Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Podsumowanie

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Streszczenie

Inwazja i przerzutowe rozprzestrzenianie się komórek rakowych są główną przyczyną zgonów z powodu raka. Testy opracowane wcześnie w celu pomiaru potencjału inwazyjnego populacji komórek nowotworowych zazwyczaj generują pojedynczy pomiar końcowy, który nie rozróżnia subpopulacji komórek nowotworowych o różnym potencjale inwazyjnym. Ponadto mikrośrodowisko guza składa się z różnych rezydentnych komórek zrębowych i odpornościowych, które zmieniają i uczestniczą w inwazyjnym zachowaniu komórek rakowych. Inwazja do tkanek odgrywa również rolę w subpopulacjach komórek odpornościowych, odpierając mikroorganizmy lub eliminując chore komórki z miąższu i komórek śródbłonka podczas przebudowy tkanek i angiogenezy. Analiza komórkowa w czasie rzeczywistym (RTCA), która wykorzystuje bioczujniki impedancyjne do monitorowania inwazji komórek, była dużym krokiem naprzód w stosunku do pomiaru inwazji w punkcie końcowym: zapewnia ciągłe pomiary w czasie, a tym samym może ujawnić różnice w szybkościach inwazji, które są tracone w teście końcowym. Korzystając z obecnej technologii RTCA, rozszerzyliśmy macierze dwukomorowe, dodając kolejną komorę, która może zawierać komórki zrębu i/lub komórki odpornościowe i umożliwia pomiar szybkości inwazji pod wpływem czynników wydzielanych ze współhodowanych komórek zrębowych lub odpornościowych w czasie. Poza tym unikalna konstrukcja pozwala na odłączenie komór w dowolnym momencie i wyizolowanie najbardziej inwazyjnej komórki nowotworowej lub innych subpopulacji komórek, które są obecne w heterogenicznych mieszankach badanych izolatów nowotworowych. Te najbardziej inwazyjne komórki nowotworowe i inne subpopulacje komórkowe napędzają złośliwą progresję do choroby przerzutowej, a ich charakterystyka molekularna jest ważna dla dogłębnych badań mechanistycznych, rozwoju sond diagnostycznych do ich wykrywania i oceny podatności. W związku z tym włączenie leków mało- lub wielkocząsteczkowych może być wykorzystane do przetestowania potencjału terapii ukierunkowanych na subpopulacje raka i/lub komórek zrębu w celu zahamowania (np. komórek rakowych) lub wzmocnienia (np. komórek odpornościowych) inwazyjnego zachowania.

Wprowadzenie

Inwazja komórek to ważny proces, który pozwala komórkom przekraczać bariery błony podstawnej w odpowiedzi na sygnały środowiskowe dostarczane przez komórki zrębu. Jest to kluczowy krok na kilku etapach rozwoju odpowiedzi immunologicznej, gojenia się ran, naprawy tkanek i nowotworów złośliwych, które mogą rozwijać się od miejscowych zmian do nowotworów inwazyjnych i przerzutowych¹. Testy opracowane wcześnie w celu pomiaru potencjału inwazyjnego populacji komórek zazwyczaj generują pojedynczy pomiar końcowy lub wymagają wstępnego znakowania komórek inwazyjnych². Integracja technik mikroelektroniki i mikrofluidyki jest obecnie rozwijana w celu wykrywania różnych aspektów biologii komórki, takich jak żywotność, ruch i przyczepienie, za pomocą impedancji elektrycznej żywych komórek na mikroelektrodach^3,4. Pomiar impedancji pozwala na bezznacznikową, nieinwazyjną i ilościową ocenę stanu komórek³. Poniżej opisujemy trzykomorową tablicę opartą na projekcie systemu analizy komórkowej w czasie rzeczywistym (RTCA), który został opracowany przez Abassi et al.⁵. Trzykomorowa matryca pozwala na ocenę współhodowanych komórek pod kątem inwazji komórkowej i odzyskiwania komórek inwazyjnych w celu dodatkowych analiz lub ekspansji.

