Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Aneuploidia to nieprawidłowość w liczbie chromosomów spowodowana obecnością jednego lub więcej dodatkowych chromosomów lub brakiem jednego lub więcej chromosomów. Zarodki, które są nosicielami pewnego rodzaju aneuploidii, takiej jak utrata jednego chromosomu X (zespół Turnera), dodatkowe kopie autosomów, takie jak trisomie autosomu 21 (zespół Downa), 13 (zespół Patau) i 18 (zespół Edwardsa) lub dodatkowe chromosomy płciowe, takie jak 47, XXY (zespół Klinefeltera) i 47, XXX (zespół potrójnego chromosomu X), mogą przetrwać do końca z wadami wrodzonymi¹. Aneuploidia jest główną przyczyną poronień w pierwszym trymestrze ciąży i nieudanych prób zapłodnienia in vitro (IVF)². Poinformowano, że wskaźnik aneuploidii może wahać się od 25,4% do 84,5% w różnych warstwach wiekowych naturalnego cyklu i grupy kontrolnej z lekiem w praktyce IVF³.

Technologia sekwencjonowania nowej generacji staje się coraz bardziej popularna w klinicznym określaniu informacji genetycznej; zapewnia praktyczny dostęp do sekwencji genomu z wydajnością i wysoką przepustowością. W szczególności sekwencjonowanie nowej generacji zrewolucjonizowało również diagnostykę zaburzeń za pomocą czynników genetycznych i testów na nieprawidłowości w klasie genome4. Wykorzystując technologię sekwencjonowania półprzewodników do bezpośredniego przesyłania sygnałów chemicznych w sekwencjonowaniu bioreakcji do danych cyfrowych, system sekwencyjny oparty na półprzewodnikach zapewnia bezpośrednią detekcję w czasie rzeczywistym w celu sekwencjonowania danych w 3-7 h^5,6.

W procedurze in vitro, preimplantacyjne testy genetyczne (PGT) badają profil genetyczny zarodka przed przeniesieniem do macicy, aby poprawić wynik IVF i zmniejszyć ryzyko zaburzeń genetycznych u noworodków^1,7. W PGT w połączeniu z technikami NGS materiał genetyczny wyekstrahowany z mniej niż 10 komórek jest amplifikowany za pomocą zestawów do amplifikacji całego genomu lub niezależnie opracowanego odczynnika do amplifikacji całego genomu. Wymaga to tylko jednego kroku w fazie amplifikacji i nie wymaga wstępnej amplifikacji, aby uzyskać produkty amplifikacji całego genomu. Startery lub panele do sekwencjonowania wariantów liczby kopii i specjalnych loci genów są projektowane i stosowane w skonstruowanej bibliotece.

Typowy przepływ pracy preimplantacyjnych testów genetycznych - aneuploidia (PGT-A) w NGS obejmuje procedury seryjne i wymaga intensywnego obciążenia personelu laboratoryjnego⁸. Niektóre błędy w działaniu spowodowane wycofaniem procedury mogą prowadzić do niepożądanej straty zarówno czasu, jak i zasobów laboratorium. Pomocne jest zwięzłe i przejrzyste standardowe procedury operacyjne (SOP) dla przepływu pracy PGS-NGS; Jednak protokoły w formacie Word nie mogą przedstawiać bardziej szczegółowych informacji na temat przetwarzania próbek, manipulacji urządzeniem i ustawień instrumentów, które można zobrazować w protokole wideo. W tym artykule zweryfikowany przepływ pracy w połączeniu z wizualizowaną demonstracją szczegółów operacyjnych może zaoferować bardziej bezpośrednie i intuicyjne protokoły referencyjne w praktyce PGT na platformie sekwencjonowania półprzewodników.

Protokół tutaj opisuje metodę, która umożliwia grupowanie do 16 biopsji zarodków równolegle. W przypadku większych partii zaleca się stosowanie komercyjnego protokołu opartego na zestawie do sekwencjonowania półprzewodników, takiego jak Reproes-PGS.

Wszystkie protokoły i biopsja trofektodermy (TE) (sekcja 1.1.1.1) zastosowane w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez komisję etyki badań na ludziach szpitala nr 924 w dniu 18 września 2017 r. (NO: PLA924-2017-59). Pacjenci/uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w tym badaniu.

