Mikrodysekcja warstwowa płatków zastawki trójdzielnej do dwuosiowej charakterystyki mechanicznej i kwantyfikacji mikrostrukturalnej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje dwuosiową charakterystykę mechaniczną, spolaryzowaną obrazowanie przestrzennej domeny częstotliwości opartej na obrazowaniu kolagenu oraz mikrodysekcję płatków zastawki trójdzielnej. Przedstawiona metoda wyjaśnia, w jaki sposób warstwy ulotek przyczyniają się do holistycznych zachowań ulotek.

Streszczenie

Zastawka trójdzielna (TV) reguluje jednokierunkowy przepływ nienatlenionej krwi z prawego przedsionka do prawej komory. Telewizor składa się z trzech ulotek, z których każda ma unikalne właściwości mechaniczne. Te różnice między trzema ulotkami telewizyjnymi można lepiej zrozumieć, badając ich cztery warstwy anatomiczne, którymi są przedsionek (A), gąbczasty (S), włóknienie (F) i zapalenie komór (V). Chociaż warstwy te są obecne we wszystkich trzech ulotkach telewizyjnych, istnieją różnice w ich grubości i składnikach mikrostrukturalnych, które dodatkowo wpływają na ich odpowiednie zachowania mechaniczne.

Ten protokół zawiera cztery kroki mające na celu wyjaśnienie różnic specyficznych dla warstwy: (i) scharakteryzowanie zachowań mechanicznych i architektonicznych włókien kolagenowych nienaruszonej ulotki telewizyjnej, (ii) oddzielenie warstw kompozytowych (A/S i F/V) ulotki telewizyjnej, (iii) przeprowadzenie tych samych charakterystyk dla warstw kompozytowych, oraz (iv) przeprowadzenie post-hoc ocena histologiczna. Ta eksperymentalna struktura w unikalny sposób pozwala na bezpośrednie porównanie nienaruszonej tkanki telewizyjnej z każdą z jej warstw kompozytowych. W rezultacie, za pomocą tego protokołu można zebrać szczegółowe informacje dotyczące mikrostruktury i funkcji biomechanicznej ulotek telewizyjnych. Takie informacje mogą być potencjalnie wykorzystane do opracowania telewizyjnych modeli obliczeniowych, które mają na celu dostarczenie wskazówek dotyczących klinicznego leczenia choroby telewizyjnej.

Wprowadzenie

Telewizor znajduje się między prawym przedsionkiem a prawą komorą serca. Przez cały cykl pracy serca telewizor reguluje jednokierunkowy przepływ krwi poprzez cykliczne otwieranie i zamykanie przedniego płatka TV (TVAL), listka TV tylnego (TVPL) i ulotki przegrody TV (TVSL). Płatki te są złożone i mają cztery odrębne warstwy anatomiczne - przedsionek (A), gąbczastą (S), włóknienie (F) i komorę (V) - z unikalnymi składnikami mikrostrukturalnymi. Włókna elastyny w przedsionkach i komorach pomagają przywrócić tkankę do niezdeformowanej geometrii po obciążeniu mechanicznym¹. W przeciwieństwie do tego, fibrosa zawiera gęstą sieć pofałdowanych włókien kolagenowych, które przyczyniają się do nośności ulotek². Przypuszcza się, że gąbczasta błona, składająca się głównie z glikozaminoglikanów, umożliwia ścinanie warstw ulotek podczas funkcji zastawki serca³. Chociaż wszystkie trzy typy ulotek mają te same warstwy anatomiczne, istnieją różnice w grubościach warstw i proporcjach składników, które mają wpływ na zachowania mechaniczne specyficzne dla ulotki.

Badacze zbadali właściwości ulotek telewizyjnych za pomocą planarnych charakterystyk mechanicznych, ocen histomorfologicznych i charakterystyk optycznych architektury włókien kolagenowych. Na przykład płaskie dwuosiowe charakterystyki mechaniczne mają na celu naśladowanie obciążenia fizjologicznego poprzez zastosowanie prostopadłych przemieszczeń do tkanki i rejestrowanie związanych z tym sił. Wynikające z tego obserwacje przemieszczenia siły (lub naprężenia-rozciągnięcia) ujawniły, że wszystkie trzy ulotki telewizyjne wykazują nieliniowe, specyficzne dla kierunku mechaniczne zachowania z bardziej widocznymi odpowiedziami specyficznymi dla ulotki w kierunku tkanki promieniowej^4,5^,6. Uważa się, że te specyficzne dla ulotek zachowania wynikają z różnic we właściwościach mikrostrukturalnych zaobserwowanych przy użyciu standardowych technik histologicznych^6,7. Co więcej, obrazowanie drugiej generacji harmonicznej⁶, rozpraszanie światła pod małym kątem⁸ oraz spolaryzowane obrazowanie w domenie częstotliwości przestrzennej⁷ (pSFDI) mają na celu zrozumienie tych właściwości mikrostrukturalnych i wykazały specyficzne dla ulotki różnice w orientacji włókien kolagenowych i zaciskaniu włókien, które mają implikacje dla obserwowanych zachowań mechanicznych na poziomie tkanki. Badania te znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat mikrostruktury tkanek i jej roli w zachowaniach na poziomie tkanki. Jednak wiele pozostaje do rozwiązania w zakresie eksperymentalnego łączenia mechaniki tkankowej i leżącej u jej podstaw mikrostruktury.

