Artykuł metodologiczny

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63519

⸱

16 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific, 2Max Planck Institute of Biochemistry, Molecular Structural Biology, 3Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Streszczenie

Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) została ustanowiona jako rutynowa metoda określania struktury białek w ciągu ostatniej dekady, biorąc pod uwagę coraz większą część publikowanych danych strukturalnych. Ostatnie postępy w technologii TEM i automatyzacji zwiększyły zarówno szybkość gromadzenia danych, jak i jakość pozyskiwanych obrazów, jednocześnie obniżając wymagany poziom wiedzy specjalistycznej do uzyskiwania map kriogenicznych w rozdzielczości poniżej 3 A. Podczas gdy większość takich struktur o wysokiej rozdzielczości została uzyskana przy użyciu najnowocześniejszych systemów krio-TEM 300 kV, struktury o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą systemów krio-TEM 200 kV, zwłaszcza gdy są wyposażone w filtr energetyczny. Ponadto automatyzacja ustawiania mikroskopu i gromadzenia danych z oceną jakości obrazu w czasie rzeczywistym zmniejsza złożoność systemu i zapewnia optymalne ustawienia mikroskopu, co skutkuje zwiększoną wydajnością wysokiej jakości obrazów i ogólną przepustowością gromadzenia danych. Protokół ten demonstruje zastosowanie najnowszych osiągnięć technologicznych i funkcji automatyzacji w kriotransmisyjnym mikroskopie elektronowym 200 kV i pokazuje, jak zbierać dane do rekonstrukcji map 3D, które są wystarczające do budowy modeli atomowych de novo. Koncentrujemy się na najlepszych praktykach, krytycznych zmiennych i typowych problemach, które należy wziąć pod uwagę, aby umożliwić rutynowe gromadzenie takich zestawów danych krioelektromagnetycznych o wysokiej rozdzielczości. W szczególności szczegółowo omówiono następujące zasadnicze tematy: i) automatyzacja ustawiania mikroskopów, ii) wybór odpowiednich obszarów do pozyskiwania danych, iii) optymalne parametry optyczne dla wysokiej jakości i wysokoprzepustowego gromadzenia danych, iv) dostrajanie filtrów energetycznych dla obrazowania bez strat oraz v) zarządzanie danymi i ocena jakości. Zastosowanie najlepszych praktyk i poprawa osiągalnej rozdzielczości za pomocą filtra energetycznego zostanie zademonstrowana na przykładzie apo-ferrytyny, która została zrekonstruowana do 1,6 A, oraz proteasomu Thermoplasma acidophilum 20S zrekonstruowanego do rozdzielczości 2,1-A przy użyciu TEM 200 kV wyposażonego w filtr energetyczny i bezpośredni detektor elektronów.

Wprowadzenie

Określenie struktury białka jest kluczowe dla zrozumienia architektury molekularnej, funkcji i regulacji kompleksów białkowych zaangażowanych w kluczowe procesy komórkowe, takie jak metabolizm komórkowy, transdukcja sygnału czy interakcje gospodarz-patogen. Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) stała się potężną techniką zdolną do rozwiązania struktury 3D wielu białek i ich kompleksów, które były zbyt trudne dla tradycyjnych technik strukturalnych, takich jak dyfrakcja rentgenowska i spektroskopia NMR. W szczególności udowodniono, że cryo-EM jest metodą z wyboru dla białek błonowych, które nie mogą być łatwo skrystalizowane lub przygotowane w wystarczających ilościach dla tradycyjnych technik strukturalnych, a także dostarczyły nowych informacji na temat struktury i funkcji ważnych receptorów komórkowych i kanałów jonowych1,2,3,4,5. Ostatnio cryo-EM odegrał ważną rolę w walce z pandemią Covid-19, określając mechanizm infekcji SARS-CoV-2 na poziomie molekularnym, co wyjaśniło pochodzenie choroby Covid-19 i dało podstawę do szybkiego rozwoju skutecznych szczepionek i środków terapeutycznych6,7,8,9,10.

Zazwyczaj, wysokiej klasy transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) 300 kV są używane do wysokorozdzielczego określania struktury biomolekuł za pomocą analizy pojedynczych cząstek krio-EM (SPA) w celu ujawnienia ich konformacji i interakcji. Niedawno technika SPA osiągnęła nową granicę, gdy powszechna próbka kriogeniczna krio-EM apo-ferrytyna została zrekonstruowana w rozdzielczości atomowej (1,2 A)11,12 przy użyciu TEM 300 kV wyposażonego w pistolet do emisji zimnego pola (E-CFEG), bezpośredni detektor elektronów i filtr energii. Przy tej rozdzielczości możliwe było jednoznaczne rozdzielenie pozycji poszczególnych atomów w strukturze, konformacji poszczególnych łańcuchów bocznych aminokwasów, a także wiązań wodorowych i innych oddziaływań, co otwiera nowe możliwości odkrywania nowych celów leków w oparciu o strukturę i optymalizacji istniejących kandydatów na leki.

Mikroskopy TEM 200 kV średniej klasy są często używane do badania przesiewowego próbek i optymalizacji próbek przed ostatecznym zebraniem danych o wysokiej rozdzielczości za pomocą wysokiej klasy mikroskopów TEM, szczególnie w większych obiektach krio-EM. Zazwyczaj zobrazowane próbki mogą być rozdzielone w zakresie rozdzielczości 3-4 A, który jest wystarczający do przejścia do wysokiej klasy TEM 300 kV w celu końcowego zebrania danych. W związku z tym gromadzenie danych za pomocą TEM 200 kV często nie jest dalej optymalizowane w celu uzyskania wyników o najwyższej możliwej rozdzielczości. Co więcej, wiele interesujących pytań biologicznych można już odpowiedzieć i opublikować w tych rozdzielczościach, ponieważ wszystkie łańcuchy boczne aminokwasów są już rozwiązane, a zajętość miejsc wiązania ligandów może być również wiarygodnie określona13. Wykazano już, że TEM 200 kV mogą osiągać rozdzielczości powyżej 3 A dla wielu próbek14,15,16,17,18. Obrazy wykonane przy napięciu 200 kV wykazują z natury wyższy kontrast obrazowanych cząstek, co może nawet ułatwić dokładniejsze początkowe ustawienie cząstek pomimo bardziej stłumionego sygnału o wysokiej rozdzielczości w porównaniu z obrazami TEM 300 kV. Należy zauważyć, że osiągnięta rozdzielczość zrekonstruowanych map krio-EM jest również ograniczona elastycznością strukturalną i niejednorodnością konformacyjną obrazowanych próbek, co ma wpływ zarówno na rekonstrukcje 200 kV, jak i 300 kV. W rzeczywistości znacznie więcej rekonstrukcji krio-EM uzyskanych przy użyciu systemów 300 kV zostało rozdzielonych w zakresie rozdzielczości 3-4 A niż w wyższych rozdzielczościach19. Ponieważ mikroskopy TEM 200 kV są mniej złożone i mieszczą się w mniejszych pomieszczeniach, mikroskopy te stanowią dobrą, tańszą opcję do określania struktury makrocząsteczek biologicznych za pomocą cryo-EM, przy jednoczesnym zachowaniu automatyzacji długich zbiorów danych z wielu próbek przechowywanych w systemie automatycznego ładowania mikroskopów.

Zbiór danych cryo-EM do wyznaczania struktur w wysokiej rozdzielczości wymaga dokładnego wyrównania optyki mikroskopu. Wyrównanie kolumn przebiega systematycznie od źródła elektronów w dół do układu soczewek kondensatora, soczewki obiektywu i filtra energii z detektorem elektronów. Pełna sekwencja wyrównań nie jest zazwyczaj wymagana. W razie potrzeby użytkownik jest prowadzony przez półautomatyczne procedury z odpowiednim opisem każdego kroku w kontekstowym oknie pomocy przez całą procedurę osiowania w interfejsie użytkownika mikroskopu (panel sterowania Bezpośrednie wyrównanie). Gdy mikroskop jest w pełni wyrównany, optyka elektronowa pozostaje stabilna, a ustawienie nie musi być zmieniane przez co najmniej kilka miesięcy. Tylko najbardziej czułe dopasowania, takie jak równoległe oświetlenie płaszczyzny próbki, obiektywny astygmatyzm i wyrównanie bez komy, muszą zostać dopracowane tuż przed rozpoczęciem zbierania każdego zestawu danych. Jakość zebranych danych może być następnie monitorowana podczas zbierania danych za pomocą różnych pakietów oprogramowania, takich jak EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 lub Appion24.

Oprócz dokładnego ustawienia mikroskopu, wysoka jakość dobrze oczyszczonych próbek przy minimalnej niejednorodności konformacyjnej i kompozycyjnej jest również warunkiem wstępnym do zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości i rozwiązywania struktur o wysokiej rozdzielczości. Więcej szczegółów na temat typowych protokołów, częstych wyzwań i możliwych środków zaradczych można znaleźć w innych recenzjach poświęconych temu tematowi25,26,27. Zasadniczo kluczowe znaczenie ma znalezienie obszarów na danej siatce krio-EM, które mają wystarczająco cienki lód, aby zachować informacje o wysokiej rozdzielczości, a poszczególne cząstki są gęsto rozmieszczone w losowych orientacjach bez nakładania się. Jednak typowe siatki kriogeniczne mają niejednolitą grubość lodu, dlatego ważne jest, aby znaleźć i wybrać optymalne obszary do obrazowania. Różne sposoby szacowania grubości lodu na siatce są dostępne w pakietach oprogramowania dedykowanych do automatycznego zbierania zbiorów danych cryo-EM, takich jak EPU 2, Leginon28, lub SerialEM29.

Pojawienie się szybkich i czułych bezpośrednich detektorów elektronów umożliwiło gromadzenie obrazów w wielu frakcjach w postaci filmów, które umożliwiły kompensację ruchów wywołanych wiązką i spowodowały znaczny wzrost jakości i ilości danych używanych do przetwarzania obrazów i końcowej rekonstrukcji 3D30. Jednocześnie automatyzacja i gromadzenie danych o wysokiej przepustowości zapewniają ogromne zbiory danych z tysiącami obrazów/filmów, które stanowią wyzwanie w zakresie przechowywania i dostępu do danych. Przyjęty model z dużymi obiektami cryo-EM obsługującymi dziesiątki do setek użytkowników wymaga w szczególności zorganizowanego zarządzania danymi z odpowiednim śledzeniem i udostępnianiem danych w ustalonych potokach cryo-EM31,32.

