Rękopis prezentuje wszechstronne, solidne i czułe protokoły spektrometrii mas do identyfikacji i ilościowego określenia kilku klas lipidów z fotoreceptorów Drosophila.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rękopis prezentuje wszechstronne, solidne i czułe protokoły spektrometrii mas do identyfikacji i ilościowego określenia kilku klas lipidów z fotoreceptorów Drosophila.
Aktywacja fosfolipazy Cβ (PLCβ) jest niezbędnym krokiem podczas transdukcji sensorycznej w fotoreceptorach Drosophila. Aktywność PLCβ powoduje hydrolizę błonowego lipidu fosfatydyloinozytolu 4,5 bisfosforanu [PI(4,5)P2], co ostatecznie prowadzi do aktywacji przejściowych kanałów potencjału receptorowego (TRP) i TRP (TRPL). Aktywność PLCβ prowadzi również do powstawania wielu gatunków lipidów, z których kilka zaproponowano jako odgrywające rolę w aktywacji TRP i TRPL. Ponadto zaproponowano kilka klas lipidów, które odgrywają kluczową rolę w organizowaniu biologii komórki fotoreceptorów w celu optymalizacji reakcji sygnałowych w celu optymalnej transdukcji czuciowej. Historycznie rzecz biorąc, odkrycia te były napędzane zdolnością do izolowania mutantów Drosophila dla enzymów, które kontrolują poziomy określonych lipidów i przeprowadzają analizę fizjologii fotoreceptorów u tych mutantów. Niedawno opracowano potężne metody spektrometrii mas do izolacji i analizy ilościowej lipidów o wysokiej czułości i swoistości. Są one szczególnie przydatne do stosowania u Drosophila, gdzie analiza lipidów jest teraz możliwa z fotoreceptorów bez konieczności znakowania radionuklidów. W tym artykule omówiono koncepcyjne i praktyczne rozważania dotyczące stosowania lipidowej spektrometrii mas do solidnej, czułej i dokładnej oceny ilościowej różnych lipidów sygnałowych w fotoreceptorach Drosophila. Wraz z istniejącymi metodami genetyki molekularnej i analizy fizjologicznej, takie lipidy prawdopodobnie zwiększą moc fotoreceptorów jako systemu modelowego dla odkryć w biologii.
Fototransdukcja u Drosophila odbywa się za pośrednictwem kaskady PLCβ sprzężonej z białkiem G, co prowadzi do aktywacji kanałów aktywowanych światłem TRP i TRPL1. PLCβ hydrolizuje związany z błoną fosfolipid, bisfosforan 4,5 fosfatydyloinozytolu [PI(4,5)P2] i wytwarza diacyloglicerol (DAG) i trifosforan inozytolu 1,4,5 (IP3). DAG jest następnie fosforylowany przez kinazę DAG w celu wytworzenia kwasu fosfatydowego (PA). Następnie, poprzez szereg reakcji, które obejmują wytwarzanie półproduktów lipidowych, PI(4,5)P2 jest regenerowany2. Kilka składników tego cyklu PI(4,5)P2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Hodowla much i przygotowanie chemikaliów
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyznaczanie liniowości pomiaru w MS. Liniowość to zdolność metody MS do dostarczania wyników bezpośrednio proporcjonalnych do stężenia analizowanego lipidu. Liniowość zależy od (a) wydajności jonizacji analizowanego lipidu oraz (b) zachowania jonizacji analizowanego lipidu przy różnych stężeniach, co zależy od zastosowanego źródła jonów. W jonizacji przez rozpylanie elektryczne (ESI), stosowanej w niniejszym badaniu, liniowość jest zachowana przy niższych stężeniach w zależności od (a) transportu jonów z.