Artykuł metodologiczny

Podsiatkówkowa implantacja RPE na nośniku u świnek miniaturowych: wytyczne dotyczące przygotowań przedoperacyjnych, technik chirurgicznych i opieki pooperacyjnej

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63505

⸱

11 listopada 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Eye Clinic, Department of Ophthalmology, University Hospital Giessen and Marburg GmbH, 2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging, 3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, 4Institute of Macromolecular Chemistry, Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences, 6Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University, 7Institute of Experimental Medicine, Czech Academy of Sciences, 8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Oslo, 9Moorfields Eye Hospitals UAE, 10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab, Research Center “Principe Felipe”, 11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology, Sigmund Freud University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Implantacja podsiatkówkowa pigmentowego nabłonka siatkówki (RPE) jest jednym z najbardziej obiecujących podejść do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Jednak wyniki badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych z dużymi oczami pozostają wyzwaniem. W niniejszym raporcie przedstawiono wytyczne dotyczące podsiatkówkowego przeszczepiania RPE na nośniku komórkowym do świnek miniaturowych.

Streszczenie

Zaburzenia zwyrodnieniowe siatkówki (w tym zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem), które powstają głównie w warstwie pigmentowanego nabłonka siatkówki (RPE) lub w jej obrębie, prowadzą do postępującej dezorganizacji anatomii siatkówki i pogorszenia funkcji wzrokowych. Zastąpienie uszkodzonych komórek RPE (RPE) komórkami RPE hodowanymi in vitro przy użyciu nośnika komórek podsiatkówkowych wykazało potencjał przywrócenia struktury anatomicznej zewnętrznych warstw siatkówki i dlatego jest dalej badane. W tym miejscu przedstawiamy zasady techniki chirurgicznej, która pozwala na skuteczne podsiatkówkowe przeszczepienie nośnika komórkowego z hodowanymi RPE do świnek miniaturowych. Operacje zostały przeprowadzone w znieczuleniu ogólnym i obejmowały standardową, oszczędzającą soczewkę witrektomię pars plana (PPV), podsiatkówkowe zastosowanie zrównoważonego roztworu soli (BSS), retinotomię 2,7 mm, implantację nośnika komórek nanowłóknistych do przestrzeni podsiatkówkowej przez dodatkową sklerotomię 3,0 mm, wymianę płyn-powietrze (FAX), tamponadę olejem silikonowym i zamknięcie wszystkich sklerotomii. To podejście chirurgiczne zostało zastosowane w 29 operacjach (18 zwierząt) w ciągu ostatnich 8 lat ze wskaźnikiem sukcesu 93,1%. Weryfikację anatomiczną umiejscowienia operacyjnego przeprowadzono za pomocą obrazowania dna oka in vivo (fotografia dna oka i optyczna koherentna tomografia). Zalecane kroki chirurgiczne w celu implantacji podsiatkówkowej RPE na nośniku w oczach świnki miniaturowej mogą być wykorzystane w przyszłych badaniach przedklinicznych z wykorzystaniem modeli zwierzęcych dużych oczu.

Wprowadzenie

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest uważane za główną przyczynę utraty centralnego widzenia w krajach rozwiniętych i jest jednym z wielu schorzeń związanych z dysfunkcją nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE)1,2. RPE znajduje się na podstawowo położonej błonie Brucha (BM) i zapewnia niezbędne utrzymanie fotoreceptorów. Postępująca degeneracja warstwy RPE jest cechą charakterystyczną wczesnej atroficznej postaci AMD, a także towarzyszy rozwojowi późnej postaci wysiękowej AMD. Pomimo wielu postępów w leczeniu chorób siatkówki, opracowanie skutecznej metody leczenia pozostaje wyzwaniem3. Jedną z obiecujących metod jest zastąpienie RPE za pomocą warstwy RPE z hodowli in vitro. Leczenie to jest związane z postępem w badaniach nad komórkami macierzystymi przy użyciu ludzkiego embrionalnego komórek macierzystych pochodzących z RPE (hESC-RPE) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z komórek macierzystych (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. W ostatnich latach wiele grup badawczych skupiło się na opracowywaniu różnych podejść do zastępowania RPE początkowo akceptowanym proof-of-concept8,9,10,11,12,13,14,15. Komórki RPE (RPE) są zwykle dostarczane do przestrzeni podsiatkówkowej w postaci zawiesiny komórkowej, samonośnego arkusza komórek lub monowarstwy komórek wspieranej przez sztuczny nośnik3,16,17,18,19,20,21. Wstrzyknięcie zawiesiny komórkowej jest najłatwiejszą metodą, ale pogorszony stan BM może często uniemożliwić przyczepienie się przeszczepionych komórek. Może to spowodować nieprawidłową orientację apikopodstawową RPE i niepowodzenie w tworzeniu monowarstwy22,23. Główną zaletą pozostałych dwóch metod (tj. samonośnego arkusza komórkowego i monowarstwy komórkowej wspieranej sztucznym substratem) jest to, że komórki są już w zróżnicowanym stanie monowarstwowym, gdy są wszczepione bezpośrednio do przestrzeni podsiatkówkowej24.

W ostatnich latach opublikowano wiele technik chirurgicznych opisujących dostarczanie nośników komórkowych do przestrzeni podsiatkówkowej8,9,10,11,12,13,14,15. W badaniach tych opisano wykorzystanie modeli zwierzęcych dużego oka, rodzaje nosicieli komórkowych, zastosowanie przeszczepionych kultur komórkowych, narzędzi do implantacji, a także technik chirurgicznych, a autorzy skupili się głównie na wynikach implantacji podsiatkówkowej. W 2015 roku Popelka i in. poinformowali o zastosowaniu ultracienkiej elektroprzędzonej membrany polimerowej do przeszczepiania RPE do oczu zwłok świń8. Opisana tu technika chirurgiczna polegająca na implantacji podsiatkówkowej nośnika komórkowego pozwoliła na stosunkowo precyzyjne operowanie nosicielem i łatwe ustawienie rusztowania w przestrzeni podsiatkówkowej. Kozak i wsp. ocenili wykonalność techniki dostarczania nośnika o przybliżonym rozmiarze 2 mm x 5 mm w oczach świń9. Unikalna konstrukcja nośnika komórkowego pozwoliła na jego prawidłowe umieszczenie, zapobiegając fałdowaniu i marszczeniu się monowarstwy komórkowej6. Al-Nawaiseh i wsp. jako pierwsi przedstawili szczegółowe wytyczne krok po kroku dotyczące implantacji rusztowania podsiatkówkowego u królików25. Następnie Stanzel i in. opublikowali podobny protokół w 2019 r. dotyczący przeszczepów u małych gryzoni, królików, świń i naczelnych innych niż ludzie26. Jak opublikowano wcześniej, przeszczepienie zróżnicowanej i spolaryzowanej monowarstwy RPE na stałym nośniku spowodowało poprawę przeżywalności i lepszą integrację przeszczepu w porównaniu z innymi technikami dostarczania (plik uzupełniający 1)27.

Celem wszelkich przedklinicznych badań na zwierzętach przeprowadzanych in vivo jest ujawnienie różnych aspektów chirurgicznej przezszklistej implantacji podsiatkówkowej nośnika komórkowego z naciskiem na bezpieczeństwo zabiegu, przeżycie przeszczepionych komórek, reakcję tkanek na manewry podsiatkówkowe oraz krótko- i długoterminowe wyniki pooperacyjne. Stwierdzono, że wykorzystanie oczu świni jako modelu zwierzęcego o dużych oczach jest istotne z punktu widzenia zakresu uzyskanych danych, które mogą być przydatne i potencjalnie mieć zastosowanie u ludzi10,11,14. Nasze badanie przedstawia technikę chirurgiczną zastosowaną do implantacji in vivo podsiatkówkowej nośnika komórkowego w modelu zwierzęcym z dużym okiem. Przedstawiamy szczegółowy opis preparatów przedoperacyjnych, techniki chirurgicznej implantacji nośnika komórek podsiatkówkowych oraz opieki pooperacyjnej nad oczami świnki miniaturowej w oparciu o nasze doświadczenia z ostatnich 8 lat. Opisujemy podstawowe zasady chirurgiczne, które można wykorzystać w badaniach eksperymentalnych in vivo obejmujących implantację różnych typów komórek i nośników komórkowych.

Model dużego zwierzęcia
Stado doświadczalne świnek miniaturowych Liběchov zostało założone przez sprowadzenie pięciu zwierząt ze szczepu Hormel z USA w 1967 roku. Zwierzęta te zostały skrzyżowane do badań grup krwi świń z kilkoma innymi rasami lub szczepami: świniami Landrace, Large White, Kornwalijczykami, wietnamskimi i miniaturowymi świniami pochodzenia Getynga28,29. W wieku 5 miesięcy i około 20 kg masy ciała miniświnki osiągają dojrzałość płciową. Przeżywalność rodzicielskich ras świnek miniaturowych (Hormel i Getynga) wynosi 12-20 lat. Implantacja podsiatkówkowa nośnika komórkowego jest ukierunkowana na centralną część siatkówki. Siatkówka świnek miniaturowych nie ma plamki żółtej i dołka środkowego. Ma jednak obszary silnie skoncentrowanych fotoreceptorów czopków zwanych obszarem centralnym i smugami wizualnymi30,31. Obszary te są odpowiedzialne za najwyższą ostrość widzenia.

Operacje zostały przeprowadzone przez czterech doświadczonych chirurgów witreoretinalnych z pomocą doświadczonego asystenta placówki chirurgicznej (TA). Przed eksperymentami in vivo chirurdzy zostali przeszkoleni i uzyskali specjalną wiedzę na temat anatomii oka świnki miniaturowej, np. na temat mniejszego stosunku objętości soczewki do objętości ciała szklistego, krótszej długości osiowej (15-19 mm), braku błony Bowmana w rogówce, mniejszej objętości ciała szklistego (2,8-3,2 ml), braku plamki żółtej i dołka żółtego, brak pierścienia Zinna i średnica tarczy nerwu wzrokowego (pionowa/pozioma: 1,5 mm/2,1 mm). We wszystkich przypadkach zabieg został przeprowadzony w znieczuleniu ogólnym w specjalnie zorganizowanej sali operacyjnej z zastosowaniem standardowych środków aseptycznych i antyseptycznych.

