Method Article

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

DOI:

10.3791/63511

⸱

April 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej, wrodzone komórki odpornościowe w mózgu, są głównymi reakcjami na stan zapalny lub uraz w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Mikroglej można podzielić na stan spoczynku i stan aktywowany i może szybko zmieniać stan w odpowiedzi na mikrośrodowisko mózgu. Mikroglej będzie aktywowany w różnych warunkach patologicznych i będzie wykazywał różne fenotypy. Ponadto istnieje wiele różnych podgrup aktywowanego mikrogleju i duża niejednorodność między różnymi podgrupami. Niejednorodność zależy głównie od swoistości molekularnej mikrogleju. Badania wykazały, że mikroglej zostanie aktywowany i będzie odgrywał ważną rolę w patologicznym procesie demielinizacji zapalnej. Aby lepiej zrozumieć charakterystykę mikrogleju w zapalnych chorobach demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane i spektrum zapalenia nerwu wzrokowego i rdzenia wzrokowego, proponujemy protokół pierwotnego sortowania mikrogleju w okresie okołozmianowym. Protokół ten wykorzystuje kolumnowe sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) w celu uzyskania wysoce oczyszczonego pierwotnego mikrogleju i zachowania cech molekularnych mikrogleju w celu zbadania potencjalnego wpływu mikrogleju na zapalne choroby demielinizacyjne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej wywodzi się z komórek progenitorowych woreczka żółtkowego, które bardzo wcześnie docierają do mózgu embrionalnego i uczestniczą w rozwoju klasy CNS1,2. Na przykład, są one zaangażowane w przycinanie synaptyczne3 i regulację wzrostu aksonów4. Wydzielają one czynniki, które sprzyjają przetrwaniu neuronów i pomagają w ich lokalizacji5. Jednocześnie biorą udział w usuwaniu nieprawidłowych komórek i komórek apoptotycznych, aby zapewnić prawidłowy rozwój mózgu6. Ponadto, jako kompetentne immunologicznie komórki mózgu, mikroglej nieustannie monitoruje miąższ mózgu, aby usunąć martwe komórki, dysfunkcyjne synapsy i szczątki komórkowe7. Wykazano, że aktywacja mikrogleju odgrywa ważną rolę w różnych chorobach, w tym zapalnych chorobach demielinizacyjnych, chorobach neurodegeneracyjnych i nowotworach mózgu. Aktywowany mikroglej w stwardnieniu rozsianym (SM) przyczynia się do różnicowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) i regeneracji mieliny poprzez pochłanianie resztek mieliny8.

W chorobie Alzheimera (AD) nagromadzenie beta-amyloidu (Aβ) aktywuje mikroglej, który wpływa na fagocytarne i zapalne funkcje mikrogleju9. Aktywowany mikroglej w tkance glejaka, zwany mikroglejem związanym z glejakiem (GAM), może regulować postęp glejaka i ostatecznie wpływać na rokowanie pacjentów10. Aktywacja głęboko zmienia transkryptom mikrogleju, powodując zmiany morfologiczne, ekspresję receptorów immunologicznych, zwiększoną aktywność fagocytarną i zwiększone wydzielanie cytokin11. Istnieją różne podzbiory aktywowanego mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak mikroglej związany z chorobą (DAM), mikroglej aktywowanej odpowiedzi (ARM) i fenotyp neurodegeneracyjny mikrogleju (MGnD)8.

Podobnie, wiele dynamicznych funkcjonalnych podzbiorów mikrogleju współistnieje również w mózgu w zapalnych chorobach demielinizacyjnych12. Zrozumienie niejednorodności między różnymi podgrupami mikrogleju jest niezbędne do zbadania patogenezy zapalnych chorób demielinizacyjnych i znalezienia ich potencjalnych strategii terapeutycznych. Niejednorodność mikrogleju zależy głównie od specyficzności molekularnej8. Niezbędne jest dokładne opisanie zmian molekularnych mikrogleju w celu zbadania niejednorodności. Postępy w technologii sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (RNA-seq) umożliwiły identyfikację cech molekularnych aktywowanego mikrogleju w warunkach patologicznych13. W związku z tym zdolność do izolowania populacji komórek ma kluczowe znaczenie dla dalszych badań tych komórek docelowych w określonych warunkach.