1. Izolacja DNA z biopsji ludzkiego embrionu i amplifikacja całego genomu

1. Protokół amplifikacji całego genomu^9,10
   UWAGA: Zestaw Pico PLEX WGA służy do wykonywania amplifikacji całego genomu.
   1. Pobieranie i przechowywanie próbek
      1. Biopsja trofektodermy: Pobrać średnio od sześciu do dziewięciu komórek z przepukliny TE zarodka D5/6 po wspomaganym wykluciu, aby uzyskać kwalifikowaną ilość DNA do następnej amplifikacji.
      2. Przenieść komórki próbki do probówki PCR w 5 μl PBS.
      3. Natychmiast zamrozić próbki w temperaturze -80 °C, jeżeli protokół nie prowadzi bezpośrednio do ekstrakcji DNA.
   2. Liza komórek
      UWAGA: Plik uzupełniający 1 zawiera listę zalecanych objętości każdego składnika i służy jako odniesienie dla tych objętości podczas przygotowywania mieszanki wzorcowej podczas lizy komórek i amplifikacji całego genomu partii 1, 8, 16 i 32 próbek (z nadwyżką w celu uwzględnienia błędów pipetowania). Podczas formułowania innych mieszanek wzorcowych w ramach tego protokołu, objętość każdego składnika jest dodatkowo zwiększana, aby dostosować się do zużycia składników spowodowanego wielokrotnym pipetowaniem. Wszystkie krótkie wirowanie odbywa się na mini wirówce stołowej przez 2-10 s w temperaturze pokojowej (RT), ze stałą prędkością obrotową 10 000 przy sile odśrodkowej 5 300 x g. Siła odśrodkowa musi wynosić od 2 000 x g do 12 000 x g.
      1. Przygotować mieszaninę do lizy komórek z 4,8 μl buforu do rozcieńczania enzymu ekstrakcyjnego i 0,2 μl enzymu do ekstrakcji komórek na próbkę.
      2. Odpipetować 5 μl świeżo przygotowanej próbki do lizy komórek wymieszać z każdą próbką komórek o objętości 5 μl w probówkach do PCR i krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 s. Nie obracaj rurki.
      3. Inkubować próbkę w termocyklerze w następujący sposób: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Po inkubacji krótko odwirować (5 s) probówkę.
   3. Wstępna amplifikacja DNA całego genomu
      1. Przygotować mieszaninę pre-amplifikacyjną z 4,8 μl buforu przedwzmacniacza i 0,2 μl enzymu przedwzmacniacza na próbkę.
      2. Odpipetować 5 μl wstępnego amplifikacji wymieszać z probówkami z próbką przez ścianki probówki i krótko wirować przez 3 s. Unikać sięgania końcówki do dna probówki i nie obracać probówki.
      3. Inkubować próbkę zgodnie z programem termocyklera wymienionym w tabeli 1.
   4. Amplifikacja DNA całego genomu
      1. Krótko odwirować próbkę przez 5 s i umieścić produkt inkubacji przed ampem na lodzie.
      2. Przygotuj mieszaninę do amplifikacji całego genomu z 25 μl buforu do amplifikacji, 0,8 μl enzymu amplifikacyjnego i 34,2 μl wody wolnej od nukleaz na próbkę.
      3. Zmieszać 60 μl świeżo przygotowanej mieszanki do amplifikacji całego genomu z 15 μl produktu inkubacji przed ampem; całkowita objętość musi wynosić 75 μL. Krótko wirować przez 5 sekund. Unikać sięgania końcówki do dna probówki i nie obracać probówki.
      4. Umieść probówkę PCR na termocyklerze i uruchom program termocyklera wymieniony w Tabeli 2.
      5. Odwiruj probówki krótko przez 5 s i przenieś produkty do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      6. Określ ilościowo stężenie produktu WGA za pomocą fluorometru¹¹. Próbki mogą być tymczasowo przechowywane w temperaturze -20°C przez mniej niż 2 miesiące, jeśli nie zostaną przekazane do następnego etapu.
2. Protokół niezależnie opracowanych odczynników WGA.
   1. Pobieranie i przechowywanie próbek
      1. Pobrać komórki z zarodka D5/6 po wspomaganym wykluwaniu w celu następnej amplifikacji.
      2. Przenieść próbki z 1,5 μl PBS do probówki PCR zawierającej 2 μl PBS.
         UWAGA: PBS jest wolny od Mg²⁺ i Ca²⁺.
      3. Próbki należy natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C, jeżeli nie zostały one bezpośrednio poddane protokołowi ekstrakcji DNA.
   2. Liza komórek
      1. Rozpuść bufor do lizy komórek (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM glikol etylenowy, kwas tetraoctowy (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM pirofosforan sodu, 2 mM β-glicerofosforan, 0,1% SDS) w temperaturze pokojowej i umieść go na lodzie. Dodać 2 μl buforu do lizy komórek do każdej próbki i krótko odwirować (5 s).
         UWAGA: Nie należy obracać rurki i unikać dotykania przez końcówkę pipety powierzchni cieczy w probówce, aby uniknąć wydostania komórek lub DNA z układu reakcyjnego.
      2. Inkubować próbkę w termocyklerze w następujący sposób: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, trzymać. Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 s po inkubacji.
   3. Amplifikacja DNA całego genomu
      1. Krótko odwiruj produkt lizy komórek przez 5 sekund i umieść go na lodzie.
      2. Przygotuj mieszaninę do amplifikacji całego genomu dla każdej próbki, mieszając ją z 16 μl wstępnie zmieszanego roztworu do amplifikacji, 1 μl enzymu amplifikacyjnego i 28 μl wody wolnej od nukleaz. Delikatnie wymieszaj, krótko odwiruj (5 s) i umieść mieszaninę na lodzie. Nie obracaj rurki.
      3. Odpipetować 45 μl świeżo przygotowanej mieszaniny do amplifikacji całego genomu do produktu lizy komórek przygotowanego w kroku 1.2.2.2; delikatnie wymieszać i krótko odwirować przez 5 s.
         UWAGA: Nie obracaj rurki i nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała płynu w probówce.
      4. Umieść probówkę PCR na termocyklerze i uruchom program zgodnie z opisem w Tabeli 3.
      5. Odwiruj probówki krótko przez 5 sekund i przenieś produkty do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      6. Określ ilościowo stężenie produktu WGA za pomocą fluorometru¹¹ i zapisz wyniki na karcie QA (analiza jakości). Produkty o kwalifikowanych stężeniach mogą być tymczasowo przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres krótszy niż 2 miesiące, jeśli nie zostaną przekazane do następnego etapu.

2. Wybór fragmentu amplifikacji

UWAGA: Materiały użyte w tej sekcji są dostępne w Zestawie Przygotowania Biblioteki (Tabela Materiałów).

1. Przygotowanie przed rozpoczęciem
   1. Równowaga kulek magnetycznych (n x 100 μl) do oczyszczania w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   2. Przywróć poprzedni produkt WGA do RT. Wiruj produkt w temperaturze RT przez 30 sekund przed krótkim odwirowaniem.
   3. Przygotuj świeży 70% etanol.
2. Procedura selekcji fragmentów
   1. Odpipetować 25 μl produktów WGA i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml z 25 μl wstępnie załadowanej wody wolnej od nukleaz.
   2. Dobrze odwiruj i wymieszaj kulki oczyszczające DNA. Porcjować 50 μl do każdej probówki z próbką (oryginalna próbka: kulki (objętość) = 1:1), odwirować i krótko odwirować (5 s). Ustaw probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej dla procesu wiązania DNA.
   3. Włóż probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml do stojaka magnetycznego i poczekaj, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki probówki. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Unikaj pipetowania kulek.
   4. Zgodnie z pierwotną objętością próbki, odpipetować 30 μl (oryginalna próbka: kulki (objętość) = 1:0,6) kulek magnetycznych, wirować i krótko odwirować (5 s). Ustaw probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej dla procesu wiązania DNA.
   5. Włóż probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml do stojaka magnetycznego i odczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki probówki. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
   6. Odpipetować 300 μl 70% etanolu do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, delikatnie obrócić probówkę dwukrotnie pod kątem 180° i przesunąć kulki wzdłuż ścianki probówki, aby dokładnie umyć. Odpipetować i odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
   7. Powtórz procedurę prania raz.
   8. Wyjmij probówkę wirówkową o pojemności 1.5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (5 s). Włóż rurki z powrotem do stojaka na magnesy i poczekaj, aż wszystkie koraliki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rury.
   9. Ostrożnie odpipetować pozostały płyn na dnie. Trzymaj tubę otwartą, aby wysuszyć koraliki w temperaturze RT przez 3-5 minut. Utrzymuj wilgoć z dala od koralików.
      UWAGA: Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na granulce koralików pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
   10. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego, odpipetuj 25-30 μl buforu elucyjnego DNA do probówki, a następnie zamknij nakrętkę i wir. Odwirować na krótko (5 s), aby mętna ciecz znalazła się na dnie probówki i ustawić probówkę na RT na 5 minut.
   11. Włóż probówki z powrotem do stojaków magnetycznych i poczekaj, aż wszystkie koraliki zostaną przyciągnięte do ścianki bocznej rurki, a supernatant stanie się przezroczysty. Ostrożnie przenieś roztwór DNA do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Unikaj pipetowania kulek.
   12. Określ ilościowo stężenie DNA po selekcji fragmentu za pomocą fluorometru^11, przechowuj go w temperaturze -20°C. Zazwyczaj stężenie wybranego fragmentu DNA waha się od 1,5 do 2,4 ng/μL.