Protokół

Niniejsze badanie jest zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej oraz zasadami etycznymi dotyczącymi badań medycznych z udziałem ludzi. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi Opieki i Korzystania ze Zwierząt Laboratoryjnych oraz zgodnie z wytycznymi Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Protokół badania został zatwierdzony przez Resortową Komisję Profesjonalną CAS ds. Zatwierdzania Projektów Eksperymentów na Zwierzętach w Instytucie Fizjologii i Genetyki Zwierząt Czeskiej Akademii Nauk (Liběchov, Republika Czeska) (Zatwierdzone protokoły nr 60/2016 oraz nr 64/2019).

1. Uwagi dotyczące subretinalnego przeszczepiania komórek na nośniku u minipigów

  1. Wybór zwierząt
    1. Należy pozyskać i wykorzystać minipigsy rasy Liběchov w wieku 12-36 miesięcy, obu płci, o masie ciała (BW) około 40-80 kg.
    2. Minipigsy należy trzymać w pomieszczeniach w klimatyzowanym domu dla zwierząt w temperaturze 18-22 °C, przy sztucznym cyklu światła/ciemności 13 h/11 h, w zestandaryzowanych boksach indywidualnych, z wolnym dostępem do wody i karmieniem dwa razy dziennie.
  2. Przygotowanie przed operacją
    1. Należy sprawdzić orientację chirurgiczną oka i sporządzić schematy dna oka. W tym celu należy schematycznie podzielić siatkówkę minipigsa na rysunku dna oka za pomocą pisaka, prowadząc linię pionową, na regiony: skroniowy (od tarczy nerwu wzrokowego w stronę ucha), nosowy (od tarczy nerwu wzrokowego w stronę ryjka świni) oraz centralny (między głównymi naczyniami siatkówki po stronie nosowej) (Rysunek 1A, B).
    2. Należy wybrać wyłącznie zdrowe zwierzęta bez żadnych patologii behawioralnych i neurologicznych, z prawidłową jakością skóry, otworów ciała, kału oraz spożyciem pokarmu. Obserwację kliniczną i wybór zwierząt powinien przeprowadzić doświadczony lekarz weterynarii.
    3. W dniu operacji należy wstrzyknąć domięśniowo 3 mg/kg BW chlorowodorku ceftiiofuru (1 mL/kg).
  3. Przedoperacyjna immunosupresja
    1. Należy przygotować polimerowe mikrosfery uwalniające takrolimus zgodnie z opisem w pracy Wang et al. oraz Sevc et al. 32,33 z modyfikacją.
    2. Należy upewnić się, że stężenie takrolimusu w polimerowych mikrosferach wynosi 51,3 mg/g, co określono metodą HPLC (Tabela Materiałów).
    3. Na 6 dni przed operacją oka należy wykonać podskórny zastrzyk polimerowych mikrosfer obciążonych takrolimusem w dawce 0,25 mg/kg BW, aby zapobiec odrzuceniu przeszczepu komórkowego. Jest to konieczne dla zapewnienia przeżycia ludzkich komórek dawcy nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) podczas transplantacji ksenogenicznej do oczu minipigsa.
    4. W dniu operacji należy wstrzyknąć zwierzętom domięśniowo 80 mg depo-medrolu oraz benzylpenicylinę w dawce 1 mL/10 kg zgodnie z masą ciała.
  4. Znieczulenie
    1. Przed operacją należy wprowadzić znieczulenie ogólne poprzez domięśniowy zastrzyk mieszaniny tiletaminy (2 mg/kg), zolazepamu (2 mg/kg), ketaminy (2 mg/kg) i ksylazyny (0,4 mg/kg) – TKX34,35. Głębokość znieczulenia należy sprawdzić poprzez ocenę stanu nieprzytomności oraz weryfikację odruchu stopy (uszczypnięcie skóry międzypalcowej tylnej kończyny), odruchu rogówkowego (lekkie dotknięcie rogówki), odruchu źrenicznego (reakcja na światło) oraz odruchu powiekowego (dotknięcie powieki). Należy upewnić się, że zwierzę nie mruga. Należy potwierdzić regularność tętna i oddechu.
    2. Po wprowadzeniu znieczulenia należy przetransportować uspokojone zwierzę do sali operacyjnej na wózku transportowym (Rysunek 2A).
    3. Zwierzę należy położyć na stole operacyjnym na lewym boku, aby umożliwić operację na prawym oku (Rysunek 2B).
    4. Należy przeprowadzić korektę ułożenia głowy zwierzęcia za pomocą styropianowych podkładek, aby osiągnąć najodpowiedniejszą pozycję siatkówki centralnej do implantacji (tj. poziomą i równoległą do podłogi) (Rysunek 2C).
    5. Do worka spojągowkowego należy zakroplić 0,5% roztwór okulistyczny chlorowodorku proparakainy trzy razy w odstępach 1 min w celu wywołania znieczulenia miejscowego.
    6. Należy wprowadzić kaniulę żylną i przeprowadzić intubację zwierzęcia rurką endotrachealną w celu podtrzymania znieczulenia wziewnego (1,5% izofluranu) przy użyciu aparatury do znieczulania wyposażonej w monitor pacjenta (Rysunek 2A, B).
    7. Około 15 min przed rozpoczęciem operacji oka należy podać domięślniowy zastrzyk 1 mL Eficuru na 16 kg BW oraz 20 mg Depo-Medrolu 1 (Tabela Materiałów).
    8. Fizjologiczną temperaturę ciała należy utrzymać, przykrywając zwierzę folią izotermiczną, a następnie przeprowadzić operację zgodnie z opisem w sekcji 3.
    9. Podczas operacji należy monitorować temperaturę zwierzęcia wraz z częstotliwością akcji serca i wysyceniem krwi tlenem, używając klipsa ucha i monitora pacjenta. Należy unikać obniżenia temperatury ciała poniżej 38 °C podczas procedur, co jest uznawane za bezpieczną granicę36. Należy utrzymywać wysycenie tlenem (>96%) i tętno (70-90 uderzeń na minutę) przez cały czas trwania eksperymentu.
    10. Po zakończeniu operacji należy wyłączyć dopływ izofluranu i ekstubować zwierzę.
    11. Po powrocie do spontanicznego oddychania i przebudzeniu, zwierzęta należy przenieść do boksów.
  5. Przygotowanie sali operacyjnej
    1. Salę operacyjną należy przygotować zgodnie z wymaganiami operacji na oczach modelu zwierzęcego z dużymi oczami (Rysunek 3A, B). Należy dostosować wysokość krzeseł chirurga oraz wysokość mikroskopu, aby osiągnąć wygodną pozycję operatorów względem położenia ryjka świni.

Schematy perymetrii siatkówkowej; pomiar pola widzenia, budowa oka, orientacja nosowo-skroniowa.
Rycina 1: Schematyczny rysunek stref siatkówki u minipigów. (A) Schematyczny rysunek stref siatkówki w odniesieniu do głowy minipiga; żółta elipsa przedstawia pożądany obszar implantacji podsiatkówkowej, T oznacza skroniowy obszar siatkówki, a N oznacza nosowy obszar siatkówki. (B) Przykład schematu dna oka po podsiatkówkowej implantacji nośnika komórek (żółty) poprzez retinotomię (czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Procedura chirurgiczna na oczach świni; ustawienie anestezji; schemat śródoperacyjny pokazujący ustawienie siatkówki.
Rysunek 2: Transport i ułożenie zwierzęcia. (A) Transport uspokojonego zwierzęcia do sali operacyjnej. (B) Ułożenie zwierzęcia podczas intubacji. (C) Dopasowanie pozycji głowy zwierzęcia w celu zapewnienia optymalnego dostępu do centralnej części siatkówki podczas operacji (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Użycie mikroskopu chirurgicznego wraz ze schematem; metoda operacji oka; wizualizacja procedury medycznej.
Rysunek 3: Standardowy układ sali operacyjnej. (A) Schematyczne przedstawienie pozycji chirurgów (S = chirurg, A = asystent) w odniesieniu do położenia stołu operacyjnego z minipigiem, mikroskopu operacyjnego (OM), urządzenia do witrektomii (VM), stolika instrumentacyjnego (IT) oraz aparatury anestezjologicznej (AM). Istnieją dwie możliwe pozycje urządzenia do witrektomii (żółta i szara). (B) Rzeczywiste ustawienie na sali operacyjnej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Nośnik komórek, hodowle komórkowe oraz injektor do implantacji

