Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Podsumowanie

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Streszczenie

Organizmy wielokomórkowe polegają na interakcjach między receptorami błonowymi i pokrewnymi ligandami w otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do zarządzania wieloma funkcjami, w tym adhezją, proliferacją, migracją i różnicowaniem. Siły mechaniczne mogą być przenoszone z komórki za pośrednictwem integryny receptora adhezyjnego do ligandów w ECM. Ilość i organizacja przestrzenna tych sił generowanych przez komórki może być modulowana przez receptory czynnika wzrostu, w tym receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR). Obecnie dostępne narzędzia do ilościowego określania zmian w mechanice komórek spowodowanych przesłuchami i powiązania ich ze zrostami ogniskowymi, morfologią komórkową i sygnalizacją są ograniczone. Do ilościowego określenia tych zmian wykorzystano oparte na DNA czujniki siły molekularnej, znane jako uwięzi miernika napięcia (TGT). Sondy TGT są wyjątkowe pod względem zdolności zarówno do modulowania podstawowego progu siły, jak i raportowania sił receptora w skali Piconewtona na całej przylegającej powierzchni komórki w rozdzielczości przestrzennej ograniczonej dyfrakcją. Zastosowane tutaj sondy TGT opierają się na nieodwracalnej dysocjacji dupleksu DNA przez siły receptor-ligand, które generują sygnał fluorescencyjny. Pozwala to na ilościowe określenie skumulowanego napięcia integryny (historii sił) komórki. W artykule opisano protokół wykorzystujący TGT do badania wpływu EGFR na mechanikę integryny i tworzenie adhezji. Montaż mechanicznej platformy detekcyjnej TGT jest systematycznie szczegółowy, a procedura obrazowania sił, zrostów ogniskowych i rozprzestrzeniania się komórek jest nakreślona. Ogólnie rzecz biorąc, zdolność do modulowania podstawowego progu siły sondy, liganda adhezyjnego oraz rodzaju i stężenia czynnika wzrostu zastosowanego do stymulacji sprawiają, że jest to solidna platforma do badania wzajemnych oddziaływań różnych receptorów błonowych w regulacji sił za pośrednictwem integryny.

Wprowadzenie

Komórki mają wrodzoną zdolność do wyczuwania, generowania i reagowania na siły mechaniczne, co prowadzi do zmian w fenotypie komórkowym i przebudowy lokalnego mikrośrodowiska^1,2. Siły odgrywają kluczową rolę w regulacji wielu aspektów zachowania komórek, w tym adhezji, migracji, proliferacji, różnicowania i gojenia się ran^3,4. Aberracje w dwukierunkowej wymianie mechanicznej między komórką a mikrośrodowiskiem mogą prowadzić do stanów chorobowych, w tym raka⁵. Liczne receptory błonowe są zaangażowane w utrzymanie homeostazy macierzy komórkowej; spośród nich integryny i receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) wykazują silną synergię^6,7. Klasycznie integryny ustanawiają mechaniczne połączenie między mikrośrodowiskiem a wewnątrzkomórkowym cytoszkieletem, podczas gdy EGFR reguluje wzrost, proliferację i przeżycie komórek^8,9. EGFR jest wysoce zbadanym celem terapeutycznym, skoncentrowanym na regulacji zewnętrznej ułatwiającej sygnalizację wewnątrzkomórkową. Przesłuch EGFR-integryna został ustalony genetycznie i biochemicznie w celu regulacji postępu wielu chorób, w tym raka^10,11. Podczas gdy badania wskazują na istnienie wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna, wyniki przypisuje się szlakom sygnałowym z dala od błony komórkowej^7,12,13,14. Wpływ EGFR lub innych czynników wzrostu na mechanikę komórek pozostaje w dużej mierze niezbadany, częściowo z powodu braku narzędzi do pomiaru sił komórkowych i wyników sygnalizacji. Wyzwanie polega na zidentyfikowaniu odpowiednich narzędzi do badania komunikacji między tymi równoległymi paradygmatami sygnalizacji i ilościowego określenia ich konkretnego wkładu w mechanikę komórki.

Opracowano kilka podejść do pomiaru sił generowanych przez receptory adhezyjne komórek, a czytelnik jest kierowany do szczegółowych recenzji tych technik^15,16. Krótko mówiąc, mikroskopia sił trakcyjnych i detekcja matryc mikrofilarów opierają się na deformacji podłoża w celu wywnioskowania sił nanoniutonów (nN), o rząd wielkości większych niż siły poszczególnych receptorów^17,18. Techniki jednocząsteczkowe, w tym AFM i pęseta optyczna, są wrażliwe na siły pikonewtonu pojedynczego białka (pN), ale mierzą tylko jeden receptor na raz i nie oferują dobrej (lub żadnej) rozdzielczości przestrzennej. Sondy napięcia molekularnego oparte na DNA i sondy TGT oferują rozdzielczość siły pN z ograniczoną dyfrakcją (lub lepszą) rozdzielczością przestrzenną, co nadaje im wyjątkową rolę w badaniu sił pojedynczych komórek^19,20 z różnych typów komórek, w tym fibroblastów, komórek rakowych, płytek krwi i komórek odpornościowych^21,22,23,24. Podczas gdy sondy napięcia molekularnego mają wysuwany element "sprężynowy", idealny do obrazowania w czasie rzeczywistym, sondy TGT nieodwracalnie pękają, pozostawiając fluorescencyjną "historię sił". TGT dodatkowo modulują próg naprężenia podłoża znajdującego się pod spodem; seria sond o podobnym składzie chemicznym, ale różnych siłach zerwania lub tolerancjach naprężenia (T_tol) może być wykorzystana do ilościowego określenia minimalnego napięcia wymaganego do tworzenia adhezji ogniskowej i rozprzestrzeniania się komórek. Sondy TGT składają się z dwóch komplementarnych nici DNA, z których jedna jest zakotwiczona w powierzchni, a druga przedstawia komórce ligand. Jeśli receptor wiąże ligand i wywiera siłę większą niż_{T tol} sondy, nici zostaną rozdzielone. T_tol definiuje się jako stałą siłę potrzebną do rozerwania 50% sond w odstępie 2 s w idealnych warunkach. W "włączających" sondach TGT wygaszacz na górnym splocie można oddzielić od fluoroforu na dolnym splocie. Tylko w przypadku, gdy sonda TGT została zerwana, przypuszczalnie przez siły większe lub równe T_tol, zostanie wygenerowany sygnał fluorescencyjny. Sondy TGT mogą być również zamocowane, co pozwala na łatwą manipulację systemami biologicznymi i testowanie wielu warunków. Z tych powodów w pracach wykorzystano sondy TGT.