To badanie opisuje protokół rutynowego zbierania zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu TEM 200 kV Glacios. Opisano niezbędne ustawienia optyki mikroskopu wraz z procedurami oceny próbek krio-EM i wyboru odpowiednich obszarów do zbierania danych o wysokiej rozdzielczości. Organizacja zebranych danych i powiązanych metadanych z informacjami o próbce jest zademonstrowana w Athena - platformie zarządzania danymi, która ułatwia przegląd informacji o próbkach i zebranych danych. Korzystając z próbki apo-ferrytyny na myszy, udało się uzyskać rekonstrukcję 3D w rozdzielczości 1,6 A13. Korzystając z opisanego protokołu, zrekonstruowaliśmy również mapę gęstości 3D proteasomu 20S z Thermoplasma acidophilum w rozdzielczości 2,1 A.

Protokół

Wszystkie kroki protokołu są opisane dla systemu 200 kV Glacios TEM (zwanego dalej 200 kV TEM) wyposażonego w filtr energii Selectris-X (zwany dalej filtrem energii) oraz detektor Falcon 4 (zwany dalej bezpośrednim detektorem elektronów). Kroki protokołu są specyficzne dla aplikacji EPU, która jest domyślnym oprogramowaniem do zbierania danych SPA preinstalowanym w każdym systemie Glacios. Poniższe kroki protokołu odpowiadają EPU w wersji 2.14 i w przypadku korzystania z innej wersji EPU spodziewane są niewielkie modyfikacje. Warunkami wstępnymi dla tego protokołu są: i) wyrównanie pistoletu i kolumny jest dobrze wyrównane, ii) kalibracje EM są prawidłowe oraz iii) automatyczne funkcje EPU są prawidłowo skalibrowane.

1. Wczytywanie siatek do mikroskopu

UWAGA: TEM 200 kV użyty w tym eksperymencie może pomieścić do 12 automatycznych siatek (tj. konwencjonalnych siatek TEM wpiętych w specjalny wkład) w kasecie, która jest załadowana do automatycznego ładowania mikroskopu i stale utrzymywana w temperaturze poniżej -170 °C, aby zapobiec dewitryfikacji próbki.

  1. Włóż automatyczne siatki do kasety automatycznego podajnika w warunkach ciekłego azotu.
  2. Włóż kasetę z automatycznymi siatkami do chłodzonej ciekłym azotem kapsuły transferowej.
  3. Włóż kapsułkę do mikroskopu i kliknij przycisk Dock w interfejsie użytkownika mikroskopu, aby załadować kasetę z kapsuły do automatycznego podajnika mikroskopu.
  4. Kliknij przycisk Inwentaryzacja, aby sprawdzić obecność automatycznych siatek w załadowanej kasecie.
  5. Kliknij przyciski Załaduj i Rozładuj, aby wstawić automatyczne siatki do kolumny obrazowania TEM.

2. Ustawienie projektu na platformie zarządzania danymi (Opcjonalnie)

UWAGA: Przykładowe informacje i zebrane dane mogą być zorganizowane na dostarczonej platformie zarządzania danymi, która umożliwia przechowywanie uporządkowanych danych dla wszystkich podłączonych instrumentów. Można utworzyć projekt, dla którego można zdefiniować dowolne kroki przepływu pracy w celu przechwycenia obrazów i metadanych w zorganizowany sposób w celu przejrzenia i wyeksportowania.

  1. Uruchom aplikację portalu zarządzania danymi i zaloguj się za pomocą nazwy użytkownika i hasła.
  2. W lewym panelu interfejsu użytkownika portalu kliknij przycisk Dodaj projekt, aby utworzyć nowy projekt, lub kliknij przycisk istniejącego projektu na poniższej liście, aby otworzyć projekt.
  3. Kliknij przycisk Dodaj eksperyment, aby utworzyć nowy eksperyment w otwartym projekcie.
  4. Wypełnij opis w panelu Metadane nowego eksperymentu i kliknij przycisk Dodaj przepływ pracy, aby utworzyć nowy przepływ pracy w ramach eksperymentu (np. Analiza pojedynczych cząstek).
  5. Opcjonalnie kliknij przycisk Dodaj krok w środkowym panelu, aby utworzyć niestandardowy przepływ pracy lub dodać dodatkowe kroki do predefiniowanego przepływu pracy SPA (Rysunek 1 i Rysunek 2).
    UWAGA: Etapy mogą obejmować przygotowanie próbki, charakterystykę próbki za pomocą technik biochemicznych, witryfikację próbki, badania przesiewowe siatek krio-EM, sesje zbierania danych i analizę danych.
  6. Opcjonalnie wypełnij opisy w uwagach do każdego kroku, które mogą zawierać obrazy i zdjęcia.
  7. Utwórz krok zestawu danych w przepływie pracy i wybierz typ zestawu danych jako EPU.
    UWAGA: Umożliwi to oprogramowaniu analitycznemu automatyczne umieszczenie wszystkich danych/metadanych wyników we właściwym miejscu w portalu zarządzania danymi podczas pozyskiwania danych i automatyczne eksportowanie danych do preferowanego miejsca docelowego przy jednoczesnym zachowaniu pełnego zapisu wszystkich kroków i transferu danych.
  8. Wypełnij szablony dotyczące siatek Próbka i EM w kroku Biochemia i skojarz każdą siatkę z próbką (zwróć uwagę, że jedna próbka może być skojarzona z wieloma siatkami).
  9. Skojarz kombinacje siatek próbek w sekcji metadanych kroku Zestaw danych.

3. Ustawianie ustawień obrazowania i kalibracji przesunięcia obrazu w oprogramowaniu do analizy

  1. Ustawić parametry obrazowania dla poszczególnych trybów obrazowania, jak pokazano w Tabeli 1. Zagadnienia dotyczące wyboru konkretnych ustawień są szczegółowo opisane w sekcji Dyskusja.
  2. Ustaw równoległe oświetlenie dla wybranego powiększenia w ustawieniach akwizycji danych w oprogramowaniu analitycznym
    UWAGA: Istnieje tylko jedno ustawienie soczewki C2 do równoległego oświetlenia próbki przy danym rozmiarze SPOT (tj. wstępnie ustawione siły soczewki C1) w 2-kondensatorowych systemach TEM, takich jak TEM 200 kV używany w tym badaniu. Szybkość dawki elektronów na jednostkę powierzchni (e-/Å2/s) można zatem regulować tylko poprzez zmianę ustawień rozmiaru SPOT i ponowne dostosowanie siły C2 (intensywności wiązki) zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Przenieś się do obszaru z podtrzymującą folią węglową i cienkim lodem lub bez lodu.
    2. Wybierz aperturę obiektywu 100 μm lub 70 μm w menu Przysłona w interfejsie użytkownika TEM.
    3. Naciśnij przycisk Dyfrakcja na panelach sterowania, aby przełączyć się w tryb dyfrakcji.
    4. Włóż ekran fluorescencyjny i zmień tryb FluCam na Wysoka rozdzielczość.
    5. Przesuń centralną plamkę dyfrakcyjną do krawędzi przysłony. Jeśli krawędź przysłony nie jest widoczna, zwiększ długość aparatu (za pomocą pokrętła Powiększenie).
    6. Ostrożnie obróć pokrętło ostrości na panelu sterowania, aby ustawić ostrość na tylnej płaszczyźnie ogniskowej. Tylna płaszczyzna ogniskowej jest ostrościowa, gdy krawędź przysłony jest widocznie ostra.
    7. Zmniejsz czułość kamery FluCam do najniższego poziomu i przesuń centralną plamkę dyfrakcyjną do środka kamery FluCam.
    8. Zminimalizuj rozmiar centralnego punktu za pomocą pokrętła Intensywność na panelu sterowania.
    9. Cofnij przysłonę obiektywu w TEM UI i przełącz się z powrotem do trybu obrazowania.
    10. Kliknij przycisk Pobierz w oprogramowaniu analitycznym, aby zapisać ustawienia w ustawieniu wstępnym Akwizycji danych.
  3. Dostosuj szybkość dawki elektronów w ustawieniu wstępnym Akwizycji danych, która jest optymalna dla używanego detektora:
    1. Przejdź do pustego obszaru na siatce (np. kwadratu siatki z pękniętą folią węglową)
    2. Kliknij przycisk Zmierz dawkę w oprogramowaniu do analizy, aby zmierzyć szybkość dawki elektronów.
    3. Zmień rozmiar SPOT, aby osiągnąć optymalną dawkę dawki. W przypadku bezpośredniego detektora elektronów stosowanego w tym protokole, do akwizycji danych o wysokiej rozdzielczości zwykle stosuje się dawkę 4-5 e-/pixel/s. Zazwyczaj odpowiada to rozmiarowi SPOT 4-6.
    4. Sprawdź i wyreguluj równoległe oświetlenie przy nowym ustawieniu rozmiaru SPOT, jak opisano powyżej.
    5. Wybierz opcję EER w obszarze Frakcje, aby użyć trybu EER w bezpośrednim detektorze elektronów33.
    6. Kliknij przycisk Pobierz w oprogramowaniu analitycznym, aby zapisać ustawienia w ustawieniu Akwizycji danych.
    7. Przełącz się na ustawienie autofokusa i naciśnij przycisk Pobierz, aby zapisać ustawienia oświetlenia do ustawiania ostrości. Ręcznie zmień czas ekspozycji na 1 s i tryb binningu 2.
    8. Przełącz się na ustawienie Thon Rings i naciśnij przycisk Pobierz, aby zapisać ustawienia podświetlenia dla tego ustawienia wstępnego. Ręcznie zmień czas ekspozycji na 1-2 s i tryb binningu 2.
    9. Przełącz się na ustawienie Zero Loss i naciśnij przycisk Pobierz, aby zapisać ustawienia podświetlenia dla tego ustawienia wstępnego. Ręcznie zmień czas ekspozycji na 0,5 s i tryb binningu 4.
  4. Kalibrację przesunięć obrazu między ustawionymi ustawieniami optycznymi zgodnie z opisem w instrukcji oprogramowania analitycznego za pomocą zadania Kalibracja przesunięcia obrazu w zakładce Przygotowanie (rysunek uzupełniający 1).