  1. Nośnik komórek
    1. Odetnij 30 µm szeroka owalna ramka o wymiarach zewnętrznych 1,7 mm x 4,8 mm, wyposażona w asymetrycznie rozmieszczone na ramce wypustki trójkątne (Rysunek 4A), z dwuosiowo orientowanego 36 µm gruba folia z politereftalanu etylenu (PET) przy użyciu lasera femtosekundowego.
    2. Przygotować roztwór polimeru poli(L-laktydu-ko-DL-laktydu) (LLA/DLLA 90/10, MW 868 270 g/mol) w pirydynie o stężeniu 11% wag. z dodatkiem 2.2 µL kwasu mrówkowego na 1 g roztworu.
    3. Przygotuj membranę nanofibrową z zatopioną ramką wspierającą (Rysunek 4B) poprzez elektroprzędzenie roztworu polimeru w trzech etapach8(1) nanieść pierwszą warstwę nanowłókien na podłoże krzemowe, (2) umieścić ramkę na warstwie i (3) nanieść drugą warstwę nanowłókien.
      UWAGA: Każdą warstwę należy nanosić przez 7 min, aby uzyskać całkowitą grubość błony wynoszącą 3.7 µm. Należy zastosować następujące parametry, aby uzyskać membranę składającą się z włókien o grubości 380 nm i średniej wielkości porów wynoszącej 0.4 µm oraz porowatością na poziomie około 70%37igła całkowicie stalowa 20 G, napięcie 7,1 kV, przerwa 10 cm, szybkość przepływu 250 µL/minoraz temperaturze 25.0 °C ± 0.5 °C.
    4. Ostrożnie usuń membranę z osadzonym stelażem z podłoża krzemowego i przymocuj ją do korpusu komercyjnego wkładu do hodowli komórkowej z 12 dołkami, pozbawionego oryginalnej membrany, aby umożliwić wysiew i wzrost komórek.
    5. Przed wysiewaniem komórek poddaj membranę nanofibrową działaniu plazmy powietrznej przez 30 s przy mocy 70 W w urządzeniu do czyszczenia plazmowego.
  2. Kultury komórkowe wykorzystywane do hodowli na nośniku komórkowym
    UWAGA: Można zastosować następujące nośniki komórkowe: 1) nanofibrowy nośnik komórkowy bez komórek; 2) nanofibrowy nośnik komórkowy z pierwotnymi ludzkimi komórkami nabłonka pigmentowego siatkówki (hRPE); 3) nanofibrowy nośnik komórkowy z ludzkimi komórkami RPE pochodzącymi z iPSC.
    1. Hodowla pierwotnych hRPE
    2. Wyizolować pierwotne komórki hRPE z oczu ludzkich dawców zgodnie z wcześniej opisaną techniką38.
    3. Komórki należy pozyskać poprzez enzymatyczne traktowanie siatkówki przez 30 min. Następnie pierwotne komórki hRPE (pasaż 0) należy hodować przez maksymalnie 2 tygodnie w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    4. Gdy hodowle komórkowe osiągną pełną konfluencję, należy zmienić pożywkę na taką z dodatkiem 1% FBS i inkubować przez kolejne 30 dni.
    5. Wysiać pierwotne hRPE na płytki trans-well oraz na powleczony lamininą nanofibrowy nośnik komórkowy z zagęszczeniem 2 000 komórek/mm²2Po kolejnych 30 dniach inkubacji w 1% FBS, należy wykorzystać nośniki komórkowe z pierwotnymi hRPE do implantacji podsiatkówkowej u miniprzetworni.
  3. Komórki RPE pochodzące z ludzkich iPSC
    1. Należy użyć hiPSC pochodzących z fibroblastów pacjenta z zapaleniem nabłonka pigmentowego siatkówki związanym z MERTK39 które poddano korekcie genetycznej obu alleli z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9 (RP1-FiPS4F1-GC2)40oraz hiPSC pochodne z fibroblastów zdrowego dawcy (Ctrl2-FiPS5F2)41 które są wykorzystywane jako kontrola.
    2. Zgenerować i następnie zróżnicować obie linie komórek hiPSC w kierunku komórek RPE (hiPSC-RPE) zgodnie z wcześniej opisaną procedurą42.
    3. Wysiać hiPSC-RPE w zagęszczeniu 200 000 komórek/cm²2 na wkładkach do hodowli komórkowych powlekanych lamininą z nanofibrowymi membranami z poli(L-laktydu-co-DL-laktydu) z owalnymi ramkami implantacyjnymi w pożywce RPE zawierającej DMEM knockout, 20% surowicy knockout, 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 0,23 mM β-merkaptoetanolu, 100 J/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny oraz 10 mM nikotynamidu.
    4. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień i hoduj hiPSC-RPE przez 2 miesiące przed implantacją, aby wspomóc polaryzację wzrostu.
  4. Injektor do implantacji
    1. Przygotować plastikową kapilarę o prostokątnym przekroju poprzecznym 2,8 mm x 0,8 mm poprzez formowanie wtryskowe z plastikowej rurki o średnicy zewnętrznej (OD) 1,75 mm i średnicy wewnętrznej (ID) 1,10 mm.
    2. Wytnij okno załadowcze o wymiarach 4 mm x 2,2 mm w kapilarze plastikowym, w odległości 6 mm od końca.
    3. Zmontuj inżektor z kapilary plastikowej, silikonowego uchwytu, stalowego tłoka z ostrzem oraz tłoka (Rysunek 5A).
    4. Wprowadź nośnik do wstrzykiwacza przez okno załadowania, a następnie podaj go do przestrzeni podsiatkowej poprzez pchnięcie tłoka, zgodnie z opisem w kroku 3.5.2 (Rycina 5B).
  5. Przygotowanie nanowłóknistego nośnika i załadowanie wstrzykiwacza
    1. Napełnić małą plastikową szalkę Petriego 2 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Wyjąć wkład z przygotowaną warstwą komórek, umieścić go na półmiękkiej płytce polistyrenowej i wycentrować pod mikroskopem świetlnym. Używając zmodyfikowanego wycinaka, wyciąć nośnik wzdłuż owalnej ramki pod mikroskopem. Wymiary nośnika powinny wynosić 2 mm x 5 mm.
    2. Należy użyć wykonanego na zamówienie wstrzykiwacza z płaskim, przezroczystym przewodem do wprowadzania nośnika; w odległości 6 mm od dystalnego końca kapilary znajduje się okno do wprowadzania nośnika. Okno wstrzykiwacza należy wypełnić buforem PBS.
    3. Za pomocą pęsety należy odczepić próbkę z dna naczynia, wyjąć ją z cieczy i przenieść do okna injektora, sprawdzając wcześniej oznaczenia orientacji bocznej na ramce w celu zidentyfikowania strony górnej nośnika z przylegającymi komórkami. Owana ramka ułatwia manipulację nośnikiem.
    4. Za pomocą sondy stomatologicznej (stalowego narzędzia stomatologicznego z ostrym zakończeniem) umieść nośnik w otworze wtryskiwacza. Używając tłoka, wsuń nośnik do zamkniętej i bezpiecznej górnej części wtryskiwacza. Następnie przygotuj nośnik do zabiegu chirurgicznego.
    5. Na każdym etapie należy sprawdzić orientację boków nośnika. Wyjąć nośnik nanowłóknisty z injektora, naciskając metalowy tłok.

Schemat pomiaru modułu sprężystości; rozciąganie włókien; widok mikroskopowy; właściwości mechaniczne.
Rysunek 4: Nanowłóknisty nośnik z zatopioną wspierającą ramką z PET. (A) Trzy widoczne oznaczenia na ramce umożliwiają kontrolę orientacji bocznej nośnika (białe strzałki). (B) Powiększony widok fragmentu ramki z PET zatopionej w nanowłóknistej membranie (białe strzałki) nośnika komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat metody kapilarnej z tłokiem, kapilarą i nanofibrowym nośnikiem do ładowania próbki.
Rysunek 5: Iniektor do implantacji. (A>) Części iniektora. (B>) Nanofibrowy nośnik komórek z zatopioną wspierającą ramką z PET, załadowany do plastikowej prostokątnej kapilary iniektora do implantacji. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Procedura chirurgiczna

