Artykuł metodologiczny

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

DOI:

10.3791/63493

⸱

17 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie nowej generacji nabiera coraz większego znaczenia w zastosowaniach klinicznych do określania wariantów genetycznych. W preimplantacyjnym teście genetycznym technika ta ma swoje unikalne zalety w zakresie skalowalności, przepustowości i kosztów. W przypadku preimplantacyjnego testu genetycznego do analizy aneuploidii, przedstawiony tutaj system sekwencjonowania nowej generacji (NGS) oparty na półprzewodnikach zapewnia kompleksowe podejście do określania strukturalnych wariantów genetycznych w rozdzielczości co najmniej 8 Mb. Od pobrania próbki do raportu końcowego, proces pracy wymaga wielu etapów przy ścisłym przestrzeganiu protokołów. Ponieważ różne krytyczne kroki mogą decydować o wyniku amplifikacji, jakości biblioteki, pokryciu odczytów i danych wyjściowych, informacje opisowe z wizualną demonstracją inną niż słowa mogą dostarczyć więcej szczegółów na temat operacji i manipulacji, co może mieć duży wpływ na wyniki wszystkich krytycznych kroków. Przedstawione w niniejszym dokumencie metody przedstawią procedury związane z amplifikacją całego genomu (WGA) komórek trophectodermy (TE) poddanych biopsji, budową biblioteki genomicznej, zarządzaniem sekwenatorem i wreszcie generowaniem raportów wariantów liczby kopii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploidia to nieprawidłowość w liczbie chromosomów spowodowana obecnością jednego lub więcej dodatkowych chromosomów lub brakiem jednego lub więcej chromosomów. Zarodki, które są nosicielami pewnego rodzaju aneuploidii, takiej jak utrata jednego chromosomu X (zespół Turnera), dodatkowe kopie autosomów, takie jak trisomie autosomu 21 (zespół Downa), 13 (zespół Patau) i 18 (zespół Edwardsa) lub dodatkowe chromosomy płciowe, takie jak 47, XXY (zespół Klinefeltera) i 47, XXX (zespół potrójnego chromosomu X), mogą przetrwać do końca z wadami wrodzonymi1. Aneuploidia jest główną przyczyną poronień w pierwszym trymestrze ciąży i nieudanych prób zapłodnienia in vitro (IVF)2. Poinformowano, że wskaźnik aneuploidii może wahać się od 25,4% do 84,5% w różnych warstwach wiekowych naturalnego cyklu i grupy kontrolnej z lekiem w praktyce IVF3.

Technologia sekwencjonowania nowej generacji staje się coraz bardziej popularna w klinicznym określaniu informacji genetycznej; zapewnia praktyczny dostęp do sekwencji genomu z wydajnością i wysoką przepustowością. W szczególności sekwencjonowanie nowej generacji zrewolucjonizowało również diagnostykę zaburzeń za pomocą czynników genetycznych i testów na nieprawidłowości w klasie genome4. Wykorzystując technologię sekwencjonowania półprzewodników do bezpośredniego przesyłania sygnałów chemicznych w sekwencjonowaniu bioreakcji do danych cyfrowych, system sekwencyjny oparty na półprzewodnikach zapewnia bezpośrednią detekcję w czasie rzeczywistym w celu sekwencjonowania danych w 3-7 h5,6.

W procedurze in vitro, preimplantacyjne testy genetyczne (PGT) badają profil genetyczny zarodka przed przeniesieniem do macicy, aby poprawić wynik IVF i zmniejszyć ryzyko zaburzeń genetycznych u noworodków1,7. W PGT w połączeniu z technikami NGS materiał genetyczny wyekstrahowany z mniej niż 10 komórek jest amplifikowany za pomocą zestawów do amplifikacji całego genomu lub niezależnie opracowanego odczynnika do amplifikacji całego genomu. Wymaga to tylko jednego kroku w fazie amplifikacji i nie wymaga wstępnej amplifikacji, aby uzyskać produkty amplifikacji całego genomu. Startery lub panele do sekwencjonowania wariantów liczby kopii i specjalnych loci genów są projektowane i stosowane w skonstruowanej bibliotece.

Typowy przepływ pracy preimplantacyjnych testów genetycznych - aneuploidia (PGT-A) w NGS obejmuje procedury seryjne i wymaga intensywnego obciążenia personelu laboratoryjnego8. Niektóre błędy w działaniu spowodowane wycofaniem procedury mogą prowadzić do niepożądanej straty zarówno czasu, jak i zasobów laboratorium. Pomocne jest zwięzłe i przejrzyste standardowe procedury operacyjne (SOP) dla przepływu pracy PGS-NGS; Jednak protokoły w formacie Word nie mogą przedstawiać bardziej szczegółowych informacji na temat przetwarzania próbek, manipulacji urządzeniem i ustawień instrumentów, które można zobrazować w protokole wideo. W tym artykule zweryfikowany przepływ pracy w połączeniu z wizualizowaną demonstracją szczegółów operacyjnych może zaoferować bardziej bezpośrednie i intuicyjne protokoły referencyjne w praktyce PGT na platformie sekwencjonowania półprzewodników.

Protokół tutaj opisuje metodę, która umożliwia grupowanie do 16 biopsji zarodków równolegle. W przypadku większych partii zaleca się stosowanie komercyjnego protokołu opartego na zestawie do sekwencjonowania półprzewodników, takiego jak Reproes-PGS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły i biopsja trofektodermy (TE) (sekcja 1.1.1.1) zastosowane w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez komisję etyki badań na ludziach szpitala nr 924 w dniu 18 września 2017 r. (NO: PLA924-2017-59). Pacjenci/uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w tym badaniu.