3. Przygotowanie biblioteki DNA¹²

UWAGA: Materiały użyte w tej sekcji są dostępne w Zestawie Przygotowania Biblioteki (Tabela Materiałów).

1. Zakończ naprawę
   1. Równoważ kulki magnetyczne w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   2. Zrównoważyć iloczyn DNA selekcji fragmentów w kroku 2.2.12 do RT. Sprawdzić i zapisać znacznik na każdej fiolce zawierającej DNA.
   3. Przygotuj system naprawy końcówek DNA z 30 μl produktów DNA, 10 μl buforu naprawiającego końcówki, 0,5 μl enzymu naprawiającego końcówki i 9,5 μl wody wolnej od nukleaz w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować probówkę przez 30 s i krótko odwirować (5 s) w temperaturze pokojowej, aby cała ciecz dotarła na dno probówki.
   4. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut, a po inkubacji krótko odwirować (5 s) probówkę.
   5. Odwirować lub odwrócić mieszanie kulek magnetycznych i przenieść 75 μl kulek magnetycznych do probówki zawierającej próbki DNA naprawione na końcach (próbka oryginalna: kulki (objętość) = 1:1,5). Odpipetować lub delikatnie odwirować, aby dobrze wymieszać kulki i krótko odwirować (5 s), aby odwirować całą zawiesinę na dno probówki. Ustaw probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej dla procesu wiązania DNA. Delikatnie odwróć rurki, aby koraliki były rozproszone.
   6. Włóż probówki wirówkowe do stojaka magnetycznego i odczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a supernatant stanie się przezroczysty. Usunąć supernatant i unikać pipetowania kulek, trzymając probówki na ruszcie podczas pipetowania.
   7. Przenieś 300 μl nowo przygotowanego 70% etanolu do probówek, delikatnie obróć probówki dwukrotnie pod kątem 180° i przesuń kulki wzdłuż ścianki rurki w celu dokładnego umycia. Odpipetować i odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
   8. Powtórz procedurę prania raz.
   9. Wyjmij probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (5 s). Włóż rurki z powrotem do stojaka na magnesy i poczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rury.
   10. Ostrożnie odpipetować pozostały płyn na dnie. Otwórz nakrętkę probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i susz kulki w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut. Utrzymuj wilgoć z dala od koralików.
       UWAGA: Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na granulce koralików pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
   11. Pobrać pipetą 33 μl buforu elucyjnego DNA do probówki, zamknąć nakrętkę i wprowadzić wir. Odwirować krótko (5 s), aby mętna zawiesina znalazła się na dnie probówki i ustawić probówkę w pozycji RT na 5 minut.
   12. Włóż rurki z powrotem do stojaków magnetycznych i poczekaj, aż wszystkie koraliki zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a roztwór stanie się przezroczysty. Ostrożnie przenieś roztwór DNA do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml z odpowiednim znacznikiem, unikając pipetowania kulek.
2. Podwiązanie kodów kreskowych
   1. Umieść odczynniki do ligacji kodów kreskowych w kroku 3.2.2 na lodzie, aby stopić wszystkie zamrożone odczynniki.
   2. Przygotuj system ligacji z 32 μl produktów DNA z naprawą końcową, 10 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl buforu ligazy, 1 μl ligazy i 1 μl adaptacji P1 w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 1 μl każdego odczynnika z kodem kreskowym do roztworu, wymieszać w probówce dla jednej próbki, wirować przez 5 s i krótko odwirować (5 s), aby uzyskać cały płyn na dnie probówki.
      UWAGA: Podczas dodawania kodów kreskowych upewnij się, że liczba kodów kreskowych i próbek jest zgodna; za każdym razem otwierać tylko jedną fiolkę z kodami kreskowymi, aby uniknąć zmieszanego zanieczyszczenia kodami kreskowymi; Zmień rękawice na każde pięć lub sześć dodanych kodów kreskowych.
   3. Inkubować probówki w temperaturze 25 °C przez 30 minut.
   4. Odpipetować 75 μl (oryginalna próbka: kulki (objętość) = 1:1,5) kulek magnetycznych do probówki i pipetować lub delikatnie wirować, aby dobrze wymieszać kulki. Odwirować krótko (5 s), aby odwirować całą zawiesinę do dna, unikając agregacji kulek. Ustaw probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej dla procesu wiązania DNA. Delikatnie odwróć rurki, aby koraliki były rozproszone.
   5. Włóż probówki wirówkowe do stojaka magnetycznego i odczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a supernatant stanie się przezroczysty. Usunąć supernatant i unikać pipetowania kulek, trzymając probówki na ruszcie podczas pipetowania.
   6. Przenieś 300 μl nowo przygotowanego 70% etanolu do probówek, delikatnie obróć probówki dwukrotnie pod kątem 180° i przesuń kulki wzdłuż ścianki rurki w celu dokładnego umycia. Odpipetować i odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
   7. Powtórz procedurę prania raz.
   8. Wyjmij probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (5 s). Włóż rurki z powrotem do stojaka na magnesy i poczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rury. Ostrożnie odpipetować pozostały supernatant na dnie.
   9. Trzymaj nasadkę rurki otwartą, aby wysuszyć koraliki w temperaturze RT przez 3-5 minut. Utrzymuj wilgoć z dala od koralików.
      UWAGA: Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na granulce koralików pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
   10. Pobrać pipetą 15 μl buforu elucyjnego DNA do probówki. Opłucz granulki kulek aż do dna tuby, uszczelnij nakrętkę i zawiruj. Odwirować krótko (5 s), aby mętna zawiesina opadła na dno probówki i utrzymać probówkę stabilnie na poziomie RT przez 5 minut.
3. Wzmocnienie fragmentów
   1. Umieść odczynniki do budowy biblioteki na lodzie, gdy zamrożony odczynnik się rozpuści.
   2. Przenieś 47,5 μl mieszanki enzymów i 2,5 μl mieszanki starterów do probówki zawierającej eluowane DNA i kulki, wiruj przez 5 s i krótko odwiruj (5 s), aby cała ciecz dotarła na dno probówki.
   3. Ustaw probówkę na RT na 5 minut. Włóż probówki z powrotem do stojaków magnetycznych i poczekaj, aż wszystkie koraliki zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a supernatant stanie się przezroczysty. Ostrożnie przenieś roztwór DNA do probówek PCR o pojemności 0,2 ml z wyraźnie zaznaczonymi znacznikami i unikaj pipetowania kulek.
   4. Inkubować próbkę w termocyklerze z następującym programem: 72°C, 20 min; 98°C, 2 min; 98°C, 15 s; 62°C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 cykli); 70 °C, 5 min. Po zakończeniu reakcji krótko odwirować (5 s) probówkę i przechowywać produkty w temperaturze 4 °C.
   5. Przenieś produkty PCR do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml (niskie nasadkę). Po zakończeniu reakcji dodać 97,5 μl (pierwotna objętość próbki: kulki (objętość) = 1:1,5) kulek magnetycznych do probówki, odpipetować lub delikatnie odkręcić, aby dobrze wymieszać kulki, i krótko odwirować (5 s), aby odwirować cały płyn na dno. Unikaj agregacji koralików. Ustaw rurkę na RT na 5 minut. Delikatnie odwróć rurki, aby koraliki były rozproszone.
   6. Włóż probówki wirówkowe do stojaka magnetycznego i odczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a supernatant stanie się przezroczysty. Usunąć supernatant, unikać pipetowania kulek i trzymać probówki stabilnie na ruszcie.
   7. Przenieś 300 μl nowo przygotowanego 70% etanolu do probówek, delikatnie obróć probówki dwukrotnie pod kątem 180° i przesuń kulki wzdłuż ścianki rurki w celu dokładnego umycia. Odpipetować i odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
   8. Powtórz procedurę prania raz.
   9. Wyjmij probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (5 s). Włóż rurkę z powrotem do stojaka na magnesy i poczekaj 5 minut, aż wszystkie koraliki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rury. Ostrożnie odpipetować pozostały płyn na dnie.
   10. Trzymaj nasadkę rurki otwartą, aby wysuszyć koraliki w temperaturze RT przez 3-5 minut. Utrzymuj wilgoć z dala od koralików.
       UWAGA: Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na granulce koralików pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
   11. Odpipetować 22 μl buforu elucyjnego DNA do probówki, spłukać osad kulek i zamknąć nakrętkę i wir. Odwirować krótko (5 s), aby mętny płyn opadł na dno probówki i ustawić probówkę na RT na 5 minut.
   12. Określ ilościowo stężenie zbudowanej biblioteki DNA za pomocą fluorometru¹¹ i przechowuj utworzoną bibliotekę DNA w temperaturze -20 °C; stężenie wybranego fragmentu DNA waha się od 0,6 do 10 ng/μL. Ponownie zakoduj informacje biblioteczne w bazie danych biblioteki i odpowiednio przechowuj próbki.