Tabela 1: Typowe ustawienia obrazowania do akwizycji danych o wysokiej rozdzielczości za pomocą krio-TEM 200 kV wyposażonego w filtr energii i bezpośredni detektor elektronów. Ustawienia są wyświetlane dla każdego ustawienia optycznego używanego do konfiguracji automatycznego gromadzenia danych (sekcja 3 Protokołu). Ustawienia te są specyficzne dla mikroskopu TEM 200 kV i bezpośredniego detektora elektronów używanych w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

4. Mapowanie sieci i wybór najlepszych siatek cryo-EM do zbierania danych

  1. Wybierz zakładkę Atlas i kliknij przycisk Nowa sesja, aby otworzyć nową sesję.
  2. Uzupełnij szczegóły, takie jak nazwa sesji i miejsce przechowywania danych, a następnie kliknij przycisk Zastosuj, aby otworzyć nowe okno zadania Screening, które pokazuje listę wszystkich siatek w inwentarzu Autoloadera. Opcjonalnie edytuj nazwy siatek.
  3. Wybierz interesujące Cię siatki, zaznaczając pole wyboru obok odpowiedniego numeru siatki.
  4. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć w pełni zautomatyzowane zbieranie atlasów wszystkich wybranych siatek.
  5. Po zakończeniu zbierania kliknij na etykiety siatki, aby przejrzeć nabyte atlasy.
    UWAGA: Poszczególne kwadraty siatki są klasyfikowane według ich względnej grubości lodu, która jest oparta na ocenie względnej wartości skali szarości w każdym atlasie. Sklasyfikowane kwadraty siatki są przedstawione w różnych schematach kolorów, które można wykorzystać do kierowania wyborem obszarów akwizycji danych. Siatka wyprodukowana za pomocą Vitrobot Mk IV zazwyczaj wyświetla gradient grubości lodu na całej siatce, co może pomóc w określeniu idealnej grubości lodu do zbierania danych. Optymalna siatka powinna zawierać jak najmniej zanieczyszczeń lodem transferowym i wykazywać wystarczającą ilość nieprzerwanych i wolnych od pęknięć kwadratów siatki (Rysunek 3). Siatki z odpowiednim rozkładem lodu mogą być dalej badane w celu oceny rozkładu cząstek w lodzie przy dużym powiększeniu (tj. gęstości i orientacji poszczególnych cząstek).
  6. Kliknij przycisk Załaduj próbkę w górnym menu, aby wstawić wybraną siatkę z odpowiednim rozkładem lodu do kolumny mikroskopu.
  7. Wybierz kartę Atlas, kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiedni kwadrat siatki na obrazie atlasu i wybierz opcję Przenieś scenę tutaj z menu rozwijanego, aby przenieść scenę do kwadratu siatki.
  8. Wybierz kartę Funkcje automatyczne, aby ustawić kwadrat siatki na wysokość eucentryczną. Przełącz się na ustawienie wysokości eucentrycznej, kliknij automatyczną funkcję Auto-eucentryczność przez pochylenie belki na środku wybranego kwadratu siatki i kliknij przycisk Start.
  9. Przełącz się na ustawienie wstępne Kwadrat siatki i uzyskaj obraz. Przenieś scenę do z lodem i bez lub z minimalnym zanieczyszczeniem, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Przenieś scenę tutaj.
  10. Przełącz się na ustawienie wstępne Wysokość otworu/emucentru i uzyskaj obraz. Przenieś scenę do obszaru węglowego obok interesującego Cię otworu, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Przenieś scenę tutaj.
  11. Kliknij funkcję autofokusa i ustaw wartości żądanego rozmycia na 0 μm i Iteruj na -2 μm. Przełącz się na ustawienie Autofokus i kliknij przycisk Start.
  12. Ponownie wybierz kartę Przygotowanie i przełącz się na ustawienie wstępne Wysokość otworu/eucentryczności. Na poprzednio uzyskanym obrazie otworu wybierz obszar zainteresowania w otworze i przesuń stół montażowy do tej pozycji, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Przenieś etap tutaj.
  13. Przełącz się na ustawienie Akwizycji danych i ustaw czas oczekiwania po przesunięciu wiązki na 0,5 s, a czas oczekiwania po przesunięciu stolika na 20 s. Uzyskaj obraz za pomocą rozmycia w zakresie od -3 μm do -5 μm, aby zwiększyć kontrast o niskiej rozdzielczości i lepszą wizualizację poszczególnych cząstek.
  14. Opcjonalnie powtórz kroki 4.7-4.13, aby w razie potrzeby zobrazować cząstki w różnych otworach i różnych kwadratach siatki o różnej grubości lodu.
  15. Po zidentyfikowaniu i wybraniu najbardziej odpowiedniej siatki do zbierania danych w wysokiej rozdzielczości kliknij przycisk Załaduj próbkę w górnym menu, aby załadować wybraną siatkę do TEM.
    UWAGA: Alternatywnie, jeśli potrzeba więcej informacji i/lub pożądana jest automatyzacja tego procesu przesiewowego, należy wykonać sekcję 5.

5. Konfiguracja sesji zbierania danych w oprogramowaniu do analizy pojedynczych cząstek

UWAGA: Jeśli używasz siatek ze złotej folii, udoskonalenie obiektywnego astygmatyzmu i wyrównania komy (sekcja 6) może nie działać niezawodnie. Zaleca się załadowanie siatki z folii węglowej lub siatki krzyżowej EM i wykonanie tych ostatecznych wyrównań przed skonfigurowaniem zbierania danych.