1. Izolacja DNA z biopsji ludzkiego embrionu i amplifikacja całego genomu

  1. Protokół amplifikacji całego genomu9,10
    UWAGA: Zestaw Pico PLEX WGA służy do wykonywania amplifikacji całego genomu.
    1. Pobieranie i przechowywanie próbek
      1. Biopsja trofektodermy: Pobrać średnio od sześciu do dziewięciu komórek z przepukliny TE zarodka D5/6 po wspomaganym wykluciu, aby uzyskać kwalifikowaną ilość DNA do następnej amplifikacji.
      2. Przenieść komórki próbki do probówki PCR w 5 μl PBS.
      3. Natychmiast zamrozić próbki w temperaturze -80 °C, jeżeli protokół nie prowadzi bezpośrednio do ekstrakcji DNA.
    2. Liza komórek
      UWAGA: Plik uzupełniający 1 zawiera listę zalecanych objętości każdego składnika i służy jako odniesienie dla tych objętości podczas przygotowywania mieszanki wzorcowej podczas lizy komórek i amplifikacji całego genomu partii 1, 8, 16 i 32 próbek (z nadwyżką w celu uwzględnienia błędów pipetowania). Podczas formułowania innych mieszanek wzorcowych w ramach tego protokołu, objętość każdego składnika jest dodatkowo zwiększana, aby dostosować się do zużycia składników spowodowanego wielokrotnym pipetowaniem. Wszystkie krótkie wirowanie odbywa się na mini wirówce stołowej przez 2-10 s w temperaturze pokojowej (RT), ze stałą prędkością obrotową 10 000 przy sile odśrodkowej 5 300 x g. Siła odśrodkowa musi wynosić od 2 000 x g do 12 000 x g.
      1. Przygotować mieszaninę do lizy komórek z 4,8 μl buforu do rozcieńczania enzymu ekstrakcyjnego i 0,2 μl enzymu do ekstrakcji komórek na próbkę.
      2. Odpipetować 5 μl świeżo przygotowanej próbki do lizy komórek wymieszać z każdą próbką komórek o objętości 5 μl w probówkach do PCR i krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 s. Nie obracaj rurki.
      3. Inkubować próbkę w termocyklerze w następujący sposób: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Po inkubacji krótko odwirować (5 s) probówkę.
    3. Wstępna amplifikacja DNA całego genomu
      1. Przygotować mieszaninę pre-amplifikacyjną z 4,8 μl buforu przedwzmacniacza i 0,2 μl enzymu przedwzmacniacza na próbkę.
      2. Odpipetować 5 μl wstępnego amplifikacji wymieszać z probówkami z próbką przez ścianki probówki i krótko wirować przez 3 s. Unikać sięgania końcówki do dna probówki i nie obracać probówki.
      3. Inkubować próbkę zgodnie z programem termocyklera wymienionym w tabeli 1.
    4. Amplifikacja DNA całego genomu
      1. Krótko odwirować próbkę przez 5 s i umieścić produkt inkubacji przed ampem na lodzie.
      2. Przygotuj mieszaninę do amplifikacji całego genomu z 25 μl buforu do amplifikacji, 0,8 μl enzymu amplifikacyjnego i 34,2 μl wody wolnej od nukleaz na próbkę.
      3. Zmieszać 60 μl świeżo przygotowanej mieszanki do amplifikacji całego genomu z 15 μl produktu inkubacji przed ampem; całkowita objętość musi wynosić 75 μL. Krótko wirować przez 5 sekund. Unikać sięgania końcówki do dna probówki i nie obracać probówki.
      4. Umieść probówkę PCR na termocyklerze i uruchom program termocyklera wymieniony w Tabeli 2.
      5. Odwiruj probówki krótko przez 5 s i przenieś produkty do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      6. Określ ilościowo stężenie produktu WGA za pomocą fluorometru11. Próbki mogą być tymczasowo przechowywane w temperaturze -20°C przez mniej niż 2 miesiące, jeśli nie zostaną przekazane do następnego etapu.
  2. Protokół niezależnie opracowanych odczynników WGA.
    1. Pobieranie i przechowywanie próbek
      1. Pobrać komórki z zarodka D5/6 po wspomaganym wykluwaniu w celu następnej amplifikacji.
      2. Przenieść próbki z 1,5 μl PBS do probówki PCR zawierającej 2 μl PBS.
        UWAGA: PBS jest wolny od Mg2+ i Ca2+.
      3. Próbki należy natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C, jeżeli nie zostały one bezpośrednio poddane protokołowi ekstrakcji DNA.
    2. Liza komórek
      1. Rozpuść bufor do lizy komórek (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM glikol etylenowy, kwas tetraoctowy (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM pirofosforan sodu, 2 mM β-glicerofosforan, 0,1% SDS) w temperaturze pokojowej i umieść go na lodzie. Dodać 2 μl buforu do lizy komórek do każdej próbki i krótko odwirować (5 s).
        UWAGA: Nie należy obracać rurki i unikać dotykania przez końcówkę pipety powierzchni cieczy w probówce, aby uniknąć wydostania komórek lub DNA z układu reakcyjnego.
      2. Inkubować próbkę w termocyklerze w następujący sposób: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, trzymać. Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 s po inkubacji.
    3. Amplifikacja DNA całego genomu
      1. Krótko odwiruj produkt lizy komórek przez 5 sekund i umieść go na lodzie.
      2. Przygotuj mieszaninę do amplifikacji całego genomu dla każdej próbki, mieszając ją z 16 μl wstępnie zmieszanego roztworu do amplifikacji, 1 μl enzymu amplifikacyjnego i 28 μl wody wolnej od nukleaz. Delikatnie wymieszaj, krótko odwiruj (5 s) i umieść mieszaninę na lodzie. Nie obracaj rurki.
      3. Odpipetować 45 μl świeżo przygotowanej mieszaniny do amplifikacji całego genomu do produktu lizy komórek przygotowanego w kroku 1.2.2.2; delikatnie wymieszać i krótko odwirować przez 5 s.
        UWAGA: Nie obracaj rurki i nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała płynu w probówce.
      4. Umieść probówkę PCR na termocyklerze i uruchom program zgodnie z opisem w Tabeli 3.
      5. Odwiruj probówki krótko przez 5 sekund i przenieś produkty do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      6. Określ ilościowo stężenie produktu WGA za pomocą fluorometru11 i zapisz wyniki na karcie QA (analiza jakości). Produkty o kwalifikowanych stężeniach mogą być tymczasowo przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres krótszy niż 2 miesiące, jeśli nie zostaną przekazane do następnego etapu.

2. Wybór fragmentu amplifikacji

UWAGA: Materiały użyte w tej sekcji są dostępne w Zestawie Przygotowania Biblioteki (Tabela Materiałów).