4. Przygotowanie szablonu sekwencjonowania^13,14

UWAGA: Materiały użyte w tej sekcji są dostępne w Zestawie Zestawu do Przygotowania Szablonów (Odczynniki/Roztwory/Materiały) Uniwersalnego Zestawu Reakcji Sekwencjonowania (Tabela Materiałów).

1. Mix biblioteczny
   1. Wypełnij formularz karty zapisów przed uruchomieniem w systemie serwerowym i oznacz probówkę z próbką stężeniem biblioteki i numerem kodu kreskowego. Unikaj używania tych samych kodów kreskowych na różnych próbkach w jednym przebiegu.
   2. Odwirować i wymieszać próbkę z biblioteki i krótko odwirować (5 s). Rozcieńczyć wszystkie próbki do 100 pM wodą wolną od nukleaz, wirować przez 30 s i krótko odwirować próbkę.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że DNA ma średnią długość 260 pz, a 1 pz wynosi 660 g/mol, oblicz konwersję ng/μL na pM, korzystając z następującego równania: 1 ng/μL = 5,827.5 pM/L.
   3. Odpipetować 10 μl rozcieńczonej biblioteki o stężeniu 100 pM do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, wirować przez 30 s i krótko wirować przez 2 s. Przechowywać wymieszaną bibliotekę na lodzie.
2. Przygotowanie szablonu
   1. Uruchom system wzmacniania szablonów i wybierz czysty program. Dodaj olej reakcyjny do 1/2 probówki i dodaj roztwór łamiący emulgator do 1/3 probówki.
   2. Upewnij się, że amppłytka lifikacyjna i adapter myjący są ustawione w pozycji ON. Wyczyść butelkę na odpady i włóż igłę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby zebrać odpady. Potwierdź przetworzone kroki na ekranie systemu amplifikacji szablonu. Naciśnij DALEJ, aby uruchomić czysty program, który zajmie około 15 minut.
   3. Po zakończeniu programu czyszczenia wymienić płytkę wzmacniającą na nową, włożyć probówki zbiorcze zawierające 150 μl roztworu łamiącego II do wirnika i umieścić mostek na probówkach zbiorczych. Dodaj olej reakcyjny do 1/2 probówki, a roztwór do rozbijania emulgatora do 1/3 probówki.
   4. Przygotowanie odczynnika do emulgowania PCR: Zrównoważyć zemulgowany bufor PCR w temperaturze pokojowej aż do rozpuszczenia, krótko odwirować (5 s) wszystkie odczynniki i umieścić je na lodzie przed użyciem.
   5. Odpipetować 120 μl zemulgowanej mieszaniny enzymów PCR, 100 μl buforu matrycowych cząstek kuli jonowej (ISPs), 170,5 μl wody wolnej od nukleaz i 9,5 μl biblioteki mieszanej (100 pM) do probówki zawierającej 2 000 μl zemulgowanego buforu PCR. Dobrze wymieszać roztwór, powtarzając pipetowanie.
      UWAGA: Zmieszany roztwór należy załadować do systemu amplifikacji matrycy w ciągu 15 minut; wszystkie zabiegi należy wykonać w RT.
   6. Umieść nowy filtr do przygotowania szablonu stabilnie na stojaku na probówki portalem próbki do góry. Wirować roztwór przez 5 s, krótko odwirować (5 s) i przenieść roztwór do portalu próbki filtra po wielokrotnym trzykrotnym pipetowaniu 800 μl. Odwirować probówkę, aby zmniejszyć ilość pęcherzyków przed ostatnim wstrzyknięciem. Unikaj wstrzykiwania powietrza do filtra. Po zmieszaniu roztworu wstrzyknąć 200 μl oleju reakcyjnego II.
   7. Obrócić portal próbki filtra w dół i wymienić przyrząd myjący na filtr. Włóż igłę do próbki do środkowego otworu pokrywy wirnika, a następnie dociśnij igłę do dna.
   8. Naciśnij przycisk URUCHOM na ekranie, wybierz program zgodnie z odpowiednim zestawem i naciśnij WSPOMAGANY, aby sprawdzić wszystkie kroki. Naciskaj przycisk NEXT, aż rozpocznie się bieg; Zajmuje to około 4,5 godziny.
   9. Naciśnij przycisk NEXT po zakończeniu programu; system rozpocznie wirowanie trwające 10 minut. Po zatrzymaniu wirowania naciśnij przycisk Otwórz pokrywę i przenieś probówki zbiorcze na stojaki. Jeśli procedura nie przejdzie do następnego kroku w ciągu 15 minut, naciśnij przycisk Końcowe wirowanie, aby ponownie odwirować.
   10. Usunąć sklarowany osad z probówki zbiorczej, pozostawiając w niej 100 μl roztworu. Wymieszaj pozostałą próbkę przez pipetowanie i przenieś próbkę do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml oznaczonych OT (system One touch 2).
       UWAGA: Podczas pipetowania supernatantu należy unikać dotykania dna probówki wzdłuż boku.
   11. Odpipetować 100 μl wody wolnej od nukleaz do każdej z probówek zbiorczych i przenieść roztwór do probówki OT przemytej wielokrotnym pipetowaniem. Dodaj 600 μl wody wolnej od nukleaz do probówki OT, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml, wirować przez 30 s i wirować przy 15 500 x g przez 8 minut.
   12. Delikatnie usuń supernatant z probówki OT z pozostałymi 100 μl i użyj końcówki, aby dokładnie usunąć warstwę oleju. Dodać 900 μl wody wolnej od nukleaz, wirować przez 30 s i wirować przy 15 500 x g przez 8 minut.
   13. Usunąć supernatant do momentu, gdy pozostanie 20 μl, dodać roztwór do ponownego zaparcia matrycy, aby uzyskać objętość 100 μl, wirować przez 30 s i krótko odwirować przez 2 s.
       UWAGA: Roztwór uzyskany w tym kroku musi przejść do następnego kroku w czasie krótszym niż 12 godzin.
   14. Uruchom czysty program w systemie amplifikacji szablonu przed wyłączeniem jego zasilania.
3. Wzbogacanie szablonów
   1. Przygotować mieszaninę do stopienia z 280 μl tween-80 i 40 μl 1 M NaOH.
   2. Umyj koraliki C1. Wirować roztwór kulek C1 przez 30 sekund. Przenieść 100 μl kulek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, włożyć probówkę na stojak magnetyczny na 2 minuty i wyrzucić supernatant.
   3. Przenieś 1 ml roztworu do płukania kulek C1 do probówki i wiruj przez 30 s. Krótko odwirować (5 s), włożyć probówkę do stojaka magnetycznego na 2 minuty i wyrzucić supernatant. Pobrać pipetą 130 μl roztworu do ponownego zaparcia kulek C1 do probówki i wymieszać kulki przez wielokrotne pipetowanie. Unikaj tworzenia bąbelków.
   4. Załaduj 100 μl rozcieńczonej biblioteki, 130 μl kulek C1, 300 μl x 3 roztworu do przemywania szablonów i 300 μl roztworu topniejącego do ośmiodołkowych pasków, jak pokazano na Rysunek 1.
   5. Zainstaluj ośmiodołkowe paski na module wzbogacającym, załaduj końcówkę pipetującą i ustaw probówkę wirówkową o pojemności 200 μl w pozycji do odbioru. Naciśnij START, aby uruchomić program; Zajmuje to około 35 min.
   6. Próbka zostanie automatycznie pobrana do probówki wirówkowej o pojemności 200 μl; zamknij pokrywę i odwiruj ją przy sile 15 500 x g przez 5 minut. Sprawdź dno probówki, aby upewnić się, że pozostały jakieś kulki C1.
   7. Jeśli pozostały kulki C1, kilkakrotnie odpipetować roztwór szablonu 10 razy i włożyć probówkę na stojak magnetyczny na 4 minuty. Przenieść cały supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 0,2 ml i wirować przy 15 500 x g przez 5 minut.
   8. Jeśli nie pozostały żadne widoczne kulki C1, wyrzucić supernatant do momentu, aż pozostanie 10 μl, dodać 200 μl wody wolnej od nukleaz i mieszać pipetując 10 razy. Wirować przy 15 500 x g przez 5 min.
   9. Wyrzucić supernatant z pozostałymi 10 μl i dodać 90 μl wody wolnej od nukleaz, aby osiągnąć całkowitą objętość 100 μl. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać roztwór, wirować przez 5 s i krótko odwirować (5 s). Roztwór można przechowywać w temperaturze 2-8 °C krócej niż 3 dni.

5. Sekwencjonowanie nowej generacji^9,15

UWAGA: Wszystkie procedury w tej sekcji są wykonywane na platformie sekwencjonowania DA8600. Materiały użyte w tej sekcji są dostępne w Zestawie Zestawu do Sekwencjonowania (Odczynniki/Roztwory/Materiały) Uniwersalnego Zestawu Reakcji Sekwencjonowania (Tabela Materiałów).

