Artykuł metodologiczny

Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

DOI:

10.3791/63470

⸱

1 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phormidium lacuna to nitkowata cyjanobakteria, która została wyizolowana z morskich basenów skalnych. W artykule opisano izolację włókien ze źródeł naturalnych, ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie genomu, naturalną transformację, ekspresję sfGFP, kriokonserwację i metody ruchliwości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyjanobakterie są przedmiotem badań podstawowych i projektów biotechnologicznych, w których energia słoneczna jest wykorzystywana do produkcji biomasy. Phormidium lacuna to nowo wyizolowana nitkowata sinica. W artykule opisano, w jaki sposób można wyizolować nowe nitkowate sinice z morskich basenów skalnych. Opisano również, w jaki sposób DNA można ekstrahować z włókien i jak można sekwencjonować genomy. Chociaż transformacja jest ustalona dla wielu gatunków jednokomórkowych, rzadziej zgłasza się ją w przypadku sinic nitkowatych. Uproszczona metoda naturalnej przemiany P. lacuna jest opisana tutaj. P. lacuna jest jedynym członkiem rzędu Oscillatoriales, dla którego ustanowiono naturalną transformację. W artykule pokazano również, w jaki sposób naturalna transformacja jest wykorzystywana do ekspresji białka zielonej fluorescencji superfolderu (sfGFP). Endogenny promotor cpcB indukował około 5 razy silniejszą ekspresję niż promotory cpc560, A2813 lub psbA2 z Synechocystis sp. PCC6803. Ponadto ustalono metodę kriokonserwacji P. lacuna i Synechocystis sp. CPP 6803 oraz opisano metody oceny ruchliwości w pożywce ciekłej oraz na powierzchniach agarowych i plastikowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyjanobakterie to organizmy prokariotyczne, które wykorzystują fotosyntezę jako źródło energii1,2. Badania coraz częściej koncentrują się na gatunkach sinic. Kilka cyjanobakterii może zostać przekształconych za pomocą DNA3. Geny mogą być znokautowane lub nadmiernie eksprymowane u tych gatunków. Transformacja jest jednak ograniczona do kilku gatunków4,5,6,7,8,9,10,11, a ustalenie transformacji w szczepach z kolekcji kultur lub dzikich może być trudne8. Szczepy nitkowatego gatunku Phormidium lacuna (Ryc. 1) wyizolowano z morskich basenów skalnych, w których warunki środowiskowe, takie jak stężenie soli lub temperatura, zmieniają się w czasie. Te nitkowate cyjanobakterie mogą być używane jako organizmy modelowe dla rzędu Oscillatoriales12, do którego należą.

Podczas prób testowania transferu genów za pomocą elektroporacji13,14 stwierdzono, że P. lacuna może zostać przekształcony przez naturalną transformację15. W tym procesie DNA jest naturalnie pobierane przez niektóre komórki. W porównaniu z innymi metodami transformacji16,17, naturalna transformacja ma tę zaletę, że nie wymaga dodatkowych narzędzi, które mogłyby skomplikować procedurę. Na przykład elektroporacja wymaga odpowiednich kuwet, nienaruszonych przewodów i doboru odpowiedniego napięcia. P. lacuna jest obecnie jedynym członkiem oscylatoryjnym podatnym na naturalną transformację. Ponieważ oryginalny protokół opiera się na protokołach elektroporacji, nadal zawierał kilka etapów mycia, które mogą być niepotrzebne. Przetestowano różne podejścia w celu uproszczenia protokołu, co doprowadziło do powstania przedstawionego tutaj protokołu transformacji.

Sekwencja genomu jest niezbędna do dalszych badań molekularnych opartych na nokaucie lub nadekspresji genów. Chociaż sekwencje genomu można uzyskać za pomocą maszyn do sekwencjonowania nowej generacji w krótkim czasie, ekstrakcja DNA może być trudna i zależy od gatunku. W przypadku P. lacuna przetestowano kilka protokołów. Następnie ustalono zmodyfikowaną metodę opartą na bromku cetylu trimetyloamoniowym (CTAB), która pozwoliła uzyskać akceptowalną czystość DNA i wydajność DNA w każdym cyklu oczyszczania do kontynuowania prac w laboratorium. Genom pięciu szczepów można zsekwencjonować za pomocą tego protokołu. Kolejnym krokiem transformacji logicznej było ustalenie ekspresji białka u P. lacuna.

