Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Podsumowanie

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Streszczenie

Cyjanobakterie to zróżnicowana grupa fotosyntetycznych, Gram-ujemnych bakterii, które odgrywają kluczową rolę w globalnych ekosystemach i służą jako podstawowe modele biotechnologiczne. Niedawne prace wykazały, że zarówno morskie, jak i słodkowodne sinice wytwarzają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe - małe struktury związane z błoną uwalniane z zewnętrznej powierzchni drobnoustrojów. Podczas gdy pęcherzyki prawdopodobnie przyczyniają się do różnych procesów biologicznych, ich specyficzne role funkcjonalne w biologii sinic pozostają w dużej mierze nieznane. Aby zachęcić do badań w tej dziedzinie i posunąć je naprzód, przedstawiono szczegółowy protokół izolacji, koncentracji i oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic. W obecnej pracy omówiono metodologie, które z powodzeniem wyizolowały pęcherzyki z dużych kultur Prochlorococcus, Synechococcus i Synechocystis. Przedstawiono metody ilościowego oznaczania i charakterystyki próbek pęcherzyków z tych szczepów. Opisano również metody izolowania pęcherzyków z próbek z pola wodnego. Na koniec omówiono również typowe wyzwania związane z oczyszczaniem pęcherzyków sinicowych, względy metodologiczne dla różnych dalszych zastosowań oraz kompromisy między podejściami.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to kuliste struktury o średnicy od ~20 do 400 nm, uwalniane przez praktycznie wszystkie organizmy do otaczającego je środowiska^1,2,3. Pęcherzyki są ograniczone dwuwarstwą lipidową i nie mogą się replikować. Uważa się, że u bakterii Gram-ujemnych struktury te powstają głównie w wyniku "pęcherzenia" małych porcji z błony zewnętrznej. Jeszcze inne procesy, w tym ruch wici, liza komórek i wydzielanie zarówno wewnętrznego, jak i zewnętrznego materiału błony, mogą również wytwarzać pęcherzyki^4,5. EV mogą zawierać różne biomolekuły, w tym lipidy, białka rozpuszczalne i błonowe, kwasy nukleinowe i metabolity, i mogą transportować ten materiał między komórkami^4,5,6. Biorąc pod uwagę te cechy, EV są badane w celu zrozumienia ich możliwych ról w szerokim zakresie procesów biologicznych, w tym komunikacji komórkowej, tworzeniu biofilmu, horyzontalnym transferze genów, dynamice gospodarz-i wymianie składników odżywczych^4,6.

Cyjanobakterie to duża i zróżnicowana grupa bakterii Gram-ujemnych, w tym organizmy jednokomórkowe i nitkowate. Są one interesujące z wielu perspektyw, w tym ze względu na zrozumienie ich fizjologii i różnorodności^7,8, krytyczne funkcje ekosystemu, którym służą^9,10, oraz ich użyteczność dla biotechnologii^11,12. Sinice występują w wielu różnych siedliskach, zarówno jako organizmy wolno żyjące w środowisku morskim, słodkowodnym i lądowym, jak i w symbiotycznych związkach z mchami, paprociami, roślinami lub w porostach i gąbkach¹³. Służą jako kluczowi pierwotni producenci w ekosystemach wodnych, produkując tlen i węgiel organiczny w procesie fotosyntezy tlenowej^9,10, a niektóre są również zdolne do wiązania azotu atmosferycznego⁷. Sinice morskie i słodkowodne, w tym Prochlorococcus, Synechococcus i Synechocystis, wytwarzają EV w warunkach laboratoryjnych^14,15,16, a pęcherzyki sinic można również znaleźć w naturalnym środowisku^14,17. Biologiczne i ekologiczne funkcje pęcherzyków sinic nie są znane, ale dalsze badania w tej dziedzinie prawdopodobnie dostarczą nowych informacji na pytania dotyczące fizjologii sinic, różnicowania, strategii komunikacyjnych, ewolucji i interakcji troficznych. Ponadto zdolność sinicowych EV do przenoszenia różnych kategorii biomolekuł może mieć zastosowania komercyjne^18,19.

Obecny protokół opisuje metody izolowania i charakteryzowania pęcherzyków z kultur cyjanobakterii i próbek terenowych, aby umożliwić i zachęcić do szerszego badania biologii pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic. Chociaż opisany tutaj przepływ pracy jest analogiczny do protokołów izolowania i charakteryzowania EV od innych bakterii, kultury cyjanobakterii i próbki terenowe zazwyczaj zawierają niższe stężenia komórek i pęcherzyków niż są powszechnie obserwowane w systemach modeli związanych z gospodarzem lub patogennych^20,21,22. W związku z tym badania EV sinic wymagają specjalnych rozważań i optymalizacji w zakresie uprawy i izolacji pęcherzyków, które różnią się jeszcze bardziej w zależności od szczepu i podłoża. Ponieważ żaden pojedynczy protokół nie będzie działał równie dobrze dla wszystkich szczepów, warunków wzrostu i dalszych zastosowań, przedstawiamy wiele opcji i omawiamy związane z tym kompromisy, aby badacze mogli określić podejścia najbardziej odpowiednie do odpowiedzi na ich pytania eksperymentalne.

Protokół

Szczepy cyjanobakterii pochodzą z kilku kolekcji kultur (szczegóły w Dyskusji).

1. Hodowla sinic

1. Hoduj sinice morskie Prochlorococcus i Synechococcus, wykonując poniższe czynności.
   1. Hodować szczepy Prochlorococcus i Synechococcus w kolbach poliwęglanowych przy użyciu odpowiedniego podłoża, takiego jak Pro99 lub SN (patrz tabela materiałów). Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz poprzednio opublikowane Referencje^23,24.
   2. Zaaklimatyzować kultury, hodując je w dwóch do trzech transferach (1:20 rozcieńczenia kultury na świeże podłoże na każde pasażowanie) w pożądanych warunkach temperatury i natężenia promieniowania wymaganych w eksperymencie.
      UWAGA: Typowe warunki wzrostu^23,25 obejmują temperatury w zakresie 15-30 °C przy natężeniu promieniowania między 8-150 μmol fotonów ^{m-2 s-1}, ale indywidualne tolerancje odkształceń i optima różnią się znacznie²⁶ i muszą być ustawione na podstawie wytycznych z odpowiednich instrukcji zbierania kultur lub literatury. Monitoruj tempo wzrostu za pomocą fluorescencji hodowli lub cytometrii przepływowej counts²³ i upewnij się, że kultury rosną w stałym tempie wykładniczym w stanie ustalonym przed rozpoczęciem eksperymentu.
   3. Wykonaj zestaw kolejnych stopniowych transferów od mniejszych do większych objętości, gdy komórki osiągną późną fazę wykładniczą (np. 20 ml < 250 ml < 2 l < 10 l < 20 l).
      UWAGA: Kultury o dużej objętości nie mogą być bezpośrednio inokulowane z małych ilości kultury wyjściowej. Należy pamiętać, że większe kultury mogą wymagać dodania (takich jak 1 mM HEPES, pH 7,5 lub 3,75 mM TAPS, pH 8), wraz z dodatkowym wodorowęglanem sodu lub bulgotania sterylnym powietrzem²⁴.
2. Uprawiać słodkowodne sinice Synechocystis sp. PCC 6803.
   1. Przygotować kulturę Synechocystis sp. PCC 6803 do wykorzystania jako inokulum, hodując ją z napowietrzaniem (bulgoczące powietrze o prędkości 1 l/min), w temperaturze 30 °C, w 16 godzinnym świetle (liczba fotonów 50 μmol ^{m-2 s-1}) / 8 godzin ciemności, do gęstości optycznej przy 730 nm (OD730) wynoszącej 1,0 (faza wykładnicza) w BG11 medium²⁷.
   2. Zaszczepić 30 ml tej kultury Synechocystis sp. PCC 6803 w 570 ml pożywki BG11 do OD730 0,05 w szklanych butelkach do mycia gazem o pojemności 1 l.
   3. Pozwolić komórkom rosnąć z napowietrzaniem, w temperaturze 30 °C, w 16-godzinnym trybie światła (liczba fotonów 50 μmol ^{m-2 s-1}) / 8 godzin ciemności, aż do końcowego OD730 1,0-1,5.

