Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza sygnalizacji lipidowej w fotoreceptorach Drosophila przy użyciu spektrometrii mas

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63516

⸱

7 marca 2022

 ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

W tym artykule

Podsumowanie

Rękopis prezentuje wszechstronne, solidne i czułe protokoły spektrometrii mas do identyfikacji i ilościowego określenia kilku klas lipidów z fotoreceptorów Drosophila.

Streszczenie

Aktywacja fosfolipazy Cβ (PLCβ) jest niezbędnym krokiem podczas transdukcji sensorycznej w fotoreceptorach Drosophila. Aktywność PLCβ powoduje hydrolizę błonowego lipidu fosfatydyloinozytolu 4,5 bisfosforanu [PI(4,5)P2], co ostatecznie prowadzi do aktywacji przejściowych kanałów potencjału receptorowego (TRP) i TRP (TRPL). Aktywność PLCβ prowadzi również do powstawania wielu gatunków lipidów, z których kilka zaproponowano jako odgrywające rolę w aktywacji TRP i TRPL. Ponadto zaproponowano kilka klas lipidów, które odgrywają kluczową rolę w organizowaniu biologii komórki fotoreceptorów w celu optymalizacji reakcji sygnałowych w celu optymalnej transdukcji czuciowej. Historycznie rzecz biorąc, odkrycia te były napędzane zdolnością do izolowania mutantów Drosophila dla enzymów, które kontrolują poziomy określonych lipidów i przeprowadzają analizę fizjologii fotoreceptorów u tych mutantów. Niedawno opracowano potężne metody spektrometrii mas do izolacji i analizy ilościowej lipidów o wysokiej czułości i swoistości. Są one szczególnie przydatne do stosowania u Drosophila, gdzie analiza lipidów jest teraz możliwa z fotoreceptorów bez konieczności znakowania radionuklidów. W tym artykule omówiono koncepcyjne i praktyczne rozważania dotyczące stosowania lipidowej spektrometrii mas do solidnej, czułej i dokładnej oceny ilościowej różnych lipidów sygnałowych w fotoreceptorach Drosophila. Wraz z istniejącymi metodami genetyki molekularnej i analizy fizjologicznej, takie lipidy prawdopodobnie zwiększą moc fotoreceptorów jako systemu modelowego dla odkryć w biologii.

Wprowadzenie

Fototransdukcja u Drosophila odbywa się za pośrednictwem kaskady PLCβ sprzężonej z białkiem G, co prowadzi do aktywacji kanałów aktywowanych światłem TRP i TRPL1. PLCβ hydrolizuje związany z błoną fosfolipid, bisfosforan 4,5 fosfatydyloinozytolu [PI(4,5)P2] i wytwarza diacyloglicerol (DAG) i trifosforan inozytolu 1,4,5 (IP3). DAG jest następnie fosforylowany przez kinazę DAG w celu wytworzenia kwasu fosfatydowego (PA). Następnie, poprzez szereg reakcji, które obejmują wytwarzanie półproduktów lipidowych, PI(4,5)P2 jest regenerowany2. Kilka składników tego cyklu PI(4,5)P2 pełni funkcje w fotoreceptorach Drosophila. Mechanizm, za pomocą którego aktywacja PLC prowadzi do bramkowania kanałów TRP i TRPL, pozostaje nierozwiązany. Jednak kilka linii dowodów sugeruje, że półprodukty lipidowe generowane przez hydrolizę PI(4,5)P2 mogą pośredniczyć w tym procesie3. Dlatego bardzo ważne jest zidentyfikowanie i ilościowe określenie tych pośrednich lipidów, aby rzucić światło na mechanizm aktywacji TRP i TRPL w fototransdukcji Drosophila. Oprócz swojej roli w fototransdukcji per se, lipidy odgrywają również kilka ważnych ról w organizacji komórkowej fotoreceptorów (recenzja w3). Zrozumienie tych funkcjonalnych ról lipidów jest wspomagane przez zdolność do wykrywania i ilościowego określania ich poziomów in vivo. Niniejszy artykuł zawiera przegląd oraz protokoły wyboru i wdrażania metod ilościowego oznaczania lipidów z fotoreceptorów Drosophila.

Historycznie, analiza lipidów składała się z frakcjonowania według klas chemicznych, po którym następowała analiza poszczególnych klas. Aby skutecznie zidentyfikować i określić ilościowo lipidy, opracowano wiele metod analitycznych, które są ukierunkowanymi lub nieukierunkowanymi analizami lipidów4,5,6,7,8,9,10. Ukierunkowana analiza koncentruje się na znanych lipidach i wykorzystuje określoną metodę o wysokiej czułości do analizy ilościowej tych konkretnych lipidów. Nieukierunkowana analiza lipidów ma na celu jednoczesne wykrycie wielu gatunków lipidów w próbce. Te metody analityczne obejmują chromatografię cienkowarstwową (TLC)4, chromatografię gazową (GC)5, chromatografię cieczową (LC)6, testy immunoenzymatyczne (ELISA)7, magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)8, znakowanie radionuklidów i spektrometria mas (MS)9,10. Chociaż znakowanie radioaktywne jest czułą metodą wykrywania lipidów i może być stosowane w kontekście hodowanych komórek, jego zastosowanie w analizie lipidów w nienaruszonych organizmach, takich jak Drosophila, jest trudne ze względu na względy bezpieczeństwa znakowania radioaktywnego żywych zwierząt latających. Innym wyzwaniem związanym ze znakowaniem promieniotwórczym jest to, że jest ono zależne od znakowania wszystkich pul prekursorów do stanu bliskiego równowagi, co może być trudne w kontekście modeli in vivo.