Badania przeprowadzone w celu zrozumienia cech i funkcji mikrogleju są zazwyczaj badaniami in vitro, ponieważ stwierdzono, że duża liczba pierwotnego mikrogleju może być przygotowana i hodowana z mózgów młodych myszy (1-3 dni), które przyczepiają się do kolb hodowlanych i rosną na powierzchni plastiku z innymi mieszanymi komórkami glejowymi. Następnie czysty mikroglej można wyizolować na podstawie różnej adhezji mieszanych komórek glejowych14,15. Jednak ta metoda może wyizolować mikroglej tylko od mózgu okołoporodowego i trwa kilka tygodni. Potencjalne zmienne w hodowli komórkowej mogą wpływać na charakterystyki mikrogleju, takie jak ekspresja molekularna16. Co więcej, mikroglej wyizolowany tymi metodami może uczestniczyć w eksperymentach in vitro jedynie poprzez symulację warunków chorób OUN i nie może reprezentować cech i funkcji mikrogleju w stanach chorobowych in vivo. Dlatego konieczne jest opracowanie metod izolowania mikrogleju od mózgu dorosłej myszy.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i separacja magnetyczna to dwie powszechnie stosowane metody, chociaż mają swoje różne ograniczenia16,17,18,19. Ich zalety i wady zostaną skontrastowane w części dyskusji. Dojrzewanie technologii MACS daje możliwość szybkiego oczyszczania komórek. Huang i wsp. opracowali wygodną metodę oznaczania zmian demielinizacyjnych w mózgu20. Łącząc te dwa podejścia techniczne, proponujemy szybki i wydajny protokół separacji magnetycznej CD11b kolumnowy, który krok po kroku opisuje, jak wyizolować mikroglej wokół zmian demielinizacyjnych w mózgach dorosłych myszy i zachować cechy molekularne mikrogleju. Ogniskowe zmiany demielinizacyjne były spowodowane stereotaktycznym wstrzyknięciem 2 μl roztworu lizolecytyny (1% LPC w 0,9% NaCl) do ciała modzelowatego na 3 dni przed rozpoczęciem protokołu21. Protokół ten stanowi podstawę do przeprowadzenia kolejnego kroku w eksperymentach in vitro. Co więcej, protokół ten oszczędza czas i pozostaje możliwy do powszechnego stosowania w różnych eksperymentach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Instytutu Opieki nad Zwierzętami Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Chiny.

1. Materiały

  1. Przed rozpoczęciem protokołu przygotuj następujące roztwory.
    1. Przygotować bufor ładujący, dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS, 2%) do buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS).
    2. Dodaj neutralny czerwony (NR) barwnik (końcowy 1%) do PBS.
  2. Przygotuj następujące roztwory, korzystając z dostępnego na rynku zestawu do dysocjacji mózgu dla dorosłych (patrz tabela materiałów).
    1. Aby przygotować mieszaninę enzymów 1, należy odpipetować 1,9 ml buforu Z i 50 μl enzymu P do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Aby przygotować mieszaninę enzymów 2, należy odpipetować 20 μl buforu Y i 10 μl enzymu A do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    3. Przygotuj roztwór do usuwania zanieczyszczeń.