Niedawno, to laboratorium przeprowadziło mechaniczne charakterystyki warstw ulotki telewizyjnej rozdzielonych na dwie warstwy kompozytowe (A/S i F/V) przy użyciu techniki mikrodysekcji⁹. Wcześniejsze prace uwypukliły różnice we właściwościach mechanicznych warstw i pomogły uzyskać wgląd w to, w jaki sposób warstwowa mikrostruktura przyczynia się do mechanicznego zachowania tkanek. Chociaż badania te poszerzyły naszą wiedzę na temat mikrostruktury ulotek telewizyjnych, technika ta miała kilka ograniczeń. Po pierwsze, właściwości warstw kompozytowych nie były bezpośrednio porównywane z nienaruszoną tkanką, co prowadziło do braku pełnego zrozumienia zależności między mechaniką a mikrostrukturą. Po drugie, nie badano architektury włókien kolagenowych warstw kompozytowych. Po trzecie, zbadano tylko warstwy TVAL ze względu na trudności z zebraniem warstw kompozytowych z pozostałych dwóch ulotek telewizyjnych. Opisana w niniejszym dokumencie metoda zapewnia całościowe ramy charakterystyki, które przezwyciężają te ograniczenia i zapewniają pełną charakterystykę ulotek telewizyjnych i ich warstw kompozytowych.

Ten artykuł opisuje technikę mikrodysekcji, która rozdziela trzy ulotki telewizyjne na ich warstwy kompozytowe (A/S i F/V) w celu dwuosiowej charakterystyki mechanicznej i mikrostrukturalnej^10,11,12. Ten iteracyjny protokół obejmuje (i) dwuosiowe testy mechaniczne i charakterystykę pSFDI nienaruszonej ulotki, (ii) nowatorską i powtarzalną technikę mikrodysekcji w celu wiarygodnego uzyskania kompozytowych warstw TV oraz (iii) dwuosiowe testy mechaniczne i charakterystykę pSFDI kompozytowych warstw TV. Tkankę poddano dwuosiowemu obciążeniu rozciągającemu o różnych proporcjach sił do badań mechanicznych. Następnie wykorzystano pSFDI do określenia orientacji i wyrównania włókien kolagenowych w różnych obciążonych konfiguracjach. pSFDI zachowuje natywną architekturę włókien kolagenowych, umożliwia analizę zależną od obciążenia i omija typową potrzebę utrwalania lub czyszczenia tkanki do analizy architektury włókien kolagenowych, takich jak obrazowanie drugiej harmonicznej generacji lub rozpraszanie światła pod małym kątem. Na koniec tkanki przygotowano przy użyciu standardowych technik histologicznych w celu uwidocznienia mikrostruktury tkanki. Ta iteracyjna i holistyczna struktura pozwala na bezpośrednie porównanie właściwości mechanicznych i mikrostrukturalnych ulotki telewizyjnej z jej warstwami kompozytowymi.

Protokół

Wszystkie metody opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie w Oklahomie. Tkanki zwierzęce zostały pozyskane z rzeźni zatwierdzonej przez USDA.