SfGFP używany jako białko markerowe w tym protokole może być wykryty za pomocą dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego. Wszystkie testowane promotory można było wykorzystać do ekspresji P. lacuna sfGFP. Rosnąca liczba szczepów powstałych w wyniku transformacji spowodowała potrzebę opracowania metody przechowywania kultur. Takie metody są stosowane dla Escherichia coli i wielu innych bakterii18. W standardowych protokołach kultury glicerolu są przygotowywane, przenoszone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C. Ta metoda wymaga tylko kilku kroków i jest wysoce niezawodna dla tych gatunków, dla których została ustalona. Standardowy protokół nie był wykonalny w przypadku P. lacuna, ponieważ nie we wszystkich przypadkach można było odzyskać żywe komórki. Jednak gdy glicerol został usunięty po rozmrożeniu, komórki wszystkich prób przeżyły. Przedstawiono proste metody analizy ruchliwości P. lacuna, które można połączyć z mutagenezą nokautową w celu zbadania pilusów typu IV lub roli fotoreceptorów. Testy te różnią się od testów jednokomórkowych sinic19,20,21 i mogą być również przydatne dla innych oscylatoriów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja od środowiska naturalnego

UWAGA: Zielone algi, okrzemki, nitkowate sinice i inne mikroalgi mogą być izolowane. Protokół może być stosowany do dowolnych gatunków mikroglonów z basenów skalnych rosnących w warunkach laboratoryjnych. Sinice nitkowate, które należą do oscylatoriów, można łatwo rozpoznać po ich ruchu i nitkowatym kształcie. Gatunek można zidentyfikować w stanie półczystym przez sekwencjonowanie genomu lub sekwencjonowanie 16S rRNA.

  1. Przenieść próbki ciekłej wody morskiej z morskich basenów skalnych (tj. jam na skalistym wybrzeżu) do kolb o pojemności 50 ml. Dla każdej kolby należy zanotować dokładne miejsce lub współrzędne źródła naturalnego. Jeśli to możliwe, przefiltruj zawartość przez sieci 50 μm, aby zmniejszyć ilość zooplanktonu. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie można je poddać hodowli.
  2. Przenieś 1 ml kultur na 10 cm szalki Petriego zawierające 3% bakto-agaru w f/2 medium22,23 (patrz Tabela materiałów). Przygotuj do 20 talerzy. Uprawiać w białym świetle 50 μmol m-2 s-1,
    UWAGA: Do uprawy można stosować większe natężenia światła. Intensywność do 400 μmol m-2 s-1 może być stosowana w przypadku P. lacuna, chociaż inne gatunki mogą być bardziej wrażliwe na światło.
  3. Po tygodniu przenieś pożądane komórki na świeże płytki agarowe za pomocą sterylnych kleszczy. Izoluj komórki pod mikroskopem dwuokularowym w sterylnych warunkach. Przechowywać starą płytkę agarową w temperaturze 4 °C do momentu pojawienia się komórek i wzrostu na nowej płytce agarowej.
  4. Powtarzaj ten krok przenoszenia co tydzień, aby wyeliminować zanieczyszczenie. Użyj gołego oka do wykrywania silnych zanieczyszczeń i mikroskopu z 400-krotnym powiększeniem do dodatkowych kontroli zanieczyszczeń.
  5. Jeśli próbka wydaje się wolna od zanieczyszczeń, należy przeprowadzić test na obecność bakterii lub grzybów na płytkach agarowych. Przenieś frakcję kultury za pomocą pętli inokulacyjnej na płytkę agarową LB24 (średnica 10 cm), utrzymuj płytkę w temperaturze pokojowej i sprawdzaj, czy nie ma wzrostu zanieczyszczeń przez 1-3 dni.
  6. W przypadku uzyskania sterylnego nitkowatego gatunku sinicy należy go użyć do dalszych prac hodowlanych. Uprawiaj P. lacuna w płynie lub na płytkach bakto-agarowych. Użyj kolb o pojemności 250 ml z 50 ml pożywki f/2 lub pożywki f/2+ do płynnej hodowli.

2. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Ta metoda została zaadoptowana z 25 26

  1. Przygotować dwie kolby z 50 ml pożywki f/2. Zaszczep każdy z nich ~1 ml włókien P. lacuna z innych kultur uprawowych. Przechowywać kultury przez 7 dni lub dłużej w mieszaniu (rotacja pozioma) przy 50 obr./min w świetle białym (50 μmol m-2 s-1) w temperaturze 25 °C.
  2. Poddaj hodowlę ultradźwiękom (patrz tabela materiałów) przez 2 minuty z pełną energią. Zmierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali 750 nm; Sprawdź, czy wynosi ~0,5. Kontynuuj uprawę kultur, jeśli OD jest zbyt niski.
  3. Zebrać włókna przez 5 000 × g, odwirować 20 minut. Usunąć supernatant. Przenieś filamenty z resztkami cieczy do komory French Press27. Ustaw ciśnienie prasy francuskiej na 20 000 psi i wyodrębnij komórki.
    UWAGA: Francuska prasa podda się lizie wszystkich komórek i uwolni DNA; silne siły ścinające wytworzą fragmenty DNA o długości 1500 pz.
  4. Odwirować próbkę przez 10 minut przy masie 10 000 × g i usunąć sklarowany nad osadem.
  5. Dodać 400 μl buforu do lizy (4 M mocznik, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) i 50 μl proteinazy K (10 mg/ml) do osadu. Podgrzewać próbkę do temperatury 55 °C przez 60 minut, wytrząsając przy 550 obr./min.
  6. Dodać 1 ml buforu do ekstrakcji DNA (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% sarkozylu, 0,1 M DTT, pH 8) i inkubować przez 60 minut w temperaturze 55 °C i 550 obr./min. Przenieść roztwory do probówek wirówkowych i dodać dwie objętości chloroformu/alkoholu izoamylowego (24/1).
  7. Po wstrząśnięciu odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 9 000 × g. Przenieść górną, wodną fazę do fiolek reakcyjnych i dodać 1 ml lodowatego etanolu i 50 μl 3 M octanu sodu.
  8. Wstrząsnąć próbkę i umieścić ją w temperaturze -20 °C na 1 godzinę lub dłużej.
  9. Wirować przez 5 minut w temperaturze 10 000 × g (4 °C) i odrzucić supernatant. Umyj granulat 70% etanolem.
  10. Ponownie odwirować próbkę. Usunąć supernatant i wysuszyć osad przez noc. Rozpuść DNA w wodzie wolnej od nukleaz. Zmierz widmo DNA, aby sprawdzić, czy OD 260 nm/OD 280 nm mieści się w przedziale od 1,6 do 1,9.
  11. Przeanalizuj rozmiar DNA w żelu do elektroforezy agarozowej28.
  12. Sekwencjonowanie genomowego DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji przez 300 cykli, z ustawieniem sparowanych końców i długością odczytu 150 zasad (patrz Tabele materiałów).
  13. Wykonać montaż za pomocą odpowiedniego programu komputerowego; patrz przykład podany w Tabeli Materiałów.
  14. Prześlij szkic genomu na serwer RAST w celu adnotacji.
    UWAGA: Prześlij sekwencje DNA, aby uzyskać pełną adnotację w ciągu kilku minut.

3. Naturalna transformacja i wyrażenie GFP

UWAGA: Transformacja opiera się na wektorze plazmidowym rozchodzącym się w E. coli; pGEM-T lub pUC19 mogą być używane jako wektory szkieletowe. Techniki klonowania są znane w wielu laboratoriach; zobacz także standardowe protokoły28 oraz artykuły o wektorach transformacji dla P. lacuna15,29. Przykłady wektorów dla wyrażenia sfGFP są opisane w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych. Szczegółowe informacje na temat czterech jeszcze nieopublikowanych wektorów znajdują się w Pliku Uzupełniającym 1.