W systemie analizatora komórek, komórki przenikają przez zewnątrzkomórkową matrycę pokrytą porowatą membraną i docierają do międzypalcowej matrycy elektrod umieszczonej po przeciwnej stronie bariery. Ponieważ komórki inwazyjne z czasem nadal przyczepiają się i zajmują ten układ elektrod, impedancja elektryczna zmienia się równolegle. Obecny system składa się z 16-dołkowej płytki do inwazji i migracji komórek (CIM) z dwiema komorami. Przyrząd RTCA-DP (dual purpose) (zwany dalej analizatorem ogniw dwufunkcyjnych) zawiera czujniki do pomiaru impedancji oraz zintegrowane oprogramowanie do analizy i przetwarzania danych impedancji. Wartości impedancji na linii podstawowej zależą od siły jonowej mediów w studzienkach i zmieniają się, gdy ogniwa przyczepiają się do elektrod. Zmiany impedancji zależą od liczby ogniw, ich morfologii i stopnia, w jakim ogniwa przyczepiają się do elektrod. Pomiar studzienek z pożywką przed dodaniem komórek jest uważany za sygnał tła. Tło jest odejmowane od pomiarów impedancji po osiągnięciu równowagi z ogniwami przyczepiającymi się i rozchodzącymi na elektrodach. Niemianowany parametr stanu ogniw na elektrodzie, określany jako indeks ogniwa (CI), oblicza się w następujący sposób: CI = (impedancja po równowadze - impedancja w przypadku braku ogniw) / nominalna wartość impedancji⁶. Gdy porównuje się szybkości migracji różnych linii komórkowych, Delta CI może być używana do porównywania stanu komórek niezależnie od różnicy w przyłączeniu, która jest reprezentowana w pierwszych kilku pomiarach.

Nowo zaprojektowana trójkomorowa tablica bazuje na istniejącym projekcie i wykorzystuje górną komorę z dwufunkcyjnego systemu analizatora komórek, który zawiera elektrody. Zmodyfikowane komory środkowe i dolne są przystosowane do dopasowania zespołu do dwufunkcyjnego analizatora celowego do pomiaru i analizy impedancji za pomocą zintegrowanego oprogramowania. Dwa główne postępy, które nowy projekt zapewnia w stosunku do istniejącej dwukomorowej płytki CIM (zwanej odtąd płytką analizatora komórek) to: i) zdolność do odzyskiwania, a następnie analizowania inwazyjnych subpopulacji komórek, które są obecne w heterogenicznych mieszankach komórkowych oraz ii) opcja oceny wpływu czynników wydzielanych z kokulturowanych komórek zrębowych lub odpornościowych na inwazję komórek (Rysunek 1).

Ta technologia może być przydatna do badania subpopulacji komórek o różnych zdolnościach inwazyjnych. Obejmuje to a) inwazyjne komórki rakowe, które atakują otaczające tkanki lub naczynia krwionośne i limfatyczne lub wynaczyniają w miejscach wysiewu przerzutów w odległych narządach, (b) komórki układu odpornościowego, które atakują tkanki w celu zwalczania patogenów lub chorych komórek, (c) komórki śródbłonka, które atakują tkanki, tworząc nowe naczynia krwionośne podczas reorganizacji tkanek lub gojenia się ran, a także (d) komórki zrębu z mikrośrodowiska guza, które wspierają i atakują wraz z komórkami rakowymi. Podejście to pozwala na włączenie przesłuchów zrębowych, które mogą modulować ruchliwość i inwazję komórek. Przedstawione tutaj studia wykonalności wykorzystują tę zmodyfikowaną matrycę skoncentrowaną na inwazji komórek rakowych i interakcji ze zrębem jako systemie modelowym, w tym inwazji śródbłonka w odpowiedzi na zróżnicowane sygnały z komórek rakowych. Podejście to można ekstrapolować w celu wyizolowania komórek rakowych i innych typów komórek, takich jak subpopulacje komórek odpornościowych, fibroblasty lub komórki śródbłonka. Przetestowaliśmy inwazyjne i nieinwazyjne ustalone linie komórkowe raka piersi jako dowód zasadności. Wykorzystaliśmy również komórki z inwazji ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) w odpowiedzi na komórki odpornościowe z ludzkiego szpiku kostnego, aby wykazać możliwość wykorzystania w przyszłości również w klinicznych warunkach diagnostycznych. PDX to tkanki nowotworowe pacjenta, które są wszczepiane do modelu myszy z obniżoną odpornością lub humanizowanym, aby umożliwić badanie wzrostu, progresji i opcji leczenia dla pierwotnego pacjenta^7,8.

Protokół

Badanie zostało zrecenzowane i uznane za "zwolnione" przez Institutional Review Board of Georgetown University (IRB # 2002-022). Świeżo pobrane tkanki szpiku kostnego pobrano z wyrzuconych filtrów do pobierania zdrowego ludzkiego szpiku kostnego, które zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.

1. Nowy projekt komory (Rysunek 2)

1. Otwórz nową dwukomorową płytkę analizatora komórek. Odłóż na bok górną komorę z elektrodami.
2. Za pomocą frezarki ogolić 2 mm dolnych studzienek w kształcie litery U płytki analizatora komórek.
3. Przymocuj membranę polieterosulfonową (PES) o wymiarach 2 cm x 7 cm z porami o wielkości porów 0,2 μm do dna ogolonych studzienek za pomocą kleju zabezpieczonego promieniami UV. Odczekaj 30 minut, aby upewnić się, że klej jest całkowicie utwardzony i obojętny.
4. Za pomocą frezarki wytnij dwie podłużne szczeliny (1,5 mm x 5,6 mm) po bokach, aby zatrzasnąć się w grzbietach nowo wyprodukowanej trzeciej komory.
5. Za pomocą frezarki utwórz trzecią komorę poliwęglanową, która odwzorowuje całkowite wymiary płytki analizatora komórek; 72 mm x 18 mm (tabela materiałów).
6. Utwórz studzienki o głębokości 4,8 mm i średnicy 4,75 mm, aby odtworzyć 16-dołkową konstrukcję płytki analizatora komórek. Pozwala to na uzyskanie 90 μl objętości na studzienkę.
7. Po bokach utwórz dwa trójkątne grzbiety, tak aby komora zablokowała się w oryginalnych szczelinach utworzonych w kroku 1.4. Pozioma część trójkąta wynosi 1,5 mm, pionowa 1,4 mm, a przeciwprostokątna 2,052 mm.
8. Utwórz pokrętło na krótszym boku o średnicy 50,8 mm i wysokości 1,397 mm, aby pasowało do wycięcia oryginalnej płytki (Rysunek 2, środek).
9. Użyj gumowej podkładki o grubości 0.9 mm do każdej studzienki, aby zapewnić uszczelnione dopasowanie.

2. Hodowla komórkowa (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasty)

1. Przemyć przylegające kultury komórkowe (~70% konfluencji) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
2. Dodaj 0,05% roztwór trypsyny-EDTA, aby usunąć komórki.
3. Zneutralizować roztwór trypsyny pożywką do hodowli komórkowych zawierającą surowicę i policzyć komórki, używając podwielokrotności zawiesiny komórkowej.
   UWAGA: Konkretne podłoża do hodowli komórkowych można znaleźć w Tabeli 1.

3. Dysocjacja ksenoprzeszczepu pochodząca od pacjenta

1. Pokrój świeży kawałek guza (1^cm2) na drobną papkę za pomocą sterylnego skalpela.
2. Umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 20 ml pożywki DMEM F12 uzupełnionej 3 mg / ml trypsyny i 2 mg / ml kolagenazy.
3. Inkubować w wytrząsarce termicznej (150 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 20 min.
4. Wirować probówkę o masie 500 x g przez 5 minut; usunąć supernatant.
5. Dodać 20 μl DMEM F12 + 2% FBS, aby przepłukać komórki; wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
6. Ponownie zawiesić w 1 ml pożywki PDX (Tabela 1), aby policzyć komórki.