Kompleksowa analiza lipidów za pomocą MS to najnowszy postęp, który stał się możliwy dzięki rozwojowi nowoczesnych technologii MS11. Analiza lipidów w oparciu o MS ma kilka zalet, takich jak małe rozmiary próbek, możliwość zastosowania do próbek z modeli zwierzęcych, wysoka czułość, swoistość, a także wysoka przepustowość. W szczególności szerokie zastosowanie jonizacji elektronrozpylania doprowadziło do poprawy wydajności MS w analizie lipidów. Ulepszenie analizatorów mas w spektrometrach masowych, w tym połączenie różnych analizatorów masy, przyniosło dodatkowe korzyści, a opracowanie analizatora masy o wysokiej rozdzielczości ożywiło badania lipidów11. Analiza oparta na stwardnieniu rozsianym charakteryzuje cząsteczki lipidów na dwa główne sposoby: (1) lipidomika odgórna, w której eksperymenty ze stwardnieniem rozsianym mają na celu szybką ilościową charakterystykę globalnych zmian w lipidomie i opierają się wyłącznie na dokładnych masach nienaruszonych prekursorów lipidów12; (2) Lipidomika typu bottom-up, która określa ilościowo poszczególne gatunki molekularne poprzez wykrywanie charakterystycznych jonów fragmentów strukturalnych za pomocą tandemu MS13,14.

Ogólnie rzecz biorąc, analiza lipidów w fotoreceptorach Drosophila składa się z dwóch etapów: po pierwsze, ekstrakcja lipidów z tkanki oka/głowy, a po drugie, analiza wyekstrahowanych lipidów przez MS. Można to przeprowadzić przy użyciu jednej z następujących metod: rozdzielanie lipidów za pomocą chromatografii cieczowej (LC) sprzężonej z MS lub bez rozdzielania chromatograficznego przy użyciu lipidomiki typu shotgun/bezpośredniej infuzji MS (DIMS). Oba podejścia do profilowania lipidów opierają się na zastosowaniu jonizacji elektrorozpylającej MS (ESI-MS) i okazały się czułe, ilościowe i wydajne10,15. W analizie DIMS identyfikacja lipidów opiera się na masie jonów prekursorowych, skanach utraty neutralnej i sygnaturach specyficznych dla klasy lipidów14,16,17,18. Chociaż podejście to łączy w sobie szybkość analizy i solidność, nie można uniknąć tłumienia jonów lipidów o niskiej liczebności ze względu na obecność lipidów o wysokiej obfitości i wysoce polaryzowalnych w próbce. W związku z tym lipidy o niskiej obfitości, takie jak fosfoinozytydy i PA, często nie są wykrywane lub są słabo wykrywane przez standardowe platformy DIMS, między innymi z powodu tłumienia jonów19,20. Separacja metodą chromatografii cieczowej przed MS (LC-MS) może pomóc w przezwyciężeniu tłumienia jonów, a także w ukierunkowaniu analizy określonych klas lub gatunków lipidów będących przedmiotem zainteresowania21.

W tym artykule opisane są kroki związane z ilościowym określaniem głównych lipidów będących przedmiotem zainteresowania w fotoreceptorach Drosophila. W związku z tym zoptymalizowano trzy różne podejścia do MS: (1) DIMS przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości, (2) chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami po derywatyzacji - MS (RPLC-MS) przy użyciu potrójnego poczwórnego spektrometru mas oraz (3) chromatografia cieczowa z fazą normalną - monitorowanie wielu reakcji - ulepszony skan jonów produktu - MS (NPLC-MRM-EPI-MS) przy użyciu potrójnego poczwórnego spektrometru mas z ulepszoną funkcją skanowania jonów produktu. Wybór pomiędzy tymi metodami podyktowany jest konkretnymi pytaniami badawczymi, które są przedmiotem badań. Do ogólnego opisu i analizy wszystkich rodzajów glicerofosfolipidów biorących udział w fototransdukcji należy użyć DIMS. Należy jednak zauważyć, że w tym podejściu glicerofosfolipidy o niskiej polaryzacji i niskiej liczebności prawdopodobnie nie zostaną wykryte22. Aby wykryć te lipidy o niskiej liczebności, należy przeprowadzić RPLC-MS po derywatyzacji. Korzystając z tego podejścia, udało nam się wykryć i określić ilościowo kwas fosfatydowy (PA)23,24,25, fosfatydyloinozytol (PI), fosforan fosfatydyloinozytolu 5 (PI5P)26, fosforan fosfatydyloinozytolu 4 (PI4P) i PI(4,5)P227. Metody DIMS i RPLC-MS po derywatyzacji generują informacje na poziomie klasy lipidów. Na przykład, korzystając z tych dwóch metod, można określić ilościowo PA (34:2), którego m / z jest zgodne z wieloma gatunkami molekularnymi, w tym: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) i (viii) PA (20:0/14:2). Za pomocą tych metod nie można uzyskać informacji o składzie tłuszczowego łańcucha acylowego PA (34:2) obecnego w próbce. Wyzwanie to można przezwyciężyć za pomocą hybrydowej metody MS, która łączy separację LC, monitorowanie wielu reakcji (MRM) i ulepszone skanowanie jonów produktu (EPI). Metoda ta jest zarówno czuła, jak i ilościowa i umożliwia: pomiar bezpośredni, tj. bez wstępnego znakowania lub obróbki końcowej próbki, oraz ustala gatunki molekularne z dokładnymi informacjami o tłuszczowym łańcuchu acylowym25. Za pomocą tej metody zidentyfikowaliśmy dużą liczbę gatunków molekularnych PA i określiliśmy dokładny skład tłuszczowych łańcuchów acylowych w SN1 i SN2 szkieletu glicerolu. Takie podejście będzie przydatne podczas analizy funkcji określonych gatunków molekularnych dowolnej klasy lipidów w fotoreceptorach. Przedstawione tutaj szczegółowe protokoły dla każdego z tych typów analiz mogą być dostosowane do innych lipidów sygnalizacyjnych istotnych dla funkcji fotoreceptorów Drosophila (schematy patrz Rysunek 1). Należy zauważyć, że szczegółowe metody analizy lipidomicznej kilku innych klas lipidów (nieomówionych w tym artykule) zostały opisane w innym miejscu. Należą do nich ceramidy28,29, sfingolipidy30,31, neutralne lipidy, takie jak diglicerydy i trójglicerydy32,33 oraz sterole15,33. W niektórych przypadkach metody analizy tych lipidów zostały opisane dla tkanek larwalnych Drosophila i mogą być dostosowane do stosowania w fotoreceptorach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla much i przygotowanie chemikaliów