1. Dwuosiowa charakterystyka mechaniczna

1. Przygotowanie tkanek
   1. Wyjmij z zamrażarki ulotkę telewizyjną, żyletki, długopis chirurgiczny, kleszcze, pipetę z wodą dejonizowaną (DI) i matę do cięcia. Rozmrozić ulotkę telewizyjną za pomocą 2-3 kropli wody DI o temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zamiast soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) stosuje się wodę DI, aby uniknąć trudności spowodowanych przez PBS w mikrodysekcji warstwy.
   2. Połóż próbkę płasko na macie do cięcia z warstwą ventricularis (tj. powierzchnią z przyczepami struny) skierowaną do góry. Ustawić próbkę tak, aby kierunek promieniowy pokrywał się z kierunkiem Y, a kierunek obwodowy pokrywał się z kierunkiem X.
      UWAGA: Kierunek obwodowy jest zorientowany wzdłuż obwodu zaworu.
   3. Zbadaj miejsca przyczepu strun w tkance. Określ obszar, najlepiej ~12 x 12 mm, z najmniejszą ilością dużych wstawek strunowych, unikając jednocześnie bardzo cienkich (tj. przezroczystych) obszarów (Rysunek 1).
   4. Odwróć próbkę tak, aby powierzchnia przedsionka (tj. powierzchnia bez przyczepów strunowych) była skierowana do góry. Upewnij się, że kierunek obwodowy i promieniowy ulotki pozostają wyrównane odpowiednio z osiami X i Y.
   5. Wyciąć kwadratową próbkę o wymiarach 12 x 12 mm z tkanki ulotki, unikając dużych wstawów strunowych lub cienkich obszarów określonych w kroku 1.1.3. Usuń przycięte części tkanki ulotki za pomocą kleszczy i umieść je w pojemniku na odpady.
      1. Jeśli nie jest możliwe całkowite uniknięcie dużych wkłuć strunowych, przetnij tkanki tak, aby znajdowały się wzdłuż krawędzi kwadratowego preparatu. Unikanie wstawek strunowych jest ważne, ponieważ pomaga zapobiegać problemom z późniejszą mikrodysekcjami.
   6. Użyj długopisu chirurgicznego, aby umieścić małą kropkę w prawym górnym rogu, aby śledzić orientację próbki. Pozostaw atrament do wyschnięcia na około 30 sekund.
   7. Odwróć próbkę z powierzchnią komorową (tj. powierzchnią z przyczepami cięciwy) skierowaną do góry. Przytnij przyczepy strunowe z tyłu tkanki, rozciągając struny z ulotki i używając żyletki, aby przeciąć w pobliżu miejsca jej wprowadzenia. Ponownie odwróć próbkę tak, aby powierzchnia przedsionkowa (tj. gładka powierzchnia) była skierowana do góry.
2. Pomiar grubości
   1. Pobrać bezdotykowy laserowy czujnik przemieszczenia. Wyzeruj czujnik przemieszczenia na płaskim fragmencie maty tnącej w pobliżu przyciętej tkanki.
      UWAGA: Nie kieruj lasera bezpośrednio w oczy.
   2. Umieść laser w centralnym obszarze próbki. Usunąć powietrze uwięzione pod powierzchnią ulotki, ponieważ może to powodować błędy pomiaru. Aby uwolnić uwięzione powietrze, użyj pęsety, aby popchnąć bąbel do krawędzi tkanki lub podnieś jeden róg tkanki.
   3. Zapisz grubość pokazaną na wyświetlaczu czujnika przemieszczenia. Powtórz jeszcze dwa pomiary w innych miejscach próbki.
   4. Oblicz średnią grubość ulotki, korzystając z trzech pomiarów zarejestrowanych w poprzednim kroku. Wartości tej należy używać podczas tworzenia dwuosiowych protokołów charakterystyki mechanicznej.
3. Konfiguracja testera dwuosiowego i montaż tkanek
   1. Przygotować łaźnię wodną demineralizowaną w temperaturze 37 °C, zgodnie z wytycznymi systemu badawczego, aby zapewnić temperaturę w warunkach fizjologicznych in vivo.
   2. Pobrać kleszcze, próbkę tkanki, elementy montażowe, narzędzie z cienką końcówką, płynny klej cyjanoakrylowy i pomalowane na czarno szklane koraliki (średnica: 300-500 μm).
      UWAGA: Osprzęt montażowy obejmuje zęby, mostek montażowy i gumę montażową.
   3. Zamontuj próbkę tkanki w systemie testowym. Upewnij się, że kierunek obwodowy tkanki pokrywa się z kierunkiem X, który może być wspomagany przez kropkę umieszczoną wcześniej w kroku 1.1.6.
      UWAGA: Zastosowane tutaj zęby powinny być równomiernie rozmieszczone na całej długości krawędzi tkanki. Efektywna długość krawędzi wynosi 10 mm dla nienaruszonej tkanki i >3,3 mm dla warstw kompozytowych.
4. Umieszczenie znacznika referencyjnego
   1. Zidentyfikuj środkowy obszar o powierzchni jednej trzeciej kwadratu zamontowanej tkanki. Użyj przybliżonych rogów tego obszaru do umieszczenia znacznika odniesienia.
   2. Umieść szklane koraliki w otwartej łodzi wagowej i utwórz małą kałużę płynnego kleju cyjanoakrylowego w osobnej łodzi do ważenia. Pokryj górną część narzędzia z cienką końcówką niewielką ilością kleju. Nanieś nadmiar kleju na bok łodzi do ważenia.
   3. Utwórz jeden róg środkowego układu w jednej trzeciej kwadratu, delikatnie dociskając pokrytą klejem końcówkę do tkanki. Za pomocą kleszczy chwyć szklany koralik i ostrożnie umieść go na kropce kleju. Użyj kamery dwuosiowego urządzenia testującego, aby uzyskać pomoc w umieszczeniu ściegu.
   4. Powtarzaj kroki 1.4.2 i 1.4.3 dla trzech dodatkowych koralików, aż tablica kwadratowa zostanie ukończona. Upewnij się, że koraliki są dobrze przymocowane, a ich odpowiednie kropki kleju nie stykają się ani nie sklejają ze sobą. Wysuszyć klej przed opuszczeniem chusteczki do łaźni wodnej.
      1. Jeśli koraliki są ze sobą sklejone, poczekaj, aż klej wyschnie, a następnie użyj kleszczyków, aby delikatnie chwycić koralik lub klej i ściągnąć go z chusteczki.
         UWAGA: Klej i ścieg(i) powinny zejść, umożliwiając ponowną próbę umieszczenia ściegu.
5. Przygotowanie do jazdy
   1. Stwórz protokół kondycjonowania wstępnego kontrolowanego siłą, w którym tkanka o długości i grubości krawędzi zostanie poddana sześciu powtórzeniom obciążenia równoosiowego do szczytowego napięcia błony _T piku 40 N/m z obciążeniem wstępnym 3% × T_peak¹⁰ oraz czasy rozciągania i odzyskiwania wynoszące 30 s każdy.