  1. Przygotowanie przed rozpoczęciem
    1. Równowaga kulek magnetycznych (n x 100 μl) do oczyszczania w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Przywróć poprzedni produkt WGA do RT. Wiruj produkt w temperaturze RT przez 30 sekund przed krótkim odwirowaniem.
    3. Przygotuj świeży 70% etanol.
  2. Procedura selekcji fragmentów
    1. Odpipetować 25 μl produktów WGA i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml z 25 μl wstępnie załadowanej wody wolnej od nukleaz.
    2. Dobrze odwiruj i wymieszaj kulki oczyszczające DNA. Porcjować 50 μl do każdej probówki z próbką (oryginalna próbka: kulki (objętość) = 1:1), odwirować i krótko odwirować (5 s). Ustaw probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej dla procesu wiązania DNA.
    3. Włóż probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml do stojaka magnetycznego i poczekaj, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki probówki. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Unikaj pipetowania kulek.
    4. Zgodnie z pierwotną objętością próbki, odpipetować 30 μl (oryginalna próbka: kulki (objętość) = 1:0,6) kulek magnetycznych, wirować i krótko odwirować (5 s). Ustaw probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej dla procesu wiązania DNA.
    5. Włóż probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml do stojaka magnetycznego i odczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki probówki. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
    6. Odpipetować 300 μl 70% etanolu do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, delikatnie obrócić probówkę dwukrotnie pod kątem 180° i przesunąć kulki wzdłuż ścianki probówki, aby dokładnie umyć. Odpipetować i odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
    7. Powtórz procedurę prania raz.
    8. Wyjmij probówkę wirówkową o pojemności 1.5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (5 s). Włóż rurki z powrotem do stojaka na magnesy i poczekaj, aż wszystkie koraliki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rury.
    9. Ostrożnie odpipetować pozostały płyn na dnie. Trzymaj tubę otwartą, aby wysuszyć koraliki w temperaturze RT przez 3-5 minut. Utrzymuj wilgoć z dala od koralików.
      UWAGA: Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na granulce koralików pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
    10. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego, odpipetuj 25-30 μl buforu elucyjnego DNA do probówki, a następnie zamknij nakrętkę i wir. Odwirować na krótko (5 s), aby mętna ciecz znalazła się na dnie probówki i ustawić probówkę na RT na 5 minut.
    11. Włóż probówki z powrotem do stojaków magnetycznych i poczekaj, aż wszystkie koraliki zostaną przyciągnięte do ścianki bocznej rurki, a supernatant stanie się przezroczysty. Ostrożnie przenieś roztwór DNA do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Unikaj pipetowania kulek.
    12. Określ ilościowo stężenie DNA po selekcji fragmentu za pomocą fluorometru11, przechowuj go w temperaturze -20°C. Zazwyczaj stężenie wybranego fragmentu DNA waha się od 1,5 do 2,4 ng/μL.

3. Przygotowanie biblioteki DNA12

UWAGA: Materiały użyte w tej sekcji są dostępne w Zestawie Przygotowania Biblioteki (Tabela Materiałów).

  1. Zakończ naprawę
    1. Równoważ kulki magnetyczne w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Zrównoważyć iloczyn DNA selekcji fragmentów w kroku 2.2.12 do RT. Sprawdzić i zapisać znacznik na każdej fiolce zawierającej DNA.
    3. Przygotuj system naprawy końcówek DNA z 30 μl produktów DNA, 10 μl buforu naprawiającego końcówki, 0,5 μl enzymu naprawiającego końcówki i 9,5 μl wody wolnej od nukleaz w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować probówkę przez 30 s i krótko odwirować (5 s) w temperaturze pokojowej, aby cała ciecz dotarła na dno probówki.
    4. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut, a po inkubacji krótko odwirować (5 s) probówkę.
    5. Odwirować lub odwrócić mieszanie kulek magnetycznych i przenieść 75 μl kulek magnetycznych do probówki zawierającej próbki DNA naprawione na końcach (próbka oryginalna: kulki (objętość) = 1:1,5). Odpipetować lub delikatnie odwirować, aby dobrze wymieszać kulki i krótko odwirować (5 s), aby odwirować całą zawiesinę na dno probówki. Ustaw probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej dla procesu wiązania DNA. Delikatnie odwróć rurki, aby koraliki były rozproszone.
    6. Włóż probówki wirówkowe do stojaka magnetycznego i odczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a supernatant stanie się przezroczysty. Usunąć supernatant i unikać pipetowania kulek, trzymając probówki na ruszcie podczas pipetowania.
    7. Przenieś 300 μl nowo przygotowanego 70% etanolu do probówek, delikatnie obróć probówki dwukrotnie pod kątem 180° i przesuń kulki wzdłuż ścianki rurki w celu dokładnego umycia. Odpipetować i odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
    8. Powtórz procedurę prania raz.
    9. Wyjmij probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (5 s). Włóż rurki z powrotem do stojaka na magnesy i poczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rury.
    10. Ostrożnie odpipetować pozostały płyn na dnie. Otwórz nakrętkę probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i susz kulki w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut. Utrzymuj wilgoć z dala od koralików.
      UWAGA: Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na granulce koralików pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
    11. Pobrać pipetą 33 μl buforu elucyjnego DNA do probówki, zamknąć nakrętkę i wprowadzić wir. Odwirować krótko (5 s), aby mętna zawiesina znalazła się na dnie probówki i ustawić probówkę w pozycji RT na 5 minut.