  1. Sprzęt chirurgiczny
    1. Należy użyć następującego sprzętu chirurgicznego: mikroskopu chirurgicznego do okulistyki, systemu operacyjnego do zabiegów na przednim i tylnym odcinku oka, bezkontaktowego systemu chirurgicznego witreoretinalnego, urządzenia do fotokoagulacji laserowej oraz kamery cyfrowej.
      UWAGA: Standardowe parametry stosowane w witrektomii, ekso- i endokoagulacji oraz w urządzeniach do fotokoagulacji laserowej przedstawiono w Tabeli 1.
  2. Instrumenty chirurgiczne
    1. Wielorazowe instrumenty chirurgiczne należy wysterylizować w mobilnym autoklawowym sterylizatorze parowym lub podobnym urządzeniu zgodnie ze standardowym protokołem. Jednorazowe instrumenty i materiały chirurgiczne wymagane podczas operacji wymieniono w Tabeli materiałów.
  3. Przygotowanie do etapów chirurgicznych
    1. Po znieczuleniu zwierzęcia zgodnie z opisem w kroku 1.4.1, na 15 min przed zabiegiem należy podać do worka spojówkowego krople z 1% roztworem tropikamidu oraz 10% roztworem hydrochlorku fenylefryny w celu wywołania farmakologicznej mydriazy.
    2. Podejść do stołu operacyjnego tak, aby chirurg znajdował się w pozycji górnej, a asystent w pozycji bocznej (Rysunek 3).
    3. Ogolić obszar wokół oka za pomocą jednorazowej brzytwy i usunąć zanieczyszczenia mechaniczne.
    4. Zdezynfekować worek spojówkowy 5% roztworem powidonu jodowego przez 5 min.
    5. Zdezynfekować obszar okołopowiekowy za pomocą watowanych patyczków, pocierając od powiek w kierunku obwodowym. Proces powtórzyć trzykrotnie, stosując 10% roztwór powidonu jodowego, i pozostawić na 5 min.
    6. Przykryć pole operacyjne z okiem w centrum, używając standardowej sterylnej draperii okulistycznej z przyklejaną przezroczystą folią. Odsunąć rzęsy od gałki ocznej. Unikać przycinania rzęs, aby zmniejszyć ryzyko pooperacyjnego zapalenia wnętrza oka.
    7. Wprowadzić rozwierak powiek (typu Libermana lub rozwierak Cooka). Opcjonalnie unieruchomić błonę trzecią na skórze za pomocą szwu z poliglaktyny 8-0.
    8. Otworzyć spojówkę po stronie nosowej w odległości 2 mm do 3 mm od limbusa, aby odsłonić twardówkę do wykonania sklerotomii, używając pęsety chirurgicznej i nożyczek do spojówki Westcotta.
    9. Wprowadzić trzy trokary 25 G w odległości 2,5-3 mm od limbusa w obszarze pars plana (umieścić je na godzinie 7, 10 i 11). Podczas wprowadzania stosować ruchy obrotowe, wprowadzając trokar lekko pod kątem (100°-110°) w stronę tylnej części siatkówki, i przytrzymać trokar pęsetą (Rysunek 6).
    10. Przez cały czas trwania operacji utrzymywać rogówkę w stanie wilgotnym lub powlekać ją metylocelulozą, aby zapobiec osmotycznemu obrzękowi rogówki.
  4. Witrektomia przez pars plana (PPV)
    1. Usunąć środkową część ciała szklistego, stosując standardowe podejście do witrektomii przez trzy porty w pars plana. Ostrożnie usunąć ciała szkliste za soczewką w obszarze przyszłej dużej sklerotomii.
    2. Wykonać iniekcję do ciała szklistego 2-4 mg acetonidu triamcynolonu (TA) (50-100 µL) w celu zabarwienia tylnego ciała szklistego, które zazwyczaj pozostaje przylegać do siatkówki, aby przeprowadzić kontrolowane odwarstwienie tylnego ciała szklistego.
    3. Następnie powoli wykonać iniekcję podsiatkówkową 0,05-0,1 mL BSS za pomocą kaniuli 41 G bardziej centralnie, unikając tworzenia pęcherza w stronę obwodu.
    4. Podczas iniekcji podsiatkówkowej obniżyć ustawienia ciśnienia wewnątrzgałkowego w systemie irygacyjnym do 15 mmHg, aby zapobiec przejściowemu zamknięciu naczyń siatkówki.
    5. Wykonać liniową, rozległą endodiatermię siatkówki za pomocą sondy do endodiatermii 27 G w odległości 3 mm od podstawy pęcherza po stronie nosowej.
    6. Następnie wykonać rozległą retinotomię o szerokości 3 mm za pomocą ostrza MVR 25 G lub nożyczek pionowych, przy podwyższonym ustawieniu ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w systemie irygacyjnym do 60 mmHg przez 3 min do 5 min. Upewnić się, że z miejsca retinotomii nie występuje krwawienie, a następnie obniżyć IOP do 25 mmHg.
    7. Przeprowadzić ekzodiatermię naczyń episkleralnych między dwoma trokarami nosowymi w odległości 2,5-3 mm od limbusa za pomocą sondy do endodiatermii 27 G, delikatnie dotykając powierzchni twardówki.
    8. Przed powiększeniem sklerotomii sprawdzić poziom płynu w butelce z infuzją, ponieważ po powiększeniu sklerotomii zużycie płynu jest tymczasowo wysokie.
    9. Wykonąć dużą sklerotomię o szerokości 3,0 mm, 3 mm od limbusa, używając noża do fakoemulsyfikacji 2,75 mm.
    10. Zwrócić uwagę na możliwe krwawienie z naczyń twardówki i ciała rzęsnego wewnątrz dużej sklerotomii. W przypadku krwawienia użyć sondy do endodiatermii 27 G do koagulacji uszkodzonych naczyń. Powiększyć sklerotomię do 3,0 mm nożem satynowym, aby pomieścić końcówkę injektora (0,8 mm x 2,8 mm).
    11. Usunąć wypadnięte ciało szkliste w miejscu dużej sklerotomii za pomocą witrektora. Utrzymywać infuzję BSS na poziomie 25-30 mmHg za pomocą systemu do witrektomii, aby uniknąć zapadnięcia się gałki ocznej.
  5. Implantacja nośnika komórkowego
    1. Delikatnie wprowadzić injektor ręką dominującą do jamy ciała szklistego przez dużą sklerotomię. W przypadku oporu powiększyć otwór sklerotomii.
    2. Zaimplantować nośnik komórkowy przez retinotomię do przestrzeni podsiatkówkowej. W razie potrzeby zastosować technikę bimanualną z dodatkową sklerotomią i oświetleniem żyrandolowym w celu lepszej kontroli implantacji.
    3. Wycofać injektor z oka i zamknąć dużą sklerotomię szwem z poliglaktyny 8-0, aby uniknąć powikłań związanych z wewnątrzgałkową hipotonią.
    4. Przeprowadzić całkowitą wymianę płynu na powietrze (FAX) oraz drenaż płynu podsiatkówkowego za pomocą kaniuli z silikonową końcówką.
    5. Następnie wstrzyknąć olej silikonowy (1 000 cSt) do jamy ciała szklistego za pomocą systemu do witrektomii i układu rurek do iniekcji oleju silikonowego, aż do uzyskania prawidłowego IOP.
  6. Obrazowanie i dokumentacja śródoperacyjna
    1. Przeprowadzić nagrywanie wideo podczas całej operacji wraz z dokumentacją fotograficzną kluczowych etapów implantacji przy użyciu systemu rejestracji wideo.
    2. Uzupełnić rysunek dna oka, dokumentując lokalizację sklerotomii, retinotomii, implantu podsiatkówkowego oraz wszelkich wystąpionych powikłań, korzystając ze schematów rysunków dna oka.
  7. Kroki pooperacyjne
    1. Na koniec operacji usunąć trokary i zamknąć trzy sklerotomie oraz spojówkę szwami z poliglaktyny 8-0.
    2. Przepłukać worek spojówkowy 5% roztworem powidonu jodowego.
    3. Wykonać iniekcję podspojówkową 0,3 mL roztworu zawierającego 20 mg gentamycyny, 2 mg deksametazonu i 2% ksylokainy.
    4. Sprawdzić stan dna oka i soczewki podczas oględzin mikroskopowych.
    5. Usunąć szew/szwy z błony trzeciej za pomocą pęsety chirurgicznej i nożyczek do spojówki Westcotta (opcjonalnie).
    6. Nałożyć maść neomycynową lub okulistyczną maść z ofloksacyną do worka spojówkowego.

Schemat przygotowania do operacji oka i procedury mikrochirurgicznej z zaznaczeniem kątów nacięcia i miejsca operacji.
Rysunek 6: Wprowadzenie trokarów do oka miniprzynosa. (A) Schematyczne przedstawienie trokarów, które w oku ludzkim (kolor szary) są wprowadzane prostopadle do twardówki w kierunku centrum jamy ciała szklistego, a w oku miniprzynosa (kolor niebieski) pod kątem w kierunku tylnej części siatkówki, aby uniknąć uszkodzenia soczewki. Soczewka miniprzynosa (kolor niebieski) jest większa niż u ludzi w stosunku do rozmiaru jamy ciała szklistego. (B) Widok śródoperacyjny wprowadzonych trokarów podczas trójpodstawowej witrektomii przezpajęczynowej (PPV). Rogówka jest pokryta metylocelulozą w celu zapobiegania wysychaniu i obrzękowi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Stosuj miejscowo bacitracynę z cynkiem/octan hydrokortyzonu/siarczan neomycyny lub 0,3% ofloksacyny do worka spojówkowego zwierząt pięć razy dziennie.
  2. Po operacji sprawdź następujące parametry oka: turgor tkanek miękkich oka poprzez palpację, reakcję zapalną na powierzchni oka oraz mrużenie powiek jako reakcję ochronną, używając przenośnej lampy szczelinowej lub oftalmoskopu pośredniego.
  3. W ramach ogólnoustrojowej opieki pooperacyjnej stosuj następujące antybiotyki:
    1. Wstrzyknij domięśniowo chlorowodorek ceftiofuru w dawce 3 mg/kg BW (1 mL/kg) w drugim i trzecim dniu stabilizacji.
    2. Wstrzyknij tulatromycynę (1 mL/40 kg BW) 72 h po operacji w celu zapobiegania wtórnym infekcjom bakteryjnym.
  4. Wykonuj wstrzyknięcia domięśniowe fluniksyny (2 mL/45 kg masy ciała) i chlorowodorku tramadolu (100 mg) co 24 h przez 3 dni po operacji w celu zapobiegania bólowi.
  5. Utrzymuj miniaturowe świnie w specjalistycznym pomieszczeniu z klimatyzacją, w zakresie temperatur 18-22 °C i przy sztucznym cyklu światło/ciemność 13 h/11 h.
  6. Zapewnij im swobodny dostęp do wody i standardowe karmienie (dwukrotnie dziennie).

5. Procedury pooperacyjne

  1. Pooperacyjne badania okulistyczne
    1. W okresie pooperacyjnym należy zbadać oczy za pomocą oftalmoskopu pośredniego pod kątem występowania stanu zapalnego (np. zaczerwienienia, obrzęku tkanek lub gromadzenia się śluzu w worku spojówkowym). Pomiar ciśnienia wewnątrzgałkowego w operowanym oku należy przeprowadzić metodą palpacyjną.
  2. Pooperacyjne obrazowanie
    1. Przed fotografią dna oka i badaniem OCT należy wprowadzić miniprosiaka w stan sedacji poprzez domięśniowy wtrysk mieszaniny TKX. W celu wywołania mydriazji do worka spojówkowego miniprosiaka należy zakropić 1% tropikamidu oraz 10% hydrochlorku fenylefryny.
    2. Do utrzymania otwartych powiek należy użyć rozwieraka. Aby nawilżyć powierzchnię oka i uzyskać wyraźny obraz OCT, rogówkę zwierzęcia należy przemywać roztworem soli fizjologicznej (0.9% NaCl) co 30-60 s.
    3. Miniprosiaka należy ułożyć na stole operacyjnym w ten sam sposób, co podczas operacji (Rycina 2B,C, Rycina 3A). Głównym wymogiem jest umieszczenie głowy z boku i prostopadle do głowicy skanującej urządzenia OCT. Aby ustabilizować głowę i ustawić powierzchnię oka w pozycji poziomej, pod ryjkiem zwierzęcia należy zastosować podkładki ze styropianu.
    4. Kolorowe obrazy dna oka należy wykonać za pomocą kolorowej kamery dna oka bez konieczności rozszerzania źrenic, co pozwala na udokumentowanie przedniego odcinka oka, siatkówki i tarczy nerwu wzrokowego. Dodatkowo, za pomocą kamery bezmydriatycznej należy wykonać obraz siatkówki w trybie red-free.
    5. Obrazowanie za pomocą optycznej koherentnej tomografii należy przeprowadzić w systemie SD-OCT. Podczas obrazowania OCT lub dna oka należy ręcznie przechylać głowę miniprosiaka w stronę soczewek OCT lub soczewek kamery dna oka, aby zoptymalizować widok tylnej części siatkówki oraz obszaru implantacji (Rycina 2C). Dla uzyskania optymalnego obrazu wszczepionego nośnika na dnie oka, należy wykorzystać światło odbicia podczerwonego urządzenia OCT, aby skupić ostrość na implancie (Rycina 2C). Należy zastosować tryby skanowania crossline oraz mapy siatkówki.
    6. Na koniec badania pod powiekę oka zwierzęcia należy nałożyć maść okulistyczną z ofloksacytyną.
    7. Miniprosiaka należy przenieść do pomieszczenia i obserwować jego stan ogólny aż do ustąpienia sedacji (około 2 h do 5 h).

6. Enukleacja oka po śmierci po eutanazji

  1. Uspokój minipigsy poprzez domięśniowy wtrysk mieszaniny TKX, a następnie podaj dożylnie (poprzez kaniulę uszną 22-G) dawkę bolusową 1% propofolu (20 mL/zwierzę), po czym przeprowadź upuszczenie krwi. Nie stosuj ogólnych utrwalaczy.
  2. Uśmierć zwierzęta poprzez upuszczenie krwi podczas głębokiej narkozy ogólnej w dniach 7, 14, 28 i 42 po implantacji graftu komórkowego.
  3. Używając pęsety i nożyczek, usuń górną oraz dolną powiekę. Usuń trzecią powiekę i przetnij spojówkę. Przetnij mięśnie gałki ocznej oraz nerw wzrokowy.
  4. Przeprowadź enukleację gałek ocznych po śmierci, używając nożyczek i pęsety chirurgicznej. Upewnij się, że procedura jest wykonywana przez osobę doświadczoną.