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wiele linii dowodowych zbiega się w wielu rolach lipidów sygnałowych w regulacji organizacji i funkcji fotoreceptorów Drosophila. Oprócz dobrze zbadanej roli lipidów w regulacji fototransdukcji3, lipidy sygnalizacyjne są również zaangażowane w transport białek i organizację subkomórkową 23,30,39,40,41. Badania te były możliwe d.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Praca opisana w tym manuskrypcie była wspierana przez Departament Energii Atomowej, Rząd Indii (Numer identyfikacyjny projektu. RTI 4006), Departament Biotechnologii, Rząd Indii (BT/PR4833/MED/30/744/2012) oraz India Alliance Senior Fellowship (IA/S/14/2/501540) do PR. Dziękujemy Zakładowi Spektrometrii Mas NCBS, a w szczególności dr Dhananjay Shinde oraz członkom laboratorium PR za ich wkład w rozwój tych metod.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,1 N metanolowy HCL | Do całkowitej izolacji lipidów | ||
| 0,88% KCl | Sigma Aldrich | P9541 | Do całkowitej izolacji lipidów |
| 1,5 ml / 2ml LoBind Probówki Eppendorf | Eppendorf,022431081 | /022431102 | Do całkowitej izolacji lipidów |
| 2.3.18 16:0/18:1 Diether PE | Avanti polarne lipidy | 999974 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny 37 |
| % czysty HCl | Sigma Aldrich | 320331 | Do całkowitej izolacji lipidów |
| 96-dołkowa płytka | Test całkowitego fosforanu organicznego | ||
| Aceton | Fisher Scientific | 32005 | Do sekcji |
| Molibdenian amonu Całkowity fosforan | organiczny Test | ||
| kwasu | Ogólny fosforan organiczny | ||
| Test Sonikator | do kąpieli | ||
| Kolumna BEH300 C18 [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm] | Waters India Pvt. Ltd. | 186002352 | LC |
| Uchwyt ostrza | Fine Scientific Tools | 10052-11 | Do preparacji |
| Inkubator | Test całkowitego fosforanu organicznego | ||
| Łamliwe ostrza | Fine Narzędzia naukowe | 10050-00 | Do rozwarstwień |
| Papier maślany | GE healthcare | 10347671 | Do rozwarstwień |
| C4, 300 A0, [1.7 μ m x1 mm x 100 mm] kolumna | Waters India Pvt. Ltd. | Fiolki ze szkła w | |
| kolorze bursztynowym | Merck | 27083-U | |
| d18:1/17:0) | Lipidy polarne Avanti | 860517 | Wewnętrzny wzorzec lipidowy |
| d5-fosfatydyloinozytolu 3,5-bisfosforan [PI(3,5)P2]-16:0/16:0 | Lipidy polarne Avanti | 850172 | Wewnętrzny wzorzec lipidów |
| Mikroskopy | preparacyjneOlympus | SZ51 | Do preparacji |
| Sucha kąpiel cieplna. | |||
| Eluent A | Heksan: Alkohol izopropylowy: 100 mM wodny octan amonu (68:30:2), dla | ||
| LC Eluent B | Heksan: Alkohol izopropylowy: 100 mM wodny octan amonu (70:20:10), do LC | ||
| Bibuła filtracyjna | Indica-HM2 | 74039 | Do rozwarstwiania |
| Kolby | Borosil | Do sekcji | |
| Muchy | NA | NA | Raghu Padinjat lab |
| Pokarm dla much | NA | NA NCBS lab kitchen, skład: mąka kukurydziana 80 g/L, D-glukoza 20 g/L, sacharoza 40 g/L, agar 8 g/L, ekstrakt drożdżowy 15 g/L, kwas propionowy 4 mL, TEGO (metapara hydroksybenzoesan) 0,7 g/L, kwas ortofosforowy 0,6 mL) | |
| Kleszcze | Fine Scientific Tools | 11254-20 | Do sekcji |
| dygestoriów | |||
| Lejek | Borosil | Do rozwarstwiania | |
| Lodowaty kwas octowy | Fisher Scientific | A35-500 | Do derywatyzacji |
| Butelki szklane: przezroczysty i bursztynowy Do | całkowitej izolacji lipidów | ||
| Odporne na wysokie temperatury szklane rurki bez fosforanów. | Test całkowitego fosforanu organicznego | ||
| Probówki homogenizacyjne z kulkami tlenku cyrkonu | Do całkowitej izolacji lipidów | ||
| Homogenizator | Precellys | ||