    12. Włóż rurki z powrotem do stojaków magnetycznych i poczekaj, aż wszystkie koraliki zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a roztwór stanie się przezroczysty. Ostrożnie przenieś roztwór DNA do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml z odpowiednim znacznikiem, unikając pipetowania kulek.
  2. Podwiązanie kodów kreskowych
    1. Umieść odczynniki do ligacji kodów kreskowych w kroku 3.2.2 na lodzie, aby stopić wszystkie zamrożone odczynniki.
    2. Przygotuj system ligacji z 32 μl produktów DNA z naprawą końcową, 10 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl buforu ligazy, 1 μl ligazy i 1 μl adaptacji P1 w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 1 μl każdego odczynnika z kodem kreskowym do roztworu, wymieszać w probówce dla jednej próbki, wirować przez 5 s i krótko odwirować (5 s), aby uzyskać cały płyn na dnie probówki.
      UWAGA: Podczas dodawania kodów kreskowych upewnij się, że liczba kodów kreskowych i próbek jest zgodna; za każdym razem otwierać tylko jedną fiolkę z kodami kreskowymi, aby uniknąć zmieszanego zanieczyszczenia kodami kreskowymi; Zmień rękawice na każde pięć lub sześć dodanych kodów kreskowych.
    3. Inkubować probówki w temperaturze 25 °C przez 30 minut.
    4. Odpipetować 75 μl (oryginalna próbka: kulki (objętość) = 1:1,5) kulek magnetycznych do probówki i pipetować lub delikatnie wirować, aby dobrze wymieszać kulki. Odwirować krótko (5 s), aby odwirować całą zawiesinę do dna, unikając agregacji kulek. Ustaw probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej dla procesu wiązania DNA. Delikatnie odwróć rurki, aby koraliki były rozproszone.
    5. Włóż probówki wirówkowe do stojaka magnetycznego i odczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a supernatant stanie się przezroczysty. Usunąć supernatant i unikać pipetowania kulek, trzymając probówki na ruszcie podczas pipetowania.
    6. Przenieś 300 μl nowo przygotowanego 70% etanolu do probówek, delikatnie obróć probówki dwukrotnie pod kątem 180° i przesuń kulki wzdłuż ścianki rurki w celu dokładnego umycia. Odpipetować i odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
    7. Powtórz procedurę prania raz.
    8. Wyjmij probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (5 s). Włóż rurki z powrotem do stojaka na magnesy i poczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rury. Ostrożnie odpipetować pozostały supernatant na dnie.
    9. Trzymaj nasadkę rurki otwartą, aby wysuszyć koraliki w temperaturze RT przez 3-5 minut. Utrzymuj wilgoć z dala od koralików.
      UWAGA: Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na granulce koralików pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
    10. Pobrać pipetą 15 μl buforu elucyjnego DNA do probówki. Opłucz granulki kulek aż do dna tuby, uszczelnij nakrętkę i zawiruj. Odwirować krótko (5 s), aby mętna zawiesina opadła na dno probówki i utrzymać probówkę stabilnie na poziomie RT przez 5 minut.
  3. Wzmocnienie fragmentów
    1. Umieść odczynniki do budowy biblioteki na lodzie, gdy zamrożony odczynnik się rozpuści.
    2. Przenieś 47,5 μl mieszanki enzymów i 2,5 μl mieszanki starterów do probówki zawierającej eluowane DNA i kulki, wiruj przez 5 s i krótko odwiruj (5 s), aby cała ciecz dotarła na dno probówki.
    3. Ustaw probówkę na RT na 5 minut. Włóż probówki z powrotem do stojaków magnetycznych i poczekaj, aż wszystkie koraliki zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a supernatant stanie się przezroczysty. Ostrożnie przenieś roztwór DNA do probówek PCR o pojemności 0,2 ml z wyraźnie zaznaczonymi znacznikami i unikaj pipetowania kulek.
    4. Inkubować próbkę w termocyklerze z następującym programem: 72°C, 20 min; 98°C, 2 min; 98°C, 15 s; 62°C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 cykli); 70 °C, 5 min. Po zakończeniu reakcji krótko odwirować (5 s) probówkę i przechowywać produkty w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieś produkty PCR do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml (niskie nasadkę). Po zakończeniu reakcji dodać 97,5 μl (pierwotna objętość próbki: kulki (objętość) = 1:1,5) kulek magnetycznych do probówki, odpipetować lub delikatnie odkręcić, aby dobrze wymieszać kulki, i krótko odwirować (5 s), aby odwirować cały płyn na dno. Unikaj agregacji koralików. Ustaw rurkę na RT na 5 minut. Delikatnie odwróć rurki, aby koraliki były rozproszone.
    6. Włóż probówki wirówkowe do stojaka magnetycznego i odczekaj 5 minut, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do ściany bocznej, a supernatant stanie się przezroczysty. Usunąć supernatant, unikać pipetowania kulek i trzymać probówki stabilnie na ruszcie.
    7. Przenieś 300 μl nowo przygotowanego 70% etanolu do probówek, delikatnie obróć probówki dwukrotnie pod kątem 180° i przesuń kulki wzdłuż ścianki rurki w celu dokładnego umycia. Odpipetować i odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
    8. Powtórz procedurę prania raz.
    9. Wyjmij probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (5 s). Włóż rurkę z powrotem do stojaka na magnesy i poczekaj 5 minut, aż wszystkie koraliki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rury. Ostrożnie odpipetować pozostały płyn na dnie.
    10. Trzymaj nasadkę rurki otwartą, aby wysuszyć koraliki w temperaturze RT przez 3-5 minut. Utrzymuj wilgoć z dala od koralików.
      UWAGA: Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na granulce koralików pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
    11. Odpipetować 22 μl buforu elucyjnego DNA do probówki, spłukać osad kulek i zamknąć nakrętkę i wir. Odwirować krótko (5 s), aby mętny płyn opadł na dno probówki i ustawić probówkę na RT na 5 minut.
    12. Określ ilościowo stężenie zbudowanej biblioteki DNA za pomocą fluorometru11 i przechowuj utworzoną bibliotekę DNA w temperaturze -20 °C; stężenie wybranego fragmentu DNA waha się od 0,6 do 10 ng/μL. Ponownie zakoduj informacje biblioteczne w bazie danych biblioteki i odpowiednio przechowuj próbki.