      1. Skonstruuj dowolny katalog testowy, który będzie tymczasowo przechowywał dane do przyszłych obliczeń. Ustaw szybkość załadunku na 4,42 N/m.
      2. Skonstruuj nowy zestaw parametrów testowych o nazwie Preconditioning0. Ustaw tryby sterowania osią X i osią Y na wymuszenie i ustaw funkcje sterowania na krokowe. Zdefiniuj wielkość obciążenia jako siłę związaną ze _szczytem T, tj. szczyt f = _szczyt T · L. Określ wielkość napięcia wstępnego jako 3% _{wartości szczytowej} f tylko dla pierwszego powtórzenia i zdefiniuj zarówno czas trwania rozciągania, jak i czas odzyskiwania jako 30 s. Zdefiniuj liczbę powtórzeń jako 10,
         UWAGA: Obliczony pik pierwszego naprężenia Pioli-Kirchhoffa, tj. pik P = pik T/t, może przekraczać 200 kPa dla cieńszych tkanek, co może spowodować rozerwanie tkanki podczas badania. W tych scenariuszach szczytowe napięcie membrany zostało dostosowane do maksymalnego pierwszego naprężenia Pioli-Kirchhoffa wynoszącego 200 kPa.
   2. Wykonaj protokół kondycjonowania wstępnego. Po kondycjonowaniu wstępnym zapisz aktualne wymiary X i Y próbki do wykorzystania w protokołach badań dwuosiowych.
6. Tworzenie i wykonywanie dwuosiowych protokołów testowych
   1. Określ czas wymagany do osiągnięcia szczytowej konfiguracji równoosiowej na podstawie konfiguracji po kondycjonowaniu wstępnym z żądaną szybkością przemieszczenia. Biorąc pod uwagę stały współczynnik przemieszczenia, oblicz czasy obciążenia dla pozostałych współczynników obciążenia (tj. T_XX:T_YY = 1:0,5 i T_XX:T_YY = 0,5:1).
   2. Ręcznie przesuń impulsowo siłowniki liniowe, aby dopasować siły docelowe dla danego współczynnika obciążenia. Powtórz ten proces i zapisz wymiary ulotki dla wszystkich współczynników obciążenia.
   3. Przygotować protokół badania z kontrolowanym przemieszczeniem, który dwuosiowo przemieszcza tkankę z konfiguracji po kondycjonowaniu wstępnym do konfiguracji zapisanych w kroku 1.6.2 (tj. T_XX:T_YY = 1:1, 1:0,5, 0,5:1) w czasie określonym w kroku 1.6.1. Upewnij się, że każdy protokół ma trzy cykle ładowania/rozładowywania w celu zapewnienia powtarzalności zachowania mechanicznego.
      1. Skonstruuj katalog testowy, w którym będą przechowywane dane do przyszłych obliczeń. Upewnij się, że nazwa katalogu jest zgodna z bieżącym przykładem.
      2. Skonstruuj nowy zestaw parametrów testowych o nazwie 1:1, ustaw tryby sterowania osią X i osią Y na przemieszczenie i ustaw funkcje sterujące na rampę. Zdefiniuj wielkość rozciągnięcia, która ma być konfiguracją zapisaną w kroku 1.6.1. Zdefiniuj wielkość napięcia wstępnego jako 3% _{wartości szczytowej} f tylko dla pierwszego powtórzenia i zdefiniuj zarówno czas trwania rozciągania, jak i czas powrotu jako czas zarejestrowany w kroku 1.6.1. Zdefiniuj liczbę powtórzeń jako 3.
      3. Powtórzyć krok 1.6.3.2 dla pozostałych współczynników obciążenia (tj. T_XX:T_YY = 1:0,5 i T_XX:T_YY = 0,5:1), z wyjątkiem zdefiniowania wielkości napięcia wstępnego jako niezastosowanej. Upewnij się, że wielkość rozciągnięcia, czas trwania odcinka i czas trwania odzyskiwania są zgodne z tymi zarejestrowanymi w kroku 1.6.2.
         UWAGA: Do analiz naprężeń i odkształceń zostaną wykorzystane tylko dane z ostatniego (trzeciego) cyklu.
   4. Wykonaj protokoły kontroli przemieszczenia. Po zakończeniu badania dwuosiowego przywróć tkankę do jej wstępnie przygotowanych wymiarów.
      UWAGA: Test należy natychmiast przerwać, jeśli tkanka zacznie się rozdzierać.
7. Dalsze charakterystyki
   1. Pozostaw tkankę zanurzoną w wodzie demineralizowanej i zamontowaną w dwuosiowym systemie testowym. Wykonaj obrazowanie pSFDI zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.3.
   2. Odmontuj chusteczkę. Jeśli jest to tkanka nienaruszona, przystąp do mikrodysekcji opisanej w krokach 3.1-3.7. Jeśli nie, zbierz histologię zgodnie z krokiem 3.7.
      UWAGA: Kąpiel wodna DI może być używana do kolejnych charakterystyk w ciągu tego samego dnia.
   3. Powtórz kroki 1.2-1.7 z warstwami A/S i F/V uzyskanymi po mikrodysekcji (kroki 3.1-3.6).
      UWAGA: Powtórzenie protokołu badania dla warstw pozwala na bezpośrednie porównanie nienaruszonej tkanki z jej własnymi warstwami.
8. Procedury przetwarzania końcowego danych z testów dwuosiowych
   1. Wykonaj cyfrową korelację obrazów z uzyskanymi dwuosiowymi obrazami testowymi w celu określenia pozycji znaczników zależnych od czasu. Oblicz przemieszczenia znaczników odniesienia za pomocą korektora (1). ⁵
      (1)
      W tym przypadku x_i(t), X_i i d_i(t) są lokalizacją zależną od czasu, lokalizacją początkową (odniesienia) i przemieszczeniem znacznika i.
   2. Oblicz gradient deformacji F, traktując znaczniki odniesienia jako czterowęzłowy dwuliniowy element skończony, jak pokazano w Eq (2)⁵
      (2)
      Gdzie B_Xi i B_Yi są pochodnymi funkcji kształtu dla węzła i odpowiednio w kierunkach X i Y, a u_i(t) i v_i(t) są składnikami d_i(t): d_i(t) = [u_i(t), v_i(t)]^T.
   3. Oblicz pierwsze zastosowane naprężenie Piola-Kirchhoffa P, korzystając z zarejestrowanych sił, jak w równaniu (3)⁵
      (3)
      P_XX i P_YY są składnikami X i Y P; L i t to długość i grubość krawędzi tkanki; f_X i f_Y są siłami zarejestrowanymi w kierunkach X i Y.
   4. W razie potrzeby określ inne miary odkształceń i naprężeń, ^13, które obejmują prawe odkształcenie Cauchy'ego-Greena C = F^T/F, odkształcenie Greena-Lagrange'a E = (C - I)/2, naprężenie Cauchy'ego σ = ^J-1PF^T i drugie naprężenie Piola-Kirchhoffa S = F-1 P.
      UWAGA: W tym przypadku I jest tensorem tożsamości drugiego rzędu, a J = det(F) jest jakobianem gradientu deformacji F.