  1. Muchy tylne (Drosophila melanogaster) na standardowym pokarmie dla much w inkubatorze o wilgotności względnej 50% w temperaturze 25 °C bez wewnętrznego oświetlenia. Pokarm na muchy należy przygotować, dodając 80 g/l mąki kukurydzianej, 20 g/l D-glukozy, 40 g/l sacharozy, 8 g/l agaru, 15 g/l ekstraktu drożdżowego, 4 ml kwasu propionowego, 0,7 g/l TEGO (metaparahydroksybenzoesan) i 0,6 ml kwasu ortofosforowego, zgodnie z opisem w34 i są również dostępne w https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. Wyhoduj jedną grupę much, po eklozjach, w chłodzonym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25 °C z ciągłym oświetleniem światłem białym o natężeniu ~2,000 luksów.
  2. Przygotować bufor elucyjny fosfoinozytolu (PEB) przez dodanie chloroformu:metanolu:2,4 M kwasu solnego w stosunku 250:500:200 (obj./obj./obj.). Przygotować bufor do płukania dolnej fazy (LPWS) przez dodanie metanolu:1 M kwasu solnego:chloroform w stosunku 235:245:15 (obj./obj./obj.). Przygotować roztwór do płukania po derywatyzacji, dodając chloroform:metanol:woda w stosunku 8:4:3 (obj./obj./obj.).
    UWAGA: Używaj rozpuszczalników i chemikaliów klasy MS. Nie przechowuj bufora PEB i LPWS dłużej niż 3 miesiące.
  3. Kolumnę C4 (1,7 μm x 1 mm x 100 mm) należy stosować do fosfoinozytydów, PI4P i PI(4,5)P2 oraz kolumnę C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm) do PA, fosfatydylocholiny (PC) i fosfatydyloinozytolu (PI). W przypadku metody NPLC-MRM-EPI należy użyć kolumny krzemionkowej (1 mm x 150 mm x 3 μm).
  4. Przygotować eluent A, dodając heksan:alkohol izopropylowy:100 mM wodny octan amonu w stosunku 68:30:2 (obj./obj./obj.) i eluent B, dodając heksan:alkohol izopropylowy:100 mM wodny roztwór octanu amonu w stosunku 70:20:10 (obj./obj./obj.) dla PA, PC i PI. Przygotować rozpuszczalnik A dla fosfoinozytydów, dodając 0,1% kwasu mrówkowego do wody, a rozpuszczalnik B, dodając 0,1% kwasu mrówkowego do acetonitrylu.

2. Izolacja tkanki

  1. Zbierz 10 much na próbkę za pomocą znieczulenia dwutlenkiem węgla (CO2) (muchy unieruchamiają się w ciągu kilku sekund) i odetnij muchy za pomocą ostrego ostrza na płytce znieczulającej CO2.
  2. Zbierz ciemne lub przystosowane do światła muchy w określonym wieku (12-24 godziny) w probówkach o pojemności 1,5 ml i zamroź je w ciekłym azocie. Odwodnić muchy w acetonie w temperaturze -80 °C przez 48 godzin w szklanej fiolce35. W przypadku tkanki siatkówki zbierz 100 siatkówek z liofilizowanych much. Za pomocą skalpela usuń oczy z reszty głowy i zgarnij siatkówki.
  3. Do analizy fosfoinozytydów PI4P i PI(4,5)P2, podczas pracy ze świeżymi siatkówkami, należy użyć 25 siatkówek na próbkę od much hodowanych w warunkach odpowiedniego oświetlenia do pomiaru poziomu lipidów podczas oświetlenia oraz od much hodowanych bez światła do pomiaru poziomów lipidów w ciemności. Przechowywać w 50 μl 1x PBS w probówkach homogenizatora na suchym lodzie, aż będzie gotowy do ekstrakcji.

3. Ekstrakcja lipidów

UWAGA: Chloroform jest toksycznym rozpuszczalnikiem i ma charakter rakotwórczy. Wpływa na układ rozrodczy i działa drażniąco na skórę i oczy. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną. Wszystkie czynności związane z chloroformem powinny być wykonywane w dobrze wentylowanym kapturze chemicznym.