2. Oddzielenie biomasy sinic od frakcji małych cząstek (pęcherzyków)

UWAGA: Po pierwsze, zaleca się oddzielanie komórek od supernatantu poprzez odśrodkowe granulowanie komórek. Jednakże, gdy objętości kultur są zbyt duże, aby było to wykonalne, można pominąć wirowanie i przejść bezpośrednio do filtrowania całych kultur za pomocą filtracji kapsułkowej (krok 2.4).

1. Wykonaj wirowanie w celu oddzielenia komórek (najlepiej dla objętości do ~4 l, w zależności od dostępnej pojemności wirówki).
   1. Butelki wirówki należy sterylizować w autoklawie lub dokładnie umyć i wyczyścić wodą o ultraczystości typu I (patrz tabela materiałów), upewniając się, że nie pozostały żadne resztki mydła lub innego materiału.
   2. Załadować próbki kultur do odpowiedniej liczby butelek wirówkowych i zrównoważyć je.
   3. Wirować kultury bakterii o >10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Jeśli supernatant pozostaje widocznie mętny, należy zwiększyć warunki wirowania do 20 minut przy maksymalnej prędkości i ponowić próbę.
   4. Ostrożnie zdekantować lub odpipetować supernatant do czystego naczynia i przejść do jednej z następujących opcji filtracji wymienionych w krokach 2.2-2.4.
2. Opcja 1: przeprowadzić filtrację strzykawkową za pomocą filtrów 0,2 μm (dla objętości próbki do ~50 ml).
   1. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 50 ml pożywką hodowlaną w dużej mierze bezkomórkową i przefiltruj ją przez filtr polieterosulfonowy (PES) 0,2 (lub 0,45) μm (patrz tabela materiałów). Zebrać filtrat do czystego, wysterylizowanego pojemnika.
   2. Powtarzaj ten krok, aż filtr zostanie zatkany (np. trudno będzie przepchnąć strzykawką). Wymień na nowy filtr i kontynuuj, aż próbka zostanie dokładnie przefiltrowana.
3. Opcja 2: wykonaj filtrację próżniową 0,2 μm (do ~4 L).
   1. Dokładnie umyj i wyczyść aparat próżniowy za pomocą typu I - ultraczystej wody, podłączając go do syfonu próżniowego i pompy (patrz Tabela materiałów).
   2. Włóż filtr 0,2 μm o odpowiedniej średnicy i clamp aparat próżniowy.
   3. Dodać niewielką ilość próbki hodowli, upewniając się, że podciśnienie pozostaje <10 psi.
   4. Kontynuuj filtrowanie kultury małymi krokami, aż do zakończenia. Jeśli szybkość filtracji znacznie spadnie, zatrzymaj próżnię i wymień filtr.
   5. Zebrać frakcję <0,2 μm zawierającą pęcherzyki do czystego pojemnika.
4. Opcja 3: wykonaj filtrację kapsułkową 0,2 μm (dla objętości próbki >~4 l)
   1. Wyczyść elastyczny przewód o odpowiedniej wielkości i naczynie zbiorcze, myjąc je wodą z łagodnym detergentem. Spłucz materiał wodą destylowaną i dejonizowaną.
      UWAGA: Przed użyciem, materiał należy spłukać wodą typu I - ultraczystą klasą.
   2. Umieść kulturę, która ma być przefiltrowana, w bezpiecznym, podwyższonym miejscu, z ostatnim naczyniem zbiorczym poniżej. Podłącz port odpływowy filtra kapsułkowego 0,2 μm (patrz Tabela materiałów) do jednego kawałka rurki i umieść go w naczyniu zbiorczym.
   3. Umieść kolejną rurkę w próbce, rozpocznij syfon grawitacyjny, wciągając próbkę do rurki za pomocą strzykawki i podłącz rurkę do filtra kapsułkowego. Użyj odpowietrznika, aby uwolnić nadmiar powietrza i napełnij komorę supernatantem.
   4. Pozwól materiałowi przejść przez kapsułkę, aż próbka zostanie dokładnie przefiltrowana. Jeśli natężenie przepływu staje się zbyt wolne (< ~ 1/10 początkowego natężenia przepływu lub wychodzi kroplowo, w przeciwieństwie do stale płynącego strumienia), poczekaj lub zastosuj delikatną siłę za pomocą pompy perystaltycznej, aż wzrośnie ciśnienie zwrotne. Alternatywnie, można częściowo przywrócić natężenie przepływu poprzez tymczasowe odłączenie filtra, płukanie wsteczne nagromadzonej biomasy od strony dopływu ultraczystą wodą, aż materiał przestanie być widocznie mętny, a następnie wznowić proces filtracji.

3. Zagęszczanie próbki pęcherzyków

1. Opcja 1: przeprowadzić ultrafiltrację odśrodkową w celu zagęszczenia małej (<500 ml) objętości próbek.
   1. Wypłucz wybrane koncentratory odśrodkowe ultrafiltracji o pojemności 15-20 ml wodą typu I - ultraczystą wodą.
   2. Załadować koncentratory do wirówki i odwirować w temperaturze 4 400 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić próbę i powtórzyć ten krok jeszcze co najmniej dwa razy.
   3. Załadować próbkę supernatantu do koncentratorów przepłukanych wodą i odwirować w tych samych warunkach. W zależności od celów doświadczalnych, przesącz próbki może zostać odrzucony lub pobrany w celu dalszego zagęszczenia (za pomocą koncentratorów o nominalnej masie cząsteczkowej 3 kDa) i analizy.
   4. Powtarzaj ten krok, aż próbka zostanie zagęszczona do końcowej objętości ~15-30 ml.
2. Opcja 2: przeprowadzić filtrację o przepływie stycznym (TFF) w celu zagęszczenia dużej (>500 ml) objętości próbki.
   1. Ustaw aparat TFF zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów). Podłącz pompę perystaltyczną do przewodu dolotowego i umieść regulowane zaciski na przewodzie retentatu. Zdezynfekuj TFF zgodnie z zaleceniami producenta, a następnie przepłucz urządzenie 1 litrem wody typu I - ultraczystej klasy.
      UWAGA: Przewody dolotowe i retentacyjne należy umieścić w czystym zbiorniku na próbkę (szklana butelka). Przewody filtratu należy skierować do naczynia na odpady lub zlewu.
   2. Dodać filtrat <0,2 μm do zbiornika próbki. Powoli zwiększaj prędkość pompy i poziomy ciśnienia zwrotnego na przewodzie retentatu, aby zwiększyć wydajność przewodów filtratu.
   3. Kontynuuj uruchamianie TFF, ponownie napełniając zbiornik supernatantem kultury w miarę usuwania materiału. Nie dopuścić do tego, aby przewód wlotowy wydostał się z próbki podczas przetwarzania, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza. Upewnij się, że ciśnienie zasilania nie przekracza ~10 psi i że retentat wypływa z TFF w stałym tempie z powrotem do zbiornika.
   4. Przerwać zagęszczanie próbki, gdy objętość w zbiorniku osiągnie najniższą możliwą ilość potrzebną do utrzymania przepływu do przewodu dolotowego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
   5. Zamknij przewód odpływowy za pomocą zacisku. Usunąć przeciwciśnienie na linii retentatu i recyrkulować skoncentrowany supernatant przez filtr przez ~10 minut, zmniejszając szybkość recyrkulacji do 20-40 ml / min, aby zmaksymalizować odzysk.
   6. Przenieś przewód retentatu do czystego naczynia, usuń przewód dolotowy z próbki i zbierz skoncentrowany materiał. Odzyskaj pozostały materiał w zbiorniku na próbkę za pomocą pipety.
   7. Przefiltrować stężony supernatant przez filtr strzykawkowy 0,2 μm (krok 2.2), aby upewnić się, że nie pozostały żadne komórki.
      UWAGA: Krok 3.2.7 jest opcjonalny
   .
   8. W razie potrzeby przechowuj końcowy koncentrat w temperaturze 4 °C przez ~3 tygodnie przed przejściem do oczyszczania pęcherzyków (krok 4).