2. Spolaryzowane obrazowanie przestrzennej domeny częstotliwości

1. Przygotowanie systemu
   UWAGA: W razie potrzeby markery odniesienia można usunąć z tkanki przed wykonaniem kolejnych kroków.
   1. Wyśrodkuj urządzenie pSFDI nad próbką (Rysunek 2). Włącz projektor i oświetl preparat światłem o długości fali 490 nm (cyjan).
   2. Otwórz oprogramowanie kamery i sprawdź pole widzenia kamery. Upewnij się, że próbka jest wyśrodkowana w ramie i jest całkowicie zawarta w polu view.
   3. Jeśli zamontowana próbka jest nienaruszoną ulotką, dostosuj jasność projektora cyfrowego przetwarzania światła (DLP), aby upewnić się, że tkanka jest w pełni oświetlona bez odblasków na powierzchni tkanki. Nie reguluj jasności, jeśli próbka jest jedną z warstw kompozytowych.
   4. Obróć polaryzator w pełnym zakresie ruchu, aby wykryć ewentualne odblaski lub zabrudzenia na soczewce polaryzatora. W razie potrzeby ostrożnie wyczyść soczewkę polaryzatora ściereczką z mikrofibry.
2. Gromadzenie danych
   UWAGA: Następujące gromadzenie danych można zautomatyzować za pomocą oprogramowania, takiego jak LabVIEW lub Python.
   1. Przesuń polaryzator do pozycji wyjściowej — idealnie wyrównanej z jedną z dwuosiowych osi testowych. Przechwyć jeden obraz w skali szarości i zapisz go na komputerze z lokalizacją polaryzatora (np. 0°).
   2. Obróć polaryzator o 5° i uchwyć kolejny obraz w skali szarości. Powtórz ten proces, aby uzyskać 37 obrazów w zakresie od 0° do 180° z krokiem co 5°.
      UWAGA: Obrazy z pierwszej sekwencji obrazowania pSFDI mogą być wstępnie analizowane, aby zapewnić pożądaną odpowiedź optyczną ze strony tkanki. Zapoznaj się z krokiem 2.3, aby uzyskać instrukcje.
   3. Powtórz sekwencję obrazowania pSFDI dla innych pożądanych konfiguracji tkanek, na przykład konfiguracji pików protokołów obciążenia uwzględnianych w dwuosiowych badaniach mechanicznych.
3. Procedury przetwarzania danych pSFDI
   UWAGA: Poniższa metoda obejmuje kroki dla języka programu MATLAB. Jednak zamiast tego można użyć dowolnego preferowanego języka (np. Python, C++).
   1. Użyj funkcji imread() programu MATLAB, aby skonstruować tablice zawierające intensywność pikseli 37 pobranych obrazów. Dla wygody ułóż je jako tablicę trójwymiarową n × m × 37, gdzie n i m to liczby pikseli wzdłuż dwóch osi.
   2. Zdefiniuj obszar tkanki zainteresowania (ROI) za pomocą zdefiniowanej przez użytkownika funkcji grabit().
   3. Dopasuj dane intensywności w funkcji kąta polaryzatora dla każdego piksela ROI za pomocą 3-składnikowego szeregu Fouriera, jak w Eq (4):
      (4)
      W tym przypadku I(θ) jest intensywnością pikselową w funkcji kąta polaryzatora, a b_i są stałymi Fouriera. Użyj standardowej liniowej regresji najmniejszych kwadratów, aby wyznaczyć b_i.
   4. Określ orientację światłowodu w pikselach jako kąt polaryzatora powiązany z maksymalną wartością I(θ). Oblicz stopień anizotropii optycznej (DOA) za pomocą korektora (5).
      (5)
   5. Użyj plot() i histogram(), aby zobrazować uzyskaną orientację włókien i wartości DOA. Przetworzone wyniki zapisz do późniejszego wykorzystania.