  1. Dla wszystkich glicerofosfolipidów innych niż PI4P i PI(4,5)P2
    1. Dla każdej próbki homogenizować 10 głów muchowych lub 100 siatkówek (zebranych zgodnie z opisem w kroku 2.2) w 0,1 ml 0,1 N lodowatego metanolowego HCl i 30 μl mieszaniny wzorca wewnętrznego (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), kwasu lizofosfatydowego (LPA; 13:0), lizofosfatydylocholiny (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) i PC (12:0/13:0)). Przygotować wzorce w taki sposób, aby końcowa ilość dowolnego wzorca lipidowego mieściła się w liniowej krzywej odpowiedzi spektrometru masowego.
    2. Homogenizacja tkanek za pomocą automatycznego homogenizatora, który umożliwia szybką i jednoczesną obróbkę wszystkich próbek. Krótko odwiruj probówki w wirówce stołowej i upewnij się, że nie utworzył się osad - oznacza to całkowitą homogenizację. Przenieść homogenat metanolowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z korkiem.
    3. Dodać 0,2 ml lodowatego 0,1 N metanolowego HCl w celu odzyskania pozostałości materiału w probówce i połączyć w probówce o pojemności 2 ml. Dodać 0,1 ml 0,1 N lodowatego metanolowego HCl, a następnie 0,8 ml chloroformu i dokładnie wymieszać. Pozostawić mieszaninę zawierającą homogenat tkankowy na lodzie na 10 minut, a następnie dodać 0,4 ml 0,88% KCl i wirować przez 30 s.
    4. Odwirować mieszaninę przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej. Dolną fazę organiczną zawierającą lipidy należy bardzo ostrożnie wyjąć, nie mieszając z fazą wodną i przenieść do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Podczas ekstrakcji lipidów należy przenieść dolną fazę organiczną z najwyższą ostrożnością, aby uniknąć zmieszania z fazą wodną, co może utrudnić dalszą analizę lipidów.
    5. Wysuszyć ten roztwór lipidowy w parowniku próżniowym w temperaturze 4 °C, dokonać wizualnej kontroli próbki, aby zapewnić całkowite wysuszenie. Zawiesić w 420 μl mieszaniny metanolu i chloroformu w stosunku 2:1 do analizy. Próbki należy analizować natychmiast bez przechowywania.
  2. Dla fosfoinozytydów PI4P i PI(4,5)P2
    1. Homogenizować 25 siatkówk w 950 μl buforu elucyjnego fosfoinozytylu (PEB; 250 mlCHCl 3, 500 ml metanolu i 200 ml 2,4 M HCl) i dodać wzorce wewnętrzne (fosfatydyloetanoloamina (PE) 17:0/14:1; PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); i mieszaniny PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) zawierającej 50 ng PI, 25 ng PI4P, 50 ng PI(4,5)P2 i 0,2 ng PE na próbkę.
    2. Dodać po 250 μl chloroformu i 2,4 M HCl, a następnie sonikować przez 2 minuty i odwirowywać przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu rozdzielenia faz. Dolną fazę organiczną wyjąć do świeżej probówki, przemyć 900 μl LPWS i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Ekstrahować lipidy z pozostałej fazy wodnej, ponownie przeprowadzając rozdzielanie faz, jak w kroku 3.2.2. Wysuszyć zebrane fazy organiczne w wirówce próżniowej ustawionej na 4 °C, przeprowadzić wzrokową kontrolę próbek, aby zapewnić całkowite wysuszenie.

4. Test fosforanów organicznych

  1. Przygotować roztwór podstawowy 7,34 mM KH2PO4. Roztwory wzorcowe należy wykonać przy użyciu wody destylowanej w probówkach do mikrowirówek zgodnie z tabelą 1. Lekko wymieszać probówki i przenieść wzorcowe rozcieńczenia do szklanych probówek bez fosforanów.
  2. Przygotować oddzielny zestaw szklanych probówek zawierających próbki lipidów. Zoptymalizuj objętość próbek lipidów tak, aby absorbancja przy 630 nm (po zakończeniu tego protokołu) mieściła się w zakresie standardu KH2PO4 (który wynosi od 0 do 20x).
  3. Podgrzać szklane probówki zawierające wzorcowe rozcieńczenia w temperaturze 120 °C do całkowitego wyschnięcia. Podgrzać szklane probówki zawierające próbki lipidów (pobrać 1/8 całkowitej objętości próbki wymaganej do uzyskania absorbancji w zakresie wzorca KH2PO4) w temperaturze 90 °C do całkowitego wyschnięcia.
  4. Dodać 50 μl 70% kwasu nadchlorowego do wszystkich probówek i podgrzewać w temperaturze 180 °C przez 30 minut. Schłodzić probówki do temperatury pokojowej. Do każdej probówki dodać 250 μl wody, 50 μl 2,5% molibdenianu amonu i 50 μl 10% kwasu askorbinowego.
    UWAGA: 2,5% molibdenianu amonu i 10% kwasu askorbinowego to stężenia wagowe/obj. Muszą być świeżo przygotowane i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  5. Przechowywać probówki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Podzielić 130 μl próbki na 96-dołkową płytkę i zmierzyć absorbancję przy 630 nm za pomocą spektrofotometru.

5. Derywatyzacja

UWAGA: Trimethylsilyldiazomethane (TMSD) ma wiele efektów toksykologicznych u ludzi. TMSD w roztworze działa na nerki, wątrobę, przewód pokarmowy, mięśnie szkieletowe, ośrodkowy układ nerwowy oraz układ oddechowy i rozrodczy. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną. Cały proces powinien odbywać się w dobrze wentylowanym okapie chemicznym.

  1. Do dolnej fazy organicznej próbek otrzymanych z końca etapu 3.2.3 dodać 50 μl 2 M TMSD. Pozwól reakcji postępować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, stale wstrząsając przy 250 obr./min. Po 10 minutach dodać 10 μl lodowatego kwasu octowego w celu wygaszenia reakcji, na co wskazuje zanik żółtego koloru w roztworze.
  2. Postukaj w probówki i ostrożnie je otwórz, aby usunąć N2 powstały w reakcji hartowania. Po ucieczce gazu N2 zamknij rurki i odkręć je w dół. Następnie dodać 600 μl roztworu myjącego po derywatyzacji i wirować przez 2 minuty w mieszalniku z prędkością 250 obr./min.
  3. Wyrzuć ~400 μL z górnej fazy, która się uformuje. Powtórz krok 5.2. Wyrzuć całą górną fazę i dodaj 50 μl 90% metanolu do dolnej fazy i wymieszaj.
  4. Suszyć próbki przez 2 godziny w koncentratorze odśrodkowym o ciśnieniu 800 x g pracującym w próżni. Po wysuszeniu probówki powinny zawierać ~20 μL pozostałej próbki. Dodać 180 μl 100% metanolu, dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2-3 dni przed LC-MS/MS.