4. Przygotowanie szablonu sekwencjonowania13,14

UWAGA: Materiały użyte w tej sekcji są dostępne w Zestawie Zestawu do Przygotowania Szablonów (Odczynniki/Roztwory/Materiały) Uniwersalnego Zestawu Reakcji Sekwencjonowania (Tabela Materiałów).

  1. Mix biblioteczny
    1. Wypełnij formularz karty zapisów przed uruchomieniem w systemie serwerowym i oznacz probówkę z próbką stężeniem biblioteki i numerem kodu kreskowego. Unikaj używania tych samych kodów kreskowych na różnych próbkach w jednym przebiegu.
    2. Odwirować i wymieszać próbkę z biblioteki i krótko odwirować (5 s). Rozcieńczyć wszystkie próbki do 100 pM wodą wolną od nukleaz, wirować przez 30 s i krótko odwirować próbkę.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że DNA ma średnią długość 260 pz, a 1 pz wynosi 660 g/mol, oblicz konwersję ng/μL na pM, korzystając z następującego równania: 1 ng/μL = 5,827.5 pM/L.
    3. Odpipetować 10 μl rozcieńczonej biblioteki o stężeniu 100 pM do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, wirować przez 30 s i krótko wirować przez 2 s. Przechowywać wymieszaną bibliotekę na lodzie.
  2. Przygotowanie szablonu
    1. Uruchom system wzmacniania szablonów i wybierz czysty program. Dodaj olej reakcyjny do 1/2 probówki i dodaj roztwór łamiący emulgator do 1/3 probówki.
    2. Upewnij się, że amppłytka lifikacyjna i adapter myjący są ustawione w pozycji ON. Wyczyść butelkę na odpady i włóż igłę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby zebrać odpady. Potwierdź przetworzone kroki na ekranie systemu amplifikacji szablonu. Naciśnij DALEJ, aby uruchomić czysty program, który zajmie około 15 minut.
    3. Po zakończeniu programu czyszczenia wymienić płytkę wzmacniającą na nową, włożyć probówki zbiorcze zawierające 150 μl roztworu łamiącego II do wirnika i umieścić mostek na probówkach zbiorczych. Dodaj olej reakcyjny do 1/2 probówki, a roztwór do rozbijania emulgatora do 1/3 probówki.
    4. Przygotowanie odczynnika do emulgowania PCR: Zrównoważyć zemulgowany bufor PCR w temperaturze pokojowej aż do rozpuszczenia, krótko odwirować (5 s) wszystkie odczynniki i umieścić je na lodzie przed użyciem.
    5. Odpipetować 120 μl zemulgowanej mieszaniny enzymów PCR, 100 μl buforu matrycowych cząstek kuli jonowej (ISPs), 170,5 μl wody wolnej od nukleaz i 9,5 μl biblioteki mieszanej (100 pM) do probówki zawierającej 2 000 μl zemulgowanego buforu PCR. Dobrze wymieszać roztwór, powtarzając pipetowanie.
      UWAGA: Zmieszany roztwór należy załadować do systemu amplifikacji matrycy w ciągu 15 minut; wszystkie zabiegi należy wykonać w RT.
    6. Umieść nowy filtr do przygotowania szablonu stabilnie na stojaku na probówki portalem próbki do góry. Wirować roztwór przez 5 s, krótko odwirować (5 s) i przenieść roztwór do portalu próbki filtra po wielokrotnym trzykrotnym pipetowaniu 800 μl. Odwirować probówkę, aby zmniejszyć ilość pęcherzyków przed ostatnim wstrzyknięciem. Unikaj wstrzykiwania powietrza do filtra. Po zmieszaniu roztworu wstrzyknąć 200 μl oleju reakcyjnego II.
    7. Obrócić portal próbki filtra w dół i wymienić przyrząd myjący na filtr. Włóż igłę do próbki do środkowego otworu pokrywy wirnika, a następnie dociśnij igłę do dna.
    8. Naciśnij przycisk URUCHOM na ekranie, wybierz program zgodnie z odpowiednim zestawem i naciśnij WSPOMAGANY, aby sprawdzić wszystkie kroki. Naciskaj przycisk NEXT, aż rozpocznie się bieg; Zajmuje to około 4,5 godziny.
    9. Naciśnij przycisk NEXT po zakończeniu programu; system rozpocznie wirowanie trwające 10 minut. Po zatrzymaniu wirowania naciśnij przycisk Otwórz pokrywę i przenieś probówki zbiorcze na stojaki. Jeśli procedura nie przejdzie do następnego kroku w ciągu 15 minut, naciśnij przycisk Końcowe wirowanie, aby ponownie odwirować.
    10. Usunąć sklarowany osad z probówki zbiorczej, pozostawiając w niej 100 μl roztworu. Wymieszaj pozostałą próbkę przez pipetowanie i przenieś próbkę do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml oznaczonych OT (system One touch 2).
      UWAGA: Podczas pipetowania supernatantu należy unikać dotykania dna probówki wzdłuż boku.
    11. Odpipetować 100 μl wody wolnej od nukleaz do każdej z probówek zbiorczych i przenieść roztwór do probówki OT przemytej wielokrotnym pipetowaniem. Dodaj 600 μl wody wolnej od nukleaz do probówki OT, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml, wirować przez 30 s i wirować przy 15 500 x g przez 8 minut.
    12. Delikatnie usuń supernatant z probówki OT z pozostałymi 100 μl i użyj końcówki, aby dokładnie usunąć warstwę oleju. Dodać 900 μl wody wolnej od nukleaz, wirować przez 30 s i wirować przy 15 500 x g przez 8 minut.
    13. Usunąć supernatant do momentu, gdy pozostanie 20 μl, dodać roztwór do ponownego zaparcia matrycy, aby uzyskać objętość 100 μl, wirować przez 30 s i krótko odwirować przez 2 s.
      UWAGA: Roztwór uzyskany w tym kroku musi przejść do następnego kroku w czasie krótszym niż 12 godzin.
    14. Uruchom czysty program w systemie amplifikacji szablonu przed wyłączeniem jego zasilania.
  3. Wzbogacanie szablonów
    1. Przygotować mieszaninę do stopienia z 280 μl tween-80 i 40 μl 1 M NaOH.
    2. Umyj koraliki C1. Wirować roztwór kulek C1 przez 30 sekund. Przenieść 100 μl kulek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, włożyć probówkę na stojak magnetyczny na 2 minuty i wyrzucić supernatant.
    3. Przenieś 1 ml roztworu do płukania kulek C1 do probówki i wiruj przez 30 s. Krótko odwirować (5 s), włożyć probówkę do stojaka magnetycznego na 2 minuty i wyrzucić supernatant. Pobrać pipetą 130 μl roztworu do ponownego zaparcia kulek C1 do probówki i wymieszać kulki przez wielokrotne pipetowanie. Unikaj tworzenia bąbelków.
    4. Załaduj 100 μl rozcieńczonej biblioteki, 130 μl kulek C1, 300 μl x 3 roztworu do przemywania szablonów i 300 μl roztworu topniejącego do ośmiodołkowych pasków, jak pokazano na Rysunek 1.
    5. Zainstaluj ośmiodołkowe paski na module wzbogacającym, załaduj końcówkę pipetującą i ustaw probówkę wirówkową o pojemności 200 μl w pozycji do odbioru. Naciśnij START, aby uruchomić program; Zajmuje to około 35 min.
    6. Próbka zostanie automatycznie pobrana do probówki wirówkowej o pojemności 200 μl; zamknij pokrywę i odwiruj ją przy sile 15 500 x g przez 5 minut. Sprawdź dno probówki, aby upewnić się, że pozostały jakieś kulki C1.
    7. Jeśli pozostały kulki C1, kilkakrotnie odpipetować roztwór szablonu 10 razy i włożyć probówkę na stojak magnetyczny na 4 minuty. Przenieść cały supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 0,2 ml i wirować przy 15 500 x g przez 5 minut.
    8. Jeśli nie pozostały żadne widoczne kulki C1, wyrzucić supernatant do momentu, aż pozostanie 10 μl, dodać 200 μl wody wolnej od nukleaz i mieszać pipetując 10 razy. Wirować przy 15 500 x g przez 5 min.
    9. Wyrzucić supernatant z pozostałymi 10 μl i dodać 90 μl wody wolnej od nukleaz, aby osiągnąć całkowitą objętość 100 μl. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać roztwór, wirować przez 5 s i krótko odwirować (5 s). Roztwór można przechowywać w temperaturze 2-8 °C krócej niż 3 dni.

5. Sekwencjonowanie nowej generacji9,15

UWAGA: Wszystkie procedury w tej sekcji są wykonywane na platformie sekwencjonowania DA8600. Materiały użyte w tej sekcji są dostępne w Zestawie Zestawu do Sekwencjonowania (Odczynniki/Roztwory/Materiały) Uniwersalnego Zestawu Reakcji Sekwencjonowania (Tabela Materiałów).