1. Sprawdź wszystkie odczynniki i materiały wymagane na platformie sekwencjonowania z rozbiegiem.
   1. Odczynnik do sekwencjonowania: Sprawdź, czy dostępny jest roztwór enzymu do sekwencjonowania (6 μl), startery do sekwencjonowania (20 μl), matryca kontroli jakości (5 μl) i dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μl), przechowywane w temperaturze -30-10 °C.
   2. Roztwór do sekwencjonowania: Sprawdzić, czy dostępny jest roztwór do sekwencjonowania II (100 ml), roztwór do sekwencjonowania III (50 ml), bufor do wyżarzania (1,015 μl), bufor ładujący (10 μl), środek spieniający (2 μl), tabletka chloru (1 tabletka) i kulki streptawidyny (100 μl), przechowywane w temperaturze 4 °C.
   3. Materiały: Sprawdź dostępność probówki z odczynnikami o pojemności 250 ml (8), nakrętki probówki z 250 odczynnikami (8), posążka II (8), popijaka (1), butelki z odczynnikiem o pojemności 2 litrów (1) i chipa do sekwencjonowania (1), przechowywanych w RT.
2. Umyj frytek przed użyciem.
   1. Ustaw jeden chip stabilnie na płytce roboczej, wstrzyknij 100 μl wody wolnej od nukleaz do otworu na próbkę, usuń roztwór z portalu wyjściowego i powtórz procedurę.
   2. Wstrzyknąć 100 μl 0,1 M roztworu NaOH do chipa i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   3. Wstrzyknąć 100 μl izopropanolu do otworu na próbkę, usunąć nadmiar roztworu z portalu wyjściowego i powtórzyć procedurę ponownie.
   4. Przykryj portal zewnętrzny bibułą filtracyjną, wlej azot, aby wysuszyć pozostały izopropanol w komorze przepływowej chipa i utrzymuj gotowy do użycia chip w temperaturze RT.
3. Inicjacja sekwencera
   1. Włącz zawór azotu i dostosuj ciśnienie do 30 psi. Uruchom sekwencer, naciśnij CLEAN na ekranie głównym i wybierz wodę lub chlorek, aby odpowiednio umyć maszynę.
      UWAGA: Umyj wodą przed każdym uruchomieniem, myj chlorkiem co tydzień lub w czasie, gdy maszyna będzie czuwać z odczynnikami przez 48 godzin.
   2. Mycie chlorkami: Wybierz jedną butelkę z odczynnikiem przeznaczoną do mycia chlorkami, umyj butelkę dwukrotnie wodą o mocy 18 MΩ i napełnij butelkę 1 litrem wody o mocy 18 MΩ. Umieścić jedną tabletkę chlorku w butelce, rozpuścić tabletkę przez 10 minut, dodać 1 ml 1 M NaOH, a następnie odwrócić butelkę, aby wymieszać roztwór. Roztwór chlorku zużyć w ciągu 3 godzin po przygotowaniu.
   3. Przefiltrować 100 ml roztworu chlorku za pomocą filtra 0,45 μm i zebrać za pomocą dwóch probówek. Zamontuj dwie rurki chlorkowe w pozycjach C1 i C2. Naciśnij CLEAN na ekranie głównym i wyposaż się w chip do mycia chlorków.
   4. Naciśnij DALEJ i sprawdź wszystkie kroki na ekranie, aby uruchomić program prania; program zakończy się po 30 minutach. Rozpocznij pranie wodą po umyciu chlorkiem.
   5. Mycie wodą: Oznacz dwie probówki przeznaczone do wody za pomocą C1 i C2 i umyj probówki dwukrotnie wodą o mocy 18 MΩ. Dodaj 100 ml wody o stężeniu 18 MΩ do każdej z probówek do mycia wodą i ustaw je odpowiednio w pozycjach C1 i C2.
   6. Wybierz program CLEAN, zainstaluj chip przygotowany do mycia wodą, naciśnij NEXT, a następnie sprawdź wszystkie kroki na ekranie, aby uruchomić program prania.
4. Inicjowania
   1. Wyczyść butelkę do mycia roztworem do mycia II, oznacz ją jako W2 i umyj trzykrotnie wodą o mocy 18 MΩ.
   2. Wyczyść rurkę z azotem papierem umieszczonym powietrzem, włóż ją do dna rurki i dostosuj przepływ powietrza do 0,5 l/min. Rozprowadź tlen z butelki i napełnij butelkę 1,920 ml wody o mocy 18 MΩ. Dodać roztwór sekwencyjny II i 10 μl 1 M NaOH do butelki, zamknąć nakrętkę i kilkakrotnie odwrócić butelkę, aby wymieszać roztwór.
   3. Oznacz dwie nowe lampy jako W1 i W3. Dodać 32 μl 1 M NaOH do W1, dodać 40-50 ml 1x roztwór sekwencyjny III do W3 i zamknąć nakrętki.
      UWAGA: 1x roztwór sekwencyjny III musi znajdować się w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut przy pierwszym użyciu. Roztwór sekwencyjny II musi być chroniony przed światłem i przechowywany w temperaturze pokojowej. Butelkę do mycia należy wymienić na nową po 20-krotnym użyciu.