4. Izolacja i oczyszczanie pęcherzyków

1. Osad bezpośrednio przez ultrawirowanie, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Umieścić zagęszczoną próbkę kultury <0,2 μm w czystej probówce ultrawirówkowej. W razie potrzeby dodać czystą pożywkę lub bufor, aby upewnić się, że probówka jest całkowicie napełniona.
      UWAGA: Jeśli końcowa próbka kultury jest zbyt duża, aby zmieścić się w jednej probówce, należy albo osadzać materiał w wielu probówkach, które mają być połączone przed etapami mycia, albo osadzać go szeregowo w tej samej probówce.
   2. W razie potrzeby utwórz wagę i wiruj z prędkością ~100 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
   3. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Chociaż granulki pęcherzyków sinic mogą wykazywać pewne zabarwienie, często są niewidoczne.
   4. Przemyć granulowany materiał, dodając świeżą pożywkę hodowlaną lub bufor do mycia, taki jak 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (patrz Dyskusja) do probówki ultrawirówki, wymieszać przez delikatne pipetowanie i ponownie odwirować, jak w kroku 4.1.2. Powtórz proces prania po raz drugi.
   5. Zawiesić ostateczną osadkę w świeżej kulturze, wielokrotnie, ale delikatnie pipetując w górę i w dół wokół dna probówki za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Przelać do czystego naczynia.
2. Wykonać ultrawirowanie w gradiencie gęstości.
   1. Przygotować wywar jodiksanolu (patrz Tabela Materiałów), wykonując 4-krotnie skoncentrowaną wersję tła buforowego pożądanego dla próbki (patrz Dyskusja).
   2. Wymieszaj jedną część buforu 4x z trzema częściami 60% wywaru jodixanol, aby uzyskać 45% roztwór jodiksanolu.
   3. Rozcieńczyć 45% jodiksanol objętościami 1x buforu, aby utworzyć zapasy pożywek gradientowych o stężeniach 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% i 10% końcowego jodiksanolu.
      UWAGA: Całkowita potrzebna ilość będzie się różnić w zależności od pojemności wirnika/probówek ultrawirówki.
   4. Ustaw gradient gęstości ultrawirówki, ostrożnie nakładając równe ilości 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% i 0% ioksydynolu do probówki ultrawirówki tak, aby cała objętość probówki została wykorzystana.
      UWAGA: Próbkę pęcherzyka zewnątrzkomórkowego, która ma być oczyszczona, należy umieścić na szczycie gradientu jako część warstwy 0% jodiksanolu. Jeżeli końcowa objętość próbki pęcherzyków przekracza rozmiar warstwy 0%, należy wymieszać nadmiar próbki pęcherzyków z wystarczającą ilością 45% jodiksanolu i/lub buforu, aby uzyskać wymaganą objętość 10% lub wyższych stężeń optiprepu i użyć ich w odpowiednim miejscu gradientu.
   5. Wiruj gradient przy ~100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 6 godzin.
   6. Zebrać frakcje (zwykle po 0,5 ml każda, aby uzyskać gradient ~4,5 ml) przez staranne pipetowanie lub użycie kolektora frakcji (patrz Tabela materiałów).
   7. Oznaczyć gęstość każdej frakcji (w g/ml) za pomocą wagi analitycznej i skalibrowanej pipety w celu zmierzenia masy znanej objętości próbki. Wyjmij próbkę z probówki, określ wagę i zwróć próbkę bezpośrednio.
   8. Rozcieńczyć poszczególne frakcje w nowej probówce ultrawirówki z czystym buforem i przemyć materiał, jak wspomniano w krokach 4.1.2-4.1.4. Alternatywnie, użyj kolumn dializacyjnych lub ultrafiltracyjnych do odzyskania cząstek.
      UWAGA: Sinicze pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zazwyczaj migrują do gęstości wyporu ~1,14-1,19 g / ml w jodiksanolu.
3. Przechowywać pęcherzyki w temperaturze 4 °C, jeśli mają być zużyte w ciągu 1-3 tygodni. Zamrozić pęcherzyki w temperaturze -20 °C lub -80 °C, jeśli nie są używane dłużej niż ten okres.