  1. Sprawdź wszystkie odczynniki i materiały wymagane na platformie sekwencjonowania z rozbiegiem.
    1. Odczynnik do sekwencjonowania: Sprawdź, czy dostępny jest roztwór enzymu do sekwencjonowania (6 μl), startery do sekwencjonowania (20 μl), matryca kontroli jakości (5 μl) i dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μl), przechowywane w temperaturze -30-10 °C.
    2. Roztwór do sekwencjonowania: Sprawdzić, czy dostępny jest roztwór do sekwencjonowania II (100 ml), roztwór do sekwencjonowania III (50 ml), bufor do wyżarzania (1,015 μl), bufor ładujący (10 μl), środek spieniający (2 μl), tabletka chloru (1 tabletka) i kulki streptawidyny (100 μl), przechowywane w temperaturze 4 °C.
    3. Materiały: Sprawdź dostępność probówki z odczynnikami o pojemności 250 ml (8), nakrętki probówki z 250 odczynnikami (8), posążka II (8), popijaka (1), butelki z odczynnikiem o pojemności 2 litrów (1) i chipa do sekwencjonowania (1), przechowywanych w RT.
  2. Umyj frytek przed użyciem.
    1. Ustaw jeden chip stabilnie na płytce roboczej, wstrzyknij 100 μl wody wolnej od nukleaz do otworu na próbkę, usuń roztwór z portalu wyjściowego i powtórz procedurę.
    2. Wstrzyknąć 100 μl 0,1 M roztworu NaOH do chipa i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    3. Wstrzyknąć 100 μl izopropanolu do otworu na próbkę, usunąć nadmiar roztworu z portalu wyjściowego i powtórzyć procedurę ponownie.
    4. Przykryj portal zewnętrzny bibułą filtracyjną, wlej azot, aby wysuszyć pozostały izopropanol w komorze przepływowej chipa i utrzymuj gotowy do użycia chip w temperaturze RT.
  3. Inicjacja sekwencera
    1. Włącz zawór azotu i dostosuj ciśnienie do 30 psi. Uruchom sekwencer, naciśnij CLEAN na ekranie głównym i wybierz wodę lub chlorek, aby odpowiednio umyć maszynę.
      UWAGA: Umyj wodą przed każdym uruchomieniem, myj chlorkiem co tydzień lub w czasie, gdy maszyna będzie czuwać z odczynnikami przez 48 godzin.
    2. Mycie chlorkami: Wybierz jedną butelkę z odczynnikiem przeznaczoną do mycia chlorkami, umyj butelkę dwukrotnie wodą o mocy 18 MΩ i napełnij butelkę 1 litrem wody o mocy 18 MΩ. Umieścić jedną tabletkę chlorku w butelce, rozpuścić tabletkę przez 10 minut, dodać 1 ml 1 M NaOH, a następnie odwrócić butelkę, aby wymieszać roztwór. Roztwór chlorku zużyć w ciągu 3 godzin po przygotowaniu.
    3. Przefiltrować 100 ml roztworu chlorku za pomocą filtra 0,45 μm i zebrać za pomocą dwóch probówek. Zamontuj dwie rurki chlorkowe w pozycjach C1 i C2. Naciśnij CLEAN na ekranie głównym i wyposaż się w chip do mycia chlorków.
    4. Naciśnij DALEJ i sprawdź wszystkie kroki na ekranie, aby uruchomić program prania; program zakończy się po 30 minutach. Rozpocznij pranie wodą po umyciu chlorkiem.
    5. Mycie wodą: Oznacz dwie probówki przeznaczone do wody za pomocą C1 i C2 i umyj probówki dwukrotnie wodą o mocy 18 MΩ. Dodaj 100 ml wody o stężeniu 18 MΩ do każdej z probówek do mycia wodą i ustaw je odpowiednio w pozycjach C1 i C2.
    6. Wybierz program CLEAN, zainstaluj chip przygotowany do mycia wodą, naciśnij NEXT, a następnie sprawdź wszystkie kroki na ekranie, aby uruchomić program prania.
  4. Inicjowania
    1. Wyczyść butelkę do mycia roztworem do mycia II, oznacz ją jako W2 i umyj trzykrotnie wodą o mocy 18 MΩ.
    2. Wyczyść rurkę z azotem papierem umieszczonym powietrzem, włóż ją do dna rurki i dostosuj przepływ powietrza do 0,5 l/min. Rozprowadź tlen z butelki i napełnij butelkę 1,920 ml wody o mocy 18 MΩ. Dodać roztwór sekwencyjny II i 10 μl 1 M NaOH do butelki, zamknąć nakrętkę i kilkakrotnie odwrócić butelkę, aby wymieszać roztwór.
    3. Oznacz dwie nowe lampy jako W1 i W3. Dodać 32 μl 1 M NaOH do W1, dodać 40-50 ml 1x roztwór sekwencyjny III do W3 i zamknąć nakrętki.
      UWAGA: 1x roztwór sekwencyjny III musi znajdować się w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut przy pierwszym użyciu. Roztwór sekwencyjny II musi być chroniony przed światłem i przechowywany w temperaturze pokojowej. Butelkę do mycia należy wymienić na nową po 20-krotnym użyciu.
    4. Naciśnij INITIALIZE na ekranie głównym, zmień sipper na pozycje W1, W2 i W3, ustaw odpowiednio rurki w ich pozycji i szczelnie je uszczelnij przez obrót. Zainstaluj chip do inicjalizacji i sprawdź parametry stanu maszyny.
    5. Naciśnij przycisk NEXT, aby uruchomić program inicjalizacyjny; w pierwszej sekcji zajmuje to 40 minut.
      UWAGA: Rękawice należy zmienić przed wymianą nowego łyka, aby uniknąć zanieczyszczenia korpusu łyka. Po użyciu do mycia wodą i inicjalizacji, chipy można zastosować do inicjalizacji, ale nie należy używać chipów używanych do mycia chlorkami do inicjalizacji.
    6. Rozpuść dGTP, dCTP, dATP i dTTP na lodzie i zwiruj do wymieszania. Oznacz cztery nowe probówki jako G, C, A i T i odpipetuj 70 μl roztworu zgodnie z etykietą na probówce.
  5. Przygotuj bibliotekę do uruchomienia.
    1. Umieść szablon kontroli jakości, startery i roztwór enzymatyczny na lodzie.
    2. Przygotuj bibliotekę DNA, gdy program inicjalizacyjny ma jeszcze około 20 minut. Wirować szablon kontroli jakości przez 30 sekund w celu wymieszania i krótko wirować przez 2 sekundy. Przenieść 5 μl matrycy kontroli jakości do roztworu szablonu, wirować przez 5 s i odwirować probówkę do 15 500 x g przez 5 minut. Usunąć sklarowany osad przez ostrożne pipetowanie, unikać dotykania osadu i pozostawić w probówce objętość 10 μl.
    3. Dodać 15 μl buforu do wyżarzania do probówki; całkowita objętość roztworu wynosi 25 μl.
    4. Wirować startery sekwencyjne, gdy całkowicie rozpuszczą się na lodzie i krótko wirować przez 2 s. Przenieść 20 μl starterów sekwencyjnych do probówki z poprzedniego etapu, wirować przez 5 s, krótko wirować przez 2 s, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej przed użyciem.
  6. Ładowanie próbki i sekwencjonowanie
    1. Odpipetować 55 μl roztworu próbki przygotowanego w poprzednim etapie i wstrzyknąć go do otworu na próbkę w chipie.
    2. Umieść chip na wirówce; utrzymuj wcięcie na zewnątrz, a portal próbki wewnątrz, równoważąc go innym zużytym chipem i odwiruj przez 10 minut.
    3. Przygotuj roztwór ładujący.
      1. Wymieszaj 0,5 ml buforu do wyżarzania i 0,5 ml wody wolnej od nukleaz w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Oznacz go jako 50% bufor do wyżarzania i zużyj w ciągu 7 dni.
      2. Wymieszać 0,5 ml roztworu izopropanolu i 0,5 ml buforu do wyżarzania. Oznacz go jako 50% bufor do mycia i zużyj w ciągu 24 godzin.
      3. Zmieszać 6 μl enzymu sekwencyjnego i 60 μl 50% buforu do wyżarzania. Oznaczyć go jako bufor do reakcji enzymatycznej, a po przygotowaniu umieścić roztwór na lodzie.
      4. Wymieszać 49 μl 50% buforu do wyżarzania i 1 μl środka spieniającego i oznaczyć jako roztwór pieniący.
    4. Wdmuchnąć 100 μl powietrza do roztworu pieniącego, kilkakrotnie pipetować roztwór, aż pęcherzyki znajdą się w gęstym stanie spienienia i utrzymywać objętość piany około 250 μl.
    5. Umieść wiór na stole po odwirowaniu, wstrzyknij 100 μl piany do otworu na próbkę i usuń wytłaczany roztwór do portalu wyjściowego. Umieść chip z powrotem w wirówce i krótko wiruj przez 30 sekund.
    6. Powtórz kroki 5.6.4-5.6.5.
    7. Dwukrotnie wstrzyknąć 100 μl 50% buforu płuczącego i usunąć wytłaczany roztwór do portalu wyjściowego po każdym wstrzyknięciu.
    8. Wstrzyknąć trzykrotnie 100 μl 50% buforu do wyżarzania i usunąć wytłaczany roztwór do portalu wyjściowego po każdym wstrzyknięciu.
    9. Wstrzyknąć 65 μl 50% buforu reakcji enzymatycznej, unikać pęcherzyków powietrza i usunąć wytłaczany roztwór w portalu wyjściowym.
    10. Ustabilizuj załadowany chip w RT przez 5 minut i zainstaluj chip na portalu chipów sekwencera. Wybierz plan zaprogramowany w kroku 6, sprawdź informacje i rozpocznij bieg; Trwa to około 1,5 godziny.
    11. Wykonaj program mycia wodą w ciągu 72 godzin po zakończeniu biegu. Przemycie chlorkami należy wykonać przed myciem wodą, gdy czas ten przekroczy 72 godziny. Wyłącz sekwencer i zamknij zawór azotu.