   4. Naciśnij INITIALIZE na ekranie głównym, zmień sipper na pozycje W1, W2 i W3, ustaw odpowiednio rurki w ich pozycji i szczelnie je uszczelnij przez obrót. Zainstaluj chip do inicjalizacji i sprawdź parametry stanu maszyny.
   5. Naciśnij przycisk NEXT, aby uruchomić program inicjalizacyjny; w pierwszej sekcji zajmuje to 40 minut.
      UWAGA: Rękawice należy zmienić przed wymianą nowego łyka, aby uniknąć zanieczyszczenia korpusu łyka. Po użyciu do mycia wodą i inicjalizacji, chipy można zastosować do inicjalizacji, ale nie należy używać chipów używanych do mycia chlorkami do inicjalizacji.
   6. Rozpuść dGTP, dCTP, dATP i dTTP na lodzie i zwiruj do wymieszania. Oznacz cztery nowe probówki jako G, C, A i T i odpipetuj 70 μl roztworu zgodnie z etykietą na probówce.
5. Przygotuj bibliotekę do uruchomienia.
   1. Umieść szablon kontroli jakości, startery i roztwór enzymatyczny na lodzie.
   2. Przygotuj bibliotekę DNA, gdy program inicjalizacyjny ma jeszcze około 20 minut. Wirować szablon kontroli jakości przez 30 sekund w celu wymieszania i krótko wirować przez 2 sekundy. Przenieść 5 μl matrycy kontroli jakości do roztworu szablonu, wirować przez 5 s i odwirować probówkę do 15 500 x g przez 5 minut. Usunąć sklarowany osad przez ostrożne pipetowanie, unikać dotykania osadu i pozostawić w probówce objętość 10 μl.
   3. Dodać 15 μl buforu do wyżarzania do probówki; całkowita objętość roztworu wynosi 25 μl.
   4. Wirować startery sekwencyjne, gdy całkowicie rozpuszczą się na lodzie i krótko wirować przez 2 s. Przenieść 20 μl starterów sekwencyjnych do probówki z poprzedniego etapu, wirować przez 5 s, krótko wirować przez 2 s, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej przed użyciem.
6. Ładowanie próbki i sekwencjonowanie
   1. Odpipetować 55 μl roztworu próbki przygotowanego w poprzednim etapie i wstrzyknąć go do otworu na próbkę w chipie.
   2. Umieść chip na wirówce; utrzymuj wcięcie na zewnątrz, a portal próbki wewnątrz, równoważąc go innym zużytym chipem i odwiruj przez 10 minut.
   3. Przygotuj roztwór ładujący.
      1. Wymieszaj 0,5 ml buforu do wyżarzania i 0,5 ml wody wolnej od nukleaz w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Oznacz go jako 50% bufor do wyżarzania i zużyj w ciągu 7 dni.
      2. Wymieszać 0,5 ml roztworu izopropanolu i 0,5 ml buforu do wyżarzania. Oznacz go jako 50% bufor do mycia i zużyj w ciągu 24 godzin.
      3. Zmieszać 6 μl enzymu sekwencyjnego i 60 μl 50% buforu do wyżarzania. Oznaczyć go jako bufor do reakcji enzymatycznej, a po przygotowaniu umieścić roztwór na lodzie.
      4. Wymieszać 49 μl 50% buforu do wyżarzania i 1 μl środka spieniającego i oznaczyć jako roztwór pieniący.
   4. Wdmuchnąć 100 μl powietrza do roztworu pieniącego, kilkakrotnie pipetować roztwór, aż pęcherzyki znajdą się w gęstym stanie spienienia i utrzymywać objętość piany około 250 μl.
   5. Umieść wiór na stole po odwirowaniu, wstrzyknij 100 μl piany do otworu na próbkę i usuń wytłaczany roztwór do portalu wyjściowego. Umieść chip z powrotem w wirówce i krótko wiruj przez 30 sekund.
   6. Powtórz kroki 5.6.4-5.6.5.
   7. Dwukrotnie wstrzyknąć 100 μl 50% buforu płuczącego i usunąć wytłaczany roztwór do portalu wyjściowego po każdym wstrzyknięciu.
   8. Wstrzyknąć trzykrotnie 100 μl 50% buforu do wyżarzania i usunąć wytłaczany roztwór do portalu wyjściowego po każdym wstrzyknięciu.
   9. Wstrzyknąć 65 μl 50% buforu reakcji enzymatycznej, unikać pęcherzyków powietrza i usunąć wytłaczany roztwór w portalu wyjściowym.
   10. Ustabilizuj załadowany chip w RT przez 5 minut i zainstaluj chip na portalu chipów sekwencera. Wybierz plan zaprogramowany w kroku 6, sprawdź informacje i rozpocznij bieg; Trwa to około 1,5 godziny.
   11. Wykonaj program mycia wodą w ciągu 72 godzin po zakończeniu biegu. Przemycie chlorkami należy wykonać przed myciem wodą, gdy czas ten przekroczy 72 godziny. Wyłącz sekwencer i zamknij zawór azotu.