5. Charakterystyka izolowanych pęcherzyków

1. Wykonać mikroskopię elektronową z transmisją barwienia ujemnego (patrz tabela materiałów) (TEM; wielkość cząstek, struktura, czystość).
   1. Aby poprawić jakość obrazu, jarzenie rozładowuje powierzchnię siatki TEM z powłoką wcześniej za pomocą systemu wyładowczego jarzeniowego zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów).
   2. Ostrożnie nanieść ~5 μl próbki pęcherzyków i pozostawić na 5 min.
      UWAGA: Próbki o stężeniach pęcherzyków >10^{9 mL-1} zazwyczaj dają najlepsze wyniki; Bardziej rozcieńczone próbki będą miały niewiele pęcherzyków na obrazie.
   3. Usunąć próbkę, dotykając krawędzią siatki kawałka czystej bibuły filtracyjnej.
   4. Odpipetuj 20-50 μl kropli 2% octanu uranylu (patrz Tabela Materiałów) na płaską powierzchnię pokrytą folią z tworzywa sztucznego i umieść pływającą na niej siatkę na 2 minuty.
   5. Usuń octan uranylu za pomocą bibuły filtracyjnej i unieś się na krótko na kropli ultraczystej wody do umycia. Powtórz mycie wodą po raz drugi.
      UWAGA: Ostateczna sucha siatka jest gotowa do wizualizacji po kroku 5.1.5.
2. Wykonaj barwienie ultracienkich przekrojów dla TEM (wielkość cząstek, struktura wewnętrzna).
   1. Zawiesić osad z etapu 4.1.5 za pomocą 1 ml 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7) (patrz tabela materiałów) i utrwalić próbkę na 2 godziny w temperaturze 4 °C.
   2. Wirować z prędkością ~100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
   3. Ostrożnie przemyć osad 0,1 M buforem kakodylanu sodu (pH 7), a następnie wirować w temperaturze ~100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
   4. Utrwalić osad 1 ml 1% tetratlenku osmu (patrz tabela materiałów) (przygotowanego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu) przez 1 godzinę, a następnie przemyć jak w kroku 5.2.3.
   5. Odwodnić próbkę za pomocą 1 ml serii wstępującej etanolu (50%, 70%, 90% i dwa razy w etanolu absolutnym) w krokach co 10 minut każdy w temperaturze 4 °C.
   6. Dodać 250 μl żywicy epoksydowej (patrz tabela materiałów) zmieszanej z absolutnym etanolem (1:1) do osadu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   7. Przenieś granulat do 500 μl czystej żywicy na 24 godziny. Następnie inkubować żywicę w temperaturze 65 °C przez 48 h.
      UWAGA: Żywica jest teraz gotowa do cięcia za pomocą ultramikrotomu, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
   8. Kratki zawierające skrawki należy zabarwić 2% octanem uranylu (w 50% etanolu) przez 5 min. Szkiełka należy delikatnie myć pod bieżącą wodą dejonizowaną przez 10-15 s każda. Umieść kroplę cytrynianu ołowiu (patrz tabela materiałów) i plamij przez kolejne 5 minut.
   9. Umyj jak poprzednio, usuń wodę, osuszając kratkę na bibule filtracyjnej i wysusz kratki na powietrzu. Wizualizacja za pomocą TEM zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela Materiałów).
3. Wykonaj analizę śledzenia nanocząstek (NTA) (wielkość cząstek, stężenie).
   1. Używając papieru do soczewek, ostrożnie zetrzyj kurz lub widoczne materiały z płaskiej powierzchni optycznej. Sprawdź, czy wszystkie O-ringi i inne uszczelki są czyste i nienaruszone. Włącz instrument i uruchom oprogramowanie.
   2. Za pomocą czystej strzykawki napełnij komorę ultraczystą wodą. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
   3. Kliknij na Start Camera i zwizualizuj optymalny obszar komory wokół "odcisku kciuka". W razie potrzeby dostosuj stolik mikroskopu w poziomie lub w pionie, tak aby intensywność sygnału była równomierna w całym obrazowanym obszarze. Przesuń obszar obrazowania poziomo względem odcisku palca (w prawo, w kierunku linii pionowej), znajdując pobliski obszar o słabym sygnale tła.
   4. Przesuń suwaki Wzmocnienie ekranu i Poziom kamery do maksimum, a następnie zmniejsz do najniższego poziomu, aby zobaczyć najciemniejsze cząstki.
      UWAGA: Typowe ustawienia pęcherzyków sinic wykorzystują wzmocnienie ekranu 7 i poziom kamery w zakresie 10-12.
   5. W razie potrzeby dostosuj ostrość, aby upewnić się, że cząstki są mniej więcej jednakowo widoczne w całym polu widzenia. Kontynuuj przepychanie ultra czystej wody przez komorę, aż wizualnie potwierdzisz, że komora jest czysta.
   6. Usunąć resztki wody z komory za pomocą innej strzykawki.
   7. Zbadaj próbkę pożywki/buforu, w którym znajduje się próbka, aby określić stężenie cząstek tła, wypełniając komorę pożywką/buforem za pomocą czystej strzykawki o pojemności 1 ml.
   8. Wybierz opcję Pomiar standardowy z listy rozwijanej SOP. Zmień ustawienia, aby zebrać co najmniej trzy techniczne repliki filmów z 60 sekund każdy. Naciśnij Utwórz i uruchom skrypt i postępuj zgodnie z instrukcjami. Wepchnąć ~100 μl próbki do komory między powtórzeniami.
   9. Po zakończeniu akwizycji usuń pozostały bufor za pomocą strzykawki, przepłucz 3-5 ml ultraczystej wody przez komorę i usuń pozostałą wodę.
   10. Dodaj próbkę pęcherzyków do komory za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i potwierdź ustawienia pobierania. Jeśli liczba cząstek nie mieści się w zakresie liniowym przyrządu (zwykle między 20-80 cząstkami/ramkę), próbka będzie musiała zostać rozcieńczona lub zagęszczona. Wepchnij co najmniej 500 μl próbki do komory przed pobraniem danych.
   11. Zbierz dane wideo jak w kroku 5.3.8, upewniając się, że komora jest czyszczona ultraczystą wodą między różnymi próbkami.
   12. Zbierz wszystkie kolejne próbki z tego samego organizmu/eksperymentu przy użyciu identycznych ustawień kamery, aby zapewnić porównywalność danych; zmiany w ustawieniach na poziomie kamery mogą mieć znaczący wpływ na uzyskane ostateczne wartości.
   13. Określ parametry cząstek, korzystając z sekcji analizy w oprogramowaniu. Wybierz pozycję Analiza, > Otwórz eksperyment, a następnie załaduj przykładowy plik. Wybierz opcję Przetwarzaj wybrane pliki i poczekaj na zakończenie analizy. Upewnij się, że używasz tego samego progu wykrywalności dla wszystkich kolejnych próbek z tego samego eksperymentu.
       UWAGA: Ponieważ pęcherzyki sinic są często przyciemnione, próg wykrywania zazwyczaj będzie musiał zostać dostosowany do najbardziej czułej (najniższej) wartości.
4. Wykonaj dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) (wielkość cząstek, potencjał zeta).
   1. Przefiltruj przez filtr o wielkości porów 0,2 μm dla każdej próbki, która trafia do DLS, aby odsiać duże cząstki, które zakłócają pomiary.
   2. Dodaj 1 ml pożywki/buforu do czystej kuwety, aby zbadać możliwe agregacje lub inne nanocząstki pochodzące z pożywki. Włóż kuwetę matową stroną po lewej stronie do mikropróbnika i zamknij pokrywę. Pozostawić próbkę do równowagi przez co najmniej 5 minut.
   3. Wprowadź współczynnik załamania światła materiału i absorpcję materiału, jeśli znacznie różnią się one od wartości domyślnych dla wody.
      UWAGA: Właściwości materiału miałyby bardzo mały wpływ, gdyby pęcherzyki były mniejsze niż 100 nm. Podczas pomiaru potencjału powierzchniowego (potencjału zeta) EV, pęcherzyki powinny być ponownie zawieszone w pierwotnym pożywce wzrostowej.
   4. Kliknij Panel sterowania przyrządów, aby sprawdzić odczyty i rozpocząć akwizycję danych, klikając zieloną ikonę. Jeśli wartości wyglądają dobrze, a pożywka/bufor nie zawiera agregacji ani innych cząstek, możesz teraz przystąpić do pomiaru próbki.
   5. Dodać 1 ml próbki pęcherzyków do czystej kuwety i zebrać dane, jak wspomniano w kroku 5.4.4. Zbierz co najmniej trzy powtórzenia techniczne przez 10 minut każdy.
5. Przeprowadzić analizę lipopolisacharydową (LPS), aby potwierdzić, że Gram-ujemne EV są obecne w próbce.
   1. Podgrzewać próbkę pęcherzyków denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 minut w standardowym 1 buforze do próbek Laemmli (patrz tabela materiałów).
   2. Inkubować z 0,2 j. proteazy typu XIV ze Streptomyces griseus (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu usunięcia zanieczyszczających glikoprotein.
   3. Oddziel próbki poddane działaniu substancji za pomocą elektroforezy na denaturujących 16% (w/v) żelach poliakrylamidowych SDS zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem¹⁶.
   4. Aby wykryć LPS, zabarwić żel dostępnymi na rynku zestawami do barwienia lub zmodyfikowaną techniką barwienia srebrem²⁸. Określ ilościowo względną obfitość LPS za pomocą analizy densytometrycznej barwionych żeli zgodnie z poprzednio opublikowanymi Bibliografią^29,30.