  1. Wybierz kartę EPU i kliknij przycisk Tworzenie sesji, aby utworzyć nową sesję w lewym panelu. Wybierz opcję Nowa sesja, aby użyć bieżących ustawień optycznych lub opcję Nowy z preferencji, aby wczytać wcześniej wyeksportowaną konfigurację sesji.
  2. Wpisz nazwę sesji i miejsce przechowywania danych.
    UWAGA: Ta lokalizacja będzie używana do zapisywania zintegrowanych obrazów i metadanych z sesji zbierania danych w podfolderze z nazwą sesji. Chociaż dane te nie zajmą znacznej ilości miejsca w pamięci masowej, zaleca się zapisanie tych danych w pamięci masowej Falcon offload serwera DMP, ponieważ ramki kamer EER są zawsze przechowywane w katalogu głównym tego magazynu danych w katalogu o nazwie sesji.
  3. Wybierz Ręczny typ sesji, aby mieć kontrolę nad wyborem poszczególnych otworów w kwadratach siatki wybranych do zbierania danych w dalszej części protokołu.
  4. Wybierz tryb Szybsza akwizycja, aby korzystać z przesunięcia obrazu bez aberracji (AFIS) do zbierania danych w celu zmniejszenia ruchów stolika między poszczególnymi otworami, zmniejszenia ogólnego dryfu próbki i zwiększenia przepustowości zbierania danych bez pogorszenia jakości obrazu.
  5. Wybierz domyślny format mrc zapisywanych zintegrowanych obrazów.
  6. Określ używaną siatkę i jej typ. W protokole tym wykorzystano R-1.2/1.3 UltraAufoil dla apo-ferrytyny oraz siatkę R-2/1 Quantifoil dla proteasomu 20S. Wybierz Quantifoil w obszarze Nośnik próbki i R1.2/1.3 lub 2/1 w obszarze Typ Quantifoil.
  7. OPCJONALNIE: Kliknij przycisk Logowanie do Athena w prawym dolnym rogu, aby skorzystać z EPU Quality Monitor (EQM).
    1. Wprowadź dane logowania w wyskakującym oknie przeglądarki, aby aktywować sekcję ustawień w przeglądzie ustawień sesji.
    2. Kliknij przycisk Wybierz w sekcji ustawień i wyszukaj wcześniej utworzony zestaw danych (sekcja protokołu 2), aby skojarzyć go z bieżącym zbiorem danych. Włącz pole wyboru Włącz monitor jakości.
  8. Kliknij przycisk Zastosuj, aby utworzyć nową sesję.
    UWAGA: Ta akcja otworzy nowe zadania w menu w lewej kolumnie. W dowolnym momencie sesji, jeśli niektóre szczegóły są nieprawidłowe, możliwy jest powrót do zadania Konfiguracja sesji, zmiana/aktualizacja szczegółów i ponowne kliknięcie przycisku Zastosuj, aby zaktualizować sesję.
  9. Wybierz zadanie Zaznaczanie kwadratów w lewym panelu, aby wyświetlić zebrany atlas siatki.
  10. Opcjonalnie kliknij dwukrotnie dowolny kafelek atlasu, aby zobaczyć obraz o wyższej jakości i lepiej ocenić jakość lodu w kwadratach siatki. Kliknij dwukrotnie ponownie na obrazie, aby powrócić do atlasu siatki.
  11. Zidentyfikuj kwadraty siatki o następujących cechach (Rysunek 4): (i) Folia nośna w kwadracie siatki jest nienaruszona bez uszkodzeń, (ii) Cienki lód szklisty w otworach foliowych (otwory wydają się jaśniejsze niż folia węglowa nośna), (iii) Jak najmniejsze zanieczyszczenie lodem krystalicznym (czarne plamki) w kwadracie siatki, (iv) Minimalny gradient jasności w poprzek kwadratu siatki i w obrębie poszczególnych otworów foliowych.
    UWAGA: Po wybraniu ustawień wstępnych i dobrej siatce, krioTEM 200 kV użyty w tym badaniu może obrazować z szybkością ~200-300 filmów / h. Mając to na uwadze, wybierz tyle kwadratów, ile potrzeba, lub dodaj więcej później, wracając do zadania wyboru kwadratów zgodnie z ilością dostępnego czasu mikroskopu. Dla porównania, zebrano 3000 filmów w celu osiągnięcia rozdzielczości 1,6 A apo-ferrytyny.
  12. Wybierz kwadraty siatki do zbierania danych w pełnym atlasie lub na wysokiej jakości obrazach kafelków
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy interesujący Cię kwadrat siatki i wybierz opcję Wybierz z menu kontekstowego
    2. Możesz też przytrzymać Ctrl na klawiaturze i kliknąć lewym przyciskiem myszy żądane kwadraty siatki
    3. I odwrotnie, kliknij prawym przyciskiem myszy i odznacz lub przytrzymaj Shift i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby usunąć kwadraty
    UWAGA: Kolejne kroki mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że gromadzenie danych skutkuje rekonstrukcją w wysokiej rozdzielczości. Rozpocznij zaznaczanie otworów w kwadracie siatki od cienkiej warstwy lodu. Kliknij prawym przyciskiem myszy ten kwadrat siatki i wybierz opcję Wybierz otwory, aby rozpocząć zadanie Wybór otworu.
  13. Wybierz zadanie Wybór otworu w lewym panelu, aby wybrać otwory w wybranych kwadratach siatki.
  14. Kliknij przycisk Auto-Eucentryczny, aby automatycznie przejść do pierwszego wybranego kwadratu siatki, dostosować wysokość eucentryczną i uzyskać kwadratowy obraz siatki do wyszukiwania otworów w folii.
  15. Kliknij przycisk Znajdź, aby znaleźć otwory w folii na obrazie.
    UWAGA: Jeśli znajdowanie otworów nie zadziałało prawidłowo (tj. na obrazie znajdują się pominięte otwory lub otwory o nieprawidłowym rozmiarze), sprawdź, czy we wpisie Quantifoil Type zadania Session Setup (Typ Quantifoil) wprowadzono poprawne wartości i znajdź je ponownie. Jeśli otwory nadal nie zostaną znalezione poprawnie, kliknij przycisk Zmierz rozmiar otworu, aby ręcznie ustawić średnicę i odległość otworu i ponownie znaleźć otwory.
  16. Kliknij przycisk Usuń otwory w pobliżu przycisku paska siatki, aby odznaczyć otwory w pobliżu prętów siatki.
  17. Dostosuj limity na histogramie jasności filtra lodu (w prawym dolnym rogu okna oprogramowania), aby usunąć wszystkie otwory ze zbyt grubym lodem (za pomocą lewej linii granicznej), a także wszystkie puste otwory (za pomocą prawej linii granicznej), jak pokazano w Rysunek 4.
    UWAGA: W celu doprecyzowania można również wprowadzić określone wartości intensywności w odpowiednich polach tekstowych obok przycisku Zastosuj.
  18. Opcjonalnie użyj pędzla zaznaczania, aby ręcznie doprecyzować wybór otworów: Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij pędzel, aby usunąć zaznaczenie niechcianych otworów. Przytrzymaj Ctrl i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby ponownie zaznaczyć otwory foliowe. Przytrzymaj Shift i przewijaj kółkiem myszy, aby dostosować rozmiar pędzla.
  19. Wybierz otwór do ustawiania i testowania szablonu akwizycji danych, który będzie używany wielokrotnie podczas zbierania danych: Kliknij prawym przyciskiem myszy otwór w kwadratowym obrazie siatki i wybierz opcję Przenieś stół montażowy do lokalizacji.
  20. Wybierz zadanie Definicja szablonu w lewym panelu.
  21. Wybierz ustawienie wstępne Otwór/Eucentryczny i kliknij przycisk Pobierz, aby uzyskać obraz.
  22. Kliknij przycisk Znajdź i wyśrodkuj otwór, aby wyśrodkować otwór na obrazie.
  23. Ustaw wartości dla Opóźnienia po przesunięciu obrazu na 0,5 s (domyślnie) i Opóźnienia po przesunięciu sceny na 20 s.
    UWAGA: Ponieważ średnica wiązki równoległej jest ustalona na systemie krio-TEM 200 kV używanym w tym badaniu i zwykle odpowiada 1,6-1,7 μm przy aperturze 50 μm, można uzyskać tylko 1 obraz na otwór za pomocą siatek R-1,2/1,3 i 2 obrazy na otwór (w pobliżu przeciwległych krawędzi) przy użyciu siatek R-2/1 lub R-2/2. Należy pamiętać, że rozmiar ustawionych obszarów akwizycji na ekranie nie odpowiada rzeczywistej średnicy belki. Pasek skali obrazu może być wykorzystany do oszacowania odpowiedniej odległości umieszczenia.
  24. Wybierz przycisk Dodaj obszar akwizycji i kliknij obraz, aby wybrać miejsce w wyśrodkowanym otworze, z którego zostanie pobrana akwizycja obrazu w dużym powiększeniu.
  25. Wybierz przycisk Dodaj obszar autofokusa i kliknij na obraz, aby wybrać miejsce na folii nośnej obok wyśrodkowanego otworu, w którym zostanie wykonany autofokus obrazu.
    UWAGA: Rozmiar wiązki do ustawiania ostrości wynosi 1,6-1,7 μm i powinien być umieszczony w równej odległości od sąsiednich otworów na węglu.
  26. Kliknij zielony obszar akwizycji, aby ustawić sekwencję wartości rozmycia na liście rozmycia w górnej części okna oprogramowania. Wprowadź najwyższe rozmycie jako pierwsze, aby poprawić wizualizację cząstek w przebiegu testowym następnego zadania wykonywania szablonu.
  27. Kliknij niebieski obszar autofokusa, aby ustawić ustawienia specyficzne dla autofokusa w tym samym obszarze:
    1. Wybierz opcję Po wyśrodkowaniu, aby ustawić autofokus na początku każdego zestawu wskaźników AFIS.
    2. Wybierz opcję Obiektyw obiektywowy, aby uzyskać szybszy autofokus i zmniejszyć dryf sceny.
  28. Wybierz zadanie Wykonanie szablonu i kliknij przycisk Wykonaj.
    1. Obserwuj poszczególne kroki procedury akwizycji danych (wyśrodkowanie otworu, autofokus w wybranym obszarze i akwizycja obrazu w ustawionych obszarach) i sprawdź jakość obrazowanych cząstek na finalnym obrazie w dużym powiększeniu.
    2. Kliknij przycisk FFT w prawym dolnym rogu okna obrazu w dużym powiększeniu, aby sprawdzić obraz FFT i wizualnie ocenić, czy pierścienie Thon wykazują wiele oscylacji i rozciągają się do wysokiej rozdzielczości na obrazie FFT.
  29. Jeśli wykonanie szablonu zostanie zakończone pomyślnie, kliknij przycisk Przygotuj wszystkie kwadraty w zadaniu Wybór otworów, aby automatycznie ustawić zbieranie danych we wszystkich innych wybranych kwadratach siatki zgodnie z ustawieniami użytymi w tym pierwszym kwadracie siatki.

6. Końcowe wyrównanie mikroskopu przed rozpoczęciem zbierania danych

UWAGA: Aby osiągnąć najlepsze wyniki w wysokiej rozdzielczości, najbardziej czułe wyrównania powinny być wykonane dokładnie przy tych samych ustawieniach, co tryb Akwizycji Danych w oprogramowaniu do zbierania danych i tuż przed rozpoczęciem właściwej akwizycji danych. Wyrównania te powinny być wykonane w pozycji z cienkim węglem nośnym siatki, wystarczająco oddalonej od jakichkolwiek prętów siatki i wyrównanej na wysokości eucentrycznej.

  1. Wybierz zadanie Wykonanie szablonu, zdobądź nowy obraz i przenieś się wraz ze sceną do czystego obszaru na folii węglowej za pomocą kliknięcia prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję menu Przenieś etap tutaj.
  2. Wybierz kartę Auto Functions (Funkcje automatyczne) i ustaw żądane rozmycie na 0 μm i Iteruj na -2 μm. Przełącz się na ustawienie Autofokus i kliknij przycisk Start, aby uruchomić funkcję autofokusa.
  3. Odłóż ekran fluorescencyjny i otwórz menu Bezpośrednie wyrównanie w interfejsie użytkownika TEM.
  4. Aby uzyskać najlepsze wyniki, doświadczeni użytkownicy mogą zweryfikować wyrównanie punktów obrotu: Wybierz zadanie nP Beam Tilt pp X w menu Direct Alignments i maksymalnie nakładaj na siebie odbijające się belki za pomocą pokręteł wielofunkcyjnych na panelach sterowania. Powtórz te czynności dla zadania np Beam Tilt pp Y.
  5. Kliknij przycisk EF w menu kamery z ekranem fluorescencyjnym, aby wyświetlić zielone kółko, które wskazuje otwór wejściowy filtra energetycznego i wyśrodkuj wiązkę nad zielonym okręgiem.
    UWAGA: Przed kontynuowaniem upewnij się, że pompa Turbo jest zatrzymana; Wibracje z niego płynące zmniejszają liczbę widocznych pierścieni thon i często powodują awarię funkcji automatycznych.
  6. Wróć do okna oprogramowania i wybierz kartę Funkcje automatyczne na pasku menu.
  7. Wybierz zadanie Autostigmate, przełącz się na ustawienie wstępne Thon Ring i naciśnij przycisk Start. Obserwuj proces, aby upewnić się, że (i) wykonane obrazy są wykonane na węglu, (ii) pierścienie Thona są wyraźnie widoczne i (iii) obliczone dopasowanie CTF (przerywane linie) są dobrze umieszczone na minimach pierścienia Thona (rysunek uzupełniający 2).
  8. Wybierz zadanie Autocoma i naciśnij przycisk Start. Obserwuj proces, aby upewnić się, że wykonane zdjęcia są wykonane na węglu i że pierścienie Thon są wyraźnie widoczne, a obliczone pasowania (przerywane linie) są dobrze umieszczone na minimach pierścienia Thon. Powiększ każdy obraz pierścienia Thon-ring za pomocą kółka przewijania myszy (Rysunek uzupełniający 3).
    UWAGA: Jeśli mikroskop jest wyposażony w filtr energetyczny, strojenie filtra energii powinno być wykonane w ramach sekwencji wyrównywania, aby wyśrodkować szczelinę filtra do piku o zerowej stracie i skorygować wszelkie zniekształcenia w pryzmacie filtra energii (kroki 6.9-6.14). Te wyrównania powinny być wykonywane w pustym obszarze siatki, na przykład wewnątrz przerwanego kwadratu siatki.
  9. Otwórz interfejs użytkownika Sherpa i wybierz aplikację Filtr energii (rysunek uzupełniający 4).
  10. Ustaw aparat na EF-Falcon, bin 4x, czas naświetlania 0,2 s w oknie Ustawienia.
  11. Kliknij przycisk Środek w opcji Zero Loss, aby wyśrodkować szczelinę filtra energii o zerowej stracie.
  12. Kliknij przycisk Dostrajanie w opcji Izochromatyczność (rysunek uzupełniający 4).
  13. Kliknij na Dostrój powiększenie i Dostrój zniekształcenia w opcji Zniekształcenia geometryczne i chromatyczne (Rysunek uzupełniający 5, Rysunek uzupełniający 6)
  14. Jeśli wyniki nie mieszczą się we wskazanych specyfikacjach i są wyświetlane na czerwono w raporcie wyjściowym, ponownie wykonaj iteracje wyrównań z kroku 6.11.
    UWAGA: Chociaż bezpośrednie odniesienie do wzmocnienia detektora elektronów może być stabilne przez miesiące, nowe odniesienie wzmocnienia należy wykonać za pomocą Falcon 4 Reference Image Manager, jeśli obrazy pustych obszarów nie wykazują jednolitej intensywności, ale wykazują paski lub inne wyraźne cechy. Alternatywnie można obliczyć szybką transformację Fouriera (FFT) takiego obrazu i upewnić się, że nie są widoczne żadne linie.
  15. W oknie oprogramowania wybierz zakładkę Przygotowanie i przełącz się na ustawienie wstępne Akwizycja danych.
  16. Ustaw ustawienie dawki na 40 e-/Å2 i kliknij przycisk Zmierz szybkość dawki.
  17. Przejdź do zakładki EPU, wybierz zadanie Automated Acquisition i opcjonalnie zaznacz funkcję Auto Zero Loss; kliknij przycisk Start Run, aby rozpocząć w pełni automatyczne zbieranie danych.

