Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowana technika mankietowa dla heterotopowego modelu przeszczepu szyjki macicy serca u myszy

DOI:

10.3791/63504

⸱

7 lutego 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urological Oncology Surgery, Chongqing University Cancer Hospital, 2School of Medicine, Chongqing University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Science, Army Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym protokole, model przeszczepu serca myszy jest używany do badania mechanizmu odrzucania przeszczepu alloprzeszczepu serca. W tym heterotopowym modelu przeszczepu serca poprawia się efektywność operacji, a przeżycie przeszczepów serca jest zapewnione dzięki zespoleniu implantacji serca w szyjce macicy od końca do końca przy użyciu zmodyfikowanej techniki Cuff.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odrzucenie przeszczepu allogenicznego serca ogranicza długoterminowe przeżycie pacjentów po przeszczepie serca. Model przeszczepu serca myszy jest idealny do badania mechanizmu odrzucania alloprzeszczepu serca w badaniach przedklinicznych ze względu na jego wysoką homologię z ludzkimi genami. Wiedza ta pomoże w opracowaniu unikalnych podejść do poprawy długoterminowego przeżycia pacjentów leczonych alloprzeszczepami serca. W modelu mysim implantacja serca dawcy jamy brzusznej jest zwykle wykonywana z zespoleniem end-to-end z aortą biorcy i żyłą główną dolną za pomocą szwów. W tym modelu serce dawcy jest wszczepiane poprzez zespolenie end-to-end z tętnicą szyjną i żyłą szyjną biorcy techniką zmodyfikowanego mankietu. Operacja przeszczepu jest wykonywana bez szwów, a zatem może zwiększyć przeżywalność biorcy, ponieważ nie ma zakłóceń w dopływie krwi i refluksu żylnego dolnej części ciała. Ten mysi model pomógłby w zbadaniu mechanizmów leżących u podstaw immunologicznego i patologicznego (ostrego/przewlekłego) odrzucenia alloprzeszczepów serca.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep serca stał się standardowym sposobem leczenia nieuleczalnej niewydolności serca. Ponad 5500 przeszczepów serca rocznie wykonuje się w organizacjach zarejestrowanych w Międzynarodowym Towarzystwie Transplantacji Serca i Płuc. Wśród biorców allogenicznego przeszczepu serca roczny wskaźnik odrzucenia wynosi nadal >10%, podczas gdy 3-letni wskaźnik odrzucenia wzrósł do 36%1,2. Brakuje jednak skutecznych metod leczenia profilaktycznego pacjentów z odrzuceniem przeszczepu alloprzeszczepu serca. W związku z tym uzasadnione są badania na modelach zwierzęcych, które wyjaśniają mechanizmy fizjologiczne leżące u podstaw immunologicznego i patologicznego odrzucenia alloprzeszczepów serca. Takie badania przyczyniłyby się do zbadania nowych celów wymaganych do opracowania skutecznych leków, które pomogłyby zapobiec odrzuceniu przeszczepu allogenicznego serca i poprawić wskaźniki przeżycia w tych populacjach pacjentów.

Niektóre potencjalne immunologiczne i patofizjologiczne mechanizmy odrzucenia alloprzeszczepu serca zostały ostatnio zaproponowane w badaniach na modelu mysim heterotopowego przeszczepu serca3,4,5. W związku z tym heterotopowy przeszczep serca u myszy stał się idealnym modelem przedklinicznym do badania mechanizmów odrzucenia immunologicznego i patologicznego uszkodzenia występującego w alloprzeszczepach serca po przeszczepie serca ze względu na ich wysoką homologię z ludzkimi genami. Powszechną koncepcją jest wykonanie przeszczepu heterotopowego w modelu mysim przez zespolenie brzuszne od końca do końca w aorcie biorcy i żyle głównej dolnej za pomocą szwów, podobnie jak w normalnej anatomii człowieka. Jednak ta procedura może zakłócać dopływ krwi biorcy i refluks żylny dolnej części ciała6. W związku z tym zaproponowano zmodyfikowaną procedurę heterotopowego przeszczepu serca w modelu mysim.