6. Zaplanuj sekwencjonowanie z instrukcją w systemie serwera reporterskiego¹⁶

UWAGA: Wszystkie procedury w tej sekcji są wykonywane na Ion Proton Sequencer z systemem serwera reporterskiego.

1. Zaloguj się do systemu serwera, wybierz kartę Plan i kliknij pozycję Uruchom szablon planu. Wybierz typ przebiegu Cały genom i wybierz odpowiedni szablon z listy planowanych szablonów przebiegów.
2. Na karcie Plan wprowadź lub dokonaj następujących wyborów:
   1. Wprowadź nową nazwę planu uruchamiania zgodnie z partią próbek, wybierz pozycję hg19 (Homo sapiens) z listy rozwijanej Biblioteka referencji, a następnie wybierz pozycję Brak z list rozwijanych Regiony docelowe i Regiony hotspotu.
   2. Wprowadź liczbę kodów kreskowych używanych w zestawie próbek, wybierz kod kreskowy z listy rozwijanej dla każdej próbki i wprowadź unikatową, opisową nazwę, która może być pomocna w grupowaniu i śledzeniu próbki. Unikaj używania domyślnego Sample 1 i tak dalej.
   3. Wybierz Brak na karcie Ion Reporter, kliknij Dalej i wybierz DNA w aplikacji i Cały genom jako technikę docelową.
   4. Na karcie Zestawy sprawdź wybrane opcje lub wprowadź zmiany, gdy jest to odpowiednie dla przebiegu.
      1. Wybierz Ion Plus Fragment Library Kit z listy rozwijanej Library Kit Type (Typ zestawu bibliotecznego). Wybierz zestaw Ion PI HI-Q OT2 200 z listy rozwijanej Template Kit (Zestaw szablonów), a następnie wybierz pozycję OneTouch jako domyślną. Wybierz zestaw Ion PI HI-Q Sequencing 200 z listy rozwijanej Sequencing Kit (Zestaw do sekwencjonowania).
      2. Wprowadź 300 przepływów, wybierz Ion PITM Chip z listy rozwijanej Chip Type (Typ chipa) i wybierz IonXpress z listy rozwijanej Barcode Set (Zestaw kodów kreskowych).
      3. Anuluj zaznaczenie opcji Oznacz jako duplikaty odczytów i zaznaczenie opcji Włącz ponowne wyrównanie.
   5. Wybierz odpowiednią wtyczkę w zakładce Wtyczki, aby przeprowadzić analizę danych w kroku 7. Dokonaj wyboru w kroku projektów, kliknij przycisk Dalej, a następnie kliknij przycisk Planuj przebieg w prawym dolnym rogu, aby wyświetlić listę planowanych przebiegów.
   6. Na karcie Planowane przebiegi wybierz nowo utworzony przebieg i sprawdź wszystkie ustawienia w oknie przeglądu.