3. Mikrodysekcja warstw kompozytowych płatków zastawki trójdzielnej

1. Mocowanie tkanek do tablicy woskowej
   1. Zbierz potrzebne materiały: tablicę woskową, wodę DI, pipetę, skalpel, mikronożyczki, cienkie kleszcze, zakrzywione kleszcze, grube kleszcze i szpilki.
      UWAGA: Używaj wyłącznie pęsety bez zębów i uchwytów, ponieważ kleszcze tego typu mogą bardzo łatwo rozerwać cienką tkankę warstwy A/S podczas wykonywania sekcji.
   2. Odłącz tkankę od testera dwuosiowego i zmierz jej grubość za pomocą laserowego czujnika przemieszczenia opisanego w kroku 1.2. Umieść chusteczkę na tablicy woskowej.
   3. Zbadaj stronę brzuszną tkanki pod kątem przyczepów dużych strun. Zwróć uwagę na położenie tych wstawek, aby uniknąć ich podczas sekcji (Rysunek uzupełniający S1). Zrób zdjęcie w celach informacyjnych.
   4. Rozłóż tkankę płasko na desce woskowej przedsionkami skierowanymi do góry. Przymocuj chusteczkę do deski za pomocą szpilek:
      1. W każdym rogu tkanki umieść jedną szpilkę, która jest odchylona od tkanki (dla lepszej widoczności) i lekko naciąga tkankę (Rysunek 3A). Zrób to w kolejności zgodnej z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnej do ruchu wskazówek zegara. Upewnij się, że kołki znajdują się poza otworami utworzonymi przez zęby podczas montażu chusteczki.
      2. Dostosuj nieznacznie ułożenie szpilki, aby upewnić się, że tkanka jest napięta i w konfiguracji kwadratowej (Rysunek 3B), tak aby tkanka leżała płasko i nie przesuwała się podczas mikropreparowania warstwy.
      3. W razie potrzeby umieść szpilki wzdłuż boku tkanki podczas preparowania, aby bardziej rozciągnąć tkankę. Podczas umieszczania i ustawiania dodatkowych kołków pod kątem, należy pamiętać, że należy je obejść podczas sekcji.
      4. Usuń znaczniki referencyjne szklanych koralików.
         UWAGA: Poniższy krok jest opcjonalny. Dodana woda DI pomaga utrzymać nawilżenie tkanek i zapobiega przywieraniu tkanki do siebie podczas mikrorozwarstwienia.
      5. Za pomocą pipety umieść wodę demineralizowaną na powierzchni tkanki tak, aby całkowicie pokryła tkankę w sposób przypominający pęcherzyki. Uzupełniaj wodę DI w razie potrzeby podczas sekcji.
2. Zrób początkowy róg.
   1. Wybierz róg przypiętej próbki, aby rozpocząć sekcję. Unikaj dużych wstawek strunowych i bardzo cienkich obszarów.
   2. Wykonaj nacięcie w warstwie A/S, delikatnie przeciągając skalpelem po powierzchni tkanki wzdłuż otworów montażowych z testów mechanicznych (Rysunek 3C). Upewnij się, że nacięcie ma co najmniej 5 mm długości, a krawędzie nacięcia zaczynają się rozsuwać, odsłaniając warstwę F/V pod spodem.
   3. Za pomocą cienkich kleszczy (bez ostrej końcówki) mocno przetrzyj nacięcie i rozsuń krawędzie nacięcia (rysunek uzupełniający S2).
      1. Jeśli nacięcie w warstwie A/S nie zacznie się rozpadać, delikatnie prześledź to samo cięcie ponownie skalpelem, aż zacznie to robić. Należy uważać, aby nie wciąć się zbyt głęboko w tkankę (poza warstwę kompozytu A/S), ponieważ utrudnia to czyste oddzielenie warstw.
   4. Powtórz kroki 3.2 i 3.2.3, aby wykonać drugie cięcie prostopadłe do pierwszego cięcia (Rysunek 3D). Upewnij się, że dwa nacięcia są połączone i tworzą narożnik.
      1. Jeśli dwa nacięcia nie są połączone, przeciągnij cienką pęsetę pod małym obszarem tkanki oddzielającej dwa nacięcia (rysunek uzupełniający S3). Następnie ostrożnie użyj nożyczek, aby przeciąć tkankę.
3. Oderwij chusteczkę od rogu.
   1. Pocieraj wzdłuż nacięć za pomocą cienkich kleszczy, aż tkanka zacznie oddzielać się od warstwy F/V. Gdy tylko mały kawałek tkanki zostanie oddzielony, chwyć go pęsetą i delikatnie pociągnij, aby jeszcze bardziej oddzielić warstwy kompozytu.
      UWAGA: Podczas chwytania zawsze umieszczaj końcówkę cienkiej pęsety poza krawędzią tkanki. W przeciwnym razie mogą przypadkowo zrobić dziurę w warstwie kompozytowej A/S.
   2. Kontynuuj obieranie chusteczki i pocieraj szew, aż dotrze do końca dwóch nacięć wykonanych na róg. W trakcie tego procesu przełącz się na większą pęsetę, aby chwycić tkankę do procesu obierania, aby zapobiec niepożądanemu rozdarciu i rozdarciu warstwy kompozytu A/S.
      1. Jeśli pierwsza próba zakrętu ma poważne problemy z separacją, spróbuj użyć innego zakrętu jako punktu wyjścia (wróć do kroku 3.2).
4. Przedłuż cięcia, obierz tkankę i zrób drugi róg.
   1. Wydłuż dwa nacięcia wykonane w pierwszym rogu, umieszczając końcówkę skalpela na dole każdego cięcia i lekko przeciągając ją po powierzchni tkanki (Rysunek 4A). Upewnij się, że wszystkie nacięcia przedłużające mają co najmniej 5 mm, a przedłużenia łączą się z oryginalnymi nacięciami i nadal podążają za otworami zębów lub szwów.