Serce dawcy jest wszczepiane do tętnicy szyjnej biorcy i żyły szyjnej za pomocą zespolenia szyjnego typu end-to-end przy użyciu zmodyfikowanej techniki Cuff. Ta zmodyfikowana procedura ułatwiła operację i zapewniła przeżycie przeszczepu serca bez zakłócania dopływu krwi i refluksu żylnego dolnej części ciała.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych, wydanie ósme, National Research Council (USA) 2011. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersyteckiego Szpitala Onkologicznego w Chongqing w Chongqing w Chinach. Samce myszy BALB/c i C57BL/6 o wadze 20-30 g, uzyskane ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów), wykorzystano do badania allogenicznego przeszczepu serca. Myszy C57BL/6 były używane jako dawcy i biorcy syngeniczni, podczas gdy myszy BALB/c służyły jako biorcy allogeniczni. Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 1.
UWAGA: Wszystkie materiały używane podczas operacji, w tym narzędzia i roztwory chirurgiczne, są sterylne. Zabieg chirurgiczny jest zgodny z zasadą aseptycznej techniki operacyjnej.

1. Procedura odbiorcy

  1. Znieczulenie ogólne należy wywołać poprzez inhalację 5% izofluranu przez komorę indukcyjną o wymiarach 15 x 10 x 10 cm połączoną z kapturem (patrz tabela materiałów).
  2. Zamocuj mysz odbiorcy na stole operacyjnym za pomocą poduszki grzewczej. Utrzymuj znieczulenie poprzez ciągłe wdychanie 2% izofluranu przez maskę na nos i usta.
    UWAGA: Powolna częstość i rytm oddechu, zanik odruchu rogówkowego i brak odruchu pedałowania w palcach u nóg wskazują na skuteczność znieczulenia.
  3. Po zgoleniu włosów zdezynfekuj obszar operacyjny trzema naprzemiennymi rundami peelingu powidonowo-jodowego, a następnie alkoholem. Następnie naciąć skórę 1,5-2 cm równolegle do linii środkowej szyjki macicy od prawego kąta żuchwy do końca ogona.
  4. Wypreparować ~1 cm prawej żyły szyjnej zewnętrznej za pomocą elektrokoagulatora i mikrokleszczyków. Przytnij żyłę na bliższym końcu za pomocą atraumatycznego zacisku mikronaczyniowego i podwiąż ją na dystalnym końcu.
  5. Przełóż dystalny koniec żyły przez mankiet kolczasty z poliuretanu 22 G (patrz Tabela materiałów) ze skośnym końcem i powierzchownymi rowkami. Przymocuj żyłę za pomocą uchwytu mankietu za pomocą zacisku mikronaczyniowego.
  6. Usuń 8-0 Szew podwiązany na dystalnym końcu, odwróć światło nad mankietem zaczepionym powierzchownym zadziorem na lewą stronę i przymocuj szwem chirurgicznym 10-0 w rowkach powierzchni.
  7. Wyciąć prawy gruczoł podjęzykowy, aby utworzyć dół do wszczepienia przeszczepu serca i zarezerwować prawy płat gruczołu podszczękowego i prawy mostek obojczykowo-sutkowy.
  8. Wypreparuj prawą tętnicę szyjną wspólną na ~1 cm za pomocą mikrokleszczy i przytnij tętnicę atraumatycznym zaciskiem mikronaczyniowym na bliższym końcu. Na dystalnym końcu podwiązaj i odetnij tętnicę.
  9. Przeprowadź dystalny koniec tętnicy przez mankiet kolczasty z poliuretanu 26 G (patrz Tabela materiałów) ze skośnym końcem i rowkami na powierzchni. Zamocuj tętnicę za pomocą uchwytu mankietu za pomocą zacisku mikronaczyniowego.
  10. Usuń szew podwiązaniowy na dystalnym końcu, odwróć światło na lewą stronę nad mankietem i przymocuj za pomocą powierzchownego zadzioru i rowków za pomocą szwu chirurgicznego 10-0.
  11. Po przygotowaniu naczyń biorcy należy wlać 100 j.m./ml soli fizjologicznej heparyny na naczynia, aby zapobiec zakrzepicy. Przykryj nacięcie szyjki macicy sterylną mokrą gazą z soli fizjologicznej w celu późniejszej implantacji.