Wyniki

Wyniki podsiatkówkowej implantacji nośnika komórek u miniaturowych świń rasy liběchov przedstawiono w Tabeli 2. Prawidłową implantację zdefiniowano jako uzyskanie wystarczających danych do badania histologicznego i immunohistochemicznego. Przypadki niepowodzenia zdefiniowano jako oczy z ciężkimi powikłaniami śródoperacyjnymi, które uniemożliwiły dalszą obserwację tkanek oka.

Zastosowanie proponowanej techniki z wykorzystaniem tamponady z oleju silikonowego pozwala na monitorowanie stanu przeszczepu podsiatkówkowego za pomocą metod obrazowania począwszy od następnego dnia po operacji aż do momentu enukleacji (Rysunek 7, Rysunek 8 oraz Rysunek 9).

Obrazowanie dna oka i SD-OCT
Miniświnie były badane w okresie pooperacyjnym przy użyciu obrazowania dna oka, obrazowania bezczerwonego (red-free) oraz optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) (Rysunek 7). Wysokiej jakości obrazowanie dna oka było możliwe dzięki przejrzystości ośrodków optycznych, w tym przejrzystości soczewki oraz zastosowaniu tamponady z olejem silikonowym (Rysunek 7A). W miejscu retinotomii nie stwierdzono oznak reakcji proliferacyjnej (Rysunek 7A, żółte strzałki), a rama PTE nośnika komórkowego była wyraźnie widoczna przez półprzezroczyste warstwy siatkówki świni. W obrazowaniu bezczerwonym refleksyjność hodowlanych hRPE na nośniku nie różniła się od refleksyjności endogennej warstwy RPE świni (Rysunek 7B). W badaniu SD-OCT rama PTE powodowała jedynie niewielkie zacienienie leżących poniżej struktur anatomicznych oraz lekkie pogrubienie siatkówki (Rysunek 7C, czerwone strzałki). W SD-OCT nie zauważono nietypowych stref hipo- lub hiperrefleksyjnych, a błona Brucha wydawała się pozostać nieuszkodzona. Rysunek 8 przedstawia obrazy dna oka i iOCT rusztowania z hodowanymi pierwotnymi ludzkimi komórkami RPE 1 miesiąc po operacji (Rysunek 8). Sam nośnik komórkowy (bez komórek) nie spowodował znaczącego wzrostu grubości siatkówki (Rysunek 9C). Wyniki te sugerują, że śródoperacyjny jatrogenny wpływ implantu był minimalny, a wszczepiony nośnik komórkowy zapewnił wystarczającą adaptację zaimplantowanych komórek do nadlegających komórek fotoreceptorów i tkanki neurosiatkówkowej.

Badanie siatkówki; A: obraz optyczny, B: podczerwień, C: skan OCT; metoda obrazowania diagnostycznego.
Rysunek 7: Pooperacyjne obrazowanie siatkówki u miniswini. (A) Obrazowanie dna oka, (B) obraz bezczerwony oraz (C) obrazowanie metodą optycznej koherentnej tomografii (OCT) nanofibrowego nośnika z pierwotnymi ludzkimi komórkami RPE w kontroli po 1 tygodniu od transplantacji podsiatkówkowej w oku miniswini. (A) Żółte strzałki wskazują miejsce retinotomii. (B) Czerwone strzałki pokazują krawędzie nanofibrowego nośnika komórek. (C) Czerwone strzałki wskazują lekkie zacienienie sygnału OCT spowodowane wspierającą ramką PET nanofibrowego nośnika, który został wszczepiony do przestrzeni podsiatkówkowej. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Analiza siatkówki w OCT, optyczna koherentna tomografia, wynik mikroskopii, ocena warstw siatkówki.
Rycina 8Obrazowanie dna oka oraz obrazy iOCT rusztowań 30 dni po implantacji podsiatkówkowej u miniprosi. A, B, C, D, i E odpowiadają odpowiednio świniom 169, 182, 179, 199 i 224. Żółte strzałki przedstawiają ramę rusztowania. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Analiza histologiczna i immunohistochemiczna
Po eutanazji zwierząt wyjęto całe oczy minipigów i utrwalono je w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 24 h. Usunięto przednią część oka, zidentyfikowano implantowany nośnik nanowłóknisty w nosowej części centralnej siatkówki i wyizolowano go wraz z przytwierdzoną twardówką. Wszystkie tkanki poddano krioprotekcji w roztworach sacharozy o różnym stężeniu, a następnie wykonano pionowe mrożone sekcje, zgodnie z opisem szczegółowym43. Badanie histologiczne błony nanowłóknistej bez komórek RPE po 4 tygodniach implantacji wykazało brak stanu zapalnego i zmian degeneracyjnych w siatkówce (Rycina 9A). Obecność błony nanowłóknistej stwierdzono w świetle spolaryzowanym (Rycina 9B).

Przekrój poprzeczny siatkówki, obrazy histologiczne i OCT, pokazujące warstwy siatkówki i analizę strukturalną.
Rycina 9: Analiza histologiczna wszczepionej acellularnej membrany nanowłóknistej. Barwienie hematoksyliną i eozyną acellularnej membrany nanowłóknistej 4 tygodnie po implantacji (A) przy standardowym oświetleniu oraz (B) przy użyciu mikroskopii w świetle spolaryzowanym. Biała strzałka wskazuje lokalizację membrany nanowłóknistej (pasek skali: 50 µm). (C) Obrazy optycznej koherentnej tomografii in vivo acellularnej membrany nanowłóknistej 4 tygodnie po implantacji ukazują dobrą akceptację i przyleganie membrany nanowłóknistej w przestrzeni podsiatkówkowej. Biała strzałka wskazuje położenie implantu na obrazie przekroju poprzecznego siatkówki. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rycina 10 przedstawia barwienie hematoksyliną i eosiną (H&E)&E) barwienie obszaru siatkówki zawierającego wszczepione pierwotne komórki hRPE na nośniku nanowłóknistym (żółta strzałka) w oku miniświń. Pigmentowany wygląd wszczepionych pierwotnych komórek hRPE tworzył ciągłą, lecz nieregularną warstwę pigmentową (Rysunek 10, czerwone strzałki). Po dłuższych okresach obserwacji (6 tygodni) neuroretina pod implantami wykazywała obraz przypominający rozetki lub reakcję hipertroficzną wokół miejsca retinotomii, co prawdopodobnie było wynikiem manipulacji jatrogennych. Wyniki morfologiczne te są porównywalne z obrazowaniem SD-OCT i potwierdzają dowody na minimalny wpływ dostarczonego nośnika na tkankę siatkówki.

Obraz histologiczny warstw siatkówki pokazujący komórki RPE i naczyniówkę; strzałki wskazują rozmieszczenie komórek.
Rycina 10: Analiza histologiczna wszczepionej membrany nanofibrowej z pierwotnymi hRPEs. Barwienie hematoksyliną i eozyną obszaru siatkówki zawierającego wszczepiony nanofibrowy nośnik (żółta strzałka) z pierwotnymi hRPEs w oku minipig. Zwierzę zostało uśmiercone i poddane analizie 6 tygodni po implantacji. Pierwotne hRPEs były wyraźnie rozróżnialne ze względu na swój rozmiar, okrągły kształt i pigmentację (czerwone strzałki) w przestrzeni podsiatkówkowej naprzeciwko fotoreceptorów. Jądra fotoreceptorów w ONL tworzą struktury przypominające rozety. Przestrzeń podsiatkówkowa wydaje się być hipertroficzna. Skróty: hRPE = pierwotny ludzki nabłonek pigmentowy siatkówki, ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa, INL = wewnętrzna warstwa jądrowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Barwienie immunocytochemiczne przeprowadzono z wykorzystaniem dwuetapowej metody pośredniej. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym CRALBP, będącym przeciwciałem monoklonalnym, w rozcieńczeniu 1:100. Immunofluorescencję wykonano przy użyciu przeciwciała wtórnego sprzężonego z Alexa Fluor 488.

Zaimplantowane pierwotne hRPE były obecne w obszarze implantacji i wykazywały ekspresję typowego markera RPE CRALBP, podobnie jak endogenne komórki RPE miniprzetwory (Rycina 11A). W przeciwieństwie do tego, morfologia zaimplantowanych komórek wydawała się nie przyjmować kształtu monowarstwy po implantacji, mimo że pozostawały one zlokalizowane w wyznaczonej przestrzeni podsiatkówkowej (Rycina 11A,B, białe strzałki). Następujące markery RPE/siatkówki oraz cechy morfologiczne pozostały pozytywne po 6-tygodniowym okresie po implantacji: obecność ziarnistych pigmentów/melaniny, neuronalne markery specyficzne dla późnych etapów rozwoju siatkówki dla komórek dwubiegunowych pręcikowych (PKC-alpha) i fotoreceptorów czopkowych (PNA) oraz pozytywność GFAP – oznaka aktywacji mikrogleju.

Mikroskopia fluorescencyjna, barwienie CRALBP i DAPI, analiza tkanki siatkówki świni/człowieka, porównanie warstw komórkowych.
Rysunek 11: Immunoznakowanie markerem komórek RPE, CRALBP (białko wiążące retinaldehyd w komórkach siatkówki), u miniswini 6 miesięcy po implantacji pierwotnych hRPE. (A) Pionowe mrożone przekroje potraktowanego oka świni zostały oznakowane przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CRALBP (zielony) i przeciwbarwione DAPI (niebieski). (B) Pojedyncze przedstawienie znakowania jąder komórkowych DAPI w czerni i bieli; wysoki kontrast ujawnia okrągły kształt poszczególnych komórek hRPE (niektóre wskazane białymi strzałkami). Skróty: hRPE = ludzki nabłonek pigmentowy siatkówki, ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Powikłania okulistyczne
W sumie 27 z 29 (93,1%) operacji wykonano pomyślnie. Definicję „pomyślnie wykonanych operacji” zastosowano w przypadkach, w których w operowanym oku do czasu enukleacji nie wystąpiły żadne klinicznie istotne powikłania pooperacyjne, które mogłyby wpłynąć na badanie histologiczne i immunohistochemiczne. Zmniejszona przejrzystość ośrodków optycznych wpłynęła na obrazowanie pooperacyjne w czterech przypadkach (13,7%); mimo to oczy te poddano dalszej analizie histologicznej i immunohistochemicznej.