6. Zaplanuj sekwencjonowanie z instrukcją w systemie serwera reporterskiego16

UWAGA: Wszystkie procedury w tej sekcji są wykonywane na Ion Proton Sequencer z systemem serwera reporterskiego.

  1. Zaloguj się do systemu serwera, wybierz kartę Plan i kliknij pozycję Uruchom szablon planu. Wybierz typ przebiegu Cały genom i wybierz odpowiedni szablon z listy planowanych szablonów przebiegów.
  2. Na karcie Plan wprowadź lub dokonaj następujących wyborów:
    1. Wprowadź nową nazwę planu uruchamiania zgodnie z partią próbek, wybierz pozycję hg19 (Homo sapiens) z listy rozwijanej Biblioteka referencji, a następnie wybierz pozycję Brak z list rozwijanych Regiony docelowe i Regiony hotspotu.
    2. Wprowadź liczbę kodów kreskowych używanych w zestawie próbek, wybierz kod kreskowy z listy rozwijanej dla każdej próbki i wprowadź unikatową, opisową nazwę, która może być pomocna w grupowaniu i śledzeniu próbki. Unikaj używania domyślnego Sample 1 i tak dalej.
    3. Wybierz Brak na karcie Ion Reporter, kliknij Dalej i wybierz DNA w aplikacji i Cały genom jako technikę docelową.
    4. Na karcie Zestawy sprawdź wybrane opcje lub wprowadź zmiany, gdy jest to odpowiednie dla przebiegu.
      1. Wybierz Ion Plus Fragment Library Kit z listy rozwijanej Library Kit Type (Typ zestawu bibliotecznego). Wybierz zestaw Ion PI HI-Q OT2 200 z listy rozwijanej Template Kit (Zestaw szablonów), a następnie wybierz pozycję OneTouch jako domyślną. Wybierz zestaw Ion PI HI-Q Sequencing 200 z listy rozwijanej Sequencing Kit (Zestaw do sekwencjonowania).
      2. Wprowadź 300 przepływów, wybierz Ion PITM Chip z listy rozwijanej Chip Type (Typ chipa) i wybierz IonXpress z listy rozwijanej Barcode Set (Zestaw kodów kreskowych).
      3. Anuluj zaznaczenie opcji Oznacz jako duplikaty odczytów i zaznaczenie opcji Włącz ponowne wyrównanie.
    5. Wybierz odpowiednią wtyczkę w zakładce Wtyczki, aby przeprowadzić analizę danych w kroku 7. Dokonaj wyboru w kroku projektów, kliknij przycisk Dalej, a następnie kliknij przycisk Planuj przebieg w prawym dolnym rogu, aby wyświetlić listę planowanych przebiegów.
    6. Na karcie Planowane przebiegi wybierz nowo utworzony przebieg i sprawdź wszystkie ustawienia w oknie przeglądu.