  1. Wszystkie kroki należy wykonywać przy użyciu sterylnego materiału w sterylnych warunkach laboratoryjnych (czysta ławka, sterylne szkło).
  2. Zaszczepić 2 x 50 ml płynnej pożywki f/2 w dwóch kolbach o pojemności 250 ml z 2 x 1 ml włókien P. lacuna z działającej hodowli. Uprawiać w świetle białym (50 μmol m-2 s-1) pod mieszaniem (obrót poziomy, 50 obr./min) przez ~5 dni w temperaturze 25 °C.
  3. Przygotuj ~200 μg wektora transformacji DNA za pomocą zestawu do przygotowania midi (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Homogenizować 100 ml zawiesiny komórek P. lacuna (patrz tabela materiałów) przy 10 000 obr./min przez 3 minuty. Zmierzyć OD przy 750 nm (pożądana wartość = 0,35).
  5. Odwirować zawiesinę komórkową przez 15 minut w stężeniu 6 000 × g. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 800 μl (całkowita objętość łącznie z pozostałą cieczą i włóknami) pozostałej cieczy i dodatkowego podłoża f/2+.
  6. Weź osiem płytek bacto-agar f/2+ (o średnicy 10 cm) zawierających 120 μg/ml kanamycyny. Odpipetować 10 μg DNA na środek każdej płytki agarowej. Natychmiast odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do środka każdej płytki agarowej (na wierzchu DNA).
  7. Trzymaj płytkę agarową bez pokrywki na czystej ławce, aby nadmiar płynu odparował. Zamknij płytkę i uprawiaj ją w białym świetle w temperaturze 25 °C przez 2 dni.
  8. Rozprowadzić filamenty każdej płytki agarowej z pętlą inokulacyjną na kilku świeżych płytkach bakto-agarowych f/2+ zawierających 120 μg/ml kanamycyny. Hodować płytki w białym świetle w temperaturze 25 °C i regularnie sprawdzać kultury pod mikroskopem.
  9. Zidentyfikuj żywe, przekształcone włókna po 7-28 dniach pod mikroskopem. Szukaj zdrowych, zielonych filamentów (Rysunek 2), które różnią się od innych filamentów. Jeśli te zielone włókna można zidentyfikować, przejdź do następnego kroku; W przeciwnym razie zachowaj talerz przez kolejne 7 dni.
  10. Użyj kleszczy, aby przenieść te zidentyfikowane żywe włókna do 50 ml płynnej pożywki f/2+ z 250 μg/ml kanamycyny. Uprawiać w białym świetle w temperaturze 25 °C na wytrząsarce (obrót poziomy, 50 obr./min). Obserwuj wzrost przez okres do czterech tygodni.
  11. Przenieś filamenty z powrotem do podłoża agarowego zawierającego 250 μg/ml kanamycyny i poczekaj, aż włókna wyrosną. Po kilku dniach przenieś pojedyncze filamenty na świeżą płytkę agarową o wyższym stężeniu kanamycyny, np. 500 μg/ml. Zachowaj oryginalną tabliczkę.
  12. Upewnij się, że włókna rozmnażają się w wysokim stężeniu kanamycyny w płynnej kulturze lub na agarze . Ponownie zwiększ stężenie kanamycyny, aby przyspieszyć segregację.
    UWAGA: Przekształcony P. lacuna rośnie w ilości do 10 000 μg/ml kanamycyny. Inne gatunki mogą nie tolerować tak wysokich stężeń.
  13. Jeśli oporne komórki są hodowane i szeroko rozmieszczone na płytce, przetestuj integrację wstawki z genomem P. lacuna, wykonując PCR z zewnętrznymi i wewnętrznymi starterami.
    1. Użyj starterów, które zostały zaprojektowane do klonowania insercji jako starterów wewnętrznych.
    2. Do zaprojektowania zewnętrznych starterów należy wybrać sekwencje, które znajdują się w odległości 5' i 3' od proponowanego miejsca insercji w genomie P. lacuna, ale poza insercją.
    3. W przypadku reakcji PCR należy używać starterów wewnętrznych i starterów zewnętrznych. Używaj odmian odpornych i typu dzikiego.
      UWAGA: Wewnętrzne podkłady wskazują, że wkładka jest obecna; Zewnętrzne startery pokazują, że wkładka została wprowadzona we właściwym miejscu.
  14. Dla każdej reakcji PCR umieść ~10 mg filamentów bezpośrednio w probówkach PCR i wykonaj PCR zgodnie ze standardowymi protokołami24. Jeśli nie zostanie uzyskany żaden produkt, zmień temperaturę wyżarzania i umyj włókna wodą.
    UWAGA: W PCR można stosować wiele różnych polimeraz. Standardowe polimerazy, takie jak polimeraza Taq, mają wyższy wskaźnik błędów niż polimerazy sprawdzające błędy, które są droższe. Ten analityczny PCR nie wymaga żadnej polimerazy sprawdzającej błędy. Należy jednak przeprowadzić test na polimerazę sprawdzającą błędy, jeśli nie otrzymano produktu PCR przy użyciu standardowej polimerazy.
  15. Przeanalizuj produkty PCR linii opornej na elektroforezie agarozowej24.
    1. Porównaj pozycje pasma ze znacznikiem i porównaj typ dziki i transformant. W przypadku wewnętrznych i zewnętrznych starterów poszukaj większego pasma dla transformantu niż typ dziki (ze względu na włożenie kasety rezystancyjnej) lub dwóch pasm dla transformantu: jednego o wielkości pasma typu dzikiego i jednego większego. Ponieważ ten ostatni przypadek wskazuje na niepełną segregację, kontynuuj uprawę z wysokimi stężeniami kanamycyny.
      UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat PCR i elektroforezy, zobacz15,24 lub inną standardową literaturę.
  16. W celu wyrażenia GFP: obserwuj pojedyncze włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów) przy powiększeniu obiektywu ustawionego na 40x lub 63x. Uchwyć obraz transmisyjny w jasnym polu i obraz fluorescencyjny. Użyj następujących ustawień dla GFP: pasmo przepustowe 470 nm dla wzbudzenia, pasmo przepustowe 525 nm dla emisji i rozdzielacz wiązki 495 nm, początkowy czas ekspozycji 500 ms.
  17. Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać wyraźne sygnały fluorescencji, unikając intensywności nasycenia. Spróbuj użyć tego samego ustawienia dla wszystkich próbek.
  18. Ponieważ filamenty typu dzikiego będą również wykazywać fluorescencję, rób obrazy z tymi samymi ustawieniami, co powyżej dla tej fluorescencji tła.
    UWAGA: Szczep wyrażający GFP musi mieć wyższy sygnał; w przeciwnym razie nie wyraża GFP.
  19. Na podstawie czasów naświetlania i intensywności pikseli obrazów fluorescencyjnych oblicz i porównaj zawartość GFP w różnych włóknach.