2. Perfuzja i rozbiór myszy

  1. Dootrzewnowo (i.p.) wstrzyknąć myszu 500 μl 1% barwnika NR w PBS 2-3 godziny przed znieczuleniem.
    UWAGA: Dootrzewnowe wstrzyknięcie NR w demielinizujących się modelach myszy pomaga dostrzec zmiany (Rysunek 1).
  2. Znieczulij mysz pentobarbitalem (50 mg / kg, i.p.) i upewnij się, że mysz jest skutecznie znieczulona, badając reakcje bólowe.
  3. Otwórz klatkę piersiową myszy i odsłoń serce.
  4. Ostrożnie odetnij mały róg prawego przedsionka i dosercowo przetnij mysz 20-30 ml zimnego PBS z lewej komory.
  5. Odetnij głowę myszy pod narkozą.
  6. Otwórz czaszkę myszy i ostrożnie uwolnij mózg z czaszki.
  7. Przenieś mózg do foremki do krojenia mózgu myszy i pokrój mózg na plastry o średnicy 0,1 cm.
  8. Usuń plastry mózgu i umieść je w zimnym PBS na szalce Petriego (60/15 mm). Mikropreparować zmiany oznaczone barwnikiem NR wokół ciała modzelowatego pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych.
    UWAGA: Upewnij się, że wypreparowana tkanka jest tak kompletna, jak to możliwe, aby ułatwić późniejszy transfer; Całkowity postęp sekcji powinien zostać zakończony w ciągu 2 godzin.
  9. Przenieść wypreparowaną tkankę do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml zawierających odpowiednią ilość buforu do ładowania na zimno.
    UWAGA: Połącz tkankę ciała modzelowatego od 2-3 myszy w jednej probówce jako jedną próbkę.

3. Dysocjacja tkanek

  1. Odwirować wypreparowaną tkankę o masie 300 ×g przez 30 s (po osiągnięciu tej prędkości) w celu zebrania próbki na dnie probówki.
  2. Podgrzej mieszaninę enzymów 1 i mieszaninę enzymów 2 w temperaturze 2 °C do 37 °C w inkubatorze.
  3. Dodać 1,950 μl podgrzanej mieszanki enzymów 1 do jednej próbki i wytrawiać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  4. Dodać 30 μl podgrzanej mieszanki enzymatycznej 2 i delikatnie wymieszać.
  5. Trawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 minut i delikatnie mieszać co 5 minut.
  6. Dodaj 4 ml zimnego PBS do probówki po strawieniu i delikatnie wstrząśnij.
  7. Umieść filtry 70 μm na probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż filtry 500 μl zimnego PBS. Przefiltrować zdysocjowaną tkankę, przepuszczając strawione próbki tkanek przez filtry i przenieść przefiltrowaną zawiesinę w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli ilość tkanki jest zbyt mała.
  8. Przefiltrowane próbki tkanek odwirować w temperaturze 300 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i powoli i całkowicie odsysać supernatant.
    UWAGA: Wszystkie etapy należy wykonywać na lodzie, z wyjątkiem trawienia enzymatycznego.

4. Usuwanie gruzu

  1. Delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 550 μl zimnego PBS.
  2. Dodaj 450 μl zimnego roztworu do usunięcia zanieczyszczeń i dobrze wymieszaj.
  3. Nałożyć powyższą mieszaninę bardzo powoli i delikatnie na 2 x 1 ml zimnego PBS za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    UWAGA: Przechylić probówkę wirówkową o 45 ° i powoli dodawać PBS wzdłuż ścianki probówki za pomocą pipety.
  4. Powoli i delikatnie przenieść probówkę do wirówki i wirować w temperaturze 4 °C i 3 000 × g przez 10 minut.
  5. Po odwirowaniu poszukaj trzech warstw. Całkowicie odessać dwie górne warstwy za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (Rysunek 2).
  6. Napełnij probówkę do 5 ml buforem do ładowania na zimno i delikatnie odwróć probówkę trzy razy.
  7. Wirować w temperaturze 4 °C i 1 000 × g przez 10 minut. Całkowicie odessać supernatant i uniknąć rozerwania osadu komórkowego.