6. Akwizycja i analiza danych

  1. Akwizycja danych w infuzji bezpośredniej MS (DIMS)
    UWAGA: Stwardnienie rozsiane można wykonać metodą bezpośredniej infuzji lub chromatografii cieczowej MS (LC-MS). W tej sekcji opisano stwardnienie rozsiane oparte na infuzji bezpośredniej.
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentu skalibruj spektrometr masowy zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wygenerować liniową krzywą odpowiedzi dla serii rozcieńczeń wzorców syntetycznych i w oparciu o odpowiedź liniową przyrządu rozcieńczyć próbkę tak, aby intensywność analitu lipidowego mieściła się w liniowości przyrządu. Rozcieńczyć całkowite ekstrakty lipidowe lub wzorce lipidowe mieszaniną 2:1 metanol:chloroform (obj./obj.). Rozcieńczenie całkowitych ekstraktów lipidowych i syntetycznych wzorców należy dobierać indywidualnie dla każdego eksperymentu.
    3. Przenieść ekstrakty i wzorce do poszczególnych fiolek. Należy unikać pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia próbek do fiolek z próbkami SM. Pęcherzyki powietrza wytwarzają wysokie ciśnienie w kolumnie i utrudniają analizę lipidów.
    4. Przed analizą należy odwirować próbki przez 9 minut przy 6,440 x g i załadować do 96-dołkowej płytki i zamknąć folią aluminiową.
    5. Wykonać analizy MS na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości przy użyciu metody infuzji bezpośredniej. Osiągnij stabilną jonizację glicerofosfolipidów opartą na ESI za pomocą zrobotyzowanego źródła jonów nanoprzepływowych za pomocą chipów z dyszami natryskowymi o średnicy 4,1 μm.
    6. Kontroluj źródło jonów za pomocą niestandardowego oprogramowania spektrometru mas i ustaw napięcia jonizacji na poziomie +1,2 kV i -1 kV odpowiednio w trybie dodatnim i ujemnym; przeciwciśnienie na 1 psi w obu trybach; oraz temperaturę kapilary wymiany jonów na 180 °C. Wykonaj akwizycję z rozdzielczością masy, Rm/z400 = 100 000. Zobacz Rysunek 2A dla interfejsu oprogramowania do ustawiania parametrów spektrometru masowego.
    7. Ponownie rozpuścić wysuszone ekstrakty lipidowe ogółem w 400 μl chloroformu:metanolu (1:2). Do analizy załaduj 60 μl próbek na 96-dołkowe źródło jonów na płytce i zamknij folią aluminiową. Analizuj każdą próbkę przez 20 minut w trybie jonów dodatnich, aby wykryć PC, fosfatydyloserynę (PS), fosfatydyloetanoloaminę (PE), PE-O (fosfatydyloetanoloaminę związaną z eterem), ceramid (Cer) i fosforan ceramidu (Cer-P).
    8. Wykonaj niezależną akwizycję w trybie jonów ujemnych przez 20 minut, w których wykryto PA i PI. Zobacz Rysunek 2B, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji przyrządów do akwizycji danych dla MS o wysokiej rozdzielczości oraz docelową listę gatunków PA, które zostały włączone do konfiguracji akwizycji zależnej od danych (DDA).
      UWAGA: Interfejs oprogramowania do konfiguracji metody DDA jest pokazany w Rysunek 2C. Wykaz cząsteczek PA będących celem tego podejścia znajduje się w tabeli 2. Zrzut ekranu przedstawiający wynik eksperymentu w podejściu DDA jest pokazany w Rysunek 2D.
  2. Analiza danych w infuzji bezpośredniej MS (DIMS)
    UWAGA: Analiza danych masowych generowanych przez wszystkie typy spektrometrów masowych wymaga zautomatyzowanej platformy analizy lipidów. LipidXplorer36 to niekomercyjne oprogramowanie, które obsługuje wszystkie rodzaje eksperymentów lipidowych DIMS. To oprogramowanie można znaleźć tutaj: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. Po uzyskaniu danych przy użyciu metod opisanych w kroku 6.1 należy zidentyfikować gatunki lipidów za pomocą platformy analizy lipidów, dopasowując m/z ich pików monoizotopowych do odpowiednich ograniczeń składu pierwiastkowego. Przykład importu danych jest pokazany w Rysunek 3A. Ustaw tolerancję masy na 10 ppm i próg intensywności zgodnie z poziomem hałasu zgłaszanym przez oprogramowanie spektrometru mas.
    2. Po zaimportowaniu skompiluj zapytania języka zapytań o fragmentację molekularną (MFQL) dla PA w oparciu o strukturę chemiczną PA, która jest pokazana w Rysunek 3B. Zobacz Rysunek 3C dla konfiguracji MFQL na platformie analizy lipidów.
    3. Stosując podobne podejście, skompiluj MFQL dla innych glicerofosfolipidów w oprogramowaniu platformy analizy lipidów. Każde zapytanie jest przeznaczone dla jednej klasy lipidów, a wiele zapytań może być używanych w jednym wykonaniu.
    4. Uruchom wszystkie MFQL, klikając przycisk Uruchom. Wszystkie zidentyfikowane gatunki lipidów są zgłaszane w jednym pliku wyników w formacie pliku .csv z obfitością odpowiadających im jonów prekursorowych i/lub fragmentacyjnych w celu późniejszej kwantyfikacji lipidów. Przykładowy wynik przedstawiono w tabeli 3.