7. Monitorowanie i optymalizacja jakości danych podczas zbierania danych

UWAGA: Podczas zbierania danych, zebrane dane mogą być monitorowane za pomocą EQM za pośrednictwem portalu zarządzania danymi. EQM wykonuje korekcję ruchu i wyznaczanie CTF na bieżąco, a wyniki wyświetla w portalu. Użytkownik jest wtedy w stanie ocenić jakość poszczególnych przejęć, zobaczyć wykresy różnych wskaźników jakości, odfiltrować niechciane przejęcia i wyeksportować dane do ich ostatecznej pamięci w locie lub jako zadanie wsadowe.

  1. Przejdź do zestawu danych, w którym oprogramowanie analityczne umieszcza dane, za pomocą przeglądarki internetowej.
  2. W przeglądzie zestawu danych karty akwizycji wyświetlają informacje o korekcji ruchu i wyznaczaniu CTF w formacie graficznym. Kliknij na poszczególne karty, aby uzyskać więcej informacji.
  3. Włącz panel DataViz, aby wyświetlić zagregowane wykresy z pełnego zestawu danych, które pokazują zakres ufności rozmycia, astygmatyzmu i CTF dla każdej akwizycji (rysunek uzupełniający 7).
  4. Użyj filtrów w górnej części panelu, aby wybrać tylko te dane, które mieszczą się w żądanym zakresie rozmycia, mają astygmatyzm bliski zeru, a CTF można określić do określonej rozdzielczości (docelowej). Po skonfigurowaniu filtrów naciśnij przycisk Zastosuj, aby wyświetlić tylko wybrane dane w oknie przeglądu zestawu danych.
  5. Gdy większość pozyskanych obrazów mieści się w ustawionych kryteriach, pozwól, aby sesja zbierania danych była kontynuowana do zakończenia. Jeśli tylko bardzo mała część uzyskanych obrazów spełnia ustawione kryteria, należy ponownie skonfigurować ustawienia oprogramowania analitycznego, przenieść się do innego obszaru próbki (naciśnij przycisk Następny kwadrat siatki w oprogramowaniu do analizy) lub zatrzymać zbieranie danych.

Wyniki

Portal zarządzania danymi zapewnia wydajne, ustrukturyzowane przechowywanie zgromadzonych obrazów, danych i metadanych z wielu eksperymentalnych schematów pracy w ramach jednej platformy programowej. Każdy zdefiniowany eksperyment w utworzonym projekcie składa się ze schematu pracy z określonymi przez użytkownika krokami służącymi do rejestracji informacji o próbkach, zebranych danych i powiązanych metadanych, bez żadnych ograniczeń, co zapewnia maksymalną elastyczność i użyteczność dla wszelkich możliwych eksperymentów i wszystkich przypadków użycia (Rycina 1, Rycina 2). Portal zarządzania danymi posiada również funkcjonalność notatek laboratoryjnych do ilustrowania kroków schematu pracy, w tym przetwarzania obrazów z wynikami pośrednimi; wszystkie te elementy mogą zostać powiązane z projektem, tworząc jak najpełniejszą dokumentację do analizy oraz sporządzania raportów i publikacji.

Schemat przepływu projektu; etapy: od biochemii do rękopisu; procesy cryo-EM; wyjściowe dane.
Rycina 1: Przykład możliwej organizacji danych i metadanych w platformie zarządzania danymi. Każdy projekt może składać się z wielu eksperymentów, takich jak cryo-EM lub spektrometria mas (patrz: krok protokołu 2.3). Każdy eksperyment może obejmować wiele zdefiniowanych przez użytkownika przepływów pracy (patrz: krok protokołu 2.5), z których każdy składa się z wielu konfigurowalnych kroków (patrz: krok protokołu 2.7). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat przepływu pracy dla biochemii i obrazowania, obejmujący etapy przesiewania i przetwarzania.
Rysunek 2: Widok otwartego przepływu pracy projektu w platformie do zarządzania danymi. Na rysunku przedstawiono powiązane metadane i notatki do otwartego kroku w przepływie pracy. Lewy pasek z ikonami zapewnia szybki dostęp do różnych opcji i menu platformy do zarządzania danymi. Lewy panel zawiera listę zapisanych przepływów pracy (pokazano tylko jeden zapisany przepływ pracy „Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7”) oraz niebieski przycisk służący do dodawania nowego przepływu pracy. Panel centralny pokazuje poszczególne kroki w otwartym przepływie pracy, co zaprezentowano tutaj na przykładzie przepływu pracy SPA. Niebieski przycisk w prawym górnym rogu umożliwia dodanie dodatkowego kroku do otwartego przepływu pracy. Prawy panel zawiera miejsce na zarejestrowane metadane lub wprowadzone przez użytkownika notatki do przepływu pracy, które mogą zawierać tekst, tabele i obrazy. Dostępne są różne opcje formatowania tekstu. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Siatki do krio-EM przygotowane za pomocą tradycyjnych urządzeń do mrożenia przez zanurzenie, takich jak Vitrobot, zazwyczaj wykazują gradient grubości lodu na powierzchni siatki. Niektóre siatki mogą zostać również uszkodzone (wygięte) w wyniku ręcznej manipulacji i/lub wpięcia do uchwytu autogrid. Rysunek 3 przedstawia przykłady różnych siatek widocznych w przeglądzie Atlas. Siatki z grubym lodem lub uszkodzeniami powinny zostać wykluczone z dalszych badań.

Obrazy mikroskopowe przedstawiające wzory dyfrakcyjne; formowanie siatki; metoda analizy optycznej; skala 100μm.
Rysunek 3: Galeria różnych siatek widocznych w widoku ogólnym Atlasa. (A) Zła siatka z grubym lodem, (B) wygięta siatka ze złym lodem i zanieczyszczeniami lodowymi, (C) akceptowalna siatka z dobrym gradientem lodu, (D) typowa siatka z dobrym cienkim lodem i niewielkim gradientem lodu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wybór kwadratów siatki bez uszkodzeń i o optymalnej grubości lodu jest kluczowy dla pozyskania zbiorów danych o wysokiej rozdzielczości. Grubość lodu może się różnić nawet w obrębie poszczególnych kwadratów siatki, dlatego ważne jest wybieranie tylko tych otworów, które mają optymalnie cienki lód w każdym wybranym kwadracie. Rycina 4 przedstawia odpowiedni kwadrat siatki z nienaruszoną folią i cienkim lodem w centrum. Pokazany kwadrat siatki jest dobry do ustawienia filtra dla automatycznego wyboru otworów z cienkim lodem we wszystkich wybranych kwadratach siatki, ponieważ zawiera on różne grubości lodu, a także puste otwory bez lodu, co jest niezwykle przydatne przy ustalaniu odpowiedniego zakresu intensywności w filtrze lodu w zadaniu wyboru otworów (Hole Selection).

Wykres jakości lodu; analiza siatki do mikroskopii elektronowej w celu charakterystyki materiału.
Rycina 4: Przykład pola siatki z gradientem grubości lodu – od pustych pól w centrum do grubego lodu w pobliżu prętów siatki. Filtr jakości lodu może służyć do wyboru zakresu intensywności wewnątrz otworów o idealnej grubości lodu, które są odpowiednio zaznaczone w polu siatki (otwory z zieloną nakładką). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki referencyjne uzyskane przy zastosowaniu opisanego protokołu osiągnięto przy użyciu próbki apoferrytyny mysiej (apoF) z grupy Kikkawy11. ApoF jest białkiem o wysokiej zawartości helis α, które tworzy bardzo stabilną klatkę ośmiościenną. Wysoka stabilność i symetria sprawiają, że apoF jest optymalną próbką do obrazowania i przetwarzania obrazów krio-EM o wysokiej rozdzielczości. W związku z tym apoF stało się standardową próbką do oceny wydajności instrumentów krio-EM11,12,13. Zamrożoną alikwot zawierającą 15 mg/mL oczyszczonej próbki apoF rozmrożono na lodzie i sklarowano poprzez wirowanie przy 10,000 x g przez 10 min. Nadsadzeczkę rozcieńczono do 5 mg/mL w 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl. 3 µL rozcieńczonej próbki naniesiono na poddane wyładowaniu żarowemu złote siatki R-1.2/1.3, 300 mesh przez 30 s. Następnie siatki osuszano przez 5 s przed gwałtownym zamrożeniem w etanie ciekłym chłodzonym ciekłym azotem. Gwałtowne zamrażanie wykonano przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu witryfikacji przy 100% wilgotności i 4 °C. Wszystkie siatki umieszczono w uchwytach autogrids i włożono do krio-TEM 200 kV. Zebrano około 3000 filmów przy przepustowości 300 filmów/h. Dane przetworzono zgodnie z opisanymi metodami11 z następującymi modyfikacjami: i) zamiast Relion 3.1 użyto wersji Relion 4-beta, ii) automatyczny wybór cząstek przeprowadzono z wykorzystaniem średnich klas 2D z poprzednich rekonstrukcji apoF jako referencji oraz iii) wstępny model 3D wygenerowano z poprzedniej rekonstrukcji apoF po zastosowaniu filtru dolnoprzepustowego do rozdzielczości 15-Å. Dla tego zestawu danych nie przeprowadzono grupowania optyki, ponieważ zastosowana procedura AFIS34 udowodniła swoją skuteczność i niezawodność w minimalizowaniu przesunięć fazowych wywołanych nachyleniem wiązki, które nie ograniczają jakości danych niezbędnych do rekonstrukcji map 3D w raportowanych rozdzielczościach. Rafinacja 3D po polerowaniu bayesowskim i rafinacji CTF doprowadziła do uzyskania mapy o rozdzielczości 1.68 Å. Rozdzielczość tę dodatkowo poprawiono za pomocą korekcji sfery Ewalda, co zaowocowało mapą o rozdzielczości 1.63 Å. Przegląd parametrów zbierania i przetwarzania danych przedstawiono w Tabeli 2, a końcową zrekonstruowaną mapę gęstości pokazano na Rysunku 5, natomiast krzywą korelacji powłok Fouriera (FSC) przedstawiono na Rysunku dodatkowym 8.