2. Procedura dawcy

  1. Zastosuj tę samą procedurę znieczulenia (krok 1.1) dla myszy dawcy.
  2. Ogolić włosy na brzuchu za pomocą elektrycznej maszynki do golenia i zdezynfekować obszar operacyjny trzema naprzemiennymi rundami peelingu powidonowo-jodowego, a następnie alkoholem.
  3. Naciąć brzuch (2-3 cm) nożycami wzdłuż linii środkowej od spojenia łonowego do wyrostka mieczykowatego i rozszerzyć nacięty obszar za pomocą retraktora.
  4. Wypreparować 1 cm aorty brzusznej i żyły głównej dolnej za pomocą elektrokoagulatora i mikrokleszczyków, a następnie przeprowadzić heparynizację poprzez wstrzyknięcie 1 ml soli fizjologicznej uzupełnionej 250 j.m./ml heparyny przez żyłę główną dolną. Następnie wytnij aortę brzuszną i żyłę główną dolną.
  5. Wytnij klatkę piersiową wzdłuż przedniej linii pachowej po obu stronach za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby oddzielić ścianę klatki piersiowej. Liguj żyłę główną górną z 8-0 szew chirurgiczny.
  6. Wbić igłę do skóry głowy w żyłę główną nadwątrobową dolną. Następnie wstrzyknij lodowatą fizjologiczną sól fizjologiczną uzupełnioną 100 j.m./ml heparyny przez igłę do skóry głowy z żyły głównej dolnej wątroby, aby przekrwić serce dawcy, aż kolor krwi zniknie.
  7. Ponownie perfuzję serca dawcy za pomocą 2-3 ml lodowatego roztworu histydyny-tryptofanu-ketoglutaranu (HTK) (patrz Tabela materiałów) za pomocą igły do skóry głowy z łuku aorty w celu ochrony mięśnia sercowego dawcy. Średni czas ciepłego niedokrwienia wynosi 5 minut.
  8. Podwiązać żyłę główną górną i dolną oraz żyłę płucną za pomocą szwu chirurgicznego 5-0. Wypreparuj i odetnij aortę dawczą i tętnicę płucną przed ich rozgałęzieniem. Następnie podziel żyłę główną górną i dolną oraz żyłę płucną, aby usunąć serce dawcy.

3. Implantacja

  1. Wszczepić serce dawcy do kieszonki szyjnej myszy biorcy w pozycji odwróconej.
  2. Pociągnij mankiet z żyłą szyjną biorcy do światła tętnicy płucnej dawcy, aby wykonać zespolenie od końca do końca tętnicy płucnej dawcy z żyłą szyjną zewnętrzną biorcy. Podwiązać mankiet za pomocą rowków na powierzchni przez szew chirurgiczny 10-0, aby zamocować zespolenie.
  3. Zastosuj podobną procedurę do kompleksowego zespolenia aorty dawcy z tętnicą szyjną biorcy.
  4. Zwolnij atraumatyczny zacisk mikronaczyniowy żyły szyjnej, a następnie tętnicę szyjną, aby ponownie wykonać fuzję serca dawcy. Średni czas zimnego niedokrwienia wynosi 15 minut.
  5. Zamocuj przeszczep serca i zszyj go prawidłowo, aby zapobiec skręceniu przeszczepu.
  6. Zamknąć nacięcie szyjki macicy szwami ciągłymi za pomocą nici monofilamentowej z poliamidu 5-0 (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Usuń szew po całkowitym zagojeniu się rany.
  7. Trzymaj mysz biorcę w ciepłej, suchej i czystej klatce, dopóki nie wyzdrowieje ze znieczulenia.
    UWAGA: Powrót do zdrowia zajmuje 5-10 minut.
  8. Buprenorfinę (0,05 mg/kg) należy wstrzykiwać podskórnie myszy biorcy co 6 godzin przez 48 godzin w celu znieczulenia pooperacyjnego.
    UWAGA: Dawka środka przeciwbólowego została zoptymalizowana na potrzeby tego badania. Jednak schemat analgezji może zostać rozszerzony/zmodyfikowany, jeśli wystąpią jakiekolwiek oznaki bólu, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym modelu heterotopowego przeszczepu szyjki macicy, wskaźnik przeżycia myszy biorców wynosił około 95,2% (przeżyło 20 z 21 myszy). Główną przyczyną zgonu było krwawienie pooperacyjne. Szybkie bicie serca w regularnym rytmie służy jako wskaźnik przeżycia wszczepionego serca dawcy.