      UWAGA: Jeśli nacięcie przedłużające jest zbyt głębokie, to nadchodzące złuszczanie musi być ściśle monitorowane, aby upewnić się, że odcinki włóknistki nie są oddzielone warstwą kompozytową A/S (Rysunek 5A).
   2. Kontynuuj przedłużanie nacięć i odklejaj wierzchnią warstwę kompozytu A/S z powrotem, pocierając szew, aż jedna strona będzie gotowa. Zauważ, że tkanka zostanie całkowicie oddzielona wzdłuż jednego cięcia; upewnij się, że szew między warstwami kompozytu A/S i F/V jest prosty (Rysunek 4B).
   3. Powtórz instrukcje w kroku 3.2 i kroku 3.3, aby utworzyć drugi narożnik prostopadły do końca całkowicie obranej strony (Rysunek 4C).
5. Całkowicie oddziel warstwę A/S.
   1. Wydłuż pozostałe cięcia, unikając wstawiania dużych cięciw. Kontynuuj oddzielanie warstw A/S i F/V, stosując techniki pocierania i ciągnięcia zastosowane w pierwszym zakręcie. Zanotuj kilka uwag lub problemów, które mogą pojawić się podczas tego procesu:
      1. Wyklucz wstawki strunowców z obszaru separacji A/S (Rysunek 5B) tylko wtedy, gdy to wykluczenie pozwoli na uzyskanie próbki A/S wystarczająco dużej do charakterystyki eksperymentalnej (>3,3 mm).
      2. Jeśli tkanka rozrywa się lub tworzy się, natychmiast przerwij oddzielanie tkanki. Aby zapobiec złapaniu pęsety, umieść nożyczki w dowolnym otworze, który się utworzy i odetnij tkankę od środka. Jeśli wada tworzy się wzdłuż szwu separacji, zacznij oddzielać tkankę wzdłuż innej krawędzi, aby zapobiec dalszemu rozdarciu (Rysunek 5C).
      3. Szukaj połączeń międzywarstwowych, które mogą pojawić się podczas oddzielania tkanki i zapobiegaj dalszemu oddzielaniu tkanki bez wysokiego ryzyka rozerwania (Rysunek 5D). Zwróć uwagę, że są to cienkie, ale mocne pasma, które należy ostrożnie przyciąć nożyczkami. Unikaj tworzenia w warstwie A/S lub wcinania się w dół w warstwę F/V, ponieważ spowodowałoby to nierównomierne oddzielenie.
      4. Kontynuuj ten proces, aż zostanie oddzielona największa możliwa próbka warstwy A/S. Zaznacz orientację próbki za pomocą pisaka chirurgicznego (Rysunek 6A).
6. Zakończ sekcję.
   1. Użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż szwu oddzielającego pozostałą krawędź tkanki (Rysunek 6B). Upewnij się, że to cięcie znajduje się jak najbliżej szwu separacji.
   2. Umieść oddzieloną warstwę kompozytu A/S płasko na macie do cięcia. W razie potrzeby użyj skalpela, aby wyprostować krawędzie tkanki i stworzyć kwadratowy kształt tkanki odpowiedni do dwuosiowych testów mechanicznych. Umieść warstwę A/S w wodzie DI, aż będzie gotowa do testu.
   3. Zaznacz orientację warstwy F/V, która pozostaje na płycie woskowej. Wytnij największy możliwy kwadrat z obszaru, z którego usunięto warstwę A/S (Rysunek 6C), a następnie umieść go w wodzie DI.
7. histologia
   1. Wyciąć dwa paski tkanki - wyrównane z kierunkiem obwodowym i promieniowym - do wykorzystania w histologii. Stosuj różne protokoły dla warstw nienaruszonych i kompozytowych (tj. A/S i F/V).
      1. W przypadku nienaruszonej warstwy pobierz próbki z tkanki, która pozostaje przypięta do płyty woskowej. Tkankę należy stosować na zewnątrz otworów na zęby/szwy, ponieważ ta część tkanki nie została wypreparowana i będzie reprezentować nienaruszoną ulotkę.
      2. W przypadku warstw kompozytowych A/S i F/V próbki histologiczne należy pobrać dopiero po pełnym zakończeniu ich testowania i obrazowania. Odmontuj próbkę z dwuosiowego systemu testowego, połóż tkankę płasko na macie do cięcia i wytnij paski obwodowe i promieniowe za pomocą żyletki.
   2. Umieść wycięte paski w kasetach na chusteczki higieniczne i zanurz kasety w 10% formalinie.
   3. Wyrzuć pozostałą tkankę. Wyczyść narzędzia do preparowania za pomocą środka czyszczącego (patrz tabela materiałów).
   4. Po 24-48 godzinach utrwalania przenieś kasety do etanolu, gdzie mogą być przechowywane przez czas nieokreślony do czasu obróbki histologicznej i barwienia.
      UWAGA: Ta analiza histologiczna może potwierdzić, że mikrodysekcja zakończyła się sukcesem. UWAGA: 10% formalina powoduje podrażnienie skóry i poważne uszkodzenie oczu. Może również powodować reakcję alergiczną lub raka poprzez wdychanie. Podczas obsługi należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny, i używać tylko w dobrze wentylowanych pomieszczeniach, takich jak wyciąg. Gdy nie jest używany, upewnij się, że pojemnik do przechowywania jest szczelnie zamknięty.