Tabela 2: Parametry gromadzenia danych i przetwarzania obrazów wykorzystane do rekonstrukcji 3D apoferrytyny. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Struktura Cryo-EM i schemat rozdzielczości atomowej białka, przedstawiający konfigurację molekularną.
Rysunek 5: Rekonstrukcja Cryo-EM apo-ferrytyny. (Panel lewy) Rendering 3D zrekonstruowanej mapy Cryo-EM apoF przy rozdzielczości 1,6 Å. (Panel prawy) Szczegółowy widok zrekonstruowanej mapy na poziomie poszczególnych łańcuchów bocznych aminokwasów. Gęstość łańcuchów bocznych aminokwasów jest dobrze rozdzielona, a model atomowy może zostać jednoznacznie zbudowany w obrębie tej mapy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wpływ i korzyści z zastosowania filtra energii w rekonstrukcjach SPA oceniono na przykładzie prokariotycznego proteasomu 20S wyizolowanego z T. acidophilum. Prokariotyczny proteasom 20S jest również stosowany jako standardowa próbka do krio-EM, ponieważ reprezentuje on stabilny rdzeń katalityczny kompleksu proteasomu o symetrii D7. Siatki przygotowano, nakładając 4,5 µL oczyszczonej próbki proteasomu 20S z T. acidophilum na miedzianą siatkę R 2/1 o gęstości 200 mesh, poddaną wyładowaniom żarowym. Próbki witryfikowano w mieszaninie ciekłego etanu i propanu, korzystając z w pełni zautomatyzowanego systemu witryfikacji ustawionego na 4 °C i 100% wilgotności, przy sile blotowania wynoszącej 20 i czasie blotowania 4,5 s.

Zejście trzech różnych zestawów danych z tej samej siatki do cryo-EM, z podobnych pól siatki, przy użyciu różnych szerokości szczeliny filtra energii w następującej kolejności: i) szczelina całkowicie otwarta (brak wstawionej szczeliny), ii) szczelina 20 eV oraz iii) szczelina 10 eV. Pola siatki wybrano za pomocą filtra jakości lodu w oprogramowaniu analitycznym. Wszystkie pozostałe parametry gromadzenia i przetwarzania danych pozostawiono bez zmian. Zbiory danych gromadzono przez 15 h, uzyskując łącznie 4000 filmów, a następnie przetworzono zgodnie z opisanymi metodami11 przy użyciu programu Relion 3.1, z modyfikacją polegającą na zastosowaniu algorytmu wyboru cząstek opartego na Laplacianie Gaussa w celu wygenerowania wstępnych średnich klas 2D do wyboru cząstek w oparciu o referencje z pełnych zestawów danych. Do końcowej iteracji i rekonstrukcji 3D każdego zestawu danych wybrano i wykorzystano tę samą liczbę (102 200) losowo wybranych cząstek. Zmienne przetwarzania danych opisano w poniższej tabeli (Tabela 3), aby uzyskać końcową zrekonstruowaną mapę gęstości EM pokazaną na Rysunku 6 z krzywą FSC przedstawioną na Rysunku uzupełniającym 9. W przypadku tych zestawów danych nie przeprowadzono również grupowania optyki ani korekty sfery Ewalda.

Tabela 3: Parametry zbierania danych i przetwarzania obrazów wykorzystane do rekonstrukcji 3D proteasomu 20S T. acidophilum. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Podsumowanie osiągniętej rozdzielczości i czynnika B dla rekonstrukcji cryo-EM proteasomu 20S T. acidophilum z wykorzystaniem zestawów danych o różnej szerokości szczeliny energetycznej. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

Analiza struktury Cryo-EM; obrazy z mikroskopii elektronowej pokazujące dane niefiltrowane oraz dane z szparą 10 eV, model molekularny.
Rysunek 6: Wpływ filtrowania energii na obrazy cryo-EM. (A) Obrazy cryo-EM przy różnych wartościach defocusu, zebrane z wykorzystaniem lub bez wykorzystania szpary 10 eV. (B) Przegląd mapy cryo-EM proteasomu 20S z podzielonymi podjednostkami. (C) Powiększony widok mapy proteasomu 20S z dopasowanym modelem atomowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Zadanie kalibracji przesunięć obrazu (żółta elipsa) w celu wyrównania przesunięć obrazu między różnymi ustawieniami optycznymi (czerwone elipsy) w oprogramowaniu analitycznym, z wykorzystaniem kryształu lodu heksagonalnego, który jest widoczny w pełnym zakresie powiększeń od 100x do 165 000x. (Góra) Kalibracja między ustawieniami Data Acquisition a Hole/Eucentric Height, (środek) kalibracja między ustawieniami Hole/Eucentric Height a Grid Square, (dół) kalibracja między ustawieniami Grid Square a Atlas. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Funkcja autostygmatyzacji w oprogramowaniu analitycznym (żółta elipsa). (Obraz po lewej) Obraz pozyskany. (Obraz po prawej) Transformata Fouriera pozyskanego obrazu pokazująca koncentryczne pierścienie Thona oraz dopasowanie CTF przedstawione w wiązkach radialnych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Interfejs użytkownika funkcji Autocoma w oprogramowaniu analitycznym (żółta elipsa) służący do korekcji komy. Panel obrazów przedstawia obrazy transformaty Fouriera pozyskane przy różnych kątach nachylenia wiązki oraz dopasowania CTF, które są wykorzystywane do obliczenia komy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: Interfejs użytkownika strojenia filtra energii. Przykład poprawnego raportu strojenia izochromatyczności filtra energii, w którym wszystkie parametry (wyświetlone zielonym tekstem) mieszczą się w specyfikacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Interfejs użytkownika strojenia filtra energetycznego. Przykład poprawnego raportu strojenia zniekształceń powiększenia filtra energetycznego, w którym wszystkie parametry (wyświetlone zielonym tekstem) mieszczą się w granicach specyfikacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 6: Interfejs użytkownika strojenia filtra energii. Przykład prawidłowego strojenia aberracji chromatycznych filtra energii, w którym wszystkie parametry (wyświetlone na zielono) mieszczą się w specyfikacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 7: Panel DataViz monitora jakości EPU z przeglądem jakości danych w zebranym zestawie danych cryo-EM. Wykresy z zagregowanymi danymi ze wszystkich zebranych obrazów/filmów przedstawiają wartości (wykresy punktowe) i rozkład (wykresy słupkowe) wybranych krytycznych wskaźników jakości, takich jak pewność dopasowania CTF (niebieski), defocus (pomarańczowy) i astygmatyzm (zielony). Podzbiór zebranych obrazów/filmów można wybrać, ustawiając filtry parametrów w górnej części panelu DataViz. Po zastosowaniu filtrów wybrane obrazy/filmy mogą zostać wyeksportowane do dalszego przetwarzania w innym pakiecie do przetwarzania obrazów, takim jak Relion lub CryoSpark. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 8: Krzywa FSC końcowej rekonstrukcji apoF do rozdzielczości 1,6 Å, wyznaczona za pomocą programu Relion 4-beta.Niebieska krzywa przedstawia FSC zamaskowanych map 3D z dwóch niezależnie dopasowanych rekonstrukcji 3D z dwóch wzajemnie wykluczających się połow zbiory danych (half-datasets). Zgodnie ze złotym standardem FSC na poziomie 0,143, rozdzielczość końcowej mapy 3D zrekonstruowanej z pełnego zbioru danych wynosi 1,6 Å. Pomarańczowa krzywa pokazuje FSC zamaskowanych rekonstrukcji 3D z randomizowanymi fazami. Gwałtowny spadek krzywej FSC wskazuje, że zastosowana maska nie wpłynęła na obserwowaną wartość FSC oryginalnych zrekonstruowanych map (niebieska krzywa) powyżej rozdzielczości ~2 Å. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 9: Krzywe FSC dla końcowej rekonstrukcji proteasomu 20S T. acidophilum przy zastosowaniu różnych szerokości szczelin filtra energetycznego, wygenerowane przez program Relion 3.1.Niebieskie krzywe przedstawiają FSC zamaskowanych map 3D z dwóch niezależnie doprecyzowanych rekonstrukcji z dwóch połowic każdego zestawu danych. Standard złota (gold-standard) FSC przy 0.143 wskazuje osiągnięte rozdzielczości końcowych map 3D zrekonstruowanych z poszczególnych pełnych zestawów danych (odpowiednio rozdzielczość 2.3 Å, 2.2 Å i 2.1 Å). Czerwone krzywe przedstawiają FSC zamaskowanych map z randomizowanymi fazami. Gwałtowny spadek czerwonych krzywych FSC wskazuje, że zastosowana maska nie wpływała na FSC oryginalnych zrekonstruowanych map powyżej rozdzielczości ~3 Å. Zielone krzywe przedstawiają FSC niezamaskowanych map 3D, które są pod wpływem szumu w całej zrekonstruowanej objętości 3D, a zatem spadają szybciej niż FSC zamaskowanych map 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dostępność danych: Mapy gęstości cryo-EM zostały zdeponowane w EM Data Bank pod numerami dostępowymi: apoferrytyna: EMD 14173, EMPIAR-10973; proteasom 20S: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Dyskusja