Sondy TGT zostały wykorzystane do zbadania, jak zależne od integryny adhezja komórek i siły mechaniczne są modulowane przez aktywowany EGFR²¹. Prace te ugruntowały pozycję EGFR jako "mechano-organizatora", dostrajającego organizację przyczepności ogniskowej i generowanie naprężeń. Ponadto stwierdzono, że stymulacja EGF wpływa na dystrybucję i dojrzałość zrostów ogniskowych oraz zwiększa rozprzestrzenianie się komórek. Podejście to może zostać wykorzystane w przyszłych badaniach w celu zbadania, w jaki sposób czynniki wzrostu wpływają na siły mechaniczne w progresji i dynamice guza. Podczas gdy rola przesłuchu EGFR-integryna w regulacji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego jest już ustalona, rola sił mechanicznych w tym procesie pozostaje niedostatecznie zbadana¹⁰.

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół dla tych eksperymentów, obejmujący syntezę i montaż 56 sond TGT pN, generowanie powierzchni TGT na szklanych szkiełkach nakrywkowych, zastosowanie komórek Cos-7 na powierzchni TGT i stymulację EGF, utrwalanie i barwienie komórek falloidyną oraz przeciwciałem anty-paxillin, obrazowanie wysokiej rozdzielczości całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) i mikroskopii kontrastowej interferencji odbicia (RICM), i kwantyfikacja obrazu. Protokół ten, choć napisany w celu zbadania stymulacji EGF komórek Cos-7, można łatwo dostosować do wielu eksperymentów opartych na TGT. Różne ligandy, T_tol, typy komórek, parametry stymulacji, białka znakowane po utrwaleniu i analiza ilościowa mogą być łatwo zastąpione, dzięki czemu protokół ten jest solidny i szeroko użyteczny.

Protokół

1. Przygotowanie oligonukleotydów TGT

UWAGA: Szczegóły syntezy sondy oligonukleotydowej są opisane tutaj. Należy pamiętać, że niektóre modyfikacje i etapy oczyszczania można zlecić na zewnątrz w celu niestandardowej syntezy.

1. Aktywuj pierwszorzędową aminę peptydu cyklo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] za pomocą łącznika azydko-NHS, jak opisano przez Zhang et al²² przez zmieszanie w stosunku 1:1,5 (100:150 nmol) w końcowej objętości 10 μl dimetyloformamidu. Dodać 0,1 μl organicznej bazy trietyloaminy i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 4°C.
2. Oczyść produkt za pomocą HPLC z odwróconymi fazami przy użyciu 0,1 M TEAA (rozpuszczalnik A) i 100% acetonitrylu (rozpuszczalnik B) o natężeniu przepływu 1 ml / min i stanie początkowym 10% rozpuszczalnika B ustawionym na gradient 0,5% / min. Połącz eluowane piki (absorbancja przy 203 nm) i sprawdź za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Produktem jest azydek cRGDfK.
3. Aby wygenerować górną nić TGT, połącz cRGDfK-azydek i oligonukleotyd alkino-21-BHQ2 (górna nić TGT: 5Hexynyl/GTGAAATACCGCACAGATGCG/3BHQ_2) w stosunku 2:1 ( ͂200 μM: 100 μM) w 100 μL 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 5 mM askorbinianu sodu i 0,1 μM wstępnie uformowanym Cu-THPTA. Pozostawić reakcję na co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Przetrzyj mieszaninę przez żel odsalający P2, aby usunąć nadmiar barwnika, produktów ubocznych, rozpuszczalnika organicznego i nieprzereagowanych odczynników. Przygotuj kolumnę wirówkową z 650 μl wstępnie uwodnionego żelu P2, obracając ją w dół z prędkością 18 000 x g przez 1 minutę. Odrzucić ciecz przepływową i dodać mieszaninę reakcyjną. Wirować ponownie przy 18 000 x g przez 1 minutę i zebrać przepływ. Doprowadzić mieszaninę reakcyjną do końcowej objętości 300 μl wodą ultraczystą.
   UWAGA: Wstępnie nawilżaj żel P2 wodą przez 6 godzin.
5. Oczyścić odsoloną mieszaninę reakcyjną za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Rozpuszczalniki organiczne używane do tego oczyszczania to 0,1 M TEAA w_H2O(rozpuszczalnik A) i 100% MeCN (rozpuszczalnik B lub faza ruchoma).
   1. Przed wstrzyknięciem mieszaniny należy zrównoważyć kolumnę z początkowym stanem 10% rozpuszczalnika B o nachyleniu 1%/min. Dostosować natężenie przepływu do 1 ml/min. Wstrzyknąć mieszaninę reakcyjną do pętli HPLC za pomocą igły iniekcyjnej o pojemności 500 μl.
   2. Zbierz produkt, wizualizując szczytową absorpcję przy 260 nm dla DNA i 560 nm dla wygaszacza BHQ2. Wymyty produkt suszyć przez noc w próżniowym koncentratorze odśrodkowym.
6. Zastosuj substytucję nukleofilową, aby połączyć dolną nić TGT z estrem Cy3B-NHS, jak opisano w Ma et. al²⁵. Zmieszać 100 μM dolnej nici TGT o sile 56 pN (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT) z 50 μg estru Cy3B-NHS wstępnie rozpuszczonego w 10 μl DMSO. Dostosuj pH tej mieszaniny do 9 za pomocą 0,1 M wodorowęglanu sodu i doprowadź końcową objętość do 100 μl za pomocą 1x PBS. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Oczyszczać mieszaninę sekwencyjnie, stosując filtrację w żelu P2 i HPLC z odwróconymi fazami w celu oddzielenia nieprzereagowanych odczynników, soli i rozpuszczalników organicznych (opisanych w krokach 1.4 i 1.5).
8. Oszacować stężenie oczyszczonych koniugatów oligonukleotyd-barwnik, rejestrując ich absorbancję przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometru.
9. Scharakteryzować oczyszczone produkty za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Rozpuścić nadmiar kwasu 3-hydroksypikolinowego w rozpuszczalniku TA50 (acetonitryl 50:50 v/v i 0,1% TFA w_ddH2O) w celu przygotowania świeżej matrycy MALDI. Szacunkowe i zmierzone masy cząsteczkowe dla oznakowanych produktów to: cRGDfK-1-BHQ2 - 8157.9 (obliczone), 8160.1 (znalezione); Cy3B oznaczony 56 pN TGT - 10272.7 (obliczony), 10295.8 (znaleziony).
10. Górną i dolną nić należy rozpuścić oddzielnie w wodzie wolnej od nukleaz o stężeniu 30-50 μM. Aby uniknąć zanieczyszczenia materiału, należy używać końcówek do pipet bez DNaz. Przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku zastosowań krótkotrwałych lub -20 °C w przypadku zastosowań długotrwałych. Na stabilność oligonukleotydów nie mają wpływu powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania.

