i próbka) należy przygotować co najmniej w dwóch powtórzeniach.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
5. Pomiar absorbancji
- Zmierz absorbancję próbki w spektrofotometrze lub czytniku płytek przy długości fali 535 nm względem referencji z wody dejonizowanej. Płytki można odczytywać bez przykrywek lub z przykrywkami. W przypadku użycia przykrywek, bezpośrednio przed pomiarem usuń wszelką kondensację powstałą w wyniku wydzielania oparów kwasu z pokrywki, aby uniknąć możliwych zakłóceń odczytu absorbancji.
UWAGA: Absorbancja optyczna próbki ślepej kwasowej odczytana względem wody dejonizowanej (referencji) powinna być mniejsza niż 0,015; absorbancja optyczna standardu i próbek powinna mieścić się w zakresie od 0,100 do 1,000. W przypadku próbek o bardzo wysokiej lub bardzo niskiej zawartości żelaza, może być konieczna korekta objętości ekstraktu kwasowego (naduosadu) oraz diH2O (Tabela 2): jeśli absorbancja jest większa niż 1,0, należy użyć mniejszej objętości próbki (naduosadu); gdy absorbancja jest niższa niż 0,1, należy użyć większej objętości nadosadu. Objętość próbki (Vsmp) jest uwzględniana podczas obliczania zawartości żelaza w tkance dla każdej próbki (patrz krok 6).
6. Obliczanie zawartości żelaza w tkance
- Oblicz zawartość żelaza niehemowego w tkance za pomocą następującego równania:
Żelazo w tkance (µg/g suchej tkanki) =
AT = absorbancja próbki badawczej
AB = absorbancja ślepej próby kwasowej
AS = absorbancja standardu
Fes = stężenie żelaza w WISS (µg Fe/mL)
W = masa suchej tkanki (g)
Vsmp = objętość próbki (zmienna objętość supernatantu z Tabeli 2 przeliczona na mL)
Vf = objętość końcowa mieszaniny kwasowej po inkubacji przez noc w 65 °C (odpowiada objętości kwasu plus objętości suchej tkanki w mL; jeśli masy próbek nie różnią się znacząco, przyjmij stałą objętość ≈ 1 mL)
Vstd = objętość standardu żelaza (objętość WISS z Tabeli 2 przeliczona na mL)
Vrv = końcowa objętość reakcji (objętość całkowita z Tabeli 2 przeliczona na mL)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Porównanie kuwety z mikropłytką 96-dołkową
Pomiar niehemowego żelaza w tkankach za pomocą reakcji z odczynnikiem batofenantrolinowym, pierwotnie opisanym przez Torrance'a i Bothwella5,6, opiera się na wykorzystaniu spektrofotometru do odczytu absorbancji. W związku z tym objętości stosowane w reakcji chromogennej są dostosowane do rozmiaru standardowej kuwety spektrofotometrycznej. Niniejsza praca opisuje adaptację metody, w której reakcje ch...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiono protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, wykorzystujący adaptację testu kolorymetrycznego opartego na batofenantrolinie, pierwotnie opisanego przez Torrance'a i Bothwella 5,6. Krytycznymi etapami metody są suszenie próbki tkanki; denaturacja białek i uwalnianie żelaza nieorganicznego w procesie hydrolizy kwasowej; redukcja żelaza (Fe3+) do stanu żelaza (Fe2+) w obecności czynnika redukującego kwas ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Fundusze Krajowe przez FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., w ramach projektu UIDB/04293/2020.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96-dołkowa przezroczysta płytka UV | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Waga analityczna | Kern | ABJ 220-4M | |
| Bezwodny octan sodu | Merck | 106268 | |
| Satofenantroliny sulfonian (kwas dissulfonowy 4,7-difenylo-1,10-fenantroliny) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 myszy (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Karbonylowy proszek żelaza, ≥ 99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Kuwety jednorazowe z polimetakrylanu metylu (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Podwójnie destylowana, sterylna woda | B. Braun | 0082479E | |
| fluorescencyjnych | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Kwas solny, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Kuchenka mikrofalowa do trawienia i białe kubki teflonowe | CEM | MDS-2000 | |
| Kwas azotowy | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Karma dla gryzoni | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Białko Dieta pielęgnacyjna dla gryzoni zawierająca 175 mg/kg żelaza |
| Okoń morski (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Karma dla okonia morskiego | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Spektrofotometr UV-Vis z pojedynczą wiązką | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Kwas tioglikolowy | Merck | 100700 | |
| Kwas trichlorooctowy | Merck | 100807 |
Bibliografia
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297(2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