7. Analiza danych

  1. Analizuj warianty numerów kopii (CNV) przy użyciu bioinformatycznego przepływu pracy.
    UWAGA: CNV zostały przeanalizowane w przepływie pracy bioinformatycznej z implementacją algorytmu opartego na ukrytym modelu Markowa (HMM)17; Model wykorzystuje pokrycie odczytu w całym genomie do przewidywania liczby kopii lub statusu ploidalności liczby całkowitej (tj. 0, 1, 2, 3 itd.). Cały potok bioinformatyczny został zbudowany we wtyczce systemu serwera sekwencji, co jest pokazane w Rysunek 2. Etap analizy bioinformatycznej trwa średnio 4 godziny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy plan sekwencji kończy się po uruchomieniu procesu w maszynie, system serwera sekwencji raportuje podsumowanie z opisowymi informacjami o wygenerowanych danych, stanie chipa, szybkości ładowania ISP i jakości biblioteki, jak pokazano w Rysunek 2. W tej demonstracji wyników uzyskano 17,6 G danych w całkowitej bazie, a ogólny współczynnik obciążenia ISP wynosił 88% w całkowitych studzienkach chipa; mapa cieplna pokazała, że próbka była równomiernie obciążona na całkowitej powierzchni chipa ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploidia chromosomalna zarodków jest przyczyną dużej części utraty ciąży, zarówno poczętej naturalnie, jak i w wyniku zapłodnienia in vitro (IVF). W praktyce klinicznej zapłodnienia in vitro proponuje się, że badanie przesiewowe aneuploidii zarodka i przeniesienie zarodka euploidii może poprawić wyniki zapłodnienia in vitro. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest najwcześniejszą techniką przyjętą do selekcji płci i PGT-A; Technika ta wymaga jednak większej wiedzy technicznej od personelu laborator...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr. Zhangyong Mingowi i Panu Rongji Hou za ich rady dotyczące rozszerzonej aplikacji LIMS. Badanie to jest wspierane przez Specjalne Projekty Badawcze PLA na rzecz Planowania Rodziny (17JS008, 20JSZ08), Fundusz Kluczowego Laboratorium Badań nad Chorobami Metabolicznymi Guangxi (nr 20-065-76) oraz Projekt Badawczy Nauki i Technologii Zdrowia Obywatelskiego w Kantonie (201803010034).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m Filtr strzykawkowyMerkmilliporeMillex-HV
1,5 ml Probówki DNA LoBindEppendorf30108051
15 ml ProbówkiGreiner Bio-One188261
2,0 mLDNA LoBind ProbówkiEppendorf30108078
50 mlGreiner Bio-One227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)FAPON&
nbsp; Odczynnik Anstart Tap DNA PolymeraseFAPON
AMPure XP (kulki magnetyczne do wiązania DNA)BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Bufor do lizy komórekPołudniowy UniwersytetMedyczny Bufor do lizy komórek zawierający 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM glikol etylenowy kwas tetraoctowy (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodu pirofosforan, 2 mM β-glicerofosforan, 0,1% SDS
ClinVarNCBIBufor
elucyjny https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ DNANEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Alkohol etylowyGuangzhou Fabryka odczynników chemicznych Thermo Fisher Naukowehttp://www.chemicalreagent.com/
Niezależnie opracowane odczynniki do amplifikacji całego genomuPołudniowy UniwersytetOdczynniki składają się z następujących składników:
1. Liza komórek
2. Amplifikacja Wstępnie zmieszany roztwór
      1) Podkład WGA-P2 (10 μ M)
      2) dNTP (10 mM)
      3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2 + < / sup> Plus)
3. Enzym wzmacniający
      1) Polimeraza DNA Anstart Tap (5 U/μ L)
Zestaw Ion PI Hi-Q OT2 200Zestaw Thermo Fisher ScientificA26434Zestaw wspomniany w kroku 4.2.8
Zestaw sekwencjonowania Ion PI Hi-Q 200   Thermo Fisher ScientificA26433
Technologie żywotnościsystemu jonów protonowych4476610
Technologie żywotnościsystemu serwerów Ion Reporter4487118
Fabrykaodczynników chemicznych izopropanolu w Kantoniehttp://www.chemicalreagent.com/
zestaw do przygotowania bibliotekiDaan Gene Co., Ltd114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
Technologie życia wodnego bez nukleazAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNN
NNNNATGTGG-3'OneTouch
2 Technologieżywotności4474779  System amplifikacji i wzbogacania szablonów
Probówki PCRAxygenPCR-02D-C
Zestaw PicoPLEX WGATakara Bio USAR300671
Końcówki do pipetWysokiej jakości produktyhttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Przenośna mini wirówka LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0 FluorometerLife TechnologiesQ33216Fluorometr
Probówki do oznaczania kubitówLife TechnologiesQ32856
Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HS LifeTechnologiesQ32851
System serwera sekwenceraThermo Fisher ScientificTorrent Suite
Oprogramowanie Reakcje sekwencjonowania Uniwersalny zestawDaan Gene Co., Ltd113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
Ten zestaw zawiera następujące elementy:
1. Zestaw do przygotowania szablonów

1.1 Zestaw do przygotowania szablonów:
Bufor emulsyjny do PCR
Emulsyjna mieszanka enzymów PCR
Roztwór nośnika szablonu

1.2 Roztwory do przygotowania szablonów:
Przygotowanie szablonu Olej reakcyjny I
roztwór do rozbijania emulgatora II
Przygotowanie szablonu Olej reakcyjny II
Woda wolna od nukleaz
Animacja roztwór
Roztwór deemulgujący I
Roztwór do mycia szablonów
Roztwór do mycia kulek C1
Roztwór do ponownego zawieszania kulek C1
Roztwór do ponownego zawieszania szablonów

1.3 Materiały do przygotowania szablonu:
Rurka odczynnika I
złącze
Probówka zbiorcza
Pipeta z probówką z odczynnikiem I
Płytka wzmacniająca
8 dołków strip
Dedykowane końcówki
Adapter do mycia przygotowania szablonu
Filtr do przygotowania szablonu

2. Zestaw do sekwencjonowania

2.1 Zestaw do sekwencjonowania:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Roztwór enzymu do sekwencjonowania
Startery do sekwencjonowania
Szablony kontroli jakości

2.2  Rozwiązania do sekwencjonowania:
Roztwór do sekwencjonowania II
Roztwór do sekwencjonowania IIII
Bufor do wyżarzania
Bufor ładujący
Środek spieniający
Tabletki chloru
Koralik C1

2.3 Materiały do sekwencjonowania:
Probówka z odczynnikiem II
Nasadka probówki z odczynnikiem
Łyk probówki z odczynnikiem  II
Łyk do butelek z odczynnikami
Butelki z odczynnikami

3. Chip
Roztwór wodorotlenku soduSigma72068-100ML
Thermal CyclerLife Technologies4375786
Medyczny systemu naukowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341(2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266(2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871(2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22(2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345(2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585(2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164(2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170(2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Badanie genetyczne aneuploidiip przewodnikowa platforma sekwencjonowaniaamplifikacja ca ego genomukom rki trofektodermykonstrukcja biblioteki genomicznejwarianty liczby kopiikoraliki do oczyszczania DNAzarz dzanie sekwenconorem

Powiązane artykuły