4. Kriokonserwacja

UWAGA: P. lacuna i jednokomórkowa sinica Synechocystis sp. Zastosowano PCC 6803. Obecna metoda działa lepiej w przypadku P. lacuna.

  1. Uprawiać P. lacuna lub Synechocystissp PCC 6803 przez co najmniej 10 dni w 10 ml odpowiednio pożywki f/2+ lub BG-11 w świetle białym (50 μmol m-2 s-1) w temperaturze 25 °C pod mieszaniem (obrót poziomy, 50 obr./min).
  2. Homogenizować kulturę P. lacuna (patrz tabela materiałów) przy 10 000 obr./min przez 3 minuty lub za pomocą urządzenia ultradźwiękowego (patrz tabela materiałów) przez 2 minuty przy pełnej energii. Określić OD 750 nm dowolnej hodowli, aby sprawdzić, czy wartość mieści się w przedziale od 1 do 7.
  3. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 6 000 × g przez 15 minut. Usunąć supernatant.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 800 μl pożywki f/2+ lub BG-11 (objętość końcowa) i przenieść do kriowialu o pojemności 2 ml. Dodać 800 μl 50% roztworu glicerolu do zawiesiny komórek. Zamknąć fiolkę i wymieszać, wielokrotnie odwracając do góry nogami.
  5. Przenieś kriowial do ciekłego azotu i przechowuj go w krioboxie w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Zanotuj położenie pudełka w zamrażarce i współrzędne próbki w pudełku.
  6. W celu odzyskania komórek wyjmij kriowial i rozmroź zawartość w temperaturze pokojowej. Przenieść zawartość do probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml.
  7. Umyć próbkę dwukrotnie. W przypadku 1. prania odwirować przy 6 000 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml pożywki f/2+ lub BG-11. W przypadku drugiego płukania odwirować przy 6 000 × g przez 5 minut, usunąć supernatant i zawiesić osad w 2 ml pożywki f/2+ lub BG-11.
  8. Aby sprawdzić integralność tych komórek, które są gotowe do hodowli, przenieś osad do 9 ml pożywki i hoduj je w białym świetle (50 μmol m-2 s-1) pod mieszaniem (55 obr./min). Porównaj OD 750 nm kultury pierwszego dnia i po 1 tygodniu.

5. Ruchliwość Phormidium lacuna

UWAGA: Opisane zostaną trzy różne testy. We wszystkich przypadkach stosowana jest ta sama kultura.