C57BL/6 i BALB/c myszy były odpowiednio typami MHC (H-2b) i MHC (H-2d) w tym modelu7,8. Te dwa szczepy różnią się H-2, który powoduje ostre odrzucenie za p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model przeszczepu serca u myszy przyczynia się do badania mechanizmów odrzucania przeszczepu serca, przyczyniając się do opracowania unikalnych podejść mających na celu poprawę długoterminowego przeżycia biorców alloprzeszczepu serca. Jednak przeszczep serca u myszy jest złożonym i wymagającym zadaniem, wymagającym wysokiego poziomu technik mikrochirurgicznych, zwłaszcza w zespoleniach naczyniowych 11,12,13. Mysi model heterotop...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81870304) dla Jun Li.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  5-0 Szew poliamidowyB.Braun Medical Inc.C3090954
  8-0 Szew poliamidowy jednożyłowyB.Braun Medical Inc.
10-0 Szew poliamidowy z monofilamentuB.Braun Medical Inc.
Mankiet poliuretanowy G0090781 22 GB.Braun Medical Inc.4251628-02
Mankiet poliuretanowy 26 GSuzhou Linhua Medical Instrument Co., LTDREF383713
Komora indukcyjna anestezjologiiRWD Life Science Co., LTDV100
Atraumatyczny zacisk mikronaczyniowyBeyotimeFS500
BALB/c i myszy C57BL/6 (20– 30 g)Centrum Zwierząt Doświadczalnych (Wojskowy Uniwersytet Medyczny, Chongqing, Chiny)
BuprenorfinaAmerykańskie nauki biologiczne352004
ElektrokoagulatorGuangzhou Runman Medical Instrument Co., LTDZJ1099
GauzeHenan piaoan group Co., LTD10210402
Poduszka grzewczaGuangzhou Dewei Biological Technology Co., LTDDK0032
HeparinNorth China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
Roztwór HTKShenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTDYZB/Min8263-2013
Strzykawka iniekcyjna (10 ml)Shandong weigao group medical polymer Co., LTD20211001
IsofluraneRWD Life Science Co., LTD21070201
Sól fizjologicznaSouthwest pharmaceutical Co., LTDH50021610
Igła do skóry głowyHongyu Medical Group20183150210
GolarkaBeyotimeFS600
Maszyna do znieczulania małych zwierzątRWD Life Science Co., LTDR500
Mikroskop chirurgicznyTiannuoxiang Scientific Instrument Co., Ltd, Pekin, ChinySZX-6745
WacikYubei Medical Materials Co., LTD21080274
C2090880

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khush, K. K., et al. The International thoracic organ transplant registry of the international society for heart and lung transplantation: Thirty-sixth adult heart transplantation report - 2019; focus theme: Donor and recipient size match. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 38 (10), 1056-1066 (2019).
  2. Stehlik, J., et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: 29th official adult heart transplant report--2012. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 31 (10), 1052-1064 (2012).
  3. Huang, H., et al. Combined intrathymic and intravenous injection of mesenchymal stem cells can prolong the survival of rat cardiac allograft associated with decrease in miR-155 expression. Journal of Surgical Research. 185 (2), 896-903 (2013).
  4. Eggenhofer, E., et al. Features of synergism between mesenchymal stem cells and immunosuppressive drugs in a murine heart transplantation model. Transplant Immunology. 25 (2-3), 141-147 (2011).
  5. Sula Karreci, E., et al. Brief treatment with a highly selective immunoproteasome inhibitor promotes long-term cardiac allograft acceptance in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (52), 8425-8432 (2016).
  6. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. 6, 238(2007).
  7. Lin, C. M., Gill, R. G., Mehrad, B. The natural killer cell activating receptor, NKG2D, is critical to antibody-dependent chronic rejection in heart transplantation. American Journal of Transplantation. 21 (11), 3550-3560 (2021).
  8. Ito, H., Hamano, K., Fukumoto, T., Wood, K. J., Esato, K. Bidirectional blockade of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules: An effective immunosuppressive treatment in the mouse heart transplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 17 (5), 460-469 (1998).
  9. Zhou, Y. X., et al. Acute rejection correlates with expression of major histocompatibility complex class I antigens on peripheral blood CD3(+)CD8(+) T-lymphocytes following skin transplantation in mice. Journal of International Medical Research. 39 (2), 480-487 (2011).
  10. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).
  11. Cui, D., Tan, C., Liu, Z. An alternative technique of arterial anastomosis in mouse heart transplantation. Clinical Transplantation. 32 (6), 13264(2018).
  12. Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26 (4), 223-228 (2013).
  13. Fang, J., et al. A simplified two-stitch sleeve technique for arterial anastomosis of cervical heterotopic cardiac transplantation in mice. American Journal of Translational Research. 5 (5), 521-529 (2013).
  14. Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
  15. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  16. Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), 293-299 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczep serca myszyszyjny model transplantacjiodrzucanie allograftu sercaanastomoza naczyanastomoza koniec w koniecimplantacja serca dawcyzacisk mikro naczyniowyprze ywalno przeszczepu sercazwierz cy model transplantacji

Powiązane artykuły