Wyniki

Mikrodysekcja da próbki A/S i F/V o względnie jednakowej grubości, które można zamontować na (komercyjnym) dwuosiowym urządzeniu testowym. Analiza histologiczna nienaruszonego płatka i dwóch wypreparowanych warstw pozwoli zweryfikować, czy tkanka została prawidłowo oddzielona wzdłuż granicy między gąbczastym a zwłóknieniem (Ryc. 7). Dodatkowo mikrofotografie histologiczne mogą być wykorzystane do określenia grubości warstwy tkankowej i frakcji masowych składników za pomocą oprogramowania ImageJ. Nieud...

Dyskusja

Kluczowe etapy protokołu obejmują: (i) mikrodysekcję warstwy, (ii) montaż tkanki, (iii) umieszczenie markera odniesienia oraz (iv) konfigurację pSFDI. Odpowiednia mikrodysekcja warstw jest najważniejszym i najtrudniejszym aspektem opisywanej tu metody. Przed rozpoczęciem śledztwa z wykorzystaniem tej techniki, sekcja (sektory) powinna mieć długotrwałą praktykę z techniką mikrodysekcji i wszystkimi trzema ulotkami telewizyjnymi. Sekcja powinna zapewnić, że próbki warstwy kompozytowej są wystarczająco duże (>3,3 mm) i mają...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% roztwór formaliny, neutralny buforowany	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Detergent Alconox	Środek czyszczący	Alconox
BioTester - Tester dwuosiowy		biomateriałów CellScale	1,5 N Pojemność ogniwa obciążnikowego
Mata do cięcia	Dahle	B0027RS8DU
Woda dejonizowana	N/A
Narzędzie z cienką końcówką	Kleszcze HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
- Zakrzywione	naukowe przybory laboratoryjne	16122
Kleszcze - Grube	naukowe przybory laboratoryjne	161001078
Kleszcze - cienkie	naukowe przybory laboratoryjne	16127
Wersja testowania biomateriałów LabJoy CellScale	10.66
Przemieszczenie laserowe Czujnik	Keyence	IL-030
Płynny klej cyjanoakrylowy	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Wersja 2020a
Mikronożyczki	HTI Instruments	CAS55C
Pipeta	Belmaks	360758081051Y4
Spolaryzowane urządzenie do obrazowania w domenie częstotliwości przestrzennej	Nie dotyczy		Wykonane we własnym zakresie przy użyciu cyfrowego projektora światła, polaryzatora liniowego, obrotowego mocowania polaryzatora i kamery urządzenia sprzężonego z ładunkiem. Więcej informacji można znaleźć w doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699).
Skalpel	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Przemysłowe żyletki z pojedynczą krawędzią (chirurgiczna stal węglowa)		VWR International
Szpilki teowe
Tablica woskowa	Nie dotyczy		Wykonane we własnym zakresie przy użyciu wosku modelarskiego i blachy do pieczenia
Łódka wagowa	Pure Ponta	mdo-azoc-1030