6. Pomiary szybkości produkcji pęcherzyków

1. Korzystając z analizy śledzenia nanocząstek, jak w kroku 5.3, lub równoważnej technologii, zmierz stężenie cząstek w pożywce wzrostowej na potrzeby eksperymentu. Jeśli zostanie stwierdzona duża liczba cząstek, przefiltruj przez filtr porowy 0,1 μm i sprawdź ponownie.
   UWAGA: Aby zminimalizować błąd, stężenie cząstek tła podłoża powinno być mniejsze niż 10% stężenia cząstek występujących w kulturach o najniższej gęstości.
2. Aklimatyzować kulturę, hodując komórki do co najmniej dwóch kolejnych transferów seryjnych w pożywce i warunkach środowiskowych wymaganych dla doświadczeń, jak w kroku 1.1.2. Kultury muszą być przenoszone, gdy są jeszcze w fazie wzrostu wykładniczego. Upewnij się, że mierzone tempo wzrostu kultury jest spójne we wszystkich transferach; Jeśli nie, kontynuuj przenoszenie kultur, aż tempo wzrostu będzie powtarzalne.
3. Pobieraj próbki z biegiem czasu po inokulacji i regularnie w odstępach czasu na krzywej wzrostu do wczesnej fazy stacjonarnej. Przesuwaj w czasie punkty, aby zebrać co najmniej 3-4 próbki w pełnym zakresie wykładniczego wzrostu. Aby pobrać próbkę w każdym punkcie czasowym, wykonaj następujące kroki.
   1. Przefiltrować 1 ml lub więcej kultury bezpośrednio przez czysty, sterylny filtr strzykawkowy 0,2 μm i zachować filtrat do pomiaru stężenia pęcherzyków, jak w kroku 5.3. W razie potrzeby zamrozić próbki z biegiem czasu. Użyj fluorescencji względnej, aby śledzić dynamikę wzrostu kultury.
   2. Zachowaj próbkę całej kultury, aby określić wielkość populacji przy użyciu metody odpowiedniej dla organizmu (cytometria przepływowa, posiew kolonii lub inna).
4. Uzyskaj pomiary komórek i cząstek pęcherzykowatych (na ml) w każdym punkcie czasowym.
5. Zidentyfikuj punkty czasowe, które wystąpiły w fazie wzrostu wykładniczego. Aby obliczyć r, liczbę pęcherzyków wytwarzanych na komórkę na pokolenie, między dwoma punktami podczas wykładniczego wzrostu (zwykle początkiem i końcem przebiegu czasu), użyj równania podanego w pliku uzupełniającym 1.
   UWAGA: Ta metoda jest ważna tylko w warunkach wzrostu w stanie ustalonym; Podstawowe założenia i sposób wyprowadzania obliczeń są szczegółowo opisane w Reference¹⁴.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia przegląd procesu izolacji pęcherzyków sinicowych, podkreślając kluczowe aspekty opisanego tutaj protokołu. Na szczególną uwagę zasługują etapy szczegółowo opisujące oddzielanie biomasy sinic od frakcji małych cząstek (pęcherzyków), zagęszczanie próbki pęcherzyków oraz izolację i oczyszczanie pęcherzyków (Rysunek 1, kroki od 2 do 4), które mają kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych preparatów pęcherzyków. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych cyjanobakterii Synechocystis sp. PCC 6803. Wykazano, że zewnętrzna błona tego cyjanobakterii zawiera karotenoidy³¹, które nadają charakterystyczne pomarańczowe zabarwienie próbkom pęcherzyków pobranym przez bezpośrednie granulowanie przez ultrawirowanie (Rysunek 2A). Po ponownym zawieszeniu osadu pęcherzyka, pęcherzyki można badać za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), albo przez ujemne barwienie próbek octanem uranylu (Rysunek 2B) lub przez obserwację ultracienkich skrawków (Rysunek 2C). Rozkład wielkości i stężenie pęcherzyków można ocenić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (Rysunek 2D) i analiz śledzenia nanocząstek (NTA) (Rysunek 2E). Przy opisanym protokole zazwyczaj uzyskiwano ~3,5 ± 1,0 x 10⁸ nanocząstek na ml w wykładniczo rosnącej kulturze Synechocystis sp. PCC 6803 przy OD730 wynoszącym 1,0. Analizy biochemiczne izolowanych EV mogą być przeprowadzane w celu uzupełnienia charakterystyki fizycznej izolowanych pęcherzyków. Na przykład oczyszczone pęcherzyki Synechocystis sp. PCC 6803 oddzielono na żelu poliakrylamidowym SDS i wybarwiono na obecność lipopolisacharydów (LPS; Rysunek 2F). Ponieważ LPS są specyficzne dla błony zewnętrznej³², detekcja LPS może potwierdzić obecność pęcherzyków związanych z błoną i służyć jako marker do analizy względnej zawartości pęcherzyków między preparatami z tego samego szczepu³³. Badanie względnej liczebności LPS o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej może wskazać na zmiany w składzie pęcherzyków między próbkami^34,35.

Rysunek 1: Eksperymentalne procedury stosowane do izolacji i charakterystyki sinic EV. Schematyczne przedstawienia rosnących kultur (1) i oddzielenie biomasy sinic od pożywki wzrostowej (2). Bezkomórkowe próbki zawierające pęcherzyki są zagęszczane (3), a następnie EV są izolowane i oczyszczane (4). W zależności od zastosowania, preparaty pęcherzykowe można scharakteryzować za pomocą jednej lub kombinacji transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA), dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i profilowania lipopolisacharydów (LPS) (5). RT, temperatura pokojowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i charakterystyki cyjanobakterii Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografia osadu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (osad EVs) otrzymanego po ultraodwirowaniu skoncentrowanego, bezkomórkowego podłoża zewnątrzkomórkowego z 600 ml kultury Synechocystis sp. PCC 6803 wyhodowanej do OD730 1,0-1,5. Zwróć uwagę na typowe pomarańczowe zabarwienie osadu pęcherzyka pochodzącego z karotenoidów znajdujących się w błonie zewnętrznej. (B,C) Zdjęcia z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) negatywowo barwionych (B) i ultracienkich skrawków (C) próbek pęcherzyków Synechocystis sp. PCC 6803. Podziałka skali: odpowiednio 200 nm i 50 nm. Próbki wizualizowano na transmisyjnym mikroskopie elektronowym pracującym pod napięciem 80 kV. (D) Typowy wykres dynamicznego rozpraszania światła (DLS) przedstawiający rozkład objętości pęcherzyków w funkcji średnicy pęcherzyka (w nm). Kolorowe linie wskazują dane z trzech powtórzonych pomiarów technicznych tej samej próbki. (E) Reprezentatywne dane z analizy śledzenia nanocząstek (NTA) rozkładu wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Synechocystis (w nm). linia oznacza średnią z trzech kontrprób technicznych, a czerwona linia oznacza błąd standardowy średniej. (F) Profil lipopolisacharydów (LPS) wykryto po oddzieleniu preparatu pęcherzykowego za pomocą elektroforezy na 16% (w/v) żelu poliakrylamidowym SDS i barwieniu dostępnym w handlu zestawem do barwienia LPS. Wykrywalne są LPS o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej, odpowiadające odpowiednio formom szorstkim i gładkim LPS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Równanie do obliczenia r. Za pomocą tego równania określa się liczbę pęcherzyków wytwarzanych na komórkę na pokolenie między dwoma punktami podczas wzrostu wykładniczego (zwykle początek i koniec przebiegu czasu). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Uwagi ogólne
Protokół (ryc. 1) jest przedstawiony jako zestaw opcji mających na celu podkreślenie, że nie ma jednej uniwersalnej metody pracy z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi sinic. Zainteresowani badacze mogą korzystać z sekcji tego protokołu, które są kompatybilne i odpowiednie dla ich konkretnego organizmu modelowego, pytań/celów eksperymentalnych i dostępności sprzętu. Wszystkie podejścia do izolacji pęcherzyków wiążą się z kompromisami i nieuchronnie spowodują pewien stopień stronniczości. Chociaż należy dążyć do zminimalizowania tego zjawiska, gdy tylko jest to możliwe, najważniejszą kwestią jest zapewnienie, że zastosowana szczegółowa metodologia jest podawana zgodnie z odpowiednimi wytycznymi MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)³⁶.

Rozwój kultury
Kultury sinic można łatwo uzyskać z jednej z wielu kolekcji kultur dostępnych na całym świecie. Kilka przykładów to Kolekcja Kultur Roscoff (Station Biologique de Roscoff, Francja), Kolekcja Kultur Pasteura (Instytut Pasteura, Paryż, Francja) oraz Narodowe Centrum Alg Morskich i Mikrobioty Provasoli-Guillard (NCMA, Maine, USA). Wybrany szczep sinicy musi być uprawiany w odpowiednim podłożu i warunkach środowiskowych, różniących się znacznie w zależności od szczepu. Listę powszechnie stosowanych pożywek do hodowli sinic można znaleźć na stronach internetowych z kolekcjonowaniem kultur lub w innych publikacjach 37,38,39.

Praca z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi sinic wiąże się z pewnymi wyjątkowymi wyzwaniami w porównaniu z metodologiami opisanymi dla wielu typowych modelowych heterotrofów laboratoryjnych. Kultury sinic mają stężenie pęcherzyków o rzędy wielkości niższe niż w przypadku innych drobnoustrojów, takich jak Escherichia coli 14,16,40. Różnice te, prawdopodobnie wynikające z mniejszej gęstości komórek i/lub tempa produkcji pęcherzyków, oznaczają, że stosunkowo duże hodowle (~1-20 l lub więcej) mogą być wymagane do uzyskania wystarczającej ilości materiału do analiz masowych. W związku z tym zachęca się naukowców do testowania wydajności pęcherzyków z kultur na mniejszą skalę, aby określić, ile materiału będzie potrzebne do osiągnięcia pożądanych celów końcowych. Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu należy również podkreślić znaczenie ustalenia, czy pożywka użyta w doświadczeniu ma wykrywalne tło w postaci cząstek stałych, ponieważ materiał ten może potencjalnie zakłócić ilościowe określanie populacji pęcherzyków, zmniejszyć czułość pomiarów stężenia/wielkości pęcherzyków lub zanieczyścić końcowe preparaty pęcherzyków.