Opisany protokół zakłada, że optyka zastosowanego mikroskopu TEM jest w stanie dobrze wyrównanym. W przypadku TEM 200 kV używanego w niniejszym protokole, takie wyrównanie kolumn jest wykonywane, weryfikowane i zapisywane przez doświadczonego inżyniera serwisu po zainstalowaniu mikroskopu lub jakiejkolwiek znaczącej interwencji serwisowej. Te ustawienia wyrównania można przywołać w dowolnym momencie w interfejsie użytkownika mikroskopu. Użytkownicy mogą korzystać z procedur bezpośredniego wyrównywania w interfejsie mikroskopu, aby ponownie dostosować parametry krytyczne. Niektóre ustawienia, takie jak nachylenie i przesunięcie pistoletu, są stabilne i nie muszą być codziennie regulowane przez użytkowników. Zaleca się sprawdzanie i ponowne ustawienie (jeśli jest to wymagane) nachylenia i przesunięcia pistoletu przez kierownika mikroskopu dwa razy w roku. Z drugiej strony, niektóre wyrównania są krytyczne i muszą być wyrównane przed każdym zbieraniem danych, jak opisano w powyższym protokole (takie jak obiektywny astygmatyzm i wyrównanie bez śpiączki). Jeśli funkcja Autocoma w oprogramowaniu analitycznym nie jest zbieżna, należy zweryfikować i wyregulować wyrównanie punktów obrotu pochylenia belki i/lub środka obrotu, a także potwierdzić prawidłowe wyśrodkowanie otworu C2. Następnie należy uruchomić funkcję autostygmatyzacji, ponieważ obiektywne stygmaty są również używane do korekcji śpiączki. Te dopasowania powinny być iterowane, dopóki zarówno Autostigmate, jak i Autocomafunctions nie powiodą się w pierwszej iteracji. W razie potrzeby można wybrać inny obszar (np. podporę folii węglowej bez lodu), dostosować rozmycie obrazu lub wydłużyć czas akwizycji obrazu, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu w pozyskanych obrazach oraz widoczność wielu pierścieni Thon w transformacji Fouriera uzyskanych obrazów.

Nowoczesne mikroskopy kriogeniczne generują ogromne ilości danych, które często przekraczają 1 TB na zestaw danych, aby uzyskać rekonstrukcje 3D o wysokiej rozdzielczości, szczególnie w przypadku białek o niskiej symetrii. Dane i wyniki Cryo-EM są również zazwyczaj uzupełniane danymi i wynikami z metod ortogonalnych, aby w pełni zrozumieć zależności struktura-funkcja w każdym projekcie naukowym. Organizacja zebranych danych, ich transfer do potoku przetwarzania obrazu i udostępnianie wynikowej rekonstrukcji cryo-EM między współpracownikami nakłada dodatkowe wymagania na nowych użytkowników metodologii cryo-EM w celu skonfigurowania lokalnej infrastruktury IT. Oprogramowanie do zarządzania danymi, takie jak Athena, ułatwia scentralizowane przechowywanie danych uzyskanych przez dowolne podłączone urządzenie lub oprogramowanie obsługiwane przez zarejestrowanego użytkownika. Przechowywane dane i metadane są dostępne za pomocą prostego interfejsu przeglądarki internetowej dla wielu użytkowników, którzy mogą pełnić różne role w projekcie z różnymi prawami dostępu (jako właściciel, współpracownik lub osoba przeglądająca) na podstawie swoich danych logowania i definicji udostępniania danych w konfiguracji eksperymentu. Ta digitalizacja eksperymentalnych przepływów pracy zapewnia możliwość udostępniania danych i metadanych między współpracownikami bez zbędnego powielania oraz zwiększa produktywność i identyfikowalność używanych przepływów pracy. Implementacja ogólnej i konfigurowalnej struktury projektów, eksperymentów i przepływów pracy w oprogramowaniu do zarządzania danymi jest uniwersalna i pozwala na dostosowanie i integrację eksperymentów ortogonalnych przy użyciu uzupełniających się metod w jedną bazę danych projektu.

Wybór obszarów do gromadzenia danych na siatce cryo-EM ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego pozyskiwania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości. Siatki Cryo-EM produkowane za pomocą tradycyjnych urządzeń do zamrażania wgłębnego, takich jak Vitrobot (w pełni zautomatyzowany system witryfikacji), zazwyczaj wyświetlają gradient grubości lodu na powierzchni siatki (ilustracja 4). Może to być korzystne, ponieważ siatka zawiera obszary o różnej grubości lodu; Jednak obszary o idealnej grubości lodu do zbierania danych muszą być zidentyfikowane zgodnie z opisem w powyższym protokole. Optymalna siatka kriogeniczna powinna zawierać jak najmniej zanieczyszczeń lodem transferowym i zawierać wystarczającą ilość kwadratów siatki z nienaruszoną, dziurawą folią nośną. Nie zaleca się zbierania danych na kwadratach siatki, które mają pęknięcia lub uszkodzone obszary, ponieważ zebrane obrazy będą miały wpływ znacznie silniejszy ogólny dryf po oświetleniu wiązką elektronów w porównaniu z kwadratami siatki z nienaruszoną folią nośną. Nadmiar krystalicznego lodu może zasłaniać większość otworów foliowych i/lub zakłócać autofokus, dlatego należy również unikać takich kwadratów siatki. Kwadraty siatki z cienkim lodem zwykle wykazują duże szkliste obszary i wiele jasnych otworów foliowych, które są widoczne na zdjęciu wykonanym przy użyciu ustawień wstępnych Atlasu. Występowanie grubszego lodu w pobliżu prętów siatki jest spodziewane i niekrytyczne, ponieważ otwory foliowe w tych obszarach kwadratu siatki są wykluczone podczas procedury wyboru otworów. Obecność kilku pustych otworów w kwadracie siatki może oznaczać, że szklisty lód w otaczających otworach jest niezwykle cienki i może zawierać uszkodzone cząstki lub nie zawierać żadnych cząstek. Ogólnie rzecz biorąc, rozsądnie jest wybrać kwadraty siatki o różnych grubościach lodu w różnych regionach siatki do wstępnego badania przesiewowego i oceny, aby zrozumieć, które obszary mają najlepsze warunki do zbierania danych w wysokiej rozdzielczości i wykazują idealną gęstość cząstek i rozkład orientacji. W przypadku próbek proteasomów apoF i 20S wykorzystanych w tym badaniu, obszary z najcieńszym obserwowalnym lodem zawierają najlepsze warunki do obrazowania tych próbek w wysokiej rozdzielczości.

W przypadku automatycznego wybierania otworów we wszystkich wybranych kwadratach siatki za pomocą oprogramowania do zbierania danych, zaleca się wykonanie zadania Wykonania szablonu na reprezentatywnym otworze w każdym kwadracie siatki, aby sprawdzić i upewnić się, że do zbierania danych nie wybrano ani zbyt grubych, ani zbyt cienkich, ani nieoczekiwanie nieszklistych kwadratów. Podczas akwizycji danych za pomocą EQM można monitorować kluczowe wskaźniki jakości zebranych obrazów, takie jak dryf obrazu i dopasowanie CTF. Gromadzenie danych można następnie zoptymalizować, pomijając obszary, w których powstają obrazy o niskiej jakości. Jednak obrazy z dopasowaniami CTF o wysokiej rozdzielczości mogą nadal zawierać obrazy z cząstkami w kilku preferowanych orientacjach lub cząstkami zdenaturowanymi w zbyt cienkiej warstwie lodu. Wybieranie cząstek w czasie rzeczywistym i klasyfikacja 2D na podstawie zebranych obrazów dostarczyłyby dodatkowych informacji na temat jakości danych strukturalnych w zobrazowanych cząstkach i ujawniłyby zarówno preferowane orientacje nienaruszonych cząstek w lodzie, jak i niespójną strukturę (częściowo) zdenaturowanych cząstek. Obliczanie średnich klas może zatem pomóc w dalszym doprecyzowaniu odpowiednich regionów do gromadzenia danych, jak to zostało już zaimplementowane i pokazane w innych pakietach oprogramowania23,28.

Wybór ustawień obrazowania do akwizycji danych, takich jak powiększenie, szybkość dawki elektronów i zakres rozmycia, zależy od kilku kryteriów, takich jak rozdzielczość docelowa, wielkość białka, stężenie próbki, pożądana przepustowość mikroskopu itp. Dla kamery z bezpośrednim detektorem elektronów używanej w tych eksperymentach dozór elektronów dozowano dawkę elektronów w zakresie 4-5 e-/pix/s, dobierając odpowiedni rozmiar i intensywność SPOT, aby utrzymać równoległe oświetlenie. Jak pokazano w Tabeli 1, w ustawieniu wstępnym Otwór/Wysokość eucentryczna można użyć innego rozmiaru SPOT, aby zapewnić wystarczający stosunek sygnału do szumu na obrazie do wyśrodkowania otworów podczas zbierania danych. Powiększenie powinno być tak dobrane, aby rozmiar piksela był co najmniej 2-3 razy mniejszy niż rozdzielczość docelowa dla rekonstrukcji cryo-EM. Jednak im większe powiększenie (tj. mniejszy rozmiar piksela), tym mniejsze pole widzenia jest rejestrowane na obrazach, a na obrazie jest mniej cząstek, co ostatecznie prowadzi do dłuższego czasu zbierania danych w celu zebrania obrazów z wystarczającą ilością cząstek, aby zrekonstruować mapy 3D do wysokiej rozdzielczości. W przypadku próbki apoF użyliśmy rozmiaru piksela 0,43 A, ponieważ mieliśmy wystarczające stężenie próbki dla dużej gęstości cząstek na obrazach i dążyliśmy do rozdzielczości rekonstrukcji poniżej 2 A. W przypadku próbki proteasomu 20S użyliśmy rozmiaru piksela 0,68 A, aby pokryć większe pole widzenia na pozyskanych obrazach. Typowo dla mikroskopów TEM 200 kV obrazy krio-EM są uzyskiwane w zakresie rozogniskowania od 0,8 do 2,0 μm. Jednak dzięki poprawionemu kontrastowi i stosunkowi sygnału do szumu za pomocą filtra energii, akwizycja danych może być wykonywana znacznie bliżej ostrości, aby lepiej zachować informacje o wysokiej rozdzielczości w uzyskanych obrazach ze względu na mniejsze aberracje i odpowiednio zmniejszone zanikanie funkcji obwiedni CTF. Nie używamy również przysłony obiektywu, ponieważ przysłona może wprowadzać dodatkowe aberracje obrazu, podczas gdy kontrast obrazu jest już wystarczająco zwiększony dzięki zastosowaniu filtra energii. W przypadku próbek proteasomu apoF i 20S zastosowaliśmy ustawienia rozmycia 0,5 μm, 0,7 μm i 0,9 μm. W przypadku mniejszych białek (<200 kDa) zastosowaliśmy ustawienia rozmycia -0,5 μm, -0,7 μm i -0,9 μm, aby poprawić kontrast cząstek i ułatwić łatwiejsze wybieranie cząstek i początkowe zgrubne wyrównanie na etapie udoskonalania 3D rekonstrukcji 3D, co doprowadziło do map 3D o rozdzielczości ~2,5 A (niepublikowane wyniki).