2. Przygotowanie powierzchni

Dzień 1:

1. Umieść szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm (do 8) w stojaku z politetrafluoroetylenu. Umieść stojak w zlewce borokrzemianowej o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml 200-procentowego etanolu. Przykryj zlewkę filmem parafinowym, aby uniknąć przedostawania się wody i poddaj sonifikacji z częstotliwością roboczą 35 kHz przez 10-15 minut przy RT (Rysunek 1A).
2. Napełnij zlewkę o pojemności 50 ml 40 ml roztworu piranii świeżo przygotowanego przez zmieszanie kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru w stosunku 3:1 w zlewce pyreksowej. Wymieszać szklaną pipetą. Przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki i inkubować przez 30 minut w temperaturze suchej w dygestoriach w celu wytrawienia powierzchni szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1B).
   UWAGA: Noś pełne środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i gogle, i pracuj w okapie oparów chemicznych. Powoli dodawaj nadtlenek wodoru do kwasu, aby zapobiec przegrzaniu roztworu.
3. Po wytrawieniu użyj pęsety, aby przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki z ultraczystą wodą. Powtórz ten krok sześć razy w odstępach 15 sekund, aby całkowicie zneutralizować kwas (Rysunek 1C).
   UWAGA: Pozostaw roztwór Piranha w okapie chemicznym na noc przed wyrzuceniem go do pojemnika na odpady kwasowe.
4. Sprawdź wzrokowo szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że powierzchnie wyglądają na czyste, bez wzorów i cząsteczek kurzu na powierzchni szkła. Powtórz kroki 2.1-2.4, jeśli zostaną wykryte wzory lub kurz.
   UWAGA: Przetestuj hydrofilowość powierzchni, zanurzając obrobione szkiełka nakrywkowe w wodzie i usuwając je pionowo. Woda na obrobionych szkiełkach nakrywkowych cofa się jako jednolity arkusz, tworząc pierścienie Younga, w porównaniu z nieobrobionymi szkiełkami nakrywkowymi, które tworzą plamy.
5. Przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki z 200-procentowym etanolem i myć dwukrotnie przez 15 sekund, aby wyrównać powierzchnię z rozpuszczalnikiem organicznym. Przenieś stojak na szkiełka nakrywkowe do 200-procentowego roztworu etanolu z 3% APTES przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu silanizowania szkiełek nakrywkowych (Rysunek 1D). Przykryj zlewkę folią parafinową.
   UWAGA: Parametry osadzania APTES różnią się w zależności od metody czyszczenia powierzchni, zawartości wody w rozpuszczalniku, stężenia APTES, czasu inkubacji i temperatury wyżarzania.
6. Zanurz ruszt w czystej zlewce z 200-procentowym roztworem etanolu. Powtórz to pranie trzy razy przez 15 s każde (Rysunek 1E).
7. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe przy użyciu azotu (_N2) o niskim ciśnieniu wyjściowym. Umieść szkiełka nakrywkowe w naczyniu styropianowym o grubości 10 cm, w którym płasko ułożysz kawałek folii parafinowej. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są suche i oddzielone (Rysunek 1F).
8. Dodać 100 μl roztworu biotyny NHS o stężeniu 2 mg/ml w DMSO do czterech szkiełek nakrywkowych umieszczonych na folii parafinowej. Ustaw "kanapkę" z pozostałymi czterema szkiełkami nakrywkowymi na wierzchu (dwa szkiełka nakrywkowe skierowane do siebie z roztworem funkcjonalizacyjnym pomiędzy nimi) i inkubuj naczynie przez noc w temperaturze 4 °C (Rysunek 1G).
   UWAGA: W temperaturze 4 °C odczynnik NHS jest bardziej stabilny, co ułatwia równomierną funkcjonalizację powierzchni. Dodatkowo kanapka oszczędza odczynniki. Unikaj dodawania nadmiaru roztworu do kanapki, ponieważ może on wyciekać i powodować ślizganie się szkiełek nakrywkowych.

Dzień 2:

9. Zdjąć naczynie z 4 °C i oddzielić ułożone warstwowo szkiełka nakrywkowe. Ustaw zrazy w stojaku tak, aby powlekana powierzchnia była skierowana do siebie, jak pokazano na Rysunek 2A. Umyj je 200-procentowym roztworem etanolu trzy razy przez 15 s każde. Wysuszyć gazem N₂ i umieścić je w nowym naczyniu z folią parafinową w środku.
   UWAGA: Ułożenie szkiełek nakrywkowych zgodnie z zaleceniami pomaga zidentyfikować funkcjonalizowaną powierzchnię.
10. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1 ml 1x PBS, aby zrównoważyć je z powrotem do fazy wodnej. Dodać 800 μl 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS (w/v) do każdego z szkiełek nakrywkowych i inkubować w temperaturze RT przez 30 minut, aby pasywować powierzchnię i zablokować niespecyficzne wiązanie kolejnych odczynników funkcjonalizacyjnych (Rysunek 2B).
11. Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1 ml 1x PBS. Dodaj 800 μl 1 μg/ml streptawidyny w 1x PBS w temperaturze RT przez 45-60 minut, aby funkcjonalizować szkiełka nakrywkowe (Rysunek 2C).
    UWAGA: Zachowaj jedno szkiełko nakrywkowe bez streptawidyny, aby sprawdzić skuteczność pasywacji (opcjonalnie). Add10 nM biotynylowane cząsteczki i obraz w warunkach eksperymentalnych. Ta intensywność powierzchni powinna być zbliżona do ciemnego szumu aparatu.
12. Równocześnie z krokiem 2.11 zmontuj sondy TGT (góra: dolna nić w stosunku molowym 1:1) o końcowym stężeniu 50 nM w 100 μl 1 M NaCl w probówce do PCR za pomocą termocyklera. Dysocjuj pasma w temperaturze 95 °C przez 5 minut i stopniowo wyżarzaj, obniżając temperaturę do 25 °C i utrzymując ją przez 25 minut (Rysunek 2D). Unikaj długotrwałej ekspozycji sond TGT na światło.
13. Po inkubacji streptawidyny należy użyć 1x PBS do trzykrotnego umycia szkiełek nakrywkowych. Dodać 100 μl wstępnie zmontowanych sond TGT do czterech szkiełek nakrywkowych i przygotować kanapki, używając pozostałych 4 szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowaną stroną skierowaną w stronę sond (osiem powierzchni wymaga czterech probówek zhybrydyzowanych sond TGT). Przykryj folią aluminiową i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić związanie sondy z powierzchnią (Rysunek 2E).
14. Po inkubacji oddziel kanapki i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x PBS. Powierzchnie TGT są teraz gotowe do obrazowania. Ostrożnie zmontuj szkiełka nakrywkowe we wstępnie oczyszczonych komorach obrazowania i dodaj 1x PBS, aby utrzymać nawilżenie powierzchni (Rysunek 2F).
    UWAGA: Zbyt mocne dokręcenie komór spowoduje pęknięcie powierzchni. Zapobiegaj wysuszaniu powierzchni.

3. Przygotowanie i barwienie komórek

1. Aby zbadać wpływ stymulacji naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) na mechanikę Cos-7, adhezję i rozprzestrzenianie się komórek, trypsynizuj komórki Cos-7 0,05% Trypsiną-EDTA przez 2 min. Zneutralizuj trypsynę, przemywając HBSS i odwirowując przy 800 x g przez 5 min. Powtórz etap neutralizacji jeszcze raz.
2. Komórki płytkowe o gęstości 4 x 10⁴ komórki na zmontowanych powierzchniach TGT w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 50 ng/ml EGF lub DMEM bez EGF. Pozwól komórkom rozprzestrzeniać się przez 60 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli komórkowych (Rysunek 3A).
   UWAGA: Komórki inkubuje się w DMEM bez surowicy, aby uniknąć stymulacji czynnikami wzrostu. EGF rozcieńcza się w 10 mM kwasie octowym, aby uzyskać zapas 1 mg/ml. Jest stosowany w stężeniu 50 ng / ml w DMEM do eksperymentów obrazowych.
3. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie 1x PBS i utrwal 2 ml 4% paraformaldehydu przez 12 minut w temperaturze RT (Rysunek 3B).
   UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji są wykonywane na wytrząsarce obrotowej z prędkością ~35 obr./min w celu równomiernego rozprowadzenia roztworów. Chroń powierzchnie TGT przed światłem, zakrywając je do momentu, gdy będą gotowe do obrazowania.
4. Odessać utrwalacz i przemyć szkiełka nakrywkowe pięć razy 1x PBS w odstępach 5 minut w RT. Opcjonalnie inkubować szkiełka nakrywkowe z 50 mM NH₄Cl w 1x PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu wygaszenia autofluorescencji związanej z paraformaldehydem i przemyć trzykrotnie 1x PBS w odstępach 5-minutowych (Rysunek 3B).
5. Dodać bufor A (1x PBS, 5% normalna surowica końska, 5% normalna surowica kozia, 1% BSA, 0,025% Triton X-100) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu zablokowania i przepuszczalności komórek. Umyj trzy razy 1x PBS w odstępach 5 minut (Rysunek 3B).
6. Umieść komory obrazowania ze szkiełkami nakrywkowymi w pojemniku na wilgoć. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-paksylinowe (ogniskowy marker adhezji) w stosunku 1:250 w buforze blokującym (1x PBS, 5% normalna surowica końska, 5% normalna surowica kozia, 1% BSA, 0,005% Triton x-100). Inkubować z 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełko nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (Rysunek 3B).
   UWAGA: Nie pozwól, aby powierzchnie wyschły.
7. Umyj szkiełka nakrywkowe pięć razy 1x PBS w odstępach 5-minutowych i włóż je z powrotem do pojemnika na wilgoć. Znakować komórki jednocześnie mieszaniną sprzężonego z barwnikiem koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi w rozcieńczeniu 1:800 i sprzężonej z barwnikiem falloidyny (aktyny) w rozcieńczeniu 1:400 w 200 μl buforu blokującego na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut (Rysunek 3B).
8. Umyj powierzchnie pięć razy 1x PBS w odstępach 5 minut i przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do obrazowania (Rysunek 3B).
   UWAGA: Próbki obrazu należy pobrać w ciągu 3 dni od przygotowania powierzchni, aby uniknąć degradacji sygnału.

4. Akwizycja obrazu

1. Użyj obiektywu olejowego o powiększeniu 60x i dużej aperturze numerycznej (1,49) na mikroskopie odwróconym ze wzbudzeniem 488, 561 i 647 TIRF, wzbudzeniem RICM, doskonałym systemem ustawiania ostrości i aparatem cyfrowym.
   1. Dodaj olej do obiektywu, wyczyść spód szkiełka nakrywkowego w komorze na próbkę i umieść próbkę na stoliku. Skoncentruj się na komórce i zaangażuj się w idealne skupienie.
2. Ustaw mikroskop w trybie obrazowania RICM ze wzbudzeniem epifluorescencyjnym i kostką filtra GFP z usuniętym filtrem emisyjnym. Wyrównaj RICM, zamykając i centrując przysłonę epi-illumination.
3. Przełącz mikroskop w tryb TIRF ze wzbudzeniem laserowym i czteroprzebiegową kostką filtrującą TIRF. Ustaw ostrość laser 488 nm na małym punkcie na suficie pomieszczenia i zwiększaj kąt padania aż do przekroczenia kąta krytycznego, monitorując fluorescencję w kamerze w trybie na żywo. Obserwuj gwałtowne zmniejszenie fluorescencji tła i pojedynczą płaszczyznę ostrości po przekroczeniu kąta krytycznego.
   UWAGA: TIRF wzbudza cienki obszar (~100 nm) znajdujący się najbliżej granicy faz próbka-szkiełko nakrywkowe, podkreślając otwarte sondy TGT i zrosty ogniskowe, jednocześnie eliminując nieostrą fluorescencję z wnętrza komórki. Jeżeli TIRF nie jest dostępny, można zastosować epifluorescencję; Jednak stosunek sygnału do szumu będzie niższy.
4. Zidentyfikuj komórki do obrazowania w trybie "na żywo" kamery za pomocą RICM.
5. Uzyskaj obraz RICM i obrazy TIRF aktyny (640 nm ex), napięcia integryny (561 nm ex) i paxilliny (488 nm ex). Uzyskuj obrazy sekwencyjnie, korzystając z czasu naświetlania 200 ms.
   UWAGA: Czas naświetlania zależy od wielu czynników, w tym obiektywu, mocy lasera, filtrów emisyjnych i czułości aparatu. Sygnał powinien być co najmniej 2x większy niż tło. Tło wynosi około 1000 AU, więc sygnał powinien wynosić co najmniej 2000-3000 AU.
6. Powtórz 4,4-4,5 dla co najmniej 30 komórek. Zmień szkiełka nakrywkowe, ustaw ostrość i powtórz 4,4-4,5.

5. Analiza danych

UWAGA: Wykonaj ilościową analizę obrazu za pomocą oprogramowania Fidżi i analizę za pomocą oprogramowania statystycznego.

1. Otwórz zestaw obrazów dla jednej komórki.
2. Utwórz maskę obszaru komórki (maskę RICM), śledząc granicę komórki na obrazie RICM za pomocą narzędzia do zaznaczania ImageJ Freehand. Zapisz obszar zainteresowania (ROI) w menedżerze ROI (Analyze > Tools > ROI manager) (Rysunek 4A1,2).
3. Wybierz reprezentatywny obszar poza komórką na obrazie naprężenia integryny i narysuj ROI o wymiarach co najmniej 200 x 200 pikseli. Wyklucz wszelkie inne ogniwa lub zanieczyszczenia fluorescencyjne z ROI. Zmierz fluorescencję tła w ROI za pomocą narzędzia do pomiaru (Analizuj > Mierz) (Rysunek 4A3).
4. Odejmij średnią fluorescencję tła uzyskaną w kroku 5.2 od obrazu rozciągania (Proces > Matematyka > Odejmij) (Rysunek 4A4).
5. Użyj maski RICM utworzonej w kroku 5.2, aby zdefiniować sygnał naprężenia w śladzie komórki (menedżer ROI > Wybierz > Zastosuj maskę > Edytuj > Wyczyść na zewnątrz) (Rysunek 4A5).
6. Utwórz maskę progową dla obrazu naprężenia przy użyciu metody automatycznego progowania Huanga (Obraz > Dostosuj próg >) (Rysunek 4A6). Upewnij się, że maska progowa najlepiej reprezentuje obszar generowanego naprężenia całkowania. Z reguły ustaw próg na 2x średnią fluorescencję tła.
7. Utwórz wybór progowej maski rozciągania (Edytuj > Zaznaczenie > Utwórz) (Rysunek 4A7).
8. Przenieś wybraną maskę na obraz naprężenia wygenerowany w kroku 5.4 i zmierz zintegrowaną intensywność otwartych sond (menedżer ROI > Wybierz (maska naprężenia) > Analizuj > mierz > RawIntDen) (Rysunek 4C).
9. Zmierz obszar właściwości morfometrycznych komórki, okrągłość i współczynnik proporcji za pomocą maski RICM (menedżer ROI > Wybierz (maska RICM) > Zastosuj maskę > Analizuj > Zmierz) (Rysunek 4B).
10. Zmierz gęstość mechanicznego pęknięcia, zdefiniowaną jako procent śladu ogniwa z pękniętymi sondami, wybierając obraz maski naprężającej i stosując maskę RICM (menedżer ROI > Wybierz (maska RICM) > Analizuj > Zmierz > %obszar) (Rysunek 4C).
11. Eksport pomiarów w celu dalszej analizy i wizualizacji do oprogramowania statystycznego.
12. Powtórz 5.1-5.11 dla każdej komórki.

Wyniki

Włączone sondy TGT zostały użyte do zbadania wpływu receptora aktywowanego ligandem naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) na mechanikę komórkową za pośrednictwem integryny i tworzenie adhezji w komórkach Cos-7²¹. Sondy prezentują ligand cykliczny Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)^21,23,25,26, który jest selektywny dla heterodimeru integryny αVβ3 z niewielkim powinowactwem do integryn α5β1 integrin^27,28,29,30. Sonda TGT składa się z dupleksowego DNA funkcjonalizowanego na szklanej powierzchni szkiełka nakrywkowego za pośrednictwem dolnej nici przy użyciu wiązania biotyny i streptawidyny. Górna nić wyświetla ligand integryny i jest dostępna do wiązania się z pokrewnym receptorem integryny na błonie komórkowej (Rysunek 5A). Dolne pasmo jest oznaczone fluoroforem, a górne pasmo wygaszaczem, co prowadzi do minimalnej fluorescencji tła, gdy dupleksowy TGT jest nienaruszony. Jeśli integryna wiąże ligand i przykłada siłę o wielkości większej niż_{T tol} sondy, dupleks DNA rozdzieli się, prowadząc do fluorescencji (Rysunek 5A). Każda sonda TGT, która nie została rozerwana przez siłę mechaniczną, pozostanie niefluorescencyjna. Ta selektywna fluorescencja włączająca siłę umożliwia systematyczne i ilościowe mapowanie sił generowanych przez integryny w skali pN w rozdzielczości ograniczonej dyfrakcją. Sondy TGT dodatkowo modulują próg naprężenia podłoża.

Pokazany tutaj jest reprezentatywny przykład powierzchni TGT o T_tol wynoszącym 56 pN. Komórki Cos-7 zostały posiane na tej powierzchni TGT ze stymulacją EGF lub bez niej, aby zbadać wpływ aktywacji EGFR ze stymulacją liganda na adhezję komórek i mechanikę integryny (Rysunek 5A,B). Komórki inkubowano z EGF lub bez niego na powierzchniach TGT przez 60 minut, utrwalono i wybarwiono immunologicznie, aby wyświetlić ogniskowy rozkład adhezji (paxillin) i organizację cytoszkieletu (F-aktyna) (Figura 5B). Komórki zostały następnie zobrazowane za pomocą mikroskopii RICM i TIRF. Jak wyraźnie widać na obrazie RICM, rozprzestrzenianie się komórek Cos-7 na powierzchni 56 pN TGT było znacznie zwiększone przy stymulacji EGF w porównaniu z bez stymulacji. Określono to ilościowo dla 50 komórek w każdym stanie, mierząc rozmiar obszaru kontaktowego komórka-substrat z obrazu RICM (Rysunek 5C). Stymulacja EGF spowodowała bardziej kołową morfologię, reprezentatywną dla komórek Cos-7 rozprzestrzeniających się i rosnących w ich naturalnym środowisku fizjologicznym (Ryc. 5D). Fluorescencja z otwartych sond jest również wyższa przy stymulacji EGF, co zaobserwowano na obrazie fluorescencji napięciowej. Zintegrowana intensywność otwartych sond, która jest proporcjonalna do liczby otwartych sond, była znacznie wyższa przy stymulacji EGF w porównaniu do bez (Rysunek 5B,E). Jest to reprezentacja wszystkich zaangażowań receptor-ligand, w których integryny przykładały siłę większą niż T_tol (56 pN).

Barwienie paxillin pokazało, że stymulacja EGF miała również wpływ na dystrybucję, liczbę, dojrzewanie (wielkość) i organizację zrostów ogniskowych. Zrosty ogniskowe w komórkach stymulowanych EGF wydawały się bardziej dojrzałe i zorientowane promieniowo w porównaniu z brakiem kontroli EGF. Organizacja cytoszkieletu F-aktyny została również wzmocniona stymulacją EGF, co oceniono za pomocą barwienia falloidyną (Figura 5B). Te oceny jakościowe zostały przeprowadzone poprzez wizualne porównanie obrazów z obu grup leczenia. Można przeprowadzić analizę ilościową adhezji ogniskowej, ale wykracza ona poza zakres tego protokołu. W tym eksperymencie powierzchnia TGT zapewniła platformę do systematycznego szczegółowego opisywania wpływu aktywacji EGFR na rozprzestrzenianie się komórek, mechanikę integryny i tworzenie adhezji ogniskowej.

Rysunek 1: Schemat dla pierwszego dnia przygotowania powierzchni TGT. (A) Wyczyść szkiełka nakrywkowe. (B) Wytrawić powierzchnię szkiełka nakrywkowego. (C) Zneutralizować roztwór piranii. (D) Silanizuj powierzchnię, aby wytworzyć reaktywne grupy aminowe. (E) Zrównoważyć szkiełka nakrywkowe z fazą organiczną. (F) Osuszyć szkiełka nakrywkowe gazem obojętnym. (G) Biotynyluj powierzchniowe grupy aminowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat dla dnia 2 przygotowania powierzchni TGT. (A) Wyczyść i osusz szkiełka nakrywkowe, aby usunąć resztki biotyny z poprzedniego dnia. (B) Pasywować za pomocą BSA, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu odczynnika w kolejnych etapach. (C) Funkcjonalizować szkiełka nakrywkowe streptawidyną. (D) Hybrydyzuj sondy w termocyklerze. (E) Nałożyć zsyntetyzowane sondy na szkiełka nakrywkowe (F) Zamontować szkiełko nakrywkowe w komorze obrazowania komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ogólny przepływ pracy przedstawiający ogólne kroki w całej konfiguracji eksperymentalnej. (A) Proces oddzielania komórek i powlekania na powierzchni TGT w pożywkach podstawowych (DMEM) z lub bez stymulacji EGF. (B) Schemat blokowy etapów związanych z utrwalaniem i barwieniem immunologicznym po przyczepieniu i rozprowadzeniu na powierzchni TGT. (C) Po barwieniu komórki są obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym z odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą mikroskopii RICM i TIRF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykład przetwarzania danych i analizy ilościowej. (A) Szczegółowy podział potoku analitycznego stosowanego na Fidżi (ImageJ) do kwantyfikacji obrazu RICM i naprężeń. (B) Reprezentatywny przykład wyników morfometrycznych komórek analizowanych przy użyciu powyższego potoku. (C) Reprezentatywne przykłady wyników mechanicznych ogniw analizowanych przy użyciu wyżej wymienionego potoku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykładowe dane z eksperymentu TGT. (A) Diagram przedstawiający strefę kontaktu na styku błony komórkowej i powierzchni TGT. Wkładka projektuje integryny oddziałujące z pokrewnym ligandem cRGDfK z (po prawej) lub bez (lewej) stymulacji EGF. (B) Obrazy RICM i TIRF komórek Cos-7 rozsianych na powierzchni 56 pN TGT. Obrazy uzyskuje się po 60 minutach od posiewu ze stymulacją EGF lub bez. Poszczególne obrazy RICM (w miarę uzyskiwania), napięcia integryny (skala szarości), paxilliny (pomarańczowy gorący) i F-aktyny (niebiesko-zielony) są wyświetlane z nakładkami dla obu warunków stymulacji. Podziałka: 10 μm. Wstawka podkreśla powiększony ROI (region zainteresowania) szczegółowo opisujący kolokalizację generowanego napięcia integryny w miejscach tworzenia adhezji oznaczonych przez paksylinę oraz leżącą u podstaw subkomórkową organizację cytoszkieletu oznaczoną aktyną. Pasek skali: 5 μm. (C-E) Wykresy punktowe dla obszaru rozprzestrzeniania się (ślad komórki RICM) (C), kołowości (D) i zintegrowanego napięcia (E) dla komórek Cos-7 ze stymulacją EGF lub bez. Słupki wskazują średnią ± s.d. Różnice między grupami oceniano statystycznie za pomocą testu t-Studenta; P < 0,0001. n = 50 komórek w trzech niezależnych eksperymentach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykładowe powierzchnie TGT z różnymi możliwymi problemami. (A) Obrazy naprężeń i RICM idealnej powierzchni TGT ze zmontowaną sondą hartowaną przed adhezją komórek. (B) Obrazy naprężeń i RICM powierzchni TGT, na której sonda TGT nie ma górnego pasma (wygaszacza). Obraz napięcia pokazuje jednolitą fluorescencję z otwartego fluoroforu w dolnym pasmie. (C) Obrazy napięcia i RICM dla komórek rozłożonych na idealnej powierzchni TGT. (D) Obrazy naprężeń i RICM dla komórek rozproszonych na słabo wykonanej powierzchni TGT z ograniczoną pasywacją lub zdegradowaną sondą. (E) Obrazy napięcia, RICM i jasnego pola dla komórek pokrytych na idealnej powierzchni ligandem cRGDfK wskazujące na interakcje cRGDfK-integryna są niezbędne do przyłączania komórek i generowania napięcia. (F) Obrazy napięcia, RICM i jasnego pola dla komórek pokrytych na powierzchni bez liganda cRGDfK na TGT. Podczas gdy komórki są widoczne na obrazie w jasnym polu, nie obserwuje się przyłączania komórek ani generowanego napięcia integryny. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Dzięki szczegółowej procedurze krok po kroku opisanej powyżej, można przygotować powierzchnie TGT w celu ilościowego określenia morfologii komórek i napięcia integryny generowanego przez przylegające komórki podczas przyłączania i rozprzestrzeniania się komórek po leczeniu EGF. Prosta konstrukcja sondy, synteza i przygotowanie powierzchni wraz z prostą konfiguracją eksperymentalną zapewniły stabilną platformę do badania interakcji EGFR i integryn. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki potwierdzają, że zależna od ligandu aktywacja EGFR zwiększa rozprzestrzenianie się komórek, dostraja właściwości przenoszące siłę receptorów integryny oraz wspomaga organizację i dojrzewanie adhezji ogniskowej. Wyniki uzyskane za pomocą sond TGT potwierdzają nadrzędną hipotezę, że czynniki wzrostu, takie jak EGFR, działają jako "mechano-organizatorzy", zwiększając ilość i organizację przestrzenną napięcia integryny oraz regulując orientację i mechanikę zrostów ogniskowych.

Po nałożeniu na powierzchnię TGT komórki lądują, przyłączają się i rozprzestrzeniają, gdy receptory integryny (αVβ3) wyczuwają i wiążą się z ligandem cRGDfK. W ten sposób sondy TGT mogą zostać mechanicznie rozerwane, generując fluorescencję w miejscu zaangażowania ligandów. Odczyt jest skumulowaną "historią sił" komórki oddziałującej z powierzchnią. Istnieje kilka typowych problemów z powierzchniami TGT, które mogą występować podczas tych eksperymentów. Wysoka fluorescencja tła powierzchni (rysunek 6A,B), niejednolity wygląd powierzchni, niezdolność komórek do generowania sygnału napięcia (rysunek 6C,D) i niepowodzenie komórek w rozprzestrzenianiu się (rysunek 6E,F) mogą być spowodowane wadami technicznymi sondy TGT lub syntezy powierzchniowej. Rozwiązania tych typowych problemów przedstawiono w tabeli 1.

Prosta konstrukcja sond TGT zapewnia biologom komórkowym potężne narzędzie do badania określonych wyników sygnalizacji integryny czynnika wzrostu w izolacji, bez zakłóceń ze strony innych receptorów na powierzchni komórki, dostarczając tylko określone ligandy i stymulacje. Dodatkowo sondy TGT pozwalają na badanie progu napięcia podkreślającego poszczególne receptory integrynowe podczas adhezji komórek przy czułości pN. Alternatywne podejścia nie uwzględniają sił wywieranych przez poszczególne receptory z wysoką rozdzielczością przestrzenną w ustalonych próbkach³¹. Mikroskopia sił trakcyjnych jest czuła tylko na siły nN, o rząd wielkości wyższe niż siły przyłożone przez poszczególne receptory integryny¹⁵, a sondy napięcia molekularnego mierzą siły pN, ale ponieważ są odwracalne, nie wytrzymują solidnie fiksacji. Z tych powodów sondy TGT są atrakcyjnym narzędziem do badania mechaniki oddziaływań czynnik wzrostu-integryna.

Istnieje kilka niuansów technicznych związanych z sondami TGT, które należy wziąć pod uwagę przed zaprojektowaniem eksperymentu. Obraz napięcia jest migawką w czasie, reprezentującą historię siły, a nie wskaźnikiem zaangażowania receptor-ligand w dowolnym punkcie czasowym. Ponieważ generowanie sygnału zależy od separacji sondy, fluorescencja TGT wynika z otwartych sond, które nie są pod aktywnym napięciem spowodowanym zaangażowaniem receptor-ligand. Oznacza to, że odczyt naprężenia całki uzyskany na powierzchni TGT ma charakter historyczny i kumulatywny, reprezentujący miejsca, w których występowały siły większe niż T_tol; lokalizacje obecnych sił receptor-ligand mniejszych niż T_tol nie są podane^19,32. Ponieważ pęknięcie TGT powoduje zakończenie zaangażowania receptor-ligand, rozprzestrzenianie się komórek jest spowodowane interakcjami integryna-ligand, które doświadczają sił niższych niż T_tol. Użytkownik musi zatem zachować ostrożność podczas definiowania czasu po poszyciu, aby oszacować wyniki mechaniczne związane z adhezjami na bazie integryn. Na koniec należy rozważyć znaczenie T_tol. Zastosowane tutaj sondy TGT mają T_tol 56 pN, gdzie T_tol jest stałą siłą potrzebną do rozerwania 50% sond przy zastosowaniu przez 2 s. Biorąc pod uwagę skomplikowane systemy biologiczne, TGT prawdopodobnie doświadczają niejednorodnej i zróżnicowanej gradacji sił z różnymi zależnościami czasowymi. Jeśli TGT zostaną rozerwane przez siły większe niż T_tol, fluorescencja byłaby niedoszacowaniem całkowitego napięcia. Alternatywnie, siły poniżej T_tol przyłożone przez dłuższy czas mogą spowodować pęknięcie podobnej liczby sond, co wysokie siły progowe przyłożone przez krótszy czas. Oba te scenariusze mogą skutkować takim samym odczytem intensywności fluorescencji, co utrudnia określenie dokładnej wielkości lub dynamiki naprężenia przy użyciu sond TGT^33,34.

Ogólnie rzecz biorąc, oceny napięcia integryny ze stymulacją czynnikiem wzrostu powinny być dokonywane ostrożnie, projektując eksperymenty z kontrolami wewnętrznymi, porównując profile rozprzestrzeniania się na innych powierzchniach pokrytych matrycą, dokonując równoległych ocen fluorescencji TGT w komórkach w obecności lub bez stymulacji czynnika wzrostu oraz stosując TGT o różnym T_tol. TGT umożliwiają ilościowe określenie roli sygnalizacji czynnika wzrostu w regulacji mechaniki receptorów integrynowych, dynamiki adhezji ogniskowej i rozprzestrzeniania się komórek. Protokół ten może być używany jako szablon dla wielu eksperymentów opartych na TGT przy użyciu sond o różnym_{T tol}, różnych ligandach, różnych typach komórek lub różnych warunkach stymulacji. Dowolne białka będące przedmiotem zainteresowania mogą być znakowane po utrwaleniu i można zastosować dowolny rodzaj ilościowej analizy obrazu. W związku z tym przedstawiamy szablon dla wielu eksperymentów TGT.