Kolejnym wyzwaniem dla tej dziedziny jest to, że nie wszystkie cyjanobakterie rosną dobrze lub w ogóle nie rosną w czystej kulturze. Dopóki nie stanie się aksenicznym, interpretacje cech fizycznych pęcherzyków, wskaźników produkcji lub zawartości niekoniecznie mogą prowadzić do jasnych wniosków na temat pęcherzyków wytwarzanych przez którykolwiek szczep w społeczności. Zaleca się również, aby naukowcy rozważyli, jakie inne rodzaje cząstek mogą być obecne i potencjalnie mylone z pęcherzykami za pomocą specjalnych narzędzi do analizy nanocząstek, które niekoniecznie mogą rozróżniać różne typy cząstek. Na przykład konieczne może być sprawdzenie, czy używany szczep nie ma profaga, albo poprzez sekwencjonowanie genomu, testy indukcyjne lub inne środki, albo nie uwalnia innych rodzajów cząstek stałych. Z naszego doświadczenia wynika, że większość pęcherzyków sinic ma średnicę <0,2 μm, ale patrząc na nowy szczep lub warunki wzrostu, należy potwierdzić, czy użycie filtra o wielkości porów 0,45 μm zmienia rozkład wielkości oczyszczonych cząstek.

Wiele aspektów warunków hodowli może wpływać na produkcję pęcherzyków i ich zawartość^41,42. W związku z tym warunki fizyczne i chemiczne stosowane do wzrostu kultur (w tym natężenie promieniowania światła, temperatura i skład pożywki) muszą być udokumentowane i kontrolowane w możliwym stopniu, aby zapewnić odtwarzalność wyników. Każda analiza chemiczna zawartości pęcherzyków musi uwzględniać skład tła, w szczególności podczas przeprowadzania wysokoprzepustowych analiz w stylu "-omicznym". Może to być szczególnie ważne w przypadku stosowania niezdefiniowanych pożywek, takich jak te oparte na naturalnym tle wody morskiej lub uzupełnione ekstraktem drożdżowym lub tryptonem. Stosowanie zdefiniowanej pożywki wzrostowej może być preferowane w zależności od celów eksperymentalnych.

Naukowcy muszą uważnie monitorować dynamikę wzrostu kultur w regularnych odstępach czasu, aby mieć pewność, że wiedzą, w którym momencie fazy wzrostu znajduje się dana hodowla wsadowa, a nie tylko pobierają próbki po dowolnym czasie. Skład pęcherzyków może się różnić w zależności od fazy wzrostu, szczególnie między fazą wykładniczą a stacjonarną^41,42. Na przykład przynajmniej pewna część pęcherzyków pobranych w fazie stacjonarnej może pochodzić z innego mechanizmu komórkowego, takiego jak liza komórek, która nie wystąpi podczas wykładniczego wzrostu. Chociaż może to nadal mieć duże znaczenie biologiczne, ważne jest, aby znać próbkę. Jeżeli hodowla sinic osiąga pożądaną fazę wzrostu w czasie, gdy nie jest możliwe bezpośrednie przejście do zagęszczenia próbki, zaleca się natychmiastowe oddzielenie komórek od frakcji <0,2 μm (z odwirowaniem i/lub bezpośrednią filtracją 0,2 μm), a następnie przechowywanie bezkomórkowego filtratu w temperaturze 4 °C. Materiał może być przechowywany w ten sposób przez wiele dni z niewielkim lub żadnym zauważalnym wpływem na stężenie lub rozkład wielkości pęcherzyków.

Oczyszczanie pęcherzyków
Częsta potrzeba izolowania pęcherzyków z kultur o znacznej objętości ma kluczowe znaczenie w przebiegu izolacji pęcherzyków sinicowych. Podczas pracy z większymi ilościami materiału, pęcherzyki będą musiały zostać zagęszczone przed dalszymi procesami separacji. Generalnie zaleca się stosowanie koncentratorów (membran filtracyjnych o przepływie stycznym lub kolumn odśrodkowych) o nominalnej masie cząsteczkowej 100 kDa, ponieważ umożliwiają one oddzielenie od rozpuszczalnego materiału o niskiej masie cząsteczkowej przy jednoczesnym utrzymaniu rozsądnych czasów stężenia, ale często z powodzeniem stosuje się również filtry 30 kDa. Podczas gdy kilka metod oczyszczania pęcherzyków nieopartych na ultrawirowaniu (np. chromatografia wykluczania wielkości, systemy oparte na mikroprzepływach, techniki wychwytywania powinowactwa i podejścia oparte na wytrącaniu) staje się popularnych w dziedzinie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, z naszego doświadczenia wynika, że podejścia te mogą skutkować zmniejszeniem plonów i są zazwyczaj niezgodne z wymaganymi objętościami hodowli.

Naukowcy muszą wziąć pod uwagę skład tła jodoksanolu i do przemywania / reprodukcji stosowanych podczas oczyszczania pęcherzyków, aby upewnić się, że są one kompatybilne z pożądanymi dalszymi zastosowaniami. W wielu przypadkach końcowa próbka pęcherzyków może być ponownie zawieszona w pożywce wzrostowej lub określonym buforze porównywalnym pod względem składu z podłożem wzrostowym (np. naturalna lub sztuczna woda morska). Jednak może to nie być możliwe w przypadku morskich pęcherzyków sinicowych, które będą wymagały dalszych manipulacji eksperymentalnych w celu analizy, ponieważ wysokie stężenia soli podobne do poziomów wody morskiej mogą hamować wiele reakcji enzymatycznych. W takich przypadkach standardowe laboratoryjne, takie jak filtrowane 0,2 μm, 1x PBS, zazwyczaj dobrze sprawdzają się w utrzymaniu stabilności morskich pęcherzyków sinicowych i mogą być bardziej kompatybilne z dalszymi procesami eksperymentalnymi.

Oczyszczanie w gradiencie gęstości można uznać za opcjonalne w zależności od celów eksperymentalnych i składu hodowli, ale zdecydowanie zaleca się uzyskanie bardziej rygorystycznie czystej i powtarzalnej próbki. Populacje EV są niejednorodne i można je znaleźć w różnych gęstościach wyporności, które różnią się dalej w zależności od szczepu, warunków wzrostu i innych czynników ^4,5,6. Gęstości wymienione powyżej reprezentują gęstości zwykle spotykane dla pęcherzyków z kultur sinic i próbek terenowych w jodiksanolu, ale wyniki w innych szczepach mogą się różnić. Inne materiały o gradiencie gęstości, takie jak sacharoza i CsCl, mogą być wykorzystywane do pęcherzyków, ale będą migrować do różnych gęstości wyporu na tych tłach. Różne gradientowe tła pożywki mogą zaburzać odzyskiwanie wirusów zamkniętych w lipidach⁴³ i mogą potencjalnie wpływać na regenerację pęcherzyków z różnych szczepów.

Pęcherzyki mogą zostać utracone w wielu punktach poprzez izolację pęcherzyków i opisany tutaj proces oczyszczania gradientowego, zmniejszając wydajność i zwiększając ilość materiału wyjściowego potrzebnego do osiągnięcia danej końcowej wydajności pęcherzyków do dalszych zastosowań. Szczególną ostrożność należy zachować podczas pracy z granulkami pęcherzykowymi po ultrawirowaniu. Podczas gdy niektóre pęcherzyki sinicowe mogą zawierać karotenoidy lub inne związki, które mogą nadawać próbkom pęcherzyków pewną ilość pigmentacji (ryc. 2), w zależności od szczepu lub ilości materiału, niekoniecznie oczekuje się, że będzie w stanie bezpośrednio uwidocznić osad pęcherzyków. Należy zwrócić uwagę na to, gdzie spodziewane jest osadkowanie, biorąc pod uwagę rodzaj zastosowanego wirnika wirówki. Jeśli to możliwe, sugeruje się, aby oczyszczone próbki pęcherzyków zostały zbadane za pomocą mikroskopii elektronowej w celu zweryfikowania składu odzyskanego materiału końcowego.