  1. Uprawiaj P. lacuna w podłożu f/2 pod mieszaniem poziomym (50 obr./min) w białym świetle (50 μmol m-2 s-1) przez ~5 dni, aż szacowany OD 750 nm wyniesie 0,35. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  2. Homogenizować włókna (patrz Tabela Materiałów) przy 10 000 obr./min przez 3 minuty lub za pomocą ultradźwięków (patrz Tabela Materiałów) przez 1 minutę przy maksymalnej mocy i cyklu 1. Zmierzyć średnicę zewnętrzną 750 nm. Jeśli powyżej 0,35, rozcieńczyć frakcję pożywką f/2. Użyj tego rozwiązania w testach ruchliwości w krokach 5.3, 5.4 i 5.5.
  3. Test na przemieszczanie się w ciekłym podłożu
    1. W celu bezpośredniej obserwacji ruchliwości przenieść 8 ml pożywki zawierającej P. lacuna (z kroku 5.2) na 6-centymetrową szalkę Petriego. Odczekać kilka minut, aż próbka osiągnie temperaturę pokojową. Przykryj szalkę Petriego folią celofanową.
    2. Umieść szkiełko mikroskopowe na stole x-y standardowego mikroskopu z kamerą. Włącz światło mikroskopu. Najlepiej zawsze używać tych samych ustawień elektrycznych i optycznych dla oświetlenia. Przesuń obiektyw 4x lub 10x na ścieżkę światła.
    3. Umieść szalkę Petriego na szkiełku. Dostosuj pojedyncze filamenty lub wiązki filamentów za pomocą ruchów x, y i z tabeli.
      UWAGA: Ze względu na układ trójwymiarowy tylko część odpowiedniej sekcji może być ostra. Folia celofanowa umożliwia regulację ostrości bez ograniczeń.
    4. Obserwuj ruchy pojedynczych włókien lub wiązek. Upewnij się, że soczewka obiektywu nie dotyka cieczy. Rejestruj ruchy włókien za pomocą standardowej kamery mikroskopowej (patrz Dodatkowy film S1).
  4. Test ruchu na powierzchni
    1. W celu obserwacji ruchliwości włókien na powierzchniach agaru należy przygotować 6 cm szalki Petriego z bakto-agarem f/2. Upewnij się, że agar jest wystarczająco wysoki, aby soczewka obiektywu zbliżyła się do powierzchni agaru. Alternatywnie, przygotuj warstwę agaru o grubości ~3 mm i zapisz włókna przez agar (trzymaj płytkę do góry nogami lub użyj odwróconego mikroskopu).
    2. Odmierzyć pipetą 0,5 ml roztworu zawierającego P. lacuna (z kroku 5.2) na powierzchni baktoagaru na 6 cm szalce Petriego. Pozwól, aby płyn dostał się na powierzchnię. Zamknij szalkę Petriego i obserwuj ruch włókien na powierzchni za pomocą obiektywu 4x lub 10x.
    3. Upewnij się, że te same ustawienia elektryczne i optyczne mikroskopu są używane podczas całego nagrania i w kolejnych nagraniach.
    4. Rejestruj nagrania poklatkowe za pomocą kamery okularowej i systemu minikomputerowego. Upewnij się, że odstęp czasu między kolejnymi obrazami wynosi 5 s-1 min. Zaprogramuj skrypt Linux minikomputera, aby sterować nagrywaniem poklatkowym. Zobacz Plik uzupełniający 2, aby zapoznać się z przykładowym skryptem i Dodatkowy film S2 jako przykład.
  5. Test do fototaksji