7. Chromatografia cieczowa i tandemowe MS próbek derywatyzowanych

  1. Oddzielić próbki otrzymane z kroku 5.4 za pomocą chromatografii cieczowej przy użyciu systemu ultrasprawnej chromatografii cieczowej. Wybierając ten system, upewnij się, że jego oprogramowanie można zintegrować ze spektrometrem masowym używanym do analizy.
  2. Podłącz system do spektrometru masowego z potrójnym kwadrupolem. Wybierz kolumnę separacji. Do separacji lipidów innych niż PI4P i PI(4,5)P2 należy wybrać kolumnę C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm). Dla PI4P i PI(4,5)P2 należy wybrać kolumnę C4 o wymiarach 300 A (1,0 mm x 100 mm x 1,7 μm).
  3. Przygotować fazę ruchomą zawierającą mrówczan amonu, rozpuszczając go najpierw w wodzie o określonej masie, a następnie w rozpuszczalnikach organicznych. Poddaj sonifikacji wszystkie rozpuszczalniki używane w spektrometrii mas przez 20 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
  4. Zrównoważyć kolumnę, wprowadzając roztwór A zawierający wodę + 0,1% kwas mrówkowy i roztwór B zawierający acetonitryl + 0,1% kwas mrówkowy.
  5. Wstrzyknąć eluat z systemu chromatografii cieczowej (objętość iniekcji w zakresie 1-20 μl) do spektrometru mas w celu analizy. Ustaw natężenie przepływu na 0,1 ml/min, a temperaturę kolumny na temperaturę pokojową. Wstrzyknąć całą objętość elucji wychodzącą z kolumny do spektrometru masowego.
  6. W sekwencji wstrzykiwania próbki należy zawsze zaczynać od wstrzyknięcia ślepej próby rozpuszczalnika (metanolu) i utrzymywać czyste próbki wzorcowe z przerwami między próbkami biologicznymi w celu przeprowadzenia kontroli jakości spektrometrii mas (co szósty cykl).
  7. W przypadku hybrydowego spektrometru masowego z potrójną kwadrupolową pułapką jonową, przed rozpoczęciem eksperymentu należy skalibrować spektrometr masowy zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku PA, PC i PI użyj jonizacji elektronrozpylania (ESI) do generowania jonów i działaj w trybie dodatnim w celu wykrycia dodatnio naładowanych form lipidów. Pozyskaj dane i przeanalizuj je za pomocą zainstalowanego wraz z systemem oprogramowania do analizy danych.
  8. Zoptymalizuj parametry do analizy zgodnie z odpowiednim zastosowanym standardem wewnętrznym. Parametry spektrometru mas są następujące: czas przebywania = 30 ms; CAD (dysocjacja aktywowana kolizją) = 3 psi; GS1 (źródło gazu 1) = 24 psi i GS2 (źródło gazu 2) = 21 psi; CUR (gaz kurtynowy) = 30 psi; IS (napięcie ESI) = 4,5 kV; i TEM (temperatura źródła) = 450 °C.
  9. W przypadku PI4P i PI(4,5)P2 należy użyć spektrometru mas w trybie dodatnim. Parametry spektrometru mas są następujące: czas przebywania = 65 ms; CAD (dysocjacja aktywowana kolizją) = 2 psi; GS1 (gaz źródłowy 1) i GS2 (gaz źródłowy 2) = 20 psi; CUR (gaz kurtynowy) = 37 psi; IS (napięcie ESI) = 5,2 kV; i TEM (temperatura źródła) = 350 °C.