Wpływ warunków przechowywania na pęcherzyki i ich zawartość pozostaje kwestią otwartą. Chociaż stwierdzono, że przechowywanie nie ma znaczącego wpływu na wielkość lub stężenie pęcherzyków sinic¹⁴, funkcjonalność izolowanych preparatów pęcherzykowych może się zmieniać w czasie⁴⁴. Chociaż w miarę możliwości należy unikać cykli zamrażania/rozmrażania, wpływ zamrażania próbek na ogólną liczbę i rozmiary pęcherzyków wydaje się być minimalny. Należy zdawać sobie sprawę z tego, że cykle zamrażania i rozmrażania mogą wpływać na skład zawartości pęcherzyków, takich jak długość kwasów nukleinowych związanych z pęcherzykami lub stabilność białek.

Pęcherzyki z obfitych
Obecne metody izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z naturalnych środowisk wodnych są koncepcyjnie i operacyjnie podobne do opisanych tutaj dla kultur o dużej objętości. Mimo to mogą wymagać jeszcze większych ilości materiału. Takie próbki terenowe mogą obejmować zbieranie, filtrację i zagęszczanie setek do tysięcy litrów wody w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału do analizy. W zależności od zmętnienia użytej próbki może być konieczne wprowadzenie jednego lub więcej etapów filtracji wstępnej przed filtrem 0,2 μm. Specjalne zastosowane urządzenie TFF powinno być odpowiednie do pracy z tak dużymi objętościami w rozsądnym czasie (najlepiej w kolejności godzin) i bez wywierania nadmiernego nacisku na próbkę. W praktyce często wiąże się to z użyciem znacznie większej powierzchni całkowitej niż w przypadku próbek na bazie hodowli, a także rurek o większej średnicy, aby ułatwić zwiększenie natężenia przepływu. Ta zwiększona powierzchnia filtra prawdopodobnie doprowadzi do marginalnego wzrostu strat cząstek w porównaniu z mniejszymi układami TFF i większą końcową objętością koncentratu; Obawy te należy jednak zrównoważyć względami dotyczącymi całkowitego czasu rozpatrywania wniosków. W sytuacjach takich jak przedłużony rejs oceanograficzny, w którym próbki nie wrócą do laboratorium przez wiele dni po pobraniu próbek, zalecamy przeprowadzenie wstępnej filtracji 0,2 μm i etapów TFF w terenie. Ta mniejsza objętość skoncentrowanego materiału może być następnie przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C na pokładzie (w zależności od dostępności i dalszych względów analitycznych) do czasu powrotu do laboratorium w celu ostatecznego przetworzenia.

Izolacja i oddzielenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od innych małych cząstek, zarówno organicznych, jak i nieorganicznych, może być wyzwaniem, a metody oddzielania różnych cząstek nie są jeszcze doskonałe. Na przykład gradienty gęstości jodiksanolu mogą nie być łatwe do oddzielenia wszystkich klas pęcherzyków i wirusów obecnych w danej próbce. Ze względu na to, że rodzaje cząstek zakłócających i ich właściwości fizyczne będą się różnić w zależności od miejsca pobierania próbek, obecnie niemożliwe jest zapewnienie protokołu, który solidnie podzieliłby wszystkie klasy małych cząstek wodnych. Metoda prób i błędów jest niezbędna, a eksperymentowanie z zakresem jodiksanolu stosowanym w warunkach gradientu i ultrawirowania będzie wymagało maksymalizacji separacji; Może być również wymagane zebranie frakcji o mniejszej objętości i drobniejszej gęstości. W zależności od kontekstu, użycie gradientów CsCl zamiast jodiksanolu może pomóc w oddzieleniu cząstek środowiskowych⁴⁵. Mimo to zmiana warunków osmotycznych może prowadzić do odchyleń w końcowych odzyskanych produktach, jak omówiono powyżej.

Charakterystyka pęcherzyków
Przyrządy do analizy nanocząstek nie są jeszcze rutynowo dostępne w laboratoriach mikrobiologicznych, ale stają się coraz bardziej dostępne. Wszystkie metodologie mają swoje plusy i minusy, a my nie popieramy żadnej platformy jako lepszej od wszystkich innych do pracy z pęcherzykami sinicowymi; Rzeczywiście, wszystkie mają szczególne kompromisy dotyczące kosztów, rozdzielczości, łatwości użycia, limitów wykrywalności, kompatybilności z różnymi podłożami wzrostowymi/tłami buforowymi oraz odtwarzalności danych. Oprócz opisanych powyżej przyrządów opartych na analizie śledzenia nanocząstek^{, można zastosować} inne podejścia, w tym cytometrię nanoprzepływową, mikroprzepływowe rezystancyjne wykrywanie impulsów i przestrajalne rezystancyjne wykrywanie impulsów^46,47. Użytkownicy powinni zachować ostrożność, aby poznać szczegóły dostępnego oprzyrządowania i sprawdzić, czy działa ono dobrze z ich systemem, ponieważ napotkaliśmy trudności podczas korzystania z niektórych platform z mediami na bazie wody morskiej. Zachęcamy tę dziedzinę do przejścia w kierunku ilościowej charakterystyki wielkości pęcherzyków, stężeń i wskaźników produkcji. Pomiar stężeń pęcherzyków na podstawie podstawowych cząstek na ml, a nie pod względem zawartości białka lub innych wskaźników, pozwoli na integrację pęcherzyków w bardziej ilościowe ramy i umożliwi wzajemne porównania między szczepami i warunkami. Potrzebne są dalsze wysiłki w celu poprawy możliwości kalibracji pomiarów stężeń dla cząstek o długości fali <100 nm.

Fakt, że pomiary szybkości produkcji pęcherzyków są wykonywane bezpośrednio z przefiltrowanego supernatantu hodowli 0,2 μm w celu zminimalizowania strat cząstek, byłby związany z innymi etapami oczyszczania opisanymi powyżej. Oznacza to jednak, że podejście to niekoniecznie rozróżnia rzeczywiste pęcherzyki zewnątrzkomórkowe i inne małe cząstki znajdujące się w kulturach. Tylko liczenie cząstek w określonych zakresach rozmiarów (np. średnica 50-250 nm) może pomóc w wykluczeniu niektórych wartości odstających, ale wizualne potwierdzenie, że granulowane kultury <0,2 μm wydają się być pęcherzykami związanymi z błoną (za pomocą TEM lub innych metod), jest potrzebne, aby móc jednoznacznie twierdzić, że mierzy się produkcję pęcherzyków, a nie produkcję cząstek podobnych do pęcherzyków.

Istotnym czynnikiem w charakterystyce pęcherzyków jest zapewnienie, że próbka pęcherzyka jest analizowana w odpowiednim liniowym zakresie czułości urządzenia do analizy nanocząstek. Gdy próbka jest zbyt zagęszczona, łatwo jest rozcieńczyć ten materiał czystym buforem i ponownie go przeanalizować. Z drugiej strony, stosunkowo niska gęstość komórek i/lub pęcherzyków w niektórych kulturach sinic może czasami prowadzić do powstania preparatów pęcherzykowych, które są poniżej limitów wykrywalności niektórych instrumentów. W przypadkach, gdy ma to miejsce w przypadku masowego oczyszczania pęcherzyków, można rozważyć uprawę kultur o większej objętości, ponowne granulowanie i ponowne zawieszenie materiału końcowego w mniejszej objętości lub ocenę, czy w procesie izolacji występuje etap, na którym występują nadmierne straty i można je złagodzić. Mierząc tempo produkcji pęcherzyków, poprawki niekoniecznie są takie proste. W razie potrzeby próbki można zagęścić, ale w pierwszej kolejności należy sprawdzić, czy dostosowanie pożywki może skutkować większą gęstością komórek, czy też wystarczająco skoncentrowane próbki można uzyskać z późniejszych punktów czasowych w fazie wykładniczej, w której stężenia będą wyższe.