    1. Do eksperymentów fototaksyjnych przygotuj oprawki na diody elektroluminescencyjne (LED) (tutaj z drukarką 3D), w których zamontowane są wybrane diody LED o średnicy 5 mmw celu naświetlania obszaru 20 mm 2 od dołu do góry (Rysunek 3). W razie potrzeby użyj wielu oprawek LED równolegle, łącząc każdą diodę LED elektrycznie za pomocą rezystora i potencjometru z regulowanym zasilaczem. Zmierz i dostosuj intensywność diod LED w zależności od eksperymentu. Upewnij się, że całe ustawienie odbywa się w ciemnym pomieszczeniu lub zamkniętym ciemnym pojemniku.
    2. Umieścić 8 ml pożywki zawierającej P. lacuna (z kroku 5.2) na 6-centymetrowej szalce Petriego. Dostosuj natężenie światła diody LED. Zamknij szalkę Petriego pokrywką i umieść ją na uchwycie LED tak, aby dioda LED znajdowała się na środku szalki Petriego.
    3. Po upływie pożądanego czasu (zwykle 2 dni) uchwyć obraz szalki Petriego za pomocą kamery smartfona skierowanej bezpośrednio na pozycję leczenia światłem. Do naświetlania próbki należy użyć białego panelu LED. Skorzystaj z ręcznych ustawień aparatu; unikać odbić światła; Zawsze dostosowuj, aby uzyskać taką samą odległość między obiektywem aparatu a próbką. Upewnij się, że ustawienia ekspozycji dają obraz odpowiedni do późniejszych analiz przy użyciu ImageJ.
    4. Określ ilościowo średnicę środkowego okręgu włókien za pomocą oprogramowania ImageJ.
      1. Otwórz ImageJ, kliknij Plik | Otwórz, wybierz żądany plik i kliknij Enter.
      2. Wybierz przycisk Prosty (z linią prostą). Naciśnij lewy przycisk myszy, aby narysować linię od jednego końca szalki Petriego do przeciwległego końca. Upewnij się, że linia przechodzi przez środek okręgu włókien.
      3. Naciśnij Ctrl-K na klawiaturze lub kliknij pozycję Analizuj | Profil wydruku w menu ImageJ. Poszukaj okna x-y z intensywnością pikseli wykreśloną w funkcji odległości - profilu 1D szalki Petriego. Upewnij się, że najniższa intensywność pikseli jest nieco powyżej 0, a najwyższa poniżej 255.
      4. Oszacuj średnią wartość intensywności pikseli poza okręgiem i inną średnią wartość intensywności pikseli w okręgu. W pozycji y między tymi wartościami oszacuj wartości x po obu stronach okręgu, wskazując myszą te pozycje. Zanotuj obie wartości i oblicz różnicę.
      5. Uzyskaj najwyższą wartość x, wskazując myszą oś y po prawej stronie. Zauważ, że ta wartość e reprezentuje średnicę szalki Petriego. Jeśli średnica ta wynosi 5 cm, oblicz średnicę środkowego okręgu żarnika jako d/e × 5 cm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z wyżej wymienionymi metodami, 5 różnych szczepów P. lacuna zostało wyizolowanych z basenów skalnych i zsekwencjonowanych (Rysunek 1 i Tabela 1). Wszystkie kultury były sterylne po ~1 roku subkulturacji, z wyjątkiem P. lacuna HE10JO. Szczep ten jest nadal skażony Marivirga atlantica, bakterią morską. Podczas kolejnych wypraw do Helgolandu z basenów skalnych wyizolowano inne nitkowate sinice, które różnią się od P. lacuna i wymagają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż wiele szczepów sinic jest dostępnych w kolekcjach kultur 32,33,34,35,36, nadal istnieje zapotrzebowanie na nowe cyjanobakterie ze środowiska naturalnego, ponieważ gatunki te są przystosowane do określonych właściwości. P. lacuna został zebrany z basenów skalnych i jest przystosowany do zmian stężenia soli i temperatury30