| Nawilżany CO2 podłączony do muchówek | |||
| Inkubatory sterowane oświetleniem | Panasonic Sanyo | MIR-553 | Dla muchy hodowla |
| Początkowa mieszanina | metanol:chloroform (2:1), Do całkowitej izolacji lipidów | ||
| Chloroform klasy LC-MS | Sigma Aldrich | 650498 | Do całkowitej izolacji lipidów |
| Metanol klasy LC-MS | Sigma Aldrich | 34860 | Do całkowitej izolacji lipidów |
| Woda klasy LC-MS | Sigma Aldrich | 34877 | Do całkowitej izolacji lipidów |
| Lekki miernik | Instrumenty HTC | LX-103 | |
| Końcówki o niskiej retencji | Eppendorf | 0030072006/72014/72022/72030 | Do całkowitej izolacji lipidów |
| Instrument LTQ Orbitrap XL | Thermo Fisher Scientific, Brema, Niemcy | ||
| Kwas lizofosfatydowy (LPA)- 13:0 | Lipidy polarne Avanti | LM-1700 | Wewnętrzny wzorzec lipidowy |
| Kwas lizofosfatydowy (LPA)- 17:1 | Lipidy polarne Avanti | LM 1701 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| Lizofosfatydylocholina (LPC) -13:0 | Lipidy polarne Avanti | LM-1600 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| lizofosfatydylocholina (LPC) -17:1 | Lipidy polarne Avanti | 855677 | Lipidy wewnętrzne |
| Lizofosfatydylocholina (LPC)- 19:0 | Lipidy polarne Avanti | 855776 | Lipidy wewnętrzne |
| Kwas nadchlorowy. | Ogólny test fosforanu organicznego | ||
| Fosforan wzorcowy diwodorofosforan | Test całkowitego fosforanu organicznego | ||
| Solanka buforowana fosforanami (PBS) | NA | NA | Skład: 137mMNaCl, 2,7mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 |
| Kwas fosfatydowy (PA)- 12:0/13:0 | Lipidy polarne Avanti | , LM-1400 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| Kwas fosfatydowy (PA)-17:0/14:1 | Lipidy polarne Avanti | LM-1404 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| Kwas fosfatydowy (PA)-(17:0/17:0) | Lipidy polarne Avanti | 830856 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| Kwas fosfatydowy (PA)-16:0-D31/18:1 | Lipidy polarne Avanti | 860453 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| Fosfatydylocholina (PC) -12:0/13:0 | Avanti polar lipids | LM-1000 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| Fosfatydylocholina (PC)- 17:0/14:1 | Avanti polar lipids | LM-1004 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| fosfatydyloetanoloaminy (PE) - 17:0/14:1 | Lipidy polarne Avanti | LM-110 | Lipidowy wzorzec wewnętrzny |
| Fosfatydyloinozytol (PI) - 17:0/14:1 | Lipidy polarne Avanti | LM-1504 | Wewnętrzny wzorzec lipidów |
| 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4 | Lipidy polarne Avanti | LM-1904 | Wewnętrzny wzorzec lipidów |
| 4-fosforan fosfatydyloinozytolu (PI4P) - 17:0/20:4 | Lipidy polarne Avanti | LM-1901 | Wewnętrzny wzorzec lipidów |
| Zrobotyzowane źródło jonów nanoprzepływowych | TriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA) | ||
| Rotospin instrument | Tarsons | 3090X | |
| Podkładki silikonowe | Do rozwarstwiania | ||
| rozpuszczalnik A | 0,1% kwas mrówkowy w wodzie, do | ||
| rozpuszczalnika LC B | 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu, do | ||
| LC Wirówka | |||
| Termomikser | |||
| TMS-diazometan | Acros | AC385330050 | Do derywatyzacji |
| Potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy | AB Sciex | QTRAP 6500 | |
| System UPLC | Woda Acquity | ||
| Próżniowy koncentrator odśrodkowy | Scanvac, | ||
| Vortex |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny