Artykuł metodologiczny

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63529

⸱

11 lutego 2022

 , 
1Department of Cell, Developmental, and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Streszczenie

Organizmy wielokomórkowe polegają na interakcjach między receptorami błonowymi i pokrewnymi ligandami w otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do zarządzania wieloma funkcjami, w tym adhezją, proliferacją, migracją i różnicowaniem. Siły mechaniczne mogą być przenoszone z komórki za pośrednictwem integryny receptora adhezyjnego do ligandów w ECM. Ilość i organizacja przestrzenna tych sił generowanych przez komórki może być modulowana przez receptory czynnika wzrostu, w tym receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR). Obecnie dostępne narzędzia do ilościowego określania zmian w mechanice komórek spowodowanych przesłuchami i powiązania ich ze zrostami ogniskowymi, morfologią komórkową i sygnalizacją są ograniczone. Do ilościowego określenia tych zmian wykorzystano oparte na DNA czujniki siły molekularnej, znane jako uwięzi miernika napięcia (TGT). Sondy TGT są wyjątkowe pod względem zdolności zarówno do modulowania podstawowego progu siły, jak i raportowania sił receptora w skali Piconewtona na całej przylegającej powierzchni komórki w rozdzielczości przestrzennej ograniczonej dyfrakcją. Zastosowane tutaj sondy TGT opierają się na nieodwracalnej dysocjacji dupleksu DNA przez siły receptor-ligand, które generują sygnał fluorescencyjny. Pozwala to na ilościowe określenie skumulowanego napięcia integryny (historii sił) komórki. W artykule opisano protokół wykorzystujący TGT do badania wpływu EGFR na mechanikę integryny i tworzenie adhezji. Montaż mechanicznej platformy detekcyjnej TGT jest systematycznie szczegółowy, a procedura obrazowania sił, zrostów ogniskowych i rozprzestrzeniania się komórek jest nakreślona. Ogólnie rzecz biorąc, zdolność do modulowania podstawowego progu siły sondy, liganda adhezyjnego oraz rodzaju i stężenia czynnika wzrostu zastosowanego do stymulacji sprawiają, że jest to solidna platforma do badania wzajemnych oddziaływań różnych receptorów błonowych w regulacji sił za pośrednictwem integryny.

Wprowadzenie

Komórki mają wrodzoną zdolność do wyczuwania, generowania i reagowania na siły mechaniczne, co prowadzi do zmian w fenotypie komórkowym i przebudowy lokalnego mikrośrodowiska1,2. Siły odgrywają kluczową rolę w regulacji wielu aspektów zachowania komórek, w tym adhezji, migracji, proliferacji, różnicowania i gojenia się ran3,4. Aberracje w dwukierunkowej wymianie mechanicznej między komórką a mikrośrodowiskiem mogą prowadzić do stanów chorobowych, w tym raka5. Liczne receptory błonowe są zaangażowane w utrzymanie homeostazy macierzy komórkowej; spośród nich integryny i receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) wykazują silną synergię6,7. Klasycznie integryny ustanawiają mechaniczne połączenie między mikrośrodowiskiem a wewnątrzkomórkowym cytoszkieletem, podczas gdy EGFR reguluje wzrost, proliferację i przeżycie komórek8,9. EGFR jest wysoce zbadanym celem terapeutycznym, skoncentrowanym na regulacji zewnętrznej ułatwiającej sygnalizację wewnątrzkomórkową. Przesłuch EGFR-integryna został ustalony genetycznie i biochemicznie w celu regulacji postępu wielu chorób, w tym raka10,11. Podczas gdy badania wskazują na istnienie wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna, wyniki przypisuje się szlakom sygnałowym z dala od błony komórkowej7,12,13,14. Wpływ EGFR lub innych czynników wzrostu na mechanikę komórek pozostaje w dużej mierze niezbadany, częściowo z powodu braku narzędzi do pomiaru sił komórkowych i wyników sygnalizacji. Wyzwanie polega na zidentyfikowaniu odpowiednich narzędzi do badania komunikacji między tymi równoległymi paradygmatami sygnalizacji i ilościowego określenia ich konkretnego wkładu w mechanikę komórki.

Opracowano kilka podejść do pomiaru sił generowanych przez receptory adhezyjne komórek, a czytelnik jest kierowany do szczegółowych recenzji tych technik15,16. Krótko mówiąc, mikroskopia sił trakcyjnych i detekcja matryc mikrofilarów opierają się na deformacji podłoża w celu wywnioskowania sił nanoniutonów (nN), o rząd wielkości większych niż siły poszczególnych receptorów17,18. Techniki jednocząsteczkowe, w tym AFM i pęseta optyczna, są wrażliwe na siły pikonewtonu pojedynczego białka (pN), ale mierzą tylko jeden receptor na raz i nie oferują dobrej (lub żadnej) rozdzielczości przestrzennej. Sondy napięcia molekularnego oparte na DNA i sondy TGT oferują rozdzielczość siły pN z ograniczoną dyfrakcją (lub lepszą) rozdzielczością przestrzenną, co nadaje im wyjątkową rolę w badaniu sił pojedynczych komórek19,20 z różnych typów komórek, w tym fibroblastów, komórek rakowych, płytek krwi i komórek odpornościowych21,22,23,24. Podczas gdy sondy napięcia molekularnego mają wysuwany element "sprężynowy", idealny do obrazowania w czasie rzeczywistym, sondy TGT nieodwracalnie pękają, pozostawiając fluorescencyjną "historię sił". TGT dodatkowo modulują próg naprężenia podłoża znajdującego się pod spodem; seria sond o podobnym składzie chemicznym, ale różnych siłach zerwania lub tolerancjach naprężenia (Ttol) może być wykorzystana do ilościowego określenia minimalnego napięcia wymaganego do tworzenia adhezji ogniskowej i rozprzestrzeniania się komórek. Sondy TGT składają się z dwóch komplementarnych nici DNA, z których jedna jest zakotwiczona w powierzchni, a druga przedstawia komórce ligand. Jeśli receptor wiąże ligand i wywiera siłę większą niżT tol sondy, nici zostaną rozdzielone. Ttol definiuje się jako stałą siłę potrzebną do rozerwania 50% sond w odstępie 2 s w idealnych warunkach. W "włączających" sondach TGT wygaszacz na górnym splocie można oddzielić od fluoroforu na dolnym splocie. Tylko w przypadku, gdy sonda TGT została zerwana, przypuszczalnie przez siły większe lub równe Ttol, zostanie wygenerowany sygnał fluorescencyjny. Sondy TGT mogą być również zamocowane, co pozwala na łatwą manipulację systemami biologicznymi i testowanie wielu warunków. Z tych powodów w pracach wykorzystano sondy TGT.

Sondy TGT zostały wykorzystane do zbadania, jak zależne od integryny adhezja komórek i siły mechaniczne są modulowane przez aktywowany EGFR21. Prace te ugruntowały pozycję EGFR jako "mechano-organizatora", dostrajającego organizację przyczepności ogniskowej i generowanie naprężeń. Ponadto stwierdzono, że stymulacja EGF wpływa na dystrybucję i dojrzałość zrostów ogniskowych oraz zwiększa rozprzestrzenianie się komórek. Podejście to może zostać wykorzystane w przyszłych badaniach w celu zbadania, w jaki sposób czynniki wzrostu wpływają na siły mechaniczne w progresji i dynamice guza. Podczas gdy rola przesłuchu EGFR-integryna w regulacji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego jest już ustalona, rola sił mechanicznych w tym procesie pozostaje niedostatecznie zbadana10.

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół dla tych eksperymentów, obejmujący syntezę i montaż 56 sond TGT pN, generowanie powierzchni TGT na szklanych szkiełkach nakrywkowych, zastosowanie komórek Cos-7 na powierzchni TGT i stymulację EGF, utrwalanie i barwienie komórek falloidyną oraz przeciwciałem anty-paxillin, obrazowanie wysokiej rozdzielczości całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) i mikroskopii kontrastowej interferencji odbicia (RICM), i kwantyfikacja obrazu. Protokół ten, choć napisany w celu zbadania stymulacji EGF komórek Cos-7, można łatwo dostosować do wielu eksperymentów opartych na TGT. Różne ligandy, Ttol, typy komórek, parametry stymulacji, białka znakowane po utrwaleniu i analiza ilościowa mogą być łatwo zastąpione, dzięki czemu protokół ten jest solidny i szeroko użyteczny.

Protokół

1. Przygotowanie oligonukleotydów TGT

UWAGA: Szczegóły syntezy sondy oligonukleotydowej są opisane tutaj. Należy pamiętać, że niektóre modyfikacje i etapy oczyszczania można zlecić na zewnątrz w celu niestandardowej syntezy.

  1. Aktywuj pierwszorzędową aminę peptydu cyklo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] za pomocą łącznika azydko-NHS, jak opisano przez Zhang et al22 przez zmieszanie w stosunku 1:1,5 (100:150 nmol) w końcowej objętości 10 μl dimetyloformamidu. Dodać 0,1 μl organicznej bazy trietyloaminy i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 4°C.
  2. Oczyść produkt za pomocą HPLC z odwróconymi fazami przy użyciu 0,1 M TEAA (rozpuszczalnik A) i 100% acetonitrylu (rozpuszczalnik B) o natężeniu przepływu 1 ml / min i stanie początkowym 10% rozpuszczalnika B ustawionym na gradient 0,5% / min. Połącz eluowane piki (absorbancja przy 203 nm) i sprawdź za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Produktem jest azydek cRGDfK.
  3. Aby wygenerować górną nić TGT, połącz cRGDfK-azydek i oligonukleotyd alkino-21-BHQ2 (górna nić TGT: 5Hexynyl/GTGAAATACCGCACAGATGCG/3BHQ_2) w stosunku 2:1 ( ͂200 μM: 100 μM) w 100 μL 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 5 mM askorbinianu sodu i 0,1 μM wstępnie uformowanym Cu-THPTA. Pozostawić reakcję na co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Przetrzyj mieszaninę przez żel odsalający P2, aby usunąć nadmiar barwnika, produktów ubocznych, rozpuszczalnika organicznego i nieprzereagowanych odczynników. Przygotuj kolumnę wirówkową z 650 μl wstępnie uwodnionego żelu P2, obracając ją w dół z prędkością 18 000 x g przez 1 minutę. Odrzucić ciecz przepływową i dodać mieszaninę reakcyjną. Wirować ponownie przy 18 000 x g przez 1 minutę i zebrać przepływ. Doprowadzić mieszaninę reakcyjną do końcowej objętości 300 μl wodą ultraczystą.
    UWAGA: Wstępnie nawilżaj żel P2 wodą przez 6 godzin.
  5. Oczyścić odsoloną mieszaninę reakcyjną za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Rozpuszczalniki organiczne używane do tego oczyszczania to 0,1 M TEAA wH2O(rozpuszczalnik A) i 100% MeCN (rozpuszczalnik B lub faza ruchoma).
    1. Przed wstrzyknięciem mieszaniny należy zrównoważyć kolumnę z początkowym stanem 10% rozpuszczalnika B o nachyleniu 1%/min. Dostosować natężenie przepływu do 1 ml/min. Wstrzyknąć mieszaninę reakcyjną do pętli HPLC za pomocą igły iniekcyjnej o pojemności 500 μl.
    2. Zbierz produkt, wizualizując szczytową absorpcję przy 260 nm dla DNA i 560 nm dla wygaszacza BHQ2. Wymyty produkt suszyć przez noc w próżniowym koncentratorze odśrodkowym.
  6. Zastosuj substytucję nukleofilową, aby połączyć dolną nić TGT z estrem Cy3B-NHS, jak opisano w Ma et. al25. Zmieszać 100 μM dolnej nici TGT o sile 56 pN (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT) z 50 μg estru Cy3B-NHS wstępnie rozpuszczonego w 10 μl DMSO. Dostosuj pH tej mieszaniny do 9 za pomocą 0,1 M wodorowęglanu sodu i doprowadź końcową objętość do 100 μl za pomocą 1x PBS. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
  7. Oczyszczać mieszaninę sekwencyjnie, stosując filtrację w żelu P2 i HPLC z odwróconymi fazami w celu oddzielenia nieprzereagowanych odczynników, soli i rozpuszczalników organicznych (opisanych w krokach 1.4 i 1.5).
  8. Oszacować stężenie oczyszczonych koniugatów oligonukleotyd-barwnik, rejestrując ich absorbancję przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometru.
  9. Scharakteryzować oczyszczone produkty za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Rozpuścić nadmiar kwasu 3-hydroksypikolinowego w rozpuszczalniku TA50 (acetonitryl 50:50 v/v i 0,1% TFA wddH2O) w celu przygotowania świeżej matrycy MALDI. Szacunkowe i zmierzone masy cząsteczkowe dla oznakowanych produktów to: cRGDfK-1-BHQ2 - 8157.9 (obliczone), 8160.1 (znalezione); Cy3B oznaczony 56 pN TGT - 10272.7 (obliczony), 10295.8 (znaleziony).
  10. Górną i dolną nić należy rozpuścić oddzielnie w wodzie wolnej od nukleaz o stężeniu 30-50 μM. Aby uniknąć zanieczyszczenia materiału, należy używać końcówek do pipet bez DNaz. Przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku zastosowań krótkotrwałych lub -20 °C w przypadku zastosowań długotrwałych. Na stabilność oligonukleotydów nie mają wpływu powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania.

2. Przygotowanie powierzchni

Dzień 1:

  1. Umieść szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm (do 8) w stojaku z politetrafluoroetylenu. Umieść stojak w zlewce borokrzemianowej o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml 200-procentowego etanolu. Przykryj zlewkę filmem parafinowym, aby uniknąć przedostawania się wody i poddaj sonifikacji z częstotliwością roboczą 35 kHz przez 10-15 minut przy RT (Rysunek 1A).
  2. Napełnij zlewkę o pojemności 50 ml 40 ml roztworu piranii świeżo przygotowanego przez zmieszanie kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru w stosunku 3:1 w zlewce pyreksowej. Wymieszać szklaną pipetą. Przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki i inkubować przez 30 minut w temperaturze suchej w dygestoriach w celu wytrawienia powierzchni szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1B).
    UWAGA: Noś pełne środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i gogle, i pracuj w okapie oparów chemicznych. Powoli dodawaj nadtlenek wodoru do kwasu, aby zapobiec przegrzaniu roztworu.
  3. Po wytrawieniu użyj pęsety, aby przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki z ultraczystą wodą. Powtórz ten krok sześć razy w odstępach 15 sekund, aby całkowicie zneutralizować kwas (Rysunek 1C).
    UWAGA: Pozostaw roztwór Piranha w okapie chemicznym na noc przed wyrzuceniem go do pojemnika na odpady kwasowe.
  4. Sprawdź wzrokowo szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że powierzchnie wyglądają na czyste, bez wzorów i cząsteczek kurzu na powierzchni szkła. Powtórz kroki 2.1-2.4, jeśli zostaną wykryte wzory lub kurz.
    UWAGA: Przetestuj hydrofilowość powierzchni, zanurzając obrobione szkiełka nakrywkowe w wodzie i usuwając je pionowo. Woda na obrobionych szkiełkach nakrywkowych cofa się jako jednolity arkusz, tworząc pierścienie Younga, w porównaniu z nieobrobionymi szkiełkami nakrywkowymi, które tworzą plamy.
  5. Przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki z 200-procentowym etanolem i myć dwukrotnie przez 15 sekund, aby wyrównać powierzchnię z rozpuszczalnikiem organicznym. Przenieś stojak na szkiełka nakrywkowe do 200-procentowego roztworu etanolu z 3% APTES przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu silanizowania szkiełek nakrywkowych (Rysunek 1D). Przykryj zlewkę folią parafinową.
    UWAGA: Parametry osadzania APTES różnią się w zależności od metody czyszczenia powierzchni, zawartości wody w rozpuszczalniku, stężenia APTES, czasu inkubacji i temperatury wyżarzania.
  6. Zanurz ruszt w czystej zlewce z 200-procentowym roztworem etanolu. Powtórz to pranie trzy razy przez 15 s każde (Rysunek 1E).
  7. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe przy użyciu azotu (N2) o niskim ciśnieniu wyjściowym. Umieść szkiełka nakrywkowe w naczyniu styropianowym o grubości 10 cm, w którym płasko ułożysz kawałek folii parafinowej. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są suche i oddzielone (Rysunek 1F).
  8. Dodać 100 μl roztworu biotyny NHS o stężeniu 2 mg/ml w DMSO do czterech szkiełek nakrywkowych umieszczonych na folii parafinowej. Ustaw "kanapkę" z pozostałymi czterema szkiełkami nakrywkowymi na wierzchu (dwa szkiełka nakrywkowe skierowane do siebie z roztworem funkcjonalizacyjnym pomiędzy nimi) i inkubuj naczynie przez noc w temperaturze 4 °C (Rysunek 1G).
    UWAGA: W temperaturze 4 °C odczynnik NHS jest bardziej stabilny, co ułatwia równomierną funkcjonalizację powierzchni. Dodatkowo kanapka oszczędza odczynniki. Unikaj dodawania nadmiaru roztworu do kanapki, ponieważ może on wyciekać i powodować ślizganie się szkiełek nakrywkowych.

Dzień 2:

  1. Zdjąć naczynie z 4 °C i oddzielić ułożone warstwowo szkiełka nakrywkowe. Ustaw zrazy w stojaku tak, aby powlekana powierzchnia była skierowana do siebie, jak pokazano na Rysunek 2A. Umyj je 200-procentowym roztworem etanolu trzy razy przez 15 s każde. Wysuszyć gazem N2 i umieścić je w nowym naczyniu z folią parafinową w środku.
    UWAGA: Ułożenie szkiełek nakrywkowych zgodnie z zaleceniami pomaga zidentyfikować funkcjonalizowaną powierzchnię.
  2. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1 ml 1x PBS, aby zrównoważyć je z powrotem do fazy wodnej. Dodać 800 μl 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS (w/v) do każdego z szkiełek nakrywkowych i inkubować w temperaturze RT przez 30 minut, aby pasywować powierzchnię i zablokować niespecyficzne wiązanie kolejnych odczynników funkcjonalizacyjnych (Rysunek 2B).
  3. Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1 ml 1x PBS. Dodaj 800 μl 1 μg/ml streptawidyny w 1x PBS w temperaturze RT przez 45-60 minut, aby funkcjonalizować szkiełka nakrywkowe (Rysunek 2C).
    UWAGA: Zachowaj jedno szkiełko nakrywkowe bez streptawidyny, aby sprawdzić skuteczność pasywacji (opcjonalnie). Add10 nM biotynylowane cząsteczki i obraz w warunkach eksperymentalnych. Ta intensywność powierzchni powinna być zbliżona do ciemnego szumu aparatu.
  4. Równocześnie z krokiem 2.11 zmontuj sondy TGT (góra: dolna nić w stosunku molowym 1:1) o końcowym stężeniu 50 nM w 100 μl 1 M NaCl w probówce do PCR za pomocą termocyklera. Dysocjuj pasma w temperaturze 95 °C przez 5 minut i stopniowo wyżarzaj, obniżając temperaturę do 25 °C i utrzymując ją przez 25 minut (Rysunek 2D). Unikaj długotrwałej ekspozycji sond TGT na światło.
  5. Po inkubacji streptawidyny należy użyć 1x PBS do trzykrotnego umycia szkiełek nakrywkowych. Dodać 100 μl wstępnie zmontowanych sond TGT do czterech szkiełek nakrywkowych i przygotować kanapki, używając pozostałych 4 szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowaną stroną skierowaną w stronę sond (osiem powierzchni wymaga czterech probówek zhybrydyzowanych sond TGT). Przykryj folią aluminiową i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić związanie sondy z powierzchnią (Rysunek 2E).
  6. Po inkubacji oddziel kanapki i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x PBS. Powierzchnie TGT są teraz gotowe do obrazowania. Ostrożnie zmontuj szkiełka nakrywkowe we wstępnie oczyszczonych komorach obrazowania i dodaj 1x PBS, aby utrzymać nawilżenie powierzchni (Rysunek 2F).
    UWAGA: Zbyt mocne dokręcenie komór spowoduje pęknięcie powierzchni. Zapobiegaj wysuszaniu powierzchni.

3. Przygotowanie i barwienie komórek

  1. Aby zbadać wpływ stymulacji naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) na mechanikę Cos-7, adhezję i rozprzestrzenianie się komórek, trypsynizuj komórki Cos-7 0,05% Trypsiną-EDTA przez 2 min. Zneutralizuj trypsynę, przemywając HBSS i odwirowując przy 800 x g przez 5 min. Powtórz etap neutralizacji jeszcze raz.
  2. Komórki płytkowe o gęstości 4 x 104 komórki na zmontowanych powierzchniach TGT w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 50 ng/ml EGF lub DMEM bez EGF. Pozwól komórkom rozprzestrzeniać się przez 60 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych (Rysunek 3A).
    UWAGA: Komórki inkubuje się w DMEM bez surowicy, aby uniknąć stymulacji czynnikami wzrostu. EGF rozcieńcza się w 10 mM kwasie octowym, aby uzyskać zapas 1 mg/ml. Jest stosowany w stężeniu 50 ng / ml w DMEM do eksperymentów obrazowych.
  3. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie 1x PBS i utrwal 2 ml 4% paraformaldehydu przez 12 minut w temperaturze RT (Rysunek 3B).
    UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji są wykonywane na wytrząsarce obrotowej z prędkością ~35 obr./min w celu równomiernego rozprowadzenia roztworów. Chroń powierzchnie TGT przed światłem, zakrywając je do momentu, gdy będą gotowe do obrazowania.
  4. Odessać utrwalacz i przemyć szkiełka nakrywkowe pięć razy 1x PBS w odstępach 5 minut w RT. Opcjonalnie inkubować szkiełka nakrywkowe z 50 mM NH4Cl w 1x PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu wygaszenia autofluorescencji związanej z paraformaldehydem i przemyć trzykrotnie 1x PBS w odstępach 5-minutowych (Rysunek 3B).
  5. Dodać bufor A (1x PBS, 5% normalna surowica końska, 5% normalna surowica kozia, 1% BSA, 0,025% Triton X-100) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu zablokowania i przepuszczalności komórek. Umyj trzy razy 1x PBS w odstępach 5 minut (Rysunek 3B).
  6. Umieść komory obrazowania ze szkiełkami nakrywkowymi w pojemniku na wilgoć. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-paksylinowe (ogniskowy marker adhezji) w stosunku 1:250 w buforze blokującym (1x PBS, 5% normalna surowica końska, 5% normalna surowica kozia, 1% BSA, 0,005% Triton x-100). Inkubować z 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełko nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (Rysunek 3B).
    UWAGA: Nie pozwól, aby powierzchnie wyschły.
  7. Umyj szkiełka nakrywkowe pięć razy 1x PBS w odstępach 5-minutowych i włóż je z powrotem do pojemnika na wilgoć. Znakować komórki jednocześnie mieszaniną sprzężonego z barwnikiem koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi w rozcieńczeniu 1:800 i sprzężonej z barwnikiem falloidyny (aktyny) w rozcieńczeniu 1:400 w 200 μl buforu blokującego na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut (Rysunek 3B).
  8. Umyj powierzchnie pięć razy 1x PBS w odstępach 5 minut i przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do obrazowania (Rysunek 3B).
    UWAGA: Próbki obrazu należy pobrać w ciągu 3 dni od przygotowania powierzchni, aby uniknąć degradacji sygnału.

4. Akwizycja obrazu

  1. Użyj obiektywu olejowego o powiększeniu 60x i dużej aperturze numerycznej (1,49) na mikroskopie odwróconym ze wzbudzeniem 488, 561 i 647 TIRF, wzbudzeniem RICM, doskonałym systemem ustawiania ostrości i aparatem cyfrowym.
    1. Dodaj olej do obiektywu, wyczyść spód szkiełka nakrywkowego w komorze na próbkę i umieść próbkę na stoliku. Skoncentruj się na komórce i zaangażuj się w idealne skupienie.
  2. Ustaw mikroskop w trybie obrazowania RICM ze wzbudzeniem epifluorescencyjnym i kostką filtra GFP z usuniętym filtrem emisyjnym. Wyrównaj RICM, zamykając i centrując przysłonę epi-illumination.
  3. Przełącz mikroskop w tryb TIRF ze wzbudzeniem laserowym i czteroprzebiegową kostką filtrującą TIRF. Ustaw ostrość laser 488 nm na małym punkcie na suficie pomieszczenia i zwiększaj kąt padania aż do przekroczenia kąta krytycznego, monitorując fluorescencję w kamerze w trybie na żywo. Obserwuj gwałtowne zmniejszenie fluorescencji tła i pojedynczą płaszczyznę ostrości po przekroczeniu kąta krytycznego.
    UWAGA: TIRF wzbudza cienki obszar (~100 nm) znajdujący się najbliżej granicy faz próbka-szkiełko nakrywkowe, podkreślając otwarte sondy TGT i zrosty ogniskowe, jednocześnie eliminując nieostrą fluorescencję z wnętrza komórki. Jeżeli TIRF nie jest dostępny, można zastosować epifluorescencję; Jednak stosunek sygnału do szumu będzie niższy.
  4. Zidentyfikuj komórki do obrazowania w trybie "na żywo" kamery za pomocą RICM.
  5. Uzyskaj obraz RICM i obrazy TIRF aktyny (640 nm ex), napięcia integryny (561 nm ex) i paxilliny (488 nm ex). Uzyskuj obrazy sekwencyjnie, korzystając z czasu naświetlania 200 ms.
    UWAGA: Czas naświetlania zależy od wielu czynników, w tym obiektywu, mocy lasera, filtrów emisyjnych i czułości aparatu. Sygnał powinien być co najmniej 2x większy niż tło. Tło wynosi około 1000 AU, więc sygnał powinien wynosić co najmniej 2000-3000 AU.
  6. Powtórz 4,4-4,5 dla co najmniej 30 komórek. Zmień szkiełka nakrywkowe, ustaw ostrość i powtórz 4,4-4,5.

5. Analiza danych

UWAGA: Wykonaj ilościową analizę obrazu za pomocą oprogramowania Fidżi i analizę za pomocą oprogramowania statystycznego.

  1. Otwórz zestaw obrazów dla jednej komórki.
  2. Utwórz maskę obszaru komórki (maskę RICM), śledząc granicę komórki na obrazie RICM za pomocą narzędzia do zaznaczania ImageJ Freehand. Zapisz obszar zainteresowania (ROI) w menedżerze ROI (Analyze > Tools > ROI manager) (Rysunek 4A1,2).
  3. Wybierz reprezentatywny obszar poza komórką na obrazie naprężenia integryny i narysuj ROI o wymiarach co najmniej 200 x 200 pikseli. Wyklucz wszelkie inne ogniwa lub zanieczyszczenia fluorescencyjne z ROI. Zmierz fluorescencję tła w ROI za pomocą narzędzia do pomiaru (Analizuj > Mierz) (Rysunek 4A3).
  4. Odejmij średnią fluorescencję tła uzyskaną w kroku 5.2 od obrazu rozciągania (Proces > Matematyka > Odejmij) (Rysunek 4A4).
  5. Użyj maski RICM utworzonej w kroku 5.2, aby zdefiniować sygnał naprężenia w śladzie komórki (menedżer ROI > Wybierz > Zastosuj maskę > Edytuj > Wyczyść na zewnątrz) (Rysunek 4A5).
  6. Utwórz maskę progową dla obrazu naprężenia przy użyciu metody automatycznego progowania Huanga (Obraz > Dostosuj próg >) (Rysunek 4A6). Upewnij się, że maska progowa najlepiej reprezentuje obszar generowanego naprężenia całkowania. Z reguły ustaw próg na 2x średnią fluorescencję tła.
  7. Utwórz wybór progowej maski rozciągania (Edytuj > Zaznaczenie > Utwórz) (Rysunek 4A7).
  8. Przenieś wybraną maskę na obraz naprężenia wygenerowany w kroku 5.4 i zmierz zintegrowaną intensywność otwartych sond (menedżer ROI > Wybierz (maska naprężenia) > Analizuj > mierz > RawIntDen) (Rysunek 4C).
  9. Zmierz obszar właściwości morfometrycznych komórki, okrągłość i współczynnik proporcji za pomocą maski RICM (menedżer ROI > Wybierz (maska RICM) > Zastosuj maskę > Analizuj > Zmierz) (Rysunek 4B).
  10. Zmierz gęstość mechanicznego pęknięcia, zdefiniowaną jako procent śladu ogniwa z pękniętymi sondami, wybierając obraz maski naprężającej i stosując maskę RICM (menedżer ROI > Wybierz (maska RICM) > Analizuj > Zmierz > %obszar) (Rysunek 4C).
  11. Eksport pomiarów w celu dalszej analizy i wizualizacji do oprogramowania statystycznego.
  12. Powtórz 5.1-5.11 dla każdej komórki.

Wyniki

Sondy TGT typu „turn-on” zostały wykorzystane do zbadania wpływu aktywowanego ligandem receptora epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR) na mechanikę komórek oraz tworzenie adhezji zapośredniczonej przez integryny w komórkach Cos-721. Sondy te zawierają ligand cykliczny Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)21,23,25,26, który wykazuje selektywność wobec heterodimeru integryny αVβ3 przy niewielkim powinowactwie do integryn α5β127,28,29,30. Sonda TGT składa się z dupleksu DNA zfunkcjonalizowanego na powierzchni szkiełka przedmiotowego via niższa nić za pomocą wiązania biotyna-streptawidyna. Górna nić eksponuje ligand integryny i jest dostępna do wiązania z odpowiadającym mu receptorem integrynowym na błonie komórkowej (Rysunek 5A). Niższa nić jest znakowana fluoroforem, a górna wygaszaczem, co prowadzi do minimalnej fluorescencji tła, gdy dupleks TGT pozostaje nienaruszony. Jeśli integryna zwiąże ligand i przyłoży siłę o wartości większej niż Ttol sondy, dupleks DNA rozdzielą się, co doprowadzi do emisji fluorescencji (Rysunek 5A). Każda sonda TGT, która nie została zerwana przez siłę mechaniczną, pozostanie niefluorescencyjna. Ta selektywna względem siły fluorescencja typu „turn-on” umożliwia systematyczne i ilościowe mapowanie generowanych przez integryny sił w skali pN z rozdzielczością ograniczoną dyfrakcyjnie. Sondy TGT dodatkowo modulują próg napięcia podłoża.

Przedstawiono tutaj reprezentatywny przykład powierzchni TGT z Ttol wynoszącym 56 pN. Komórki Cos-7 wysiano na tę powierzchnię TGT z lub bez stymulacji EGF, aby zbadać wpływ aktywacji EGFR przez liganda na adhezję komórek i mechanikę integryn (Rysunek 5A,B). Komórki inkubowano z lub bez EGF na powierzchniach TGT przez 60 min, po czym utrwalono i poddano immunobarwieniu w celu wykazania rozkładu adhezji ogniskowych (paksylina) oraz organizacji cytoszkieletu (aktyna F) (Rysunek 5B). Następnie wykonano obrazowanie komórek z wykorzystaniem mikroskopii RICM i TIRF. Jak wyraźnie widać na obrazie RICM, rozprzestrzenianie się komórek Cos-7 na powierzchni TGT 56 pN było znacznie silniejsze po stymulacji EGF w porównaniu do braku stymulacji. Ilościowo określono to dla 50 komórek w każdym wariancie, mierząc wielkość obszaru kontaktu komórka-podłoże na obrazie RICM (Rysunek 5C). Stymulacja EGF doprowadziła do uzyskania bardziej okrągłej morfologii, reprezentatywnej dla komórek Cos-7 rozprzestrzeniających się i rosnących w ich naturalnym środowisku fizjologicznym (Rysunek 5D). Fluorescencja otwartych sond jest również wyższa przy stymulacji EGF, co zaobserwowano na obrazie fluorescencji naprężeń. Zintegrowana intensywność otwartych sond, która jest proporcjonalna do ich liczby, była znacznie wyższa po stymulacji EGF w porównaniu do próby bez stymulacji (Rysunek 5B,E). Stanowi to obraz wszystkich oddziaływań receptor-ligand, w których integryny wywarły siłę większą niż Ttol (56 pN).

Barwienie na paksyllinę wykazało, że stymulacja EGF wpłynęła również na rozkład, liczbę, stopień dojrzałości (rozmiar) oraz organizację adhezji ogniskowych. Adhezje ogniskowe w komórkach stymulowanych EGF wydawały się bardziej dojrzałe i zorientowane radialnie w porównaniu z kontrolami bez EGF. Organizacja cytoszkieletu aktynowego (F-aktyny) była również wzmocniona po stymulacji EGF, co oceniono za pomocą barwienia falloidyną (Rycina 5B). Te oceny jakościowe przeprowadzono poprzez wizualne porównanie obrazów z obu grup badawczych. Możliwa jest analiza ilościowa adhezji ogniskowych, jednak wykracza ona poza zakres niniejszego protokołu. W tym doświadczeniu powierzchnia TGT zapewniła platformę do systematycznego szczegółowego opisania wpływu aktywacji EGFR na rozprzestrzenianie się komórek, mechanikę integryn oraz tworzenie adhezji ogniskowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat pierwszego dnia przygotowania powierzchni TGT. (A) Oczyszczanie szkiełek coverglass. (B) Trawienie powierzchni szkiełek. (C) Neutralizacja roztworu Piranha. (D) Silanizacja powierzchni w celu utworzenia reaktywnych grup aminowych. (E) Równoważenie szkiełek względem fazy organicznej. (F) Suszenie szkiełek gazem obojętnym. (G) Biotynylacja aminowych grup powierzchniowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat drugiego dnia przygotowania powierzchni TGT. (A) Oczyszczenie i osuszenie szkiełek nakrywek w celu usunięcia resztek biotyny z dnia poprzedniego. (B) Pasywacja BSA w celu zapobiegania nieswoistemu wiązaniu odczynników w kolejnych etapach. (C) Funkcjonalizacja szkiełek nakrywek streptawidyną. (D) Hybrydyzacja sond w termocyklerze. (E) Nałożenie zsyntetyzowanych sond na szkiełka nakrywki. (F) Montaż szkiełka nakrywki w komorze do obrazowania komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ogólny schemat przedstawiający główne etapy całego układu eksperymentalnego. (A) Proces odrywania komórek i wysiewania ich na powierzchnię TGT w pożywce podstawowej (DMEM) z lub bez stymulacji EGF. (B) Schemat blokowy kroków związanych z fiksacją i immunobarwieniem po przyczepieniu i rozprzestrzenianiu się komórek na powierzchni TGT. (C) Po barwieniu komórki są obrazowane przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z wykorzystaniem mikroskopii RICM i TIRF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykład przetwarzania danych i analizy ilościowej. (A) Etapowy opis potoku analizy wykorzystanego w programie Fiji (ImageJ) do ilościowego pomiaru obrazów RICM i naprężeń. (B) Reprezentatywny przykład wyników morfometrycznych komórek analizowanych za pomocą powyższego potoku. (C) Reprezentatywne przykłady wyników mechanicznych komórek analizowanych za pomocą wyżej wspomnianego potoku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5Przykładowe dane z eksperymentu TGT. (A) Schemat przedstawiający strefę kontaktu na interfejsie błony komórkowej i powierzchni TGT. Wstawka przedstawia integryny wchodzące w interakcję z ligandem cRGDfK po stymulacji EGF (po prawej) lub bez stymulacji EGF (po lewej). (B) obrazy RICM i TIRF komórek Cos-7 rozprzestrzenionych na powierzchni TGT o sile 56 pN. Obrazy uzyskano 60 minut po wysiewaniu, z lub bez stymulacją EGF. Przedstawiono poszczególne obrazy RICM (surowe), napięcia integryn (skala szarości), paxylliny (pomarańczowy hot) oraz aktyny F (niebiesko-zielony) wraz z nałożonymi obrazami dla obu warunków stymulacji. Pasek skali: 10 μmWstawka przedstawia powiększony ROI (obszar zainteresowania), szczegółowo ukazujący kolokalizację generowanego napięcia integryn w miejscach tworzenia się adhezji znakowanych paksylliną oraz leżącą u podstaw organizacji subkomórkowego cytoszkieletu znakowanego aktyną. Pasek skali: 5 μm. (C-E) Wykresy rozrzutu dla powierzchni rozprzestrzenienia (obrysu komórki w RICM) (C), kolistość (D), oraz zintegrowane napięcie (E) dla komórek Cos-7 ze stymulacją EGF lub bez niej. Słupki oznaczają średnią ± odchylenie standardowe. Różnice między grupami oceniono statystycznie za pomocą testu t Studenta t-test; ****P < 0,001. n = 50 komórek w trzech niezależnych eksperymentach. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Przykłady powierzchni TGT z różnymi możliwymi problemami. (A) Obrazy napięcia i RICM idealnej powierzchni TGT zmontowaną sondą wygaszoną przed adhezją komórek. (B) Obrazy napięcia i RICM powierzchni TGT, w której sonda TGT nie posiada górnej nici (wygaszacza). Obraz napięcia wykazuje jednorodną fluorescencję z otwartego fluoroforu w nici dolnej. (C) Obrazy napięcia i RICM dla komórek rozprzestrzenionych na idealnej powierzchni TGT. (D) Obrazy napięcia i RICM dla komórek rozprzestrzenionych na źle przygotowanej powierzchni TGT z ograniczoną pasywacją lub zdegradowaną sondą. (E) Obrazy napięcia, RICM i w jasnym polu dla komórek wysianych na idealnej powierzchni z ligandem cRGDfK, wskazujące, że interakcje cRGDfK-integryna są kluczowe dla przylegania komórek i generowania napięcia. (F) Obrazy napięcia, RICM i w jasnym polu dla komórek wysianych na powierzchni bez ligandu cRGDfK na TGT. Chociaż komórki są widoczne na obrazie w jasnym polu, nie obserwuje się przylegania komórek ani generowania napięcia integrynowego. Pasek skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Dzięki szczegółowej procedurze krok po kroku opisanej powyżej, można przygotować powierzchnie TGT w celu ilościowego określenia morfologii komórek i napięcia integryny generowanego przez przylegające komórki podczas przyłączania i rozprzestrzeniania się komórek po leczeniu EGF. Prosta konstrukcja sondy, synteza i przygotowanie powierzchni wraz z prostą konfiguracją eksperymentalną zapewniły stabilną platformę do badania interakcji EGFR i integryn. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki potwierdzają, że zależna od ligandu aktywacja EGFR zwiększa rozprzestrzenianie się komórek, dostraja właściwości przenoszące siłę receptorów integryny oraz wspomaga organizację i dojrzewanie adhezji ogniskowej. Wyniki uzyskane za pomocą sond TGT potwierdzają nadrzędną hipotezę, że czynniki wzrostu, takie jak EGFR, działają jako "mechano-organizatorzy", zwiększając ilość i organizację przestrzenną napięcia integryny oraz regulując orientację i mechanikę zrostów ogniskowych.

Po nałożeniu na powierzchnię TGT komórki lądują, przyłączają się i rozprzestrzeniają, gdy receptory integryny (αVβ3) wyczuwają i wiążą się z ligandem cRGDfK. W ten sposób sondy TGT mogą zostać mechanicznie rozerwane, generując fluorescencję w miejscu zaangażowania ligandów. Odczyt jest skumulowaną "historią sił" komórki oddziałującej z powierzchnią. Istnieje kilka typowych problemów z powierzchniami TGT, które mogą występować podczas tych eksperymentów. Wysoka fluorescencja tła powierzchni (rysunek 6A,B), niejednolity wygląd powierzchni, niezdolność komórek do generowania sygnału napięcia (rysunek 6C,D) i niepowodzenie komórek w rozprzestrzenianiu się (rysunek 6E,F) mogą być spowodowane wadami technicznymi sondy TGT lub syntezy powierzchniowej. Rozwiązania tych typowych problemów przedstawiono w tabeli 1.

Prosta konstrukcja sond TGT zapewnia biologom komórkowym potężne narzędzie do badania określonych wyników sygnalizacji integryny czynnika wzrostu w izolacji, bez zakłóceń ze strony innych receptorów na powierzchni komórki, dostarczając tylko określone ligandy i stymulacje. Dodatkowo sondy TGT pozwalają na badanie progu napięcia podkreślającego poszczególne receptory integrynowe podczas adhezji komórek przy czułości pN. Alternatywne podejścia nie uwzględniają sił wywieranych przez poszczególne receptory z wysoką rozdzielczością przestrzenną w ustalonych próbkach31. Mikroskopia sił trakcyjnych jest czuła tylko na siły nN, o rząd wielkości wyższe niż siły przyłożone przez poszczególne receptory integryny15, a sondy napięcia molekularnego mierzą siły pN, ale ponieważ są odwracalne, nie wytrzymują solidnie fiksacji. Z tych powodów sondy TGT są atrakcyjnym narzędziem do badania mechaniki oddziaływań czynnik wzrostu-integryna.

Istnieje kilka niuansów technicznych związanych z sondami TGT, które należy wziąć pod uwagę przed zaprojektowaniem eksperymentu. Obraz napięcia jest migawką w czasie, reprezentującą historię siły, a nie wskaźnikiem zaangażowania receptor-ligand w dowolnym punkcie czasowym. Ponieważ generowanie sygnału zależy od separacji sondy, fluorescencja TGT wynika z otwartych sond, które nie są pod aktywnym napięciem spowodowanym zaangażowaniem receptor-ligand. Oznacza to, że odczyt naprężenia całki uzyskany na powierzchni TGT ma charakter historyczny i kumulatywny, reprezentujący miejsca, w których występowały siły większe niż Ttol; lokalizacje obecnych sił receptor-ligand mniejszych niż Ttol nie są podane19,32. Ponieważ pęknięcie TGT powoduje zakończenie zaangażowania receptor-ligand, rozprzestrzenianie się komórek jest spowodowane interakcjami integryna-ligand, które doświadczają sił niższych niż Ttol. Użytkownik musi zatem zachować ostrożność podczas definiowania czasu po poszyciu, aby oszacować wyniki mechaniczne związane z adhezjami na bazie integryn. Na koniec należy rozważyć znaczenie Ttol. Zastosowane tutaj sondy TGT mają Ttol 56 pN, gdzie Ttol jest stałą siłą potrzebną do rozerwania 50% sond przy zastosowaniu przez 2 s. Biorąc pod uwagę skomplikowane systemy biologiczne, TGT prawdopodobnie doświadczają niejednorodnej i zróżnicowanej gradacji sił z różnymi zależnościami czasowymi. Jeśli TGT zostaną rozerwane przez siły większe niż Ttol, fluorescencja byłaby niedoszacowaniem całkowitego napięcia. Alternatywnie, siły poniżej Ttol przyłożone przez dłuższy czas mogą spowodować pęknięcie podobnej liczby sond, co wysokie siły progowe przyłożone przez krótszy czas. Oba te scenariusze mogą skutkować takim samym odczytem intensywności fluorescencji, co utrudnia określenie dokładnej wielkości lub dynamiki naprężenia przy użyciu sond TGT33,34.

Ogólnie rzecz biorąc, oceny napięcia integryny ze stymulacją czynnikiem wzrostu powinny być dokonywane ostrożnie, projektując eksperymenty z kontrolami wewnętrznymi, porównując profile rozprzestrzeniania się na innych powierzchniach pokrytych matrycą, dokonując równoległych ocen fluorescencji TGT w komórkach w obecności lub bez stymulacji czynnika wzrostu oraz stosując TGT o różnym Ttol. TGT umożliwiają ilościowe określenie roli sygnalizacji czynnika wzrostu w regulacji mechaniki receptorów integrynowych, dynamiki adhezji ogniskowej i rozprzestrzeniania się komórek. Protokół ten może być używany jako szablon dla wielu eksperymentów opartych na TGT przy użyciu sond o różnymT tol, różnych ligandach, różnych typach komórek lub różnych warunkach stymulacji. Dowolne białka będące przedmiotem zainteresowania mogą być znakowane po utrwaleniu i można zastosować dowolny rodzaj ilościowej analizy obrazu. W związku z tym przedstawiamy szablon dla wielu eksperymentów TGT.