Ograniczenia
Podobnie jak w przypadku każdego protokołu, izolacja pęcherzyków przy użyciu tych podejść ma wyraźne ograniczenia. Podejścia te nie opierają się na gwarancji, że całkowicie czysty preparat pęcherzyków zostanie wyizolowany. Zarówno hodowle, jak i próbki terenowe mogą zawierać inne materiały, które migrują podobnie jak pęcherzyki w gradientach gęstości. Mimo to, co najmniej, tego typu dodatkowe metodologie oczyszczania są niezbędne do zapewnienia rygoru i powtarzalności analizy pęcherzyków. Chociaż opisujemy podejścia do izolacji pęcherzyków w kontekście sinic, kultury wielu innych drobnoustrojów również będą zawierać pęcherzyki w stosunkowo niskich stężeniach, a opisane tutaj procedury powinny być ogólnie stosowane. Oczekuje się, że metody te nie będą służyć jako stały protokół, ale jako punkt wyjścia do pobudzenia przyszłych postępów w pracy z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzących od różnych drobnoustrojów. Konieczne są dalsze wysiłki w celu połączenia tych metod z innymi podejściami, takimi jak kolumny wykluczające wielkość lub asymetryczne frakcjonowanie przepływu w polu, aby poprawić dyskryminację i separację różnych kategorii małych cząstek z kultur i próbek środowiskowych. Mamy również nadzieję, że techniki te mogą nadal ewoluować wraz z ulepszeniami w technologiach charakteryzacji nanocząstek, aby poprawić zdolność do badania niejednorodności w populacjach pęcherzyków, ich zawartości i dokładnych ról funkcjonalnych w środowisku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4	Domowy bufor	---	standardowy bufor do mycia/przechowywania, który może być stosowany z pęcherzykami; może być wykonany w laboratorium lub zakupiony komercyjnie
2% roztwór octanu uranylu	Mikroskopia elektronowa Sciences	22400-2	Barwienie ujemne - TEM
4x Bufor do próbek Laemmli	Bio-Rad	161-0747	Denaturacja próbki pęcherzyków przed proteolizą, wymagana do barwienia lipopolisacharydami (LPS)
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra (100 kDa)	Merck	UFC9100XX	Alternatywna opcja dla ultrafiltracji odśrodkowej
Podłoże BG11 Domowe	podłoże	---	Podłoże do uprawy Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, miedź. CF200-Cu	Mikroskopia elektronowa Nauki	71150	Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
siatka easiGlow System czyszczenia wyładowań jarzeniowych	Ted Pella	91000	Komercyjna siatka TEM wyładowcza żarowa
epoksydowa EMbed 812	Mikroskopia elektronowa	Sciences 14120	Ultracienkie przekroje - TEM
Uchwyt filtra do systemu próżniowego	Thermo Fisher Scientific	300-4000	Jednostki wielokrotnego użytku z płytami nośnymi membrany filtracyjnej
Aldehyd glutarowy  Klasa I	Sigma-Aldrich	G5882-10X1ml	Ultracienkie przekroje - TEM
HEPES [sól sodowa N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N′-(kwasu 2-etanosulfonowego)]	Sigma-Aldrich	H7006	Środek buforujący do pożywek wzrostowych sinic
Cytrynian ołowiu, trójwodzian	Mikroskopia elektronowa Sciences	17800	Barwnik do stosowania w mikroskopii elektronowej
Urządzenia odśrodkowe Macrosep Advance z Membrana Omega 100K	Pall	MAP100C36	Do ultrafiltracji odśrodkowej próbek o małej objętości
Moduł Millipore Pellicon 3 TFF EMD	Millipore	XX42P0060 lub XX42P0080	Alternatywna opcja TFF do zagęszczania próbek o dużej objętości
Referencyjny system oczyszczania wody Milli-Q	Merck	Z00QSV0WW	do uzyskiwania ultraczystej wody typu I
NanoSight	Malvern Panalytical	LM14 lub NS300	Analiza śledzenia nanocząstek
Ultrawirówka Optima L80 XP Ultrawirówka	Beckman Coulter	L80 XP	(lub podobny model)
OptiPrep / Iodixanol	Sigma-Aldrich	D1556	Media gradientu gęstości
Odczynnik do tetratlenku osmu Plus	Sigma-Aldrich	201030	Ultracienkie sekcje - TEM
Pall Centramate Uchwyt PE TFF Moduł	Pall Corporation	FS002K10	TFF dobry do zagęszczania 10s-100s L próbki; wymaga dodatkowych modułów filtrujących 30 lub 100 kDa do skalowania z szacowanymi objętościami
Pompa perystaltyczna Masterflex L/S	Cole-Parmer	07559-07	Pompa do napędzania wielkogabarytowych modułów TFF
Frakcjonator tłokowy z gradientem	tłokowym Biocomp Instruments	152-001	Automatyczne frakcjonowanie w gradinie gęstości
Rurki poliwęglanowe do rotora 70 Ti	Beckman Coulter	355618	Probówki aluminiowe z poliwęglanu wielokrotnego użytku do ultrawirówek z zespołem nasadki
Pro99 medium Domowe	podłoże	---	Podłoże do uprawy Prochlorococcus
Pro-Q Szmaragdowy zestaw do barwienia żelowego LPS	Thermo Fisher Scientific	P20495	Barwienie LPS
SN średnie	Podłoże domowej roboty	---	Podłoże do hodowli sinicowych szczepów morskich, takich jak Synechococcus
Trójwodny kakodylan sodu	Sigma-Aldrich	C0250-100G	Środek buforujący w przygotowaniu próbek pęcherzyków do
rotora kubełkowego wahliwego TEM SW32Ti	Beckman Coulter	369650	Wirnik ultrawirówkowy, mieści 6x probówki ~40 ml; dobry do granulowania materiałów sypkich
SW60Ti wahadłowy wirnik kubełkowy	Beckman Coulter	335650	Wirnik ultrawirówki, mieści 6x ~4,5 ml probówek; Dobry do oczyszczania gradientowego i końcowego płukania pęcherzyków
Strzykawka 1 ml Luer	BD Plastipak	303172	Do izolacji pęcherzyków i ładowania próbek do sprzętu do analizy śledzenia cząstek (NTA)
Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m	Pall Corporation	4602	Do izolacji pęcherzyków z kultur
TAPS [Kwas N-[tris(hydroksymetylo)metylo]-3-aminopropanosulfonowy]]	Sigma-Aldrich	T5130	Środek buforujący do pożywek wzrostowych sinic
Transmisyjny mikroskop elektronowy	JEOL	JEM-1400	Lub podobny mikroskop
Typ 70 Ti Tytanowy wirnik o stałym kącie	Beckman Coulter	337922	Wirnik ultrawirówki, mieści 8x ~39 ml probówek; dobry do granulowania materiałów sypkich
Proteaza typu XIV z Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147	Enzym do proteolizy białek EVs, wymagany do barwienia LPS
Probówki UltraClear do rotora SW32Ti	Beckman Coulter	344058	Probówki do ultrawirówek jednorazowego użytku
Probówki UltraClear do rotora SW60Ti	Beckman Coulter	344062	Jednorazowego użytku Probówki ultrawirówkowe
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC	RMC Produkty,  Boeckeler Instruments	75501	Mikrotom do ultracienkich przekrojów - TEM
Uniwersalna wirówka 320 R	Hettich	Z654736	Ta lub inna podobna wirówka stołowa/stojąca ogólnego przeznaczenia może być używana do komórek granulujących
Aparat próżniowy	KNF Neuberger	N026.3 AT.18	Lub dowolna podobna pompa próżniowa i pułapka
Vivaflow 200 100 000 MWCO PES	Sartorius	VF20P4	Moduł TFF, dobry na 2-3L. Możesz podłączyć różne moduły, aby uzyskać większą głośność (rysunek 1).
Filtr kapsułkowy Whatman Polycap TC (0,2/0,2 i mikro; m)	Cytiva	6717-9502	Filtr kapsułkowy do filtrowania dużych objętości cieczy
Zetasizer	Malvern Panalytical	Zetasizer Nano ZS	Przyrząd do dynamicznego rozpraszania światła (DLS)