Wykazaliśmy już, że obrazowanie z filtrem energetycznym poprawia stosunek sygnału do szumu (SNR) w obrazach krio-EM zebranych za pomocą wysokiej klasy mikroskopów TEM 300 kV11. W rzeczywistości, gdy elektrony przechodzą przez próbkę, zachodzą dwa główne typy oddziaływań: i) Elastycznie rozproszone elektrony utrzymują swoją energię i przyczyniają się do tworzenia obrazu poprzez interferencję z nierozproszoną wiązką padającą za pośrednictwem mechanizmu kontrastu fazowego ii) nieelastycznie rozproszone elektrony tracą część energii w próbce i przyczyniają się głównie do szumu na obrazach. Dlatego SNR można znacznie poprawić, filtrując nieelastycznie rozproszone elektrony, które mają niższą energię niż wiązka padająca i elektrony elastycznie rozproszone, przy użyciu wąskiej szczeliny energetycznej. Jednak bardzo ważne jest, aby użyć wystarczająco stabilnego filtra energii, takiego jak Selectris lub Selectris-X, aby móc używać bardzo wąskich (10 eV lub mniej) szczelin przez długie (12+ godzin) automatyczne pozyskiwanie danych z zestawów danych krioEM o wysokiej rozdzielczości.

Obrazy krio-EM uzyskane za pomocą mikroskopów TEM 200 kV w tych samych warunkach, co w przypadku mikroskopów TEM 300 kV, wykazują mniejszy SNR przy wysokiej rozdzielczości (szczególnie <4 A) ze względu na szybszy zanik funkcji obwiedni CTF. W związku z tym do osiągnięcia określonej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV wymagana jest większa liczba cząstek (a tym samym większa liczba zebranych obrazów). Ponadto głębia ostrości (10-25 nm w zakresie rozdzielczości 2-3 A) jest również o około 20% mniejsza na obrazach 200 kV35, co oznacza, że mniej cząstek w warstwie lodu (zwykle o grubości 20-50 nm) będzie w pełni ostrych i konstruktywnie przyczyni się do wszystkich cech o wysokiej rozdzielczości obliczonej rekonstrukcji 3D, chyba że wartości rozmycia zostaną dopracowane dla każdej cząstki niezależnie w późniejszych etapach procedury rekonstrukcji 3D. W przypadku większych cząstek (takich jak wiriony dwudziestościenne lub inne zespoły makromolekularne) wielkość cząstek może przekraczać głębię ostrości w wysokich rozdzielczościach i wprowadzać błędy fazowe wynikające z płaskiego przybliżenia sfery Ewalda w standardowych algorytmach rekonstrukcji3D 36. Błędy te można usunąć za pomocą zaawansowanych algorytmów, które są już zaimplementowane w popularnych pakietach przetwarzania obrazów cryo-EM 37,28,39. Ponieważ sfera Ewalda ma większą krzywiznę w danych 200 kV niż w danych 300 kV, poprawka sfery Ewalda jest potrzebna przy stosunkowo niższych rozdzielczościach i/lub dla stosunkowo mniejszych zespołów makromolekularnych przy użyciu TEM 200 kV. Z drugiej strony, obrazy 200 kV wykazują wyższy kontrast cząstek w cienkim lodzie (20-50 nm), który jest znacznie cieńszy niż średnia droga swobodna elektronów 200-300 keV (220-280 nm). Wyższy kontrast pomaga poprawić prawidłowe globalne wyrównanie poszczególnych cząstek, szczególnie w przypadku słabo rozproszonych mniejszych białek, których struktura nie jest jeszcze znana, a model referencyjny 3D nie jest jeszcze dobrze ugruntowany.

Tutaj wykazaliśmy na przykładzie proteasomu 20S, że kontrast i jakość obrazu można podobnie poprawić za pomocą filtra energetycznego przy użyciu mikroskopu TEM 200 kV. Wykorzystując tę samą liczbę cząstek, dane zebrane za pomocą szczeliny 20 eV zostały zrekonstruowane do rozdzielczości 2,26 A w porównaniu z danymi zebranymi za pomocą w pełni otwartej szczeliny energetycznej, która została zrekonstruowana tylko do rozdzielczości 2,34 A. Najlepszą rekonstrukcję uzyskano na podstawie danych zebranych za pomocą szczeliny 10 eV, która została zrekonstruowana do rozdzielczości 2,14 A. Wyniki te są zgodne z teoretycznym przewidywaniem, że filtrowanie nieelastycznie rozproszonych elektronów zwiększa SNR w zebranych obrazach i ułatwia wyższą rozdzielczość w rekonstrukcjach krio-EM z podanej liczby cząstek, jak podsumowano w tabeli 4. Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone przez współczynniki B obliczone na podstawie tych zestawów danych, które wskazują na wyższą jakość obrazów w zestawach danych filtrowanych energetycznie.

Możemy zatem stwierdzić, że podczas gdy mikroskopy TEM 300 kV zapewniają najwyższą przepustowość i najwyższą możliwą rozdzielczość w rekonstrukcjach krio-EM, mikroskopy TEM 200 kV zapewniają również wysokiej jakości zestawy danych do rekonstrukcji krio-EM o wysokiej rozdzielczości. Pokazaliśmy tutaj, że jakość pozyskiwanych obrazów, a tym samym ogólny czas do ustrukturyzowania, można jeszcze bardziej poprawić, stosując TEM 200 kV wyposażony w filtr energetyczny i bezpośredni detektor elektronów. Przedstawiony Protokół opisuje wszystkie niezbędne kroki, jak rutynowo uzyskiwać dane krioelektromagnetyczne o wysokiej rozdzielczości przy użyciu tej konfiguracji i ujawniać drobne szczegóły strukturalne makromolekularnych struktur 3D, które są niezbędne do zrozumienia kluczowych relacji struktura-funkcja w biologii strukturalnej i projektowaniu leków opartych na strukturze.

Oświadczenia

Sagar Khavnekar nie zgłasza konfliktu interesów. Pozostali autorzy są pracownikami Thermo Fisher Scientific, oddziału MSD-EM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pierścienie AutoGridThermo Fisher Scientific 1036173Pakiet 100 pierścieni AutoGrid do standardowych siatek EM.
C-ClipThermo Fisher Scientific 1036171Pakiet 100 klipsów zabezpieczających
standardowe siatki EM wewnątrz pierścieni AutoGrid.
Platforma zarządzania danymiThermo Fisher Scientific1160939Część podstawowej konfiguracji Glacios; zawiera oprogramowanie Athena
Monitor jakości EPUOprogramowanie Thermo Fisher Scientific1179770
Oprogramowanie EPUThermo Fisher Scientific1025080Część konfiguracji podstawowej Glacios
Ethane 3.5WestfalenA06010110Etan używany do wytwarzania ciekłego etanu (czystość co najmniej N35, tj. 99,95% obj.)
Falcon 4 200kVThermo Fisher Scientific1166936Bezpośredni detektor elektronów
GlaciosThermo Fisher Scientific1149551200 kV TEM
GloQube Plus Glow Discharge System do siatek TEM i modyfikacji powierzchniQuorumN/Adostępny również za pośrednictwem Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
Siatki QuantiFoilQuantifoilN/AR-2/1, siatka 300 mesh; siatka z folii węglowej
RelionMRC Laboratory of Molecular BiologyN/Aoprogramowanie open source:
https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris z Falcon
4 dla 200 kV		Thermo Fisher Filtrenergii 1191753
Selectris X z Falcon
4 dla 200 kV		Thermo Fisher Scientific1191755Filtr energetyczny
UltrAuFoil kratkiQuantifoilN/AR-1.2/1.2, siatka 300; kratki ze złotej folii
Vitrobot Mk. IVThermo Fisher Scientific1086439Automatyczny system witryfikacji
Bibuła filtracyjna Whatman 595Thermo Fisher ScientificAA00420S
naukowej

Bibliografia

  1. Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -J. Structural features of activated GPCR signaling complexes. Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).
  2. Chen, S., Gouaux, E. Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes. Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).
  3. Kühlbrandt, W. Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases. Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).
  4. Laverty, D., et al. Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer. Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).
  5. Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. Molecular structure of the Human CFTR ion channel. Cell. 169 (1), 85-95 (2017).
  6. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  7. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588, 498-502 (2020).
  8. Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).
  9. Walls, A. C., Park, Y. -J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 180, 281-292 (2020).
  10. Chiba, S., et al. Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization. Communications Biology. 4 (1), 597(2021).
  11. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
  12. Bai, X. C. Seeing atoms by single-particle Cryo-EM. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).
  13. Koh, A., et al. High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4. Microscience Microscopy Congress 2021. , Abstract 212 (2021).
  14. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV. Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).
  15. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).
  16. Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV. Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).
  17. Mori, T., et al. C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes. Nature Communications. 12 (1), 6294(2021).
  18. Hamdi, F., et al. 2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope. PLoS One. 15 (5), 0232540(2020).
  19. Abbott, S., et al. EMDB web resources. Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).
  20. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  25. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  27. Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent. Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).
  28. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  29. Schorb, M., et al. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  30. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  31. Alewijnse, B., et al. Best practices for managing large CryoEM facilities. Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).
  32. Baldwin, P. R., et al. Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data. Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).
  33. Guo, H., et al. Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution. International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).
  35. Zhou, H., Chiu, W. Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution. Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).
  36. DeRosier, D. J. Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere. Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).
  37. Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy. Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).
  38. Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions. Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).
  39. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriomikroskopia elektronowaTEM 200 kVwyznaczanie struktury białekobrazowanie z filtrem energetycznymzautomatyzowany pobór danychselekcja lodu witryfikowanegobudowanie modelu atomowegoocena jakości obrazu
Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.