Zastosowanie sond TGT nie ogranicza się do badania integryn, ale można je rozszerzyć na różnorodny zestaw receptorów błony komórkowej w różnych typach komórek poprzez modyfikację ligandu. Sondy TGT wykorzystano do zbadania roli sił w regulacji różnych kaskad sygnalizacji receptorów, w tym do identyfikacji mechanicznej roli mechaniki receptora Notch w rozwoju embrionalnym i neurogenezie35, sił pośredniczących w identyfikacji i internalizacji antygenów przez receptory komórek B36 oraz zdolności mechanicznej korekty receptorów powierzchniowych komórek T do wykrywania zmian sił w celu zwiększenia siły i swoistości transferu sygnału37. Łącznie odkrycia te podkreślają ogromny potencjał sond TGT w różnych warunkach eksperymentalnych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Mattheyses za owocne dyskusje i krytykę. Potwierdzamy finansowanie dla A.L.M. z NSF CAREER 1832100 i NIH R01GM131099.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-Aminopropylo)trietoksysilanMillipore Sigma440140Przygotowanie powierzchni
Kwas 3-hydroksypikolinowy (3-HPA)Millipore Sigma56197Maldi-TOF-MS Matrix
Kwas octowy, lodowatyFisher ScientificA38SRozcieńczanie EGF
Acetonitryl (HPLC)Fisher ScientificA998SKPreparat
Alexa Fluor 488Technologia sygnalizacji komórkowej8878SImmunocytochemia
Chlorek amonuFisher ScientificA687Immunocytochemia
Przeciwciało anty-paksylinowe [Y113]Abcamab32084Immunocytochemia
BD Strzykawki tylko z Luer-LokBD bioscience309657Przygotowanie powierzchni
Bio-Gel P-2Bio-Rad1504118Preparat oligonukleotydowy
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek wolny od proteazFisher ScientificBP9703100Przygotowanie powierzchni
Komórki Cos-7ATCCCRL-1651Hodowla komórkowa, numery pasażków 11-20
Mini-stojak na szkiełka nakrywkowe, na 8 szkiełek nakrywkowychFisher ScientificC14784Przygotowanie powierzchni
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8- Kwas amino-3,6-dioksaoktanowyVivitidePCI-3696-PIPreparat oligonukleotydowy
Ester Cy3B NHSGE HealthcarePA63101Preparat oligonukleotydowy Preparat oligonukleotydowy
dimetyloformamiduMillipore SigmaPHR1553
DMEM z L-glutaminą, glukozą 4,5 g / l i pirogronianem soduFisher ScientificMT10013CHodowla komórkowa
Naskórkowy czynnik wzrostu ludzki EGFMillipore SigmaE9644Etanol z hodowli komórkowych
, 200 dowodów (100%)Fisher Scientific22032601Przygotowanie powierzchni
Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowychFisher Scientific08-772EPrzygotowanie powierzchni
Płodowa surowica bydlęcaFisher Scientific10-438-026Flurobryt do hodowli komórkowych
DMEMFisher ScientificA1896701Hodowla komórkowa
koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21244Immunocytochemia
Surowica koziaFisher Scientific16-210-064Immunocytochemia
Hank' s zrównoważone sole (HBSS)Fisher Scientific14-170-161Hodowla komórkowa
Surowica koniaFisher Scientific16050130Immunocytochemia
Nadtlenek wodoruFisher ScientificH325-500Przygotowanie powierzchni
Urządzenia odśrodkowe Nanosep MFLaboratorium PallODM02C35Preparat oligonukleotydowy
NHS-azydekFisher Scientific88902Preparat oligonukleotydowy
Butla z azotemPrzygotowanie powierzchnigazu
nr 2 okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe - 25 mmVWR48382-085Przygotowanie powierzchni
Folia laboratoryjna Parafilm MFisher Scientific13-374-10Przygotowanie powierzchni
Paraformaldehyd 16%Fisher Scientific50-980-487Immunocytochemia
PBS, 1XFisher Scientific21-030-CVPrzygotowanie powierzchni/Immunocytochemia
Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)Fisher Scientific15-070-063Hodowla komórkowa
PYREX Low Form Griffin BeakersFisher Scientific02-540GPrzygotowanie powierzchni
Askorbinian soduFisher Scientific18-606-310Preparat oligonukleotydowy
Wodorowęglan soduFisher ScientificS233Preparat oligonukleotydowy
Chlorek soduFisher ScientificBP358Przygotowanie powierzchni
StreptawidynaFisher Scientific434301Przygotowanie powierzchni
Sulfo-NHS-LC-BiotynaFisher Scientific21335Przygotowanie powierzchni
Kwas siarkowyFisher ScientificA300-500Przygotowanie powierzchni
TEAAFisher ScientificNC0322726Preparat oligonukleotydowy
TriethylamineMillipore Sigma471283Preparat oligonukleotydowy
Kwas trifluorooctowy (TFA)Fisher ScientificPI28901Preparat oligonukleotydowy
THPTAFisher ScientificNC1296293Preparat oligonukleotydowy
Triton X 100 Detergent Surfact Ams RoztwórFisher Scientific85111Immunocytochemia
Woda, klasa DNA, DNASE, bez proteazyFisher ScientificBP24701Preparat oligonukleotydowy
Sprzęt
Agilent AdvanceBio Oligonukleotyd C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 μ mAgilent653950-702Preparat oligonukleotydowy
Wysokosprawna chromatografia cieczowaAgilent1100Preparat oligonukleotydowy
Wytrząsarka orbitalna o niskiej prędkościFisher Scientific10-320-813Immunocytochemia
Spektrometr masowy czasu przelotu wspomagany desorpcją laserową / jonizacją matrycy (MALDI-TOF-MS)Voyager STRPrzygotowanie oligonukleotydów
Sondy molekularne Komora komórkowa AttofluorFisher ScientificA7816Przygotowanie powierzchni
Nanodrop 2000 Spektrofotometr UV-VisThermo FisherPreparat oligonukleotydowy
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TiMikroskopiaNikon Nikon
Doskonały system ustawiania ostrościMikroskopia Nikon
Oprogramowanie NIS ElementsMikroskopiaNikon
ORCA-Flash4.0 V3 Cyfrowy aparat CMOSMikroskopia Hamamatsu
Czterozakresowa kostka TIRF 405/488/561/647 MikroskopiaCHROMA
Kostka RICM MikroskopiaCHROMA
SOLA V-nIR Light EngineLumencorMikroskopia
Thermo Forma Steri Cycle Inkubator CO2 370Fisher ScientificCell Culture
Myjka ultradźwiękowa VWR 75DVWR13710Przygotowanie powierzchni
< silny> Analiza danych< / strong>Zastosowanie
Fidżi (zdjęcie J)https://imagej.net/software/fiji/downloadsAnaliza ilościowa
Wykres Pad PryzmatAnaliza statystyczna
Nazwa oligo< / silny> 5' modyfikacja/ Modyfikacja 3' Sekwencja (5' do 3')Zastosowanie
Alkine-21-BHQ25' Heksynyl/ 3' BHQ_2GTGAAATACCGCACAGATGCGGGGGGG:Sonda TGT z górnym pasmem
56 pN TGT5' Biosg/ TTTTTT/iUniAmMCGCATCTGTGCGGTATTTCACTTTDolna nić sonda TGT
12 pN TGT5' AmMC6/ 3' BioTEGCGCATCTGTGCGGTATTTCACTTTDolna żyła sonda TGT
oligonukleotydowy falloidyny powietrznego pe

Bibliografia

  1. Lim, C. -G., Jang, J., Kim, C. Cellular machinery for sensing mechanical force. BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).
  2. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. (Micro)managing the mechanical microenvironment. Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).
  3. Vogel, V., Sheetz, M. P. Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering. Nanotechnology. , 233-303 (2010).
  4. Wang, J. H. C., Li, B. Mechanics rules cell biology. BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16(2010).
  5. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
  6. Streuli, C. H., Akhtar, N. Signal co-operation between integrins and other receptor systems. Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).
  7. Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg. Science Signaling. 11 (515), (2018).
  8. Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).
  9. De Luca, A., et al. The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment. Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).
  10. Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors. European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083(2020).
  11. Eliceiri, B. P. Integrin and growth factor receptor crosstalk. Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).
  12. Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901. OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).
  13. Giancotti, F. G., Tarone, G. Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling. Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).
  14. Ricono, J. M., et al. Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis. Cancer Research. 69 (4), 1383-1391 (2009).
  15. Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
  16. Hang, X., et al. Nanosensors for single cell mechanical interrogation. Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086(2021).
  17. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  18. Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection. Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).
  19. Ma, V. P. -Y., Salaita, K. DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems. Small. 15 (26), 1900961(2019).
  20. Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways. Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).
  21. Rao, T. C., et al. EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation. Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).
  22. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167(2014).
  23. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  24. Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).
  25. Ma, V. P. -Y., et al. Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).
  26. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  27. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).
  28. Kantlehner, M., et al. Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation. ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).
  29. Kapp, T. G., et al. A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins. Scientific Reports. 7, 39805(2017).
  30. Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).
  31. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).
  32. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  33. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  34. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001(2019).
  35. Luca, V. C., et al. Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity. Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).
  36. Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
  37. Brockman, J. M., Salaita, K. Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells. Frontiers in Physics. 7, 14(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tethery miernik w napi ciainterakcje EGFRadhezja kom rkowastymulacja czynnikami wzrostuadhezje ogniskoweDNA owe sensory si yrozprzestrzenianie si kom rekmikroskopia TIRFobrazowanie RICM
Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.