Artykuł metodologiczny

Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63532

⸱

16 marca 2022

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Gene Therapy Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

W tym manuskrypcie, iniekcja podspojówkowa jest demonstrowana jako prawidłowa metoda dostarczania wektora do tkanek oka u myszy za pomocą systemu iniekcyjnego składającego się z pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania i gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. Ten system iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego.

Streszczenie

Choroby oczu obejmują szeroki zakres dziedzicznych zaburzeń genetycznych i nabytych, które są atrakcyjnym celem dla miejscowego dostarczania leków ze względu na ich względną łatwość dostępu za pomocą wielu dróg podawania. Zastrzyki podspojówkowe (SCJ) mają przewagę nad innymi drogami podawania wewnątrzgałkowego, ponieważ są proste, bezpieczne i zwykle wykonywane w warunkach ambulatoryjnych. Wstrzyknięcia SCJ u małych zwierząt zwykle wymagają pomocy mikroskopu operacyjnego ze względu na wielkość oka. Wcześniejsze prace wykazały, że wstrzyknięcie SCJ specyficznych serotypów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest ważną strategią dostarczania genów do ukierunkowanej transdukcji powierzchni oka, mięśnia oka, rogówki i nerwu wzrokowego, zapewniając potencjalne podejście do leczenia wielu chorób oczu.

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół dla iniekcji SCJ w modelu mysim przy użyciu systemu iniekcyjnego składającego się z programowalnej pompy strzykawkowej do infuzji/odstawienia (która pozwala na stałą i precyzyjną prędkość i ciśnienie wstrzykiwania) oraz gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. System iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego, takich jak wstrzyknięcia dostromalne, dokomorowe, szklistkowe i podsiatkówkowe u małych zwierząt. Chociaż opisano dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adenowirusem do badań nad terapią genową oczu, protokół w niniejszym dokumencie można również dostosować do różnych rozwiązań okulistycznych w małych modelach zwierzęcych. Szczegółowo omówione zostaną kluczowe kroki praktyczne na drodze podawania, konfiguracja platformy iniekcyjnej, przygotowanie do wstrzyknięcia oraz wskazówki wynikające z bezpośredniego doświadczenia. Ponadto pokrótce omówione zostaną również typowe techniki walidacji potwierdzenia dostarczenia AAV do pożądanych tkanek.

Wprowadzenie

Choroby oczu obejmują szeroki zakres zarówno zaburzeń genetycznych, jak i nabytych. Szacuje się, że w 2015 roku 36 milionów ludzi na całym świecie było prawnie niewidomych, a ponad 1 miliard ludzi cierpi na przynajmniej pewien poziom upośledzenia wzroku, co podkreśla potrzebę zwiększenia wysiłków łagodzących na wszystkich poziomach1. Główne metody dostarczania leków do oczu obejmują zarówno podawanie miejscowe, jak i miejscowe, takie jak krople do oczu lub zastrzyki podspojówkowe (SCJ), dokomorowe, szkliste i podsiatkówkowe. Chociaż nieinwazyjna terapia miejscowa jest najczęstszą metodą dostarczania leków okulistycznych i jest szeroko stosowana w przypadku wielu zaburzeń przedniego odcinka, obecność barier anatomicznych rogówki stanowi wyzwanie dla biodostępności, biodystrybucji i skuteczności substancji podawanych miejscowo, co sugeruje, że może to nie być najlepsza potencjalna droga leