Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Inwazja i przerzutowe rozprzestrzenianie się komórek rakowych są główną przyczyną zgonów z powodu raka. Testy opracowane wcześnie w celu pomiaru potencjału inwazyjnego populacji komórek nowotworowych zazwyczaj generują pojedynczy pomiar końcowy, który nie rozróżnia subpopulacji komórek nowotworowych o różnym potencjale inwazyjnym. Ponadto mikrośrodowisko guza składa się z różnych rezydentnych komórek zrębowych i odpornościowych, które zmieniają i uczestniczą w inwazyjnym zachowaniu komórek rakowych. Inwazja do tkanek odgrywa również rolę w subpopulacjach komórek odpornościowych, odpierając mikroorganizmy lub eliminując chore komórki z miąższu i komórek śródbłonka podczas przebudowy tkanek i angiogenezy. Analiza komórkowa w czasie rzeczywistym (RTCA), która wykorzystuje bioczujniki impedancyjne do monitorowania inwazji komórek, była dużym krokiem naprzód w stosunku do pomiaru inwazji w punkcie końcowym: zapewnia ciągłe pomiary w czasie, a tym samym może ujawnić różnice w szybkościach inwazji, które są tracone w teście końcowym. Korzystając z obecnej technologii RTCA, rozszerzyliśmy macierze dwukomorowe, dodając kolejną komorę, która może zawierać komórki zrębu i/lub komórki odpornościowe i umożliwia pomiar szybkości inwazji pod wpływem czynników wydzielanych ze współhodowanych komórek zrębowych lub odpornościowych w czasie. Poza tym unikalna konstrukcja pozwala na odłączenie komór w dowolnym momencie i wyizolowanie najbardziej inwazyjnej komórki nowotworowej lub innych subpopulacji komórek, które są obecne w heterogenicznych mieszankach badanych izolatów nowotworowych. Te najbardziej inwazyjne komórki nowotworowe i inne subpopulacje komórkowe napędzają złośliwą progresję do choroby przerzutowej, a ich charakterystyka molekularna jest ważna dla dogłębnych badań mechanistycznych, rozwoju sond diagnostycznych do ich wykrywania i oceny podatności. W związku z tym włączenie leków mało- lub wielkocząsteczkowych może być wykorzystane do przetestowania potencjału terapii ukierunkowanych na subpopulacje raka i/lub komórek zrębu w celu zahamowania (np. komórek rakowych) lub wzmocnienia (np. komórek odpornościowych) inwazyjnego zachowania.
Wprowadzenie
Inwazja komórek to ważny proces, który pozwala komórkom przekraczać bariery błony podstawnej w odpowiedzi na sygnały środowiskowe dostarczane przez komórki zrębu. Jest to kluczowy krok na kilku etapach rozwoju odpowiedzi immunologicznej, gojenia się ran, naprawy tkanek i nowotworów złośliwych, które mogą rozwijać się od miejscowych zmian do nowotworów inwazyjnych i przerzutowych1. Testy opracowane wcześnie w celu pomiaru potencjału inwazyjnego populacji komórek zazwyczaj generują pojedynczy pomiar końcowy lub wymagają wstępnego znakowania komórek inwazyjnych2. Integracja technik mikroelektroniki i mikrofluidyki jest obec....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie zostało zrecenzowane i uznane za "zwolnione" przez Institutional Review Board of Georgetown University (IRB # 2002-022). Świeżo pobrane tkanki szpiku kostnego pobrano z wyrzuconych filtrów do pobierania zdrowego ludzkiego szpiku kostnego, które zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.
1. Nowy projekt komory (Rysunek 2)
- Otwórz nową dwukomorową płytkę analizatora komórek. Odłóż na bok górną komorę z elektrodami.
- Za pomocą frezarki ogolić 2 mm dolnych studzienek w kształcie litery U płytki analizatora komórek.
- Przymocuj me....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przy użyciu nowo zaprojektowanej macierzy trójkomorowej przetestowano inwazję komórek w obecności lub w nieobecności komórek zrębu, takich jak fibroblasty. Inwazja komórek MDA-MB-231 została nasilona po wysianiu napromieniowanych fibroblastów Swiss 3T3 (szczep J2) w dolnej komorze, co umożliwiło wymianę czynników między obiema liniami komórkowymi. Co ciekawe, inwazja MDA-MB-231 wzrosła przy dwukrotnym zwiększeniu liczby komórek 3T3-J2 (Rysunek 3A). Z drugiej strony, tempo inwazji inwazyjnego.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zmodyfikowaliśmy konstrukcję dwukomorowej matrycy, aby zawierała trzecią komorę do monitorowania inwazji komórek w czasie rzeczywistym w obecności komórek zrębowych. Zaobserwowaliśmy wyraźny wpływ współhodowanych fibroblastów na inwazyjne i nieinwazyjne komórki nowotworowe, co wskazuje, że macierz może być wykorzystana do rozróżnienia subpopulacji komórek rakowych, które reagują inaczej na czynniki wytwarzane przez współhodowane komórki zrębu. Macierz została również wykorzystana do monitorowania inwazji komórek śródbłon.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Uniwersytet Georgetown złożył wniosek patentowy związany z niektórymi podejściami opisanymi w tym manuskrypcie. G.M.S., A.W., L.D. i M.P są wymienieni jako wynalazcy w tej aplikacji i deklarują to jako potencjalny konflikt interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dr Alanie Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, za dostarczenie nam ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (HCI-010). Prace te były wspierane przez granty NIH R01CA205632, R21CA226542, a częściowo przez grant od Agilent Technologies.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,05% Trypsyna-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Klej | Norland Klej optyczny | NOA63 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Podnośnik komórek | Sarstedt | 83.1832 | |
| Toksyna z Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| Płytka | CIMAgilent | 5665817001 | Płytka analizatora komórek |
| Kolagenaza z Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Surowica dla koni (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Ludzki EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrokortyzon | Sigma | H4001 | |
| Insulina Transferyna Selen Etanoloamina (ITSX) (100x) | Thermofisher | ||
| Insulina, ludzka rekombinant, roztwór | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasty Komórka | macierzysta (RRID: CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Pożywka o gradinie gęstości do izolacji komórek jednojądrzastych |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Matryca MCFDCIS.com błony podstawnej (DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| Ogniwa MDA-MB-231 | RRID:CVCL_0062 | ||
| Frezarka | Bridgeport Seria 1 Pionowa | ||
| sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polieterosulfon ( PES) membrana | Sterlitech | PCTF029030 | |
| roztwór do lizy RBC | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Analizator RTCA DP | Agilent | 3X16 | Dwufunkcyjny analizator komórek |
| Trypsyna | Sigma | T4799 |
Bibliografia
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of anti....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