Zastosowanie sond TGT nie ogranicza się do badania integryn, ale można je rozszerzyć na różnorodny zestaw receptorów błony komórkowej w różnych typach komórek poprzez modyfikację ligandu. Sondy TGT wykorzystano do zbadania roli sił w regulacji różnych kaskad sygnalizacji receptorów, w tym do identyfikacji mechanicznej roli mechaniki receptora Notch w rozwoju embrionalnym i neurogenezie³⁵, sił pośredniczących w identyfikacji i internalizacji antygenów przez receptory komórek B³⁶ oraz zdolności mechanicznej korekty receptorów powierzchniowych komórek T do wykrywania zmian sił w celu zwiększenia siły i swoistości transferu sygnału³⁷. Łącznie odkrycia te podkreślają ogromny potencjał sond TGT w różnych warunkach eksperymentalnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(3-Aminopropylo)trietoksysilan	Millipore Sigma	440140	Przygotowanie powierzchni
Kwas 3-hydroksypikolinowy (3-HPA)	Millipore Sigma	56197	Maldi-TOF-MS Matrix
Kwas octowy, lodowaty	Fisher Scientific	A38S	Rozcieńczanie EGF
Acetonitryl (HPLC)	Fisher Scientific	A998SK	Preparat
Alexa Fluor 488	Technologia sygnalizacji komórkowej	8878S	Immunocytochemia
Chlorek amonu	Fisher Scientific	A687	Immunocytochemia
Przeciwciało anty-paksylinowe [Y113]	Abcam	ab32084	Immunocytochemia
BD Strzykawki tylko z Luer-Lok	BD bioscience	309657	Przygotowanie powierzchni
Bio-Gel P-2	Bio-Rad	1504118	Preparat oligonukleotydowy
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek wolny od proteaz	Fisher Scientific	BP9703100	Przygotowanie powierzchni
Komórki Cos-7	ATCC	CRL-1651	Hodowla komórkowa, numery pasażków 11-20
Mini-stojak na szkiełka nakrywkowe, na 8 szkiełek nakrywkowych	Fisher Scientific	C14784	Przygotowanie powierzchni
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8- Kwas amino-3,6-dioksaoktanowy	Vivitide	PCI-3696-PI	Preparat oligonukleotydowy
Ester Cy3B NHS	GE Healthcare	PA63101	Preparat oligonukleotydowy Preparat oligonukleotydowy
dimetyloformamidu	Millipore Sigma	PHR1553
DMEM z L-glutaminą, glukozą 4,5 g / l i pirogronianem sodu	Fisher Scientific	MT10013C	Hodowla komórkowa
Naskórkowy czynnik wzrostu ludzki EGF	Millipore Sigma	E9644	Etanol z hodowli komórkowych
, 200 dowodów (100%)	Fisher Scientific	22032601	Przygotowanie powierzchni
Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowych	Fisher Scientific	08-772E	Przygotowanie powierzchni
Płodowa surowica bydlęca	Fisher Scientific	10-438-026	Flurobryt do hodowli komórkowych
DMEM	Fisher Scientific	A1896701	Hodowla komórkowa
koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21244	Immunocytochemia
Surowica kozia	Fisher Scientific	16-210-064	Immunocytochemia
Hank' s zrównoważone sole (HBSS)	Fisher Scientific	14-170-161	Hodowla komórkowa
Surowica konia	Fisher Scientific	16050130	Immunocytochemia
Nadtlenek wodoru	Fisher Scientific	H325-500	Przygotowanie powierzchni
Urządzenia odśrodkowe Nanosep MF	Laboratorium Pall	ODM02C35	Preparat oligonukleotydowy
NHS-azydek	Fisher Scientific	88902	Preparat oligonukleotydowy
Butla z azotem	Przygotowanie powierzchni	gazu
nr 2 okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe - 25 mm	VWR	48382-085	Przygotowanie powierzchni
Folia laboratoryjna Parafilm M	Fisher Scientific	13-374-10	Przygotowanie powierzchni
Paraformaldehyd 16%	Fisher Scientific	50-980-487	Immunocytochemia
PBS, 1X	Fisher Scientific	21-030-CV	Przygotowanie powierzchni/Immunocytochemia
Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)	Fisher Scientific	15-070-063	Hodowla komórkowa
PYREX Low Form Griffin Beakers	Fisher Scientific	02-540G	Przygotowanie powierzchni
Askorbinian sodu	Fisher Scientific	18-606-310	Preparat oligonukleotydowy
Wodorowęglan sodu	Fisher Scientific	S233	Preparat oligonukleotydowy
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358	Przygotowanie powierzchni
Streptawidyna	Fisher Scientific	434301	Przygotowanie powierzchni
Sulfo-NHS-LC-Biotyna	Fisher Scientific	21335	Przygotowanie powierzchni
Kwas siarkowy	Fisher Scientific	A300-500	Przygotowanie powierzchni
TEAA	Fisher Scientific	NC0322726	Preparat oligonukleotydowy
Triethylamine	Millipore Sigma	471283	Preparat oligonukleotydowy
Kwas trifluorooctowy (TFA)	Fisher Scientific	PI28901	Preparat oligonukleotydowy
THPTA	Fisher Scientific	NC1296293	Preparat oligonukleotydowy
Triton X 100 Detergent Surfact Ams Roztwór	Fisher Scientific	85111	Immunocytochemia
Woda, klasa DNA, DNASE, bez proteazy	Fisher Scientific	BP24701	Preparat oligonukleotydowy
Sprzęt
Agilent AdvanceBio Oligonukleotyd C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 μ m	Agilent	653950-702	Preparat oligonukleotydowy
Wysokosprawna chromatografia cieczowa	Agilent	1100	Preparat oligonukleotydowy
Wytrząsarka orbitalna o niskiej prędkości	Fisher Scientific	10-320-813	Immunocytochemia
Spektrometr masowy czasu przelotu wspomagany desorpcją laserową / jonizacją matrycy (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		Przygotowanie oligonukleotydów
Sondy molekularne Komora komórkowa Attofluor	Fisher Scientific	A7816	Przygotowanie powierzchni
Nanodrop 2000 Spektrofotometr UV-Vis	Thermo Fisher		Preparat oligonukleotydowy
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti	Mikroskopia	Nikon Nikon
Doskonały system ustawiania ostrości	Mikroskopia Nikon
Oprogramowanie NIS Elements	Mikroskopia	Nikon
ORCA-Flash4.0 V3 Cyfrowy aparat CMOS	Mikroskopia Hamamatsu
Czterozakresowa kostka TIRF 405/488/561/647 Mikroskopia	CHROMA
Kostka RICM Mikroskopia	CHROMA
SOLA V-nIR Light Engine	Lumencor		Mikroskopia
Thermo Forma Steri Cycle Inkubator CO2 370	Fisher Scientific		Cell Culture
Myjka ultradźwiękowa VWR 75D	VWR	13710	Przygotowanie powierzchni
< silny> Analiza danych< / strong>			Zastosowanie
Fidżi (zdjęcie J)		https://imagej.net/software/fiji/downloads	Analiza ilościowa
Wykres Pad Pryzmat			Analiza statystyczna
Nazwa oligo< / silny>	5' modyfikacja/ Modyfikacja 3'	Sekwencja (5' do 3')	Zastosowanie
Alkine-21-BHQ2	5' Heksynyl/ 3' BHQ_2	GTGAAATACCGCACAGATGCGGGGGGG:	Sonda TGT z górnym pasmem
56 pN TGT	5' Biosg/ TTTTTT/iUniAmM	CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT	Dolna nić sonda TGT
12 pN TGT	5' AmMC6/ 3' BioTEG	CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT	Dolna żyła sonda TGT