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace były wspierane przez Karlsruher Institute of Technology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Pożywka hodowlana

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Autoklaw 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Roztwór słodkowodnySigma AldrichC3061
BG-11 średniMerck73816-250ML
Kwas borowyMerck10043-35-3H3BO3
Chlorek wapnia dwuwodnyCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Kolby do hodowli komórkowych Cellstar z filtrem nakrętka, sterylne, 250 mLGreiner658190
Kolby do hodowli komórkowych Cellstar z zakrętką filtra, sterylne, 50 mLWirówka do601975
LYNX 4000Thermo Scientific75006580i wirnik
Wirówka microstar 17VWR InternationalN/Ado 13 000 obr./min
Bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Chloroform: Alkohol izoamylowy 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Sześciowodny chlorek kobaltu(II)Merck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
Pięciowodny siarczan miedzi(II)Merck7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotynaCarl Roth58-85-5  C10H16N2O3S
Drabinka DNA 1 kbNew England BiolabsN3232
Drabinka DNA 100 pzNew England BiolabsN3231
Pomoc w pipetowaniu elektrycznym accujet-pro SBrand GmbH26360do pipetowania 1-25 ml
etanoluVWR64-17-5C2H6O
Dwuwodian soli disodowej kwasu etylenodiaminowego tetraoctowegoCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
Mikroskop fluorescencyjny ApoTomeZeiss
Mikroskop fluorescencyjny Axio Imager 2Francuska
American Instrument CompanyN/A
System dokumacji żelu Saffe ImageInvitrogen
System gelelctrophorezy Mupid-One/-exuADVANCED
Wyroby szklane, różne
GlicerolCarl Roth56-81-5C3H8O3
Sześciowodny chlorek żelaza(III)MerckNumer katalogowy: 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
KanamycynaSigma-Aldrich25389-94-0
Siarczan kanamycynyCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroilsarkozyna, sól sodowa (sarkozylo)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Bulion (Lennox)Carl RothX964.4
Źródło światła, świetlówka L18W/954 światło dzienneOSRAMhodowla sinic
Źródło światła, panel LED XL 6500K 140 WBloom StarN/Ahodowla sinic, do 1,000 i mikro; mol m-2 s-1
Sześciowodny chlorek magnezuCarl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Czterowodny chlorek manganu(II)Serva13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
Mikroskop DM750Zeiss
Zestaw do ekstrakcji plazmidu preparacyjnego Midi Zestaw NucleoBond Xtra MidiMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minikomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDdo nagrywania poklatkowego
Kamera okularowa EC3Leicado ciągłego nagrywania do 30 s
Kamera okularowa MikrOkular Full HDBresserdo nagrań poklatkowych, sprzężony z minikomputerem Raspberry Pi
szalki Petriego polistyrol, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Polistyur szalek Petriego, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Fotometr Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Fotometr Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 &mikro; LGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 &mikro; LGilsonSKU: FA10004M
Pipety plastikowe 10 mL, sterylneGreiner607107
Plastikowa tuba, sterylna, 15 mLGreiner188271
Plastikowa probówka, sterylna, 50 mLGreiner227261
Bromek potasuCarl Roth7758-02-3KBr
Chlorek potasuCarl Roth7447-40-7KCl
Zasilacz Statron 3252-1Statron Gerä tetechnik GmbH
Zasilacz Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicsdo LED
Proteinaza KPromegaMC500Cod Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polimerazaNew England BiolabsM0491S
Zestaw do sekwencjonowania NextSeq 500/550 v2.5Illumina
NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Instrumentydo uprawy
Octan soduCarl Roth127-09-3NaCH3COO
Chlorek soduCarl Roth7647-14-5NaCl
Diwodorofosforan sodu jednowodnyCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
Fluorek soduCarl Roth7681-49-4NaF
Wodorowęglan soduCarl Roth144-55-8NaHCO3
Dwuwodny molibdenian soduServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
Azotan soduMerck7631-99-4NaNO3
Siarczan soduCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Chlorek strontu sześciowodnyCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
Chlorowodorek tiaminyMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Urządzenie ultradźwiękowe UP100H z sonotrodą MS3Hielscher Ultrasound TechnologyUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instrumentshomogenizator
MocznikCarl Roth57-13-6CH4N2O
Witamina B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Roztwór0,3 i mikro; M tiamina-HCl, 2,1 nM biotyna, 0,37 nM cyjanokobalamina
Destylatory wodne, Uzdatnianie wodyVEOLIA technologie wodneELGA_21001
Siarczan siedmiowodnySigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program do składaniaDNAhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelinetworzy duże rusztowania z krótkich odczytów DNA, oprogramowanie
do przetwarzania obrazów (intensywność pikseli, średnica koła)
>
Sztuczna woda morska0,41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &mikro; M SrCl2, 72 &mikro; M NaF
f/2 -ciekła pożywkasztuczna woda morska, 0,1 % (v/v) roztwór pierwiastków śladowych, 0,05 % (v/v) roztwór witaminy, 0,88 mM NaNO3, 36 &mikro; M NaH2PO4 
f/2+ płynny mediumf/2-średnie, z 10-krotnie zwiększonym NaNO3 i NaH2PO4 (0,88 mM NaNO3, 36 i mikro; M NaH2PO4
f/2+-agar3 % (w/v) agar bakto, sztuczna woda morska, 0,1 % (v/v) roztwór pierwiastków śladowych, 0,05 % (v/v) roztwór witaminy, 8,8 mM NaNO3, 0,36 mM NaH2PO4
f/2-agar3 % (w/v) agar baktowy, sztuczna woda morska, 0,1 % (v/v) roztwór pierwiastków śladowych, 0,05 % (v/v) roztwór witaminy, 0,88 mM NaNO3, 36 i mikro; M NaH2PO4
Roztwór pierwiastków śladowych0,36 mM NaH2PO4, 12 &mikro; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0,91 &mikro; M MnCl2
Roztwór witaminowy0,3 i mikro; M tiamina-HCl, 2,1 nM biotyna, 0,37 nM cyjanokobalamina
Greiner prasa ciśnieniowa Zeiss System sekwencjonowania witamin ImageJ oparte na systemie LinuxSerwer adnotacji RAST https://rast.nmpdr.org wejście: sekwencja DNA genomu, wykrywa otwarte ramki odczytu, wymienia sekwencje białek i ich funkcje

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515(2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440(2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454(2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nitkowate sinicemetoda kriokonserwacjiekstrakcja DNAmikroskopia fluorescencyjnatest ruchliwo cioporno na kanamycynpor wnanie promotor w

Powiązane artykuły