4. Ekstrakcja komórek szpiku kostnego

1. Przepłukać filtr zbiorczy szpiku kostnego (BM) 25 ml 1x PBS.
   UWAGA: W tym badaniu PBS został dodany do używanego filtra zbiorczego BM ze szpitala w celu zebrania pozostałego BM w filtrze.
2. Powoli dodaj przepłukany BM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 25 ml pożywki o gradiencie gęstości, uważając, aby warstwy były jak najbardziej oddalone.
3. Wirować z prędkością 800 x g przez 20 min w temperaturze 18 °C
4. Odsysić górne warstwy po odwirowaniu (tłuszcz/osocze) i przenieść 5 ml białej warstwy powyżej pożywki o gradiencie gęstości, która zawiera komórki BM, do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   UWAGA: Alternatywnie, zanurz pipetę o pojemności 5 ml w górnej warstwie, aż dotknie środkowej warstwy (BM) i bardzo powoli odpipetuj środkową warstwę, nie przesuwając pipety.
5. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml 1x PBS (~10 ml) i wiruj z prędkością 300 x g przez 15 minut.
6. Usunąć supernatant; pozostała biała osadka to BM.
7. Jeśli w osadzie zaobserwuje się czerwone krwinki, dodaj 5 ml roztworu do lizy RBC (tabela materiałów) i pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Wirować w 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
8. Dodaj 10 ml 1x PBS, aby umyć komórki, wirować w 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtarzać lizę RBC (krok 4.7), aż osadek stanie się biały.

5. Sadzenie i składanie komórek

1. Umieść wszystkie trzy sterylne komory w kapturze do hodowli tkankowych.
2. Znajdź pokrętło na krótszym boku dolnej komory. Ustaw dolną komorę tak, aby pokrętło było skierowane w stronę eksperymentatora.
3. Dodaj 30 000-50 000 komórek w 90 μl pożywki do każdego dołka dolnej komory. Unikaj tworzenia się bąbelków. Są to komórki zrębowe, które dostarczą wydzielanych czynników, ale nie zostaną wykryte przez elektrody górnej komory.
4. Stosować 5% pożywki wzbogaconej płodową surowicą bydlęcą w dwóch studzienkach dolnej komory jako pozytywną kontrolę ruchliwości komórek. Stosować pożywkę 0% uzupełnioną surowicą jako kontrolę negatywną.
5. Pozostaw dolną komorę z komórkami na 10-15 minut w okapie, aby się uspokoiła.
   UWAGA: Ten krok jest zalecany, jeśli komórki przylegają lub rosną w zawiesinie.
6. Obróć dolną komorę o 90° i umieść środkową komorę na górze, tak aby pokrętło na dolnej komorze wsunęło się w wycięcie w środkowej komorze.
   UWAGA: Pokrętło na dolnej komorze i niebieska kropka na środkowej komorze znajdują się na przeciwległych końcach zespołu.
7. Dociśnij pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.
8. Dodać 160 μl pożywki bez surowicy do wszystkich studzienek środkowej komory.
9. Upewnij się, że menisk w kształcie kopuły jest widoczny po napełnieniu studzienek; w przeciwnym razie dostosuj końcową objętość w oparciu o kalibrację pipety. Unikaj tworzenia się bąbelków.
10. Umieść górną komorę z elektrodami skierowanymi w dół na środkową komorę, upewniając się, że niebieskie kropki są wyrównane na środkowej i górnej komorze.
11. Dociśnij pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.
12. Do górnej komory dodać 25-50 μl podłoża bez surowicy.
13. Zamontuj zestaw na dwufunkcyjnym analizatorze komórek w inkubatorze do hodowli tkankowych i odczekaj 30 minut przed pomiarem tła.
    UWAGA: Ten czas jest niezbędny do zrównoważenia macierzy i może być wykorzystany do przygotowania linii komórkowych, które mają zostać dodane do górnej komory.
14. Zmierzyć tło (patrz sekcja 6) i umieścić zestaw z powrotem w kapturze do hodowli tkankowych.
15. Dodaj 30 000-50 000 komórek w 100 μl pożywki bez surowicy do każdego dołka górnej komory. Są to komórki, które elektroda wykryje po pomyślnej migracji przez membranę.
    UWAGA: Aby osiągnąć maksymalną odpowiedź, zaleca się hodowlę komórek w pożywce bez surowicy lub o niskiej zawartości surowicy przez 6-18 godzin przed wykonaniem testu.
16. Pozostaw zespół w okapie na 30 minut przed zamontowaniem na dwufunkcyjnym analizatorze ogniw do pomiaru impedancji.

6. Pomiar tła i impedancji

1. Umieść macierz w podstawce w dwufunkcyjnym analizatorze komórek.
2. Otwórz oprogramowanie analizatora komórek i wybierz podstawkę, która ma być używana.
3. Kliknij kartę Wiadomość i upewnij się, że jest na niej napisane Połączenia OK, aby upewnić się, że matryca jest dobrze umieszczona w podstawce, a elektrody są dobrze wyrównane z czujnikami.
4. Kliknij zakładkę Notatki z eksperymentu i podaj jak najwięcej informacji o eksperymencie.
5. Kliknij zakładkę Układ i wypełnij opis układu tablicy.
6. Kliknij kartę Harmonogram i dodaj dwa kroki z menu Kroki: krok w tle (jedno przeciągnięcie) i krok testowy ze 100 przebiegami - przemiatanie co 15 minut, w sumie 25 godzin.
7. Po 30 minutach przebywania matrycy w inkubatorze z dwufunkcyjnym analizatorem komórek, kliknij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć pomiar tła. Pojawi się okno z prośbą o wybranie folderu, w którym chcesz zapisać dane.
8. Po wykonaniu pomiaru tła wyjmij matrycę z kołyski i umieść ją z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych.
9. Dodaj komórki do górnej komory zgodnie z opisem w kroku 5.13 i trzymaj zespół w kapturze do hodowli tkankowej przez 30 minut, aby komórki się ustabilizowały.
10. Umieść tablicę z powrotem w analizatorze komórek o podwójnym przeznaczeniu i sprawdź kartę Komunikat pod kątem komunikatu Połączenia OK.
11. Kliknij przycisk Play, aby rozpocząć pomiar impedancji.
12. Kliknij zakładkę Wykres, aby monitorować postęp sygnału.
13. Jeśli punkt końcowy zostanie osiągnięty przed 25 godzinami, kliknij krok Przerwij z menu rozwijanego Wykonaj.
14. Aby wyeksportować dane, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, wybierz polecenie Kopiuj w formacie listy, a następnie wklej dane do arkusza kalkulacyjnego.
    UWAGA: Dane można wyeksportować jako indeks komórki lub indeks komórki delta. Do eksportu można również wybrać informacje o wykresie i/lub układzie.

7. Oddziaływanie i kolekcja komórek

1. Monitoruj szybkość migracji w czasie rzeczywistym na dwufunkcyjnym analizatorze komórek, aby określić punkt zatrzymania (6-18 godzin).
   UWAGA: Punkt zatrzymania zależy od szybkości inwazji komórki i od tego, kiedy zostanie osiągnięty wyraźny sygnał inwazji z kontroli negatywnej.
2. Po osiągnięciu tego celu odmontuj zestaw z dwufunkcyjnego analizatora komórek i umieść go w kapturze do hodowli tkankowych.
3. Przygotuj odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w celu zebrania komórek z interesujących nas studzienek.
4. Umieść zestaw w naczyniu o średnicy 10 cm, aby pomieścić płyny po odłączeniu komór.
5. Wciśnij elastyczne zatrzaskowe końce na dłuższym boku środkowej komory do środka, aż usłyszysz kliknięcie.
6. Zdemontuj górną komorę i odwróć ją do nowego naczynia o średnicy 10 cm.
7. Użyj podnośnika komórkowego z ostrzem 13 mm, aby zebrać komórki ze wszystkich studzienek, w których występują te same warunki eksperymentalne (tj. typ komórki, leczenie farmakologiczne itp.).
   UWAGA: Zaprojektuj konfigurację tak, aby miała co najmniej dwie studzienki dla każdego warunku eksperymentalnego, aby osiągnąć statystycznie istotną zmianę w stosunku do kontroli ujemnych.
8. Opłucz lub zanurz ostrze w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby zebrać komórki w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
9. Wiruj komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut.
10. Rozmnażać pobrane komórki (patrz punkt 8) lub przeprowadzić analizę punktu końcowego, taką jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki
    UWAGA: W przypadku masowego sekwencjonowania RNA należy użyć zestawu do ekstrakcji RNA o niskiej liczbie komórek.

8. 3D propagacja i pobieranie komórek

UWAGA: Ze względu na małą liczbę zebranych komórek, umieść komórki w 3D za pomocą macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby zwiększyć żywotność. To powiedziawszy, hodowla 2D jest również opcją w tym momencie, zwłaszcza jeśli użyte komórki pochodzą z ustalonych linii komórkowych.

1. Rozmrozić podwielokrotność matrycy błony podstawnej w temperaturze 4 °C przez noc. Utrzymuj matrycę błony podstawnej na lodzie, aż będzie gotowa do użycia.
2. Dodać 25 μl zimnej matrycy membrany podstawnej do osadu zebranych żywych komórek i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Unikaj tworzenia się bąbelków.
3. Dodaj mieszaninę macierzy błony komórkowej i podstawnej na dno małego dołka do hodowli tkankowej (tj. na 96-dołkowej płytce), tworząc kopułę. Staraj się nie dotykać ścian studni. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie delikatnie dodawać kroplami 100 μl pożywki.
4. Aby pobrać komórki, odessać pożywkę i dodać 100 μl dypazy do każdej studzienki.
5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, od czasu do czasu pipetując w górę i w dół.
6. Przenieść komórki i rozpuszczoną matrycę błony podstawnej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml 1x PBS, wirować w 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtórz pranie raz.
7. Odessać supernatant. Podziel komórki w osadzie lub przeprowadź analizę punktu końcowego.

Wyniki

Korzystając z nowo zaprojektowanego układu trójkomorowego, testowano inwazję komórek w obecności lub bez komórek zrębu, takich jak fibroblasty. Inwazja komórek MDA-MB-231 została wzmocniona, gdy napromieniowane szwajcarskie fibroblasty 3T3 (szczep J2) zostały wysiane w dolnej komorze, co pozwoliło na wymianę czynników między dwiema liniami komórkowymi. Co ciekawe, inwazja MDA-MB-231 nasiliła się, gdy liczba komórek 3T3-J2 została podwojona (Figura 3A). Z drugiej strony, szybkość inwazji inwazyjnego kl...

Dyskusja

Zmodyfikowaliśmy konstrukcję dwukomorowej matrycy, aby zawierała trzecią komorę do monitorowania inwazji komórek w czasie rzeczywistym w obecności komórek zrębowych. Zaobserwowaliśmy wyraźny wpływ współhodowanych fibroblastów na inwazyjne i nieinwazyjne komórki nowotworowe, co wskazuje, że macierz może być wykorzystana do rozróżnienia subpopulacji komórek rakowych, które reagują inaczej na czynniki wytwarzane przez współhodowane komórki zrębu. Macierz została również wykorzystana do monitorowania inwazji komórek śródbłon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Trypsyna-EDTA	Thermofisher	25300-054
Klej	Norland Klej optyczny	NOA63
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A9418
Podnośnik komórek	Sarstedt	83.1832
Toksyna z Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
Płytka	CIMAgilent	5665817001	Płytka analizatora komórek
Kolagenaza z Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Surowica dla koni (HS)	Gibco	16050-122
Ludzki EGF	Peprotech	AF-100-15
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrokortyzon	Sigma	H4001
	Insulina Transferyna Selen Etanoloamina (ITSX) (100x)	Thermofisher
Insulina, ludzka rekombinant, roztwór	Sigma	C8052
J2 Fibroblasty Komórka	macierzysta (RRID: CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Pożywka o gradinie gęstości do izolacji komórek jednojądrzastych
Matrigel	Corning	354230
Matryca MCFDCIS.com błony podstawnej (DCIS)	RRID:CVCL_5552
Ogniwa MDA-MB-231	RRID:CVCL_0062
Frezarka			Bridgeport Seria 1 Pionowa
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)	Thermofisher	10010049
Polieterosulfon ( PES) membrana	Sterlitech	PCTF029030
roztwór do lizy RBC	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
Analizator RTCA DP	Agilent	3X16	Dwufunkcyjny analizator komórek
Trypsyna	Sigma	T4799