8. Chromatografia cieczowa w fazie normalnej-monitorowanie wielu reakcji-wzmocnione skanowanie jonów produktu MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. Warunki chromatograficzne
    1. Zastosuj metodę LC w fazie normalnej przy użyciu kolumny krzemionkowej, która jest w stanie oddzielić PA od innych fosfolipidów. Użyj heksanu: alkoholu izopropylowego: 100 mM wodnego roztworu NH4COOH w stosunku 68:30:2 jako ruchoma faza A i alkohol izopropylowy:heksan:100 mM wodny NH4COOH w stosunku 70:20:10 jako faza ruchoma B.
      UWAGA: Ta kombinacja zapewniła najlepszą separację i selektywność pików różnych molekularnych gatunków PA.
    2. Wykorzystanie zachowania chromatograficznego związków odniesienia (wzorców wewnętrznych) pod względem rozdzielczości i kształtu piku w celu wybrania optymalnych warunków.
    3. Przeprowadzić rozdzielanie chromatograficzne na kolumnie krzemionkowej o normalnej fazie (1 mm x 150 mm x 3 μm) w temperaturze pokojowej na kolumnie do ultrasprawnej chromatografii cieczowej. Ustawić objętość wtrysku automatycznego podajnika próbek na 6 μl, a natężenie przepływu eluentu na 210 μl/min.
    4. Po 5 minutach równoważenia ze 100% fazą ruchomą A, liniowo zwiększaj fazę ruchomą B do 30% w ciągu 5 minut, dalej do 80% w ciągu 5 minut, a następnie do 100% w ciągu 5 minut i utrzymuj ją na stałym poziomie 100% przez 5 minut. Na koniec ponownie równoważ kolumnę przez 9 minut.
  2. Spektrometria mas
    1. Użyj hybrydowego spektrometru masowego z potrójną kwadrupolową pułapką jonową pracującego w ujemnym trybie ESI. Kontroluj działanie systemu i akwizycję danych za pomocą dostarczonego oprogramowania analitycznego. Przed rozpoczęciem eksperymentu skalibruj spektrometr masowy zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Zoptymalizuj parametry źródła za pomocą analizy wtrysku przepływu mieszaniny wzorca wewnętrznego. W związku z tym ustaw napięcie rozpylania jonów = -4,5 kV, temperaturę źródła (TEM) = 450 °C, gaz dysocjacyjny aktywowany kolizją (CAD) = 3 psi. Użyj azotu jako gazu zderzeniowego i ustaw gaz nebulizatora (GS1) = 24 psi, gaz pomocniczy (GS2) = 21 psi, a gaz kurtynowy (CUR) = 30 psi.
    3. Ustaw parametry ścieżki jonów zależnej od związku jako potencjał deklastrowania (DP) = -42 V, potencjał wejściowy (EP) = -6 V i potencjał wyjścia komórki zderzeniowej (CXP) = -12 V, zoptymalizowane przy użyciu ciągłego wlewu roztworu mieszaniny wzorca wewnętrznego. Rejestruj pełne widma produktu wraz z przejściami MRM od prekursora do produktu o zmiennej energii zderzenia (CE) od 12 eV do 40 eV w celu analizy fragmentacji za pomocą funkcji skanowania EPI dostępnej w spektrometrze mas.
      UWAGA: EPI oparty na IDA wyzwalany przez MRM jednocześnie rejestruje prekursorowy produkt jonowy, skanowanie jonowe i w locie akwizycję MS/MS. MRM zawęził zakres skanowania jonów w kwadrupolu 1 (Q1), a pułapka jonowa wzmocniła fragmenty jonów przechodzące przez Q2, poprawiając w ten sposób znacznie zdolność jakościową kwadrupola MS / MS, szczególnie do wychwytywania wszystkich fragmentów powstających z jonu prekursorowego. W trybie EPI w Q3 wykrywa się wiele jonów fragmentacyjnych powstających z jonów prekursorowych z lepszym stosunkiem sygnału do szumu.
    4. Wykonuj eksperymenty MRM z CE 39 eV, aby uzyskać wysoką czułość. Ograniczyć maksymalną liczbę MRM do 75 i czas przebywania do 30 ms w celu wykrycia i zarejestrowania MRM każdej określonej cząsteczki, która wymywa się z kolumny chromatograficznej w dowolnym momencie podczas przebiegu. Zwiększa to cykl pracy maszyny.
    5. Wykonaj eksperymentalne strojenie, aby zdecydować o najlepszych parametrach jonizacji dla PA, jak opisano powyżej. W tym eksperymencie należy ustawić napięcie rozpylania jonów = -4,5 kV, temperaturę źródła (TEM) = 450 °C, gaz dysocjacyjny aktywowany kolizją (CAD) = 3 psi. Użyj azotu jako gazu zderzeniowego. Ustaw gaz nebulizatora (GS1) = 24 psi, gaz pomocniczy (GS2) = 21 psi, a gaz kurtynowy (CUR) = 30 psi.
    6. Ręcznie sprawdź wszystkie dane strojenia, aby zapewnić prawidłowy dobór parametrów jonizacji i jonów produktu. Przy doborze jonu produktu należy wziąć pod uwagę minimalizację potencjalnych zakłóceń między kanałami MRM. Parametry doświadczalne stosowane do analizy wszystkich gatunków molekularnych PA przedstawiono w tabeli 4.
      UWAGA: Hybrydowy potrójny kwadrupolowy liniowy spektrometr masowy pułapki jonowej pozwala nam połączyć tryb skanowania MRM z funkcją skanowania pułapki jonowej, umożliwiając w ten sposób szybkie i wysokie skanowanie dzięki wykorzystaniu metod takich jak skanowanie EPI do rejestrowania użytecznych tandemowych widm masowych każdego wykrytego prekursora. W tym badaniu, aby zidentyfikować odrębne gatunki molekularne PA, wykorzystaliśmy to podejście MS / MS oparte na MRM-EPI oparte na konwencjonalnej ścieżce jonów z potrójnym kwadrupolem z właściwością skanowania EPI pułapki jonowej, kontrolowanej przez oprogramowanie analityczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyznaczanie liniowości pomiaru w MS. Liniowość to zdolność metody MS do dostarczania wyników bezpośrednio proporcjonalnych do stężenia analizowanego lipidu. Liniowość zależy od (a) wydajności jonizacji analizowanego lipidu oraz (b) zachowania jonizacji analizowanego lipidu przy różnych stężeniach, co zależy od zastosowanego źródła jonów. W jonizacji przez rozpylanie elektryczne (ESI), stosowanej w niniejszym badaniu, liniowość jest zachowana przy niższych stężeniach w zależności od (a) transportu jonów z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiele linii dowodowych zbiega się w wielu rolach lipidów sygnałowych w regulacji organizacji i funkcji fotoreceptorów Drosophila. Oprócz dobrze zbadanej roli lipidów w regulacji fototransdukcji3, lipidy sygnalizacyjne są również zaangażowane w transport białek i organizację subkomórkową 23,30,39,40,41. Badania te były możliwe d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca opisana w tym manuskrypcie była wspierana przez Departament Energii Atomowej, Rząd Indii (Numer identyfikacyjny projektu. RTI 4006), Departament Biotechnologii, Rząd Indii (BT/PR4833/MED/30/744/2012) oraz India Alliance Senior Fellowship (IA/S/14/2/501540) do PR. Dziękujemy Zakładowi Spektrometrii Mas NCBS, a w szczególności dr Dhananjay Shinde oraz członkom laboratorium PR za ich wkład w rozwój tych metod.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 N metanolowy HCLDo całkowitej izolacji lipidów