5. Magnetyczna separacja komórek mikrogleju

  1. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 90 μl buforu ładującego i dodać 10 μl kulek CD11b (Microglea).
  2. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 1 ml buforu ładującego i delikatnie pipetować płyn w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, aby umyć komórki po inkubacji. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 300 × g przez 10 minut i całkowicie odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych kulek.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl bufora ładującego.
  5. Umieść kolumnę MS z separatorem w celu pozytywnej selekcji w polu magnetycznym.
  6. Przepłukać kolumnę 500 μl buforu ładującego w celu ochrony komórek i zapewnienia wydajności sortowania magnetycznego w oparciu o protokół producenta.
  7. Zawiesinę komórek nanieść na kolumnę MS i odrzucić przepływową zawartość nieoznakowanych komórek.
  8. Dodać 500 μl buforu ładującego do kolumny trzykrotnie, aby zmyć komórki, które przylegają do ścianki kolumny i wyrzucić przepływ.
    UWAGA: Nowy bufor załadowczy do mycia należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest całkowicie pusty.
  9. Po umyciu kolumny należy wyjąć kolumnę z separatora i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
  10. Dodaj 1 ml buforu ładującego do kolumny i popchnij tłok na dno kolumny, aby wypłukać magnetycznie oznakowane komórki. Powtórz ten krok trzy razy, aby całkowicie zebrać magnetycznie oznakowane komórki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej wyizolowany za pomocą kulek CD11b ma wysoką czystość
Komórki mikrogleju wokół zmian chorobowych w mysich modelach demielinizacji wyizolowano przy użyciu wyżej wymienionego protokołu i przetestowano za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki są znakowane fluorescencyjnie izotiocyjanianem fluoresceiny CD11b (FITC) i allofikocyjaniną CD45 (APC) w celu określenia mikrogleju w cytometrii przepływowej zgodnie z instrukcjami producenta. Istnieje wiele literatury wykazującej, że przeciwciała CD11b ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokole zaproponowano metodę izolowania mikrogleju wokół zmian demielinizacyjnych, co może pomóc w badaniu cech funkcjonalnych mikrogleju w zapalnych chorobach demielinizacyjnych. Mikroglej uchwycony za pomocą kulek CD11b wykazuje wysoką czystość i żywotność. Kluczowe kroki w protokole obejmują precyzyjną lokalizację ognisk i optymalne oczyszczanie mikrogleju. W kroku 2.1 protokołu konieczne jest wstrzyknięcie roztworu NR na 2 godziny przed poświęceniem myszy, aby upewnić się, że zmiany mogą być dokładnie przedstawio...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie było wspierane przez Fundację Szpitala Tongji (HUST) dla Doskonałego Młodego Naukowca (Grant nr 2020YQ06).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroprobówki wirówkowe 1,5 mlBIOFILCFT001015
15 ml Probówki wirówkoweBIOFILCFT011150
50 ml Probówki wirówkoweBIOFILCFT011500
70 µ m FiltrMiltenyi Biotec130-095-823
Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłych, myszy i szczurówMiltenyi Biotec130-107-677
C57BL/6J MyszySJA Labs
CD11b (mikroglej) Koraliki, ludzkie i mysieMiltenyi Biotec130-093-634
Płodowa surowica bydlęcaBOSTERPYG0001
FlowJoBD BiosciencesV10
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Separator MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
Kolumny MSMiltenyi Biotec130-042-201
Neutralny czerwonySigma-Aldrich1013690025
Cytometr przepływowy NovoCyteAgilentSystem składający się z z różnych części
NovoExpressAgilent1.4.1
PBSBOSTERPYG0021
PentobarbitalSigma-AldrichP-010
StereoskopMshOtMZ62

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia IsolationMagnetic Activated Cell SortingDemyelination ModelMouse Brain MicrogliaFlow CytometryCD11b BeadsMicrodissection TechniqueMyeloid CellsCell SortingCentral Nervous System

Related Articles