7. Analiza danych

1. Analizuj warianty numerów kopii (CNV) przy użyciu bioinformatycznego przepływu pracy.
   UWAGA: CNV zostały przeanalizowane w przepływie pracy bioinformatycznej z implementacją algorytmu opartego na ukrytym modelu Markowa (HMM)¹⁷; Model wykorzystuje pokrycie odczytu w całym genomie do przewidywania liczby kopii lub statusu ploidalności liczby całkowitej (tj. 0, 1, 2, 3 itd.). Cały potok bioinformatyczny został zbudowany we wtyczce systemu serwera sekwencji, co jest pokazane w Rysunek 2. Etap analizy bioinformatycznej trwa średnio 4 godziny.

Gdy plan sekwencji kończy się po uruchomieniu procesu w maszynie, system serwera sekwencji raportuje podsumowanie z opisowymi informacjami o wygenerowanych danych, stanie chipa, szybkości ładowania ISP i jakości biblioteki, jak pokazano w Rysunek 2. W tej demonstracji wyników uzyskano 17,6 G danych w całkowitej bazie, a ogólny współczynnik obciążenia ISP wynosił 88% w całkowitych studzienkach chipa; mapa cieplna pokazała, że próbka była równomiernie obciążona na całkowitej powierzchni chipa ( Rysunek 2A). W reprezentatywnym przebiegu uzyskano łącznie 99 761 079 odczytów, z czego 77% było użytecznych; we wszystkich studniach załadowanych ISP 100% miało wzbogacone szablony, w których 78% było klonalnych. Spośród wszystkich szablonów klonalnych, 97% zostało zakwalifikowanych jako ostateczna biblioteka (Rysunek 2B). Średnia długość odczytu wynosiła 117 pz, 176 pz i 174 pz odpowiednio ze średnią, medianą i trybem (Rysunek 2C). Szczytowe liczby T, C i A w adaptacji szablonów wynosiły ~76, czyli powyżej kwalifikowanej linii odcięcia wynoszącej 50 (Rysunek 2D). We wszystkich adresowalnych studniach z działającymi dostawcami internetu 99,5% zostało zakwalifikowanych jako biblioteka zbudowana, a 20% bibliotek poliklonalnych i niskiej jakości zostało odfiltrowanych. 76,6% dostawców usług internetowych zostało zakwalifikowanych do dalszej analizy (Rysunek 2E).

Wynik wariantów liczby kopii z pojedynczej próbki S19030109-3 jest pokazany w Rysunek 3; linia kreski jest znormalizowana jako segment euploidii na 22 autosomach i chromosomach płci, czerwona linia jest znormalizowana jako region chromosomu aneuploidii reprezentujący trisomię mozaiki p16.3-q35.2 o wielkości 182,16 Mb na chromosomie 4 i monosomijny segment 33,13 Mb q11.1-q13.33 na chromosomie 22.

Reprezentatywne raporty z 12 próbek przy użyciu zestawów WGA i 13 próbek metodą jednoetapową przy użyciu niezależnie opracowanych odczynników WGA są odpowiednio pokazane w Tabeli 4 i Tabeli 5, które zawierają podsumowanie informacji o ID kodu kreskowego, nazwie próbki, liczbie unikalnych odczytów, wyrównanej średniej długości odczytów, średniej głębokości, procentowej zawartości GC i znaku wariantów chromosomów. Warianty chromosomów oznaczają demonstrowany chromosom płci, lokalizację i wielkość duplikacji oraz delecję na chromosomach.

Rysunek 1: Schemat pozycji ładowania próbki na taśmie 8-dołkowej. Każda studzienka z zawartością załadunkową wskazaną odpowiednio. U oznacza próbkę niewzbogaconą, B oznacza kulki, a W oznacza roztwór do mycia; Na rysunku zaznaczono również puste studnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Bieżące podsumowanie: rozmiar danych, obciążenie ISP i metryki jakości biblioteki. (A) Ogólny status, w tym łączna liczba baz, kluczowy sygnał i szybkość ładowania ISP z mapą cieplną. (B) Łączna liczba odczytów, użyteczna szybkość odczytów i podsumowanie informacji o dostawcy usług internetowych na każdym etapie reakcji. (C) Histogram długości odczytu. (d) Klucz 1 konsensusu TCA. (E) Studnie adresowalne i status klonalny IPS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykład wizualizacji wykresu wariantów numerów kopii: S19030109-3. Sygnały liczby kopii (CN) są wizualizowane na wykresie z niebieskimi i zielonymi interwałami dla chromosomów obok siebie. Podany przykład pokazuje zwiększoną obserwację CN w chromosomie 4 i zmniejszoną obserwację CN w chromosomie 22, ponieważ średnia linia CNV zanotowana na czerwono spada przesunięta od 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Program cyklu termicznego dla wstępnego wzmocnienia. Pokazane są warunki reakcji termicznej, takie jak temperatura, czas i cykle.

Tabela 2: Program cyklu termicznego dla amplifikacji całego genomu za pomocą zestawów do amplifikacji całego genomu. Pokazane są warunki reakcji termicznej, takie jak temperatura, czas i cykle.

Tabela 3: Program cyklu termicznego dla amplifikacji całego genomu za pomocą niezależnie opracowanych odczynników. Pokazane są warunki reakcji termicznej, takie jak temperatura, czas i cykle.

Tabela 4: Przykładowe dane wyjściowe zmienności liczby kopii przy użyciu zestawów do amplifikacji całego genomu w raporcie systemu serwerowego. Typowy arkusz wyjściowy zawiera takie parametry, jak nazwa próbki, liczba unikalnych odczytów, wyrównane odczyty, średnia długość, średnia głębokość, procent CG, odchylenie standardowe długości i dla większości znak statusu chromosomu z chromosomem płci oznaczonym XY i zakończonymi szczegółami CNV. Wykryty CNV jest oznaczony lokalizacją chromosomu i rozmiarem fragmentu.

Tabela 5: Przykładowy wynik zmiany liczby kopii metodą jednoetapową z niezależnie opracowanymi odczynnikami do amplifikacji całego genomu w raporcie systemu serwerowego. Typowy arkusz wyjściowy zawiera takie parametry, jak nazwa próbki, liczba unikalnych odczytów, wyrównane odczyty, średnia długość, średnia głębokość, procent CG, odchylenie standardowe długości i dla większości znak statusu chromosomu z chromosomem płci oznaczonym XY i zakończonymi szczegółami CNV. Wykryty CNV jest oznaczony lokalizacją chromosomu i rozmiarem fragmentu.

Plik uzupełniający 1: Zalecana objętość każdego składnika podczas przygotowywania mieszanki wzorcowej o różnych rozmiarach partii. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.