0,88% KClSigma AldrichP9541Do całkowitej izolacji lipidów
1,5 ml / 2ml LoBind Probówki EppendorfEppendorf,022431081/022431102Do całkowitej izolacji lipidów
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti polarne lipidy999974Lipidowy wzorzec wewnętrzny 37
% czysty HClSigma Aldrich320331Do całkowitej izolacji lipidów
96-dołkowa płytkaTest całkowitego fosforanu organicznego
AcetonFisher Scientific32005Do sekcji
Molibdenian amonu Całkowity fosforanorganiczny Test
kwasuOgólny fosforan organiczny
Test Sonikatordo kąpieli
Kolumna BEH300 C18 [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
Uchwyt ostrzaFine Scientific Tools10052-11Do preparacji
InkubatorTest całkowitego fosforanu organicznego
Łamliwe ostrzaFine Narzędzia naukowe10050-00Do rozwarstwień
Papier maślanyGE healthcare10347671Do rozwarstwień
C4, 300 A0, [1.7 μ m x1 mm x 100 mm] kolumnaWaters India Pvt. Ltd.Fiolki ze szkła w
kolorze bursztynowymMerck27083-U
d18:1/17:0)Lipidy polarne Avanti860517Wewnętrzny wzorzec lipidowy
d5-fosfatydyloinozytolu 3,5-bisfosforan [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Lipidy polarne Avanti850172Wewnętrzny wzorzec lipidów
MikroskopypreparacyjneOlympusSZ51Do preparacji
Sucha kąpiel cieplna.
Eluent AHeksan: Alkohol izopropylowy: 100 mM wodny octan amonu (68:30:2), dla
LC Eluent BHeksan: Alkohol izopropylowy: 100 mM wodny octan amonu (70:20:10), do LC
Bibuła filtracyjnaIndica-HM274039Do rozwarstwiania
KolbyBorosilDo sekcji
MuchyNANARaghu Padinjat lab
Pokarm dla muchNANA NCBS lab kitchen, skład: mąka kukurydziana 80 g/L, D-glukoza 20 g/L, sacharoza 40 g/L, agar 8 g/L, ekstrakt drożdżowy 15 g/L, kwas propionowy 4 mL, TEGO (metapara hydroksybenzoesan) 0,7 g/L, kwas ortofosforowy 0,6 mL)
KleszczeFine Scientific Tools11254-20Do sekcji
dygestoriów
LejekBorosilDo rozwarstwiania
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificA35-500Do derywatyzacji
Butelki szklane: przezroczysty i bursztynowy Docałkowitej izolacji lipidów
Odporne na wysokie temperatury szklane rurki bez fosforanów.Test całkowitego fosforanu organicznego
Probówki homogenizacyjne z kulkami tlenku cyrkonuDo całkowitej izolacji lipidów
HomogenizatorPrecellys
Nawilżany CO2 podłączony do muchówek
Inkubatory sterowane oświetleniemPanasonic SanyoMIR-553Dla muchy hodowla
Początkowa mieszaninametanol:chloroform (2:1), Do całkowitej izolacji lipidów
Chloroform klasy LC-MSSigma Aldrich650498Do całkowitej izolacji lipidów
Metanol klasy LC-MSSigma Aldrich34860Do całkowitej izolacji lipidów
Woda klasy LC-MSSigma Aldrich34877Do całkowitej izolacji lipidów
Lekki miernikInstrumenty HTCLX-103
Końcówki o niskiej retencjiEppendorf0030072006/72014/72022/72030Do całkowitej izolacji lipidów
Instrument LTQ Orbitrap XLThermo Fisher Scientific, Brema, Niemcy
Kwas lizofosfatydowy (LPA)- 13:0Lipidy polarne AvantiLM-1700Wewnętrzny wzorzec lipidowy
Kwas lizofosfatydowy (LPA)- 17:1Lipidy polarne AvantiLM 1701Lipidowy wzorzec wewnętrzny
Lizofosfatydylocholina (LPC) -13:0Lipidy polarne AvantiLM-1600Lipidowy wzorzec wewnętrzny
lizofosfatydylocholina (LPC) -17:1Lipidy polarne Avanti855677Lipidy wewnętrzne
Lizofosfatydylocholina (LPC)- 19:0Lipidy polarne Avanti855776Lipidy wewnętrzne
Kwas nadchlorowy.Ogólny test fosforanu organicznego
Fosforan wzorcowy diwodorofosforanTest całkowitego fosforanu organicznego
Solanka buforowana fosforanami (PBS)NANASkład: 137mMNaCl, 2,7mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4
Kwas fosfatydowy (PA)- 12:0/13:0Lipidy polarne Avanti, LM-1400  Lipidowy wzorzec wewnętrzny
Kwas fosfatydowy (PA)-17:0/14:1Lipidy polarne AvantiLM-1404Lipidowy wzorzec wewnętrzny
Kwas fosfatydowy (PA)-(17:0/17:0)Lipidy polarne Avanti830856Lipidowy wzorzec wewnętrzny
Kwas fosfatydowy (PA)-16:0-D31/18:1Lipidy polarne Avanti860453Lipidowy wzorzec wewnętrzny
Fosfatydylocholina (PC) -12:0/13:0Avanti polar lipidsLM-1000Lipidowy wzorzec wewnętrzny
Fosfatydylocholina (PC)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1004Lipidowy wzorzec wewnętrzny
fosfatydyloetanoloaminy (PE) - 17:0/14:1Lipidy polarne AvantiLM-110Lipidowy wzorzec wewnętrzny
Fosfatydyloinozytol (PI) - 17:0/14:1Lipidy polarne AvantiLM-1504Wewnętrzny wzorzec lipidów
4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Lipidy polarne AvantiLM-1904Wewnętrzny wzorzec lipidów
4-fosforan fosfatydyloinozytolu (PI4P) - 17:0/20:4Lipidy polarne AvantiLM-1901Wewnętrzny wzorzec lipidów
Zrobotyzowane źródło jonów nanoprzepływowychTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin instrumentTarsons3090X
Podkładki silikonoweDo rozwarstwiania
rozpuszczalnik A0,1% kwas mrówkowy w wodzie, do
rozpuszczalnika LC B0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu, do
LC Wirówka
Termomikser
TMS-diazometanAcrosAC385330050Do derywatyzacji
Potrójny kwadrupolowy spektrometr masowyAB SciexQTRAP 6500
System UPLCWoda Acquity
Próżniowy koncentrator odśrodkowyScanvac,
Vortex
askorbinowego BZT 186004623 LC z wkładkami organiczna potasu stołowa maszyna Labogene

Bibliografia

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157(2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600(2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), Palo Alto, Calif. 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515(2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), New York, N.Y. 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756(2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851(2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fosfolipaza C betahydroliza PI(45)P2kanały TRPkanały TRPLkwantyfikacja lipidówgenetyka molekularnatransdukcja sensoryczna

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.