Śródoperacyjne odwarstwienie obwodowej siatkówki wystąpiło w czterech przypadkach (13,8%). W dwóch przypadkach rozwiązano ten problem poprzez aspirację płynu podsiatkówkowego podczas wymiany płyn-gaz oraz zastosowanie fotokoagulacji laserowej siatkówki w obszarze odwarstwienia. W pozostałych dwóch przypadkach (6,9%) odwarstwienie siatkówki wiązało się z masywnym krwawieniem siatkówkowym i podsiatkówkowym, co uniemożliwiło implantację nośnika komórek i doprowadziło do przerwania operacji oraz natychmiastowej eutanazji minirświni na stole operacyjnym.

NieParametryStandardowe ustawienia parametrów
1Prędkość witrektomii (częstotliwość cięcia)do 20 000 cięć/min
2Pompa Venturiego50-180 mmHg
3Czas narastania1 s
4Ciśnienie irygacji18-25 mmHg
5Ciśnienie infuzji powietrza20-25 mmHg
6Bipolarna exodiatermia18-26%
7Monopolarna endodiatermia16-18%
8Fotokoagulacja laserowa siatkówki, 532 nmMoc 100–150 mW
Interwał 100 ms 
Czas trwania 100 ms

Tabela 1: Standardowe parametry stosowane podczas witrektomii i fotokoagulacji laserowej.

Całkowita liczba zwierząt, n18
Całkowita liczba oczu, n36
oczy operowane, n29
Pomyślna implantacja, n27
Przypadki niepowodzeń, n2
Średni czas operacji, min57
Wskaźnik sukcesu, %93.1

Tabela 2: Wyniki standaryzowanej techniki chirurgicznej z implantacją podsiatkówkową nośnika komórek u miniswini Liběchov w latach 2016–2020.

Plik uzupełniający 1: Podsumowanie badań poświęconych podsiatkówkowej implantacji komórek RPE na nośniku komórkowym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Implantacja podsiatkówkowa komórek RPE o różnym pochodzeniu jest bardzo obiecującym trendem w badaniach okulistycznych w leczeniu chorób zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Główną ideą tego podejścia jest zastąpienie uszkodzonych RPE zdrowymi RPE hodowanymi ex vivo (plik uzupełniający 1)44,45,46,47,48. Wykorzystanie nośników komórkowych do przeszczepiania hodowanych komórek RPE stanowi najbardziej rozsądne podejście, ponieważ porowate błony utrzymują spolaryzowaną warstwę komórek RPE we właściwej orientacji w stosunku do warstwy fotosensorycznej.

Optymalny model zwierzęcy
Kluczowym krokiem w rozwoju takich metod leczenia jest zastosowanie optymalnego modelu zwierzęcego49. W przeszłości używano małych i dużych modeli zwierzęcych, w tym królików, psów, świń i naczelnych 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. W niniejszym artykule proponujemy wykorzystanie modelu świnki miniaturowej Liběchova i opisujemy etapy przedoperacyjne, chirurgiczne i pooperacyjne, które umożliwiają uzyskanie solidnej skuteczności przeszczepu. Świnka miniaturowa Liběchov została pierwotnie wyhodowana około 20 lat temu i jest często wykorzystywana w badaniach biomedycznych w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona i Huntingtona29,50. Ponieważ świnia posiada stosunkowo duży mózg z dopływem krwi i reakcją immunologiczną podobną do ludzkiej, została wykorzystana jako model zwierzęcy do eksperymentów z przeszczepami allogenicznymi, a także 51,52,53,54. Mimo że siatkówka świnek miniaturowych nie posiada plamki żółtej i dołka środkowego podobnego do ludzkiego, zawiera obszar centralny i smugi wzrokowe, które są obszarami siatkówki o wysokim stężeniu fotoreceptorów czopków30. Zbliżona wielkość do ludzkiego oka, obecność centralnej siatkówki wzbogaconej w stożek, dobrze opisany układ odpornościowy oraz obecność metod oceny morfologii i funkcji po operacji są ważnymi argumentami przemawiającymi za zastosowaniem tego dużego modelu zwierzęcego w prezentowanym badaniu.

Zabiegu chirurgicznego
Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie ma ustandaryzowanych i powszechnie akceptowanych technik chirurgicznych do przeszczepiania komórek RPE w stanie witreoretinalnym na nośnikach. Jednym z kluczowych problemów terapii zastępczej komórek jest trudna technika chirurgiczna, która wiąże się z ryzykiem powikłań śródoperacyjnych i pooperacyjnych związanych z odwarstwieniem siatkówki, hipotonią, krwawieniem nadtwardówkowym, naczyniówkowym i/lub siatkówkowym oraz dużymi turbulencjami wewnątrzgałkowymi, które mogą prowadzić do uszkodzenia rusztowania. Po operacji istnieje ryzyko proliferacyjnej witreoretinopatii, zapalenia wnętrza gałki ocznej, hipotonii, odwarstwienia siatkówki i powstania zaćmy 4,10,13,14,15.

Pierwsze badania nad podejściami z wykorzystaniem nośników komórkowych przeprowadzono u królików szynszyli 13,16,25. Mimo że zwierzęta te reprezentują mały model zwierzęcy, wyniki koncentrujące się na technicznych aspektach operacji miały kluczowe znaczenie dla rozwoju procedur na dużych modelach zwierzęcych i dlatego zostały podsumowane poniżej.

Początkowo zastosowano wykonaną na zamówienie kaniulę infuzyjną 23 G z dwoma bocznymi portami w celu przekierowania strumienia strumieniowego, co pomogło rozwiązać problem zapadania się pęcherzyka i wynikającego z tego odwarstwienia siatkówki13. W niniejszym badaniu nie zauważyliśmy takiego zapadania się pęcherzyka. Możliwą przyczyną takiego stanu rzeczy może być większy rozmiar gałki ocznej i wykonanie witrektomii gruboigłowej z oszczędzonym ciałem szklistym na obwodzie w miejscu infuzji kaniuli, co może zmniejszyć siłę skierowanego prądu strumieniowego.

Trudności podczas wyrzucania nośnika komórkowego z instrumentu były kolejną śródoperacyjną przeszkodą w małych modelach zwierzęcych, które zostały sklasyfikowane jako "uwięzione z instrumentem". Dodatkowo autorzy zasugerowali, że resztki ciała szklistego na powierzchni siatkówki mogą powodować "przeskok" do tyłu nośnika z otworu retinotomii po implantacji. Problem ten można rozwiązać za pomocą witrektomii wspomaganej enzymatami, która umożliwia płynne, ciągłe wyrzucanie nośnika komórkowego do przestrzeni podsiatkówkowej. W większości przypadków autorzy zmienili pozycję nosiciela, aby uzyskać bardziej oddalone miejsce implantu od siatkówki. W naszej serii przypadków doświadczyliśmy również sytuacji, w której nośnik ogniw pozostał przyczepiony do końcówki wtryskiwacza. Udało się to jednak osiągnąć poprzez powolną i delikatną manipulację światłowodem i końcówką wtryskiwacza. W żadnym z naszych przypadków nie zaobserwowaliśmy żadnych zalegających ciał szklistych w miejscu retinotomii. Stosowanie PPV wspomaganego TA w operacjach można zasugerować jako metodę zmniejszenia ryzyka pozostałości przyczepionego ciała szklistego. Wielokrotne barwienie za pomocą TA może być konieczne w celu całkowitego usunięcia leżącego na powierzchni ciała szklistego.

W innym badaniu przedstawiono wyniki implantacji podsiatkówkowej ludzkich komórek macierzystych RPE hodowanych jako spolaryzowana monowarstwa komórkowa na membranie poliestrowej24. Podczas eksperymentów zastosowano tę samą technikę chirurgiczną, którą opisanowcześniej13, ale zastosowano podejście z dwoma portami PPV. Wreszcie, opublikowano protokół krok po kroku dotyczący implantacji podsiatkówkowej chirurgii nośnika komórkowego u królików25. Niniejsze opracowanie przedstawia bardzo szczegółowy i łatwy do powtórzenia opis zabiegu chirurgicznego, w tym opieki przedoperacyjnej i pooperacyjnej, który również opiera się na wcześniejszych doświadczeniach.

Podczas wykorzystania dużych modeli zwierzęcych w kolejnych badaniach poruszono nie tylko kwestie techniczne, ale także kwestie dotyczące reakcji immunologicznej na przeszczepione komórki, a także kwestie związane z wielkością nośnika komórek. W badaniu z udziałem małp cynomolgus (Macaca fascicularis) opisano wyniki implantacji podsiatkówkowej monowarstw RPE pochodzących z ludzkich komórek macierzystych15. Wszystkie zwierzęta poddano ogólnoustrojowej immunosupresji, która składała się z syrolimusa (dawka nasycająca 2 mg, dawka dobowa 1 mg) i tetracykliny (7,5 mg/kg masy ciała) rozpoczynającej się 7 dni przed zabiegiem i trwającej 3 miesiące po operacji. Zabieg chirurgiczny został przeprowadzony zgodnie z protokołami opisanymi wcześniej24,25. Autorzy zastosowali trzyportowe podejście PPV o gramaturze 25 G z endo-oświetleniem żyrandola. Co ważne, PVD wspomagane TA zastosowano w celu wykluczenia resztkowego zrostu szklistkowo-siatkówkowego na tylnej siatkówce. Jako uzupełnienie pierwotnie opisanej procedury, autorzy usunęli warstwę RPE gospodarza w obszarze przyszłej implantacji za pomocą wykonanego na zamówienie narzędzia z przedłużaną pętlą o gramaturze 20 G.

W naszym badaniu na świnkach miniaturowych stosowaliśmy również ogólnoustrojową immunosupresję. Jednak rodzaj immunosupresji różnił się od opisanego powyżej. Podaliśmy podskórne wstrzyknięcie mikrosfer polimerowych uwalniających takrolimus jako depot w dawce 0,25 mg / kg masy ciała, aby utrudnić odrzucenie przeszczepu komórkowego i reakcje zapalne. Nie usunęliśmy warstwy komórek RPE gospodarza podczas operacji, ponieważ naszym głównym celem była analiza bezpieczeństwa zabiegu i żywotności wszczepionych komórek, ale nie ich integracji z siatkówką gospodarza.

Wcześniej oceniano bezpieczeństwo i wykonalność implantacji podsiatkówkowej monowarstwy RPE pochodzących z hESC na składanej, niedegradowalnej, submikronowej membranie parylenu-C opartej na siatce (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm grubości) u10 samic świnek miniaturowych z Jukatanu. Po hodowli komórki wysiewano na membranie opartej na siatce. Immunosupresję prowadzono przy użyciu ogólnoustrojowego podawania takrolimusu (bez wskazanego reżimu i dawki) oraz wstrzyknięć do ciała szklistego w dawce 0,7 mg deksametazonu pod koniec operacji. PPV wykonano przy użyciu podejścia 20 G. Autorzy zastosowali doszklistkowe wstrzyknięcie acetonidu triamcynolonu w celu lepszej wizualizacji ciała szklistego. Duża sklerotomia miała wielkość od 2 mm do 3 mm. Po wstrzyknięciu podsiatkówkowym siatkówka została spłaszczona za pomocą tymczasowego wstrzyknięcia płynu perfluorowęglowodorowego. Po wymianie płyn-powietrze wykonano tamponadę z olejkiem silikonowym (1 000/5 000 cSt). Opieka pooperacyjna obejmowała podanie do oka maści deksametazon/neomycyna/polimyksyna B 1 tydzień po zabiegu. Autorzy poinformowali o wskaźniku sukcesu na poziomie 91% (tj. skuteczna implantacja podsiatkówkowa i wystarczające dane z obrazowania pooperacyjnego). W naszym badaniu iniekcja doszklistkowa kryształów TA była stosowana śródoperacyjnie i głównie w celu wizualizacji ciała szklistego. Jednak miejscowe działanie immunosupresyjne tego leku pozostaje niejasne. Nośniki komórek nanowłóknistych użyte w naszym badaniu miały wymiary 5,2 mm x 2,1 mm i grubość 3,7 μm, a wielkość porów wynosiła 0,4 μm. Podczas operacji wykonaliśmy bezpośredni faks zamiast wstrzykiwania płynu perfluorowęglowodorowego. Nasz wskaźnik powodzenia chirurgicznego (93,1%) był zgodny i nieco lepszy niż w przypadku Koss i wsp.10.

Przeszczep podsiatkówkowy w pełni degradowalnych nośników komórkowych (rusztowania) do implantacji podsiatkówkowej został po raz pierwszy zbadany w 2019 r. u świń Yorkshire14. Badanie koncentrowało się głównie na biodegradowalnych właściwościach implantów hydrożelowych fibrynowych. Autorzy zauważyli, że agresywna immunosupresja stosowana u świń domowych może hamować miejscową reakcję zapalną potencjalnie spowodowaną podczas biodegradacji implantów hydrożelowych fibryny. Nie sprecyzowali jednak terapii immunosupresyjnej stosowanej u świń. Podczas PPV wykonano sklerotomię o długości 3,6 mm w celu wprowadzenia urządzenia do implantacji podsiatkówkowej równolegle do rąbka i około 3,5 mm za nim. Dodatkowo zastosowali pneumatyczny system iniekcyjny, którego celem było zmniejszenie niestabilności ułożenia dłoni spowodowanej manipulacją palcami. W naszej serii przypadków wszystkie sklerotomii znajdowały się w odległości od 2,5 mm do 3,0 mm od rąbka. Duża sklerotomia do wprowadzenia wstrzykiwacza miała długość 3 mm. Wstrzykiwacz implantacyjny zastosowany w naszym badaniu był obsługiwany ręcznie. Dokładne kauteryzowanie pars plana ciała rzęskowego i wystarczające nacięcie wewnątrz dużej sklerotomii wydają się być kluczowe dla uniknięcia powikłań śródoperacyjnych, takich jak jatrogenne odwarstwienie siatkówki obwodowej, krwawienie i utrata implantu.

Podsumowując, opisano zastosowanie modelu świnki miniaturowej Liběchova do przeszczepiania komórek RPE na nośnikach biodegradowalnych jako opcji leczenia dziedzicznych i nabytych chorób siatkówki. Podobieństwa w anatomii i fizjologii oka, a także w odniesieniu do układu odpornościowego, pozwalają nam rozwijać i doskonalić techniki chirurgiczne i oprzyrządowanie do implantacji komórek podsiatkówkowych, które można łatwo przenieść do leczenia chorób oczu u ludzi. Ważne jest, aby zapewnić, że operacje na świnkach miniaturowych są wykonywane przy użyciu tego samego oprzyrządowania (w tym narzędzi do implantacji), gdy są stosowane w operacjach u ludzi, ułatwiając w ten sposób zastosowanie zdobytego doświadczenia i know-how w odniesieniu do ludzi. Alternatywne modele zwierzęce z dużym okiem z obecnością obszaru plamki żółtej, takie jak naczelne inne niż ludzie, mogą być przydatne do obserwacji i analizy zmian anatomicznych i funkcjonalnych po implantacji podsiatkówkowej w centralnym obszarze siatkówki. Szczegółowy opis procedur opieki przedoperacyjnej, chirurgicznej i pooperacyjnej będzie przydatny w przyszłych badaniach poprzez zwiększenie wydajności i standaryzacji generowania danych.

Podziękowania

Projekt był wspierany przez Czeską Fundację Naukową (Numer Projektu 18-04393S) oraz Norweską Agencję Grantów i Technologii Republiki Czeskiej (Program KAPPA, Numer Projektu TO01000107).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wyposażenie techniczne
Wato EX-65 z Mindray iMEC10Mindray, Shenzhen, ChinyAparat do znieczuleniaWato Ex-65
R-Evolution CROptikon, Rzym, WłochyFakoemulgator/witrektomR-Evolution CR
Zielony laser Merilas 532αMeridian, Thun, SzwajcariaMerilas 532αOkulistyczny zielony laser
Mikroskop Hi-R NEO 900AHaag-Streit Surgical, Wedel, Niemcy)Hi-R NEO 900Achirurgii okulistycznej
Kamera Sony PMW-10MDSony, Tokio, JaponiaPMW-10MDfull HD medyczny 2-częściowy 
Bezkontaktowy system chirurgiczny witreoretinalny MERLIN BIOMVolk, Mentor, OH, USAMERLIN BIOMBIOM
Sterylizator parowyTuttnauer Europe B.V., Breda, NL3870 Sterylizator HSG
iCam100Optovue, Fremont, CA, USAiCAM100dno oka
iVue OCT100-2Optovue, Fremont, CA, USAiVue OCT100-2PAŹ
Instrumenty i urządzenia mikrochirurgiczne
Cook Eye SpeculumKatena, New Jersey, USK1-5403Ostrza 15 mm
Serweta chirurgiczna okulistycznaHylyard, Alpharetta, Georgie, USA79304132 x 142 cm
Jednorazowy dwuetapowy system witrektomii. (rozmiar 23 / 0,6 mm)DORC, Zuidland, Holandia1272.ED06
Linia infuzyjna do kaniuli infuzyjnej 23G / 0,6 mmDORC, Zuidland, HolandiaNóż 1279.P
2,75mm, nóż kątowy IQ Geometry Tm Slit Knifed, Bevel UpSurgical Specialties Corporation, Reading, USA72-2761G
Wysuwana igła do wstrzykiwań podsiatkówkowych 41G. (rozmiar 23 / 0,6 mm)DORC, Zuidland, Holandia1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo strzykawkaBBraun, Melsungen, Niemcy4617022V3ml
1ml miękki wstrzykiwacz TuberculinHenke Sass Wolf, Tuttlingen, Niemcy5010.200V01ml
8-0 Coated VicrylEthicon, Portoryko, USAJ409G
Oczyszczony olej silikonowy (w strzykawce) 10 ml(FCI, Paryż, Francja)S5.71701000cSt
Pinnacle 360 Morris Nożyczki pionowe 23GaSynergetics, O'Fallon, USA10.24.23PIN23Ga
Revolution DSP 23Ga ILMkleszcze Alcon, Genewa, Szwajcaria706.44Griesharber revolution
23ga Prosta sonda laserowa Synergetyka, O' Fallon, USA55.21.23
FCI Protect 2.0%FCI Okulistyka, Paryż, FrancjaS5.9100wiskoelastyczne
nożyczki do ściegów DK Westcott style, CurveDuckworth & Kent, Hertfordshire, Anglia1-501
Kleszcze z nacięciem Curve Pierse, 0,3 mm StraighDuckworth & Kent, Hertfordshire, Anglia2-100-1E0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Kleszcze do wiązania prostegoDuckworth & Kent, Hertfordshire, AngliaDK 2-504E6 mm
, StraighDuckworth & Kent, Hertfordshire, Anglia3-2019mm straigh
Leki i roztwory
Unitropic 1% gtt. UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratysława, Republika Słowackatropicamidum 10 mg/mlkrople do oczu
DiprophosMerck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Holandiabetamethasonum 7 mg/ml1ml
Alcon BSS Roztwór do nawadnianiaAlcon, Genewa, SzwajcariaBilans roztworu soli (BSS)500ml
BetaisodonaMundipharma, Cambridge, Wielka Brytaniapovidon-Jod 1g/10ml30ml
Depo-medrol 120mgPfizer, New Yourk, USAmetyloprednizolon5ml/200mg
ShotapenVirbac Carros Cedex, Francjapenicylina benzylowa, dihydrostreptomycyna250ml
Flunixin a.u.v.Norbrook, Newry, Irlandia Północnaflunixinum 50,0 mg250ml
Tramal 100MG/2MLStada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschlandtramadol2ml
Zoletil 100Virbac Carros Cedex, Francjatiletamina, zolazepam100mg
Narkeran 10Vetoquinol, Magny-Vernois, Francjaketamin2ml
Rometar 20mg/mlSpofa pharmaceutica, Praga, Republika Czeskaxylazinum20mg
Braunol 75mg/gB.Braun medical, Praga, Republika Czeskapowidon jod75mg/g
Propofol 1% MCT/LCTFresenius Kabi, Bad Homburg, Niemcypropofol10mg/1ml
Isoflurane 100% Para wziewna, płynPiramal Critical Care Limited, West Drayton, Wielka Brytaniaizofluran100%
Benoxi gtt.  4mg/1mlUnimed pharma, Bratysława, Słowacjaoksybuprakaina10ml
Neosynefryna POS 10% gtt. Ursapharm , Saarbrü cken, Deutschlandchlorek fenylefryny10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GMZentiva a.s.,  Praga, Republika Czeskabacytracyna/octan hydrokortyzonu/hydrokortyzonooctan/siarczan neomycyny5mg
Floxal ung.Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Niemcyofloksacyna0.30%
Eficur inj. Hipra, Amer, Hiszpaniaceftiofurum hydrochloridum 50mg / 1ml
DraxxinZoetis Inc., New Jersey, Stany ZjednoczoneTulatromycyna100mg / 1ml
TramalStada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschlandtramadoli hydrochloridum100mg / 2ml
XylapanVetoquinol, Magny-Vernois, Francjaxylazinum0,4 mg/kg
Roztwór okulistyczny chlorowodorku proparakainy 0,5%Bausch& Lomb Incorporated Tampa, FL, USAChlorowodorek proparakainy0,50%
Prograf Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, Stany ZjednoczoneTakrolimus w proszku1 mg
Cell carrier, hodowlane kultury komórkowe i implantacja wtryskiwacz
Falcon Cell Culture InsertsCorning Inc., Kenneburg, ME, USA353103
TrypLE Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific, MA, USA12604021
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific, MA, Stany Zjednoczone11320033
Biolaminina 521 LN (LN521)BioLamina, Sundbyberg, SzwecjaLN521-02
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific, MA, USA35050061
2-merkaptoetanolThermo Fisher Scientific, MA, USAJ66742.0B
Penicylina-StreptomycynaSigma-Aldrich, San Luis, Mi, Stany ZjednoczoneP4333
CRALBPNovus Biologicals, Abingdon, Wielka BrytaniaNB100-74392
Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Niemcy Numer katalogowy: 21202
mikroskop Uchwyt igły

Bibliografia

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2011).
  2. Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 32 (6), 375-413 (1988).
  3. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
  4. Mano, F., et al. Methodological approach to improve surgical outcomes of a pig subretinal implantation model. Translational Vision Science & Technology. 11 (4), 24(2022).
  5. Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future. Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  6. Carr, A. -J. F., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).
  7. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  8. Popelka, S., et al. A frame-supported ultrathin electrospun polymer membrane for transplantation of retinal pigment epithelial cells. Biomedical Materials. 10 (4), 045022(2015).
  9. Kozak, I., et al. Safety and feasibility of new nanofiber subretinal delivery system with injector for RPE cell transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5670(2018).
  10. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  11. Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
  12. Christiansen, A. T., et al. Subretinal implantation of electrospun, short nanowire, and smooth poly(epsilon-caprolactone) scaffolds to the subretinal space of porcine eyes. Stem Cells International. 2012, 454295(2012).
  13. Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 490-500 (2012).
  14. Gandhi, J. K., et al. Fibrin hydrogels are safe, degradable scaffolds for sub-retinal implantation. PloS One. 15 (1), 0227641(2020).
  15. Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  16. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  17. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  18. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  19. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  20. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), 4097(2018).
  21. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  22. Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: Improved survival when implanted as a monolayer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).
  23. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11 (475), 7624(2019).
  24. Stanzel, B., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  25. Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments. (115), e53927(2016).
  26. Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
  27. Yaji, N., Yamato, M., Yang, J., Okano, T., Hori, S. Transplantation of tissue-engineered retinal pigment epithelial cell sheets in a rabbit model. Biomaterials. 30 (5), 797-803 (2009).
  28. Hruban, V., et al. Inheritance of malignant melanoma in the MeLiM strain of miniature pigs. Veterinarni Medicina. 49 (12), 453-459 (2004).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 161-171 (2005).
  30. Vízina, M. Comparative Ocular Anatomy in Commonly Used Laboratory Animals. Ocular Toxicology in Laboratory Animals. Wier, A. B., Collins, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 9-12 (2013).
  31. Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Veterinary Ophthalmology. 2 (3), 179-184 (1999).
  32. Wang, Q. X., et al. Biodegradable microsphere-loaded tacrolimus enhanced the effect on mice islet allograft and reduced the adverse effect on insulin secretion. American Journal of Transplantation. 4 (5), 721-727 (2004).
  33. Sevc, J., et al. Effective long-term immunosuppression in rats by subcutaneously implanted sustained-release tacrolimus pellet: Effect on spinally grafted human neural precursor survival. Experimental Neurology. 248, 85-99 (2013).
  34. Juhásová, J., et al. Osteogenic differentiation of miniature pig mesenchymal stem cells in 2D and 3D environment. Physiological Research. 60 (3), 559-571 (2011).
  35. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 156 (2), 128-134 (2012).
  36. Soerensen, D. D., Pedersen, L. J. Infrared skin temperature measurements for monitoring health in pigs: a review. Acta Veterinaria Scandinavica. 57 (1), 5(2015).
  37. Eichhorn, S. J., Sampson, W. W. Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies. Journal of the Royal Society Interface. 2 (4), 309-318 (2005).
  38. Szatmári-Tóth, M., et al. Clearance of autophagy-associated dying retinal pigment epithelial cells - a possible source for inflammation in age-related macular degeneration. Cell Death & Disease. 7 (9), 2367(2016).
  39. Lukovic, D., et al. Human iPSC derived disease model of MERTK-associated retinitis pigmentosa. Scientific Reports. 5, 12910(2015).
  40. Artero Castro, A., et al. Generation of gene-corrected human induced pluripotent stem cell lines derived from retinitis pigmentosa patient with Ser331Cysfs*5 mutation in MERTK. Stem Cell Research. 34, 101341(2019).
  41. Artero Castro, A., León, M., Del Buey Furió, V., Erceg, S., Lukovic, D. Generation of a human iPSC line by mRNA reprogramming. Stem Cell Research. 28, 157-160 (2018).
  42. Artero-Castro, A., et al. correction recovers phagocytosis in retinal pigment epithelium derived from retinitis pigmentosa-human-induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2092(2021).
  43. Müller, B., Wagner, F., Lorenz, B., Stieger, K. Organotypic cultures of adult mouse retina: Morphologic changes and gene expression. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 1930-1940 (2017).
  44. Sheridan, C. M., et al. Replacement of the RPE monolayer. Eye. 23 (10), 1910-1915 (2009).
  45. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  46. Maaijwee, K. J. M., et al. Histological evidence for revascularisation of an autologous retinal pigment epithelium--choroid graft in the pig. The British Journal of Ophthalmology. 91 (4), 546-550 (2007).
  47. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 245 (6), 835-846 (2007).
  48. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  49. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  50. Schramke, S., et al. The Libechov minipig as a large animal model for preclinical research in Huntington's disease - Thoughts and perspectives. Czech and Slovak Neurology and Neurosurgery. 78/111, Supplementum 2 55-60 (2015).
  51. Tohyama, S., Kobayashi, E. Age-appropriateness of porcine models used for cell transplantation. Cell Transplantation. 28 (2), 224-228 (2019).
  52. Dall, A. M., et al. Quantitative [18F] fluorodopa/PET and histology of fetal mesencephalic dopaminergic grafts to the striatum of MPTP-poisoned minipigs. Cell Transplantation. 11 (8), 733-746 (2002).
  53. Shrader, S. M., Greentree, W. F. Göttingen minipigs in ocular research. Toxicologic Pathology. 46 (4), 403-407 (2018).
  54. Duarri, A., et al. Transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium in a swine model of geographic atrophy. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10497(2021).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Subretinal Implantation of RPE on a Carrier in Minipigs: Guidelines for Preoperative Preparations, Surgical Techniques, and Postoperative Care
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Subretinal Implantation of RPE on a Carrier in Minipigs: Guidelines for Preoperative Preparations, Surgical Techniques, and Postoperative Care. The Authors section was updated from:

Lyubomyr Lytvynchuk*1,2
Zbynek Stranak*3, Hana Studenovska4
David Rais4
Štěpán Popelka4
Lucie Tichotová5,6
Yaroslav Nemesh5,6
Anastasiia Kolesnikova5,6
Ruslan Nyshchuk5,6
Anna Brymová5,6
Zdeňka Ellederová5
Jana Čížková5
Jana Juhásová5
Štefan Juhás5
Pavla Jendelová7
Richárd Nagymihály8
Igor Kozak9
Slaven Erceg10
Susanne Binder11
Brigitte Müller1
Knut Stieger1
Jan Motlik5
Goran Petrovski*8
Taras Ardan*5
1Eye Clinic, Department of Ophthalmology, University Hospital Giessen and Marburg GmbH
2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging
3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague
4Institute of Macromolecular Chemistry, Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences
6Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University
7Institute of Experimental Medicine, Czech Academy of Sciences
8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Oslo
9Moorfields Eye Hospitals UAE
10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab, Research Center “Principe Felipe”
11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology, Sigmund Freud University

* These authors contributed equally

to:

Lyubomyr Lytvynchuk*1,2
Zbynek Stranak*3, Hana Studenovska4
David Rais4
Štěpán Popelka4
Lucie Tichotová5,6
Yaroslav Nemesh5,6
Anastasiia Kolesnikova5,6
Ruslan Nyshchuk5,6
Anna Brymová5,6
Zdeňka Ellederová5
Jana Čížková5
Jana Juhásová5
Štefan Juhás5
Pavla Jendelová7
Richárd Nagymihály8
Igor Kozak9
Slaven Erceg10
Susanne Binder11
Brigitte Müller1
Knut Stieger1
Jan Motlik5
Goran Petrovski*8
Taras Ardan*5
1Department of Ophthalmology, Justus Liebig University, University Hospital Giessen and Marburg GmbH
2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging
3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague
4Institute of Macromolecular Chemistry, Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences
6Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University
7Institute of Experimental Medicine, Czech Academy of Sciences
8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Oslo
9Moorfields Eye Hospitals UAE
10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab, Research Center “Principe Felipe”
11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology, Sigmund Freud University

Tagi

nośnik komórek RPEmodel oka miniprosięciawitrektomia przez pars planadegeneracja siatkówkizwyrodnienie plamkowe związane z wiekiemtechnika retinotomiitamponada olejem silikonowymoptyczna koherentna tomografiaanaliza immunohistochemiczna
Podsiatkówkowa implantacja RPE na nośniku u świnek miniaturowych: wytyczne dotyczące przygotowań przedoperacyjnych, technik chirurgicznych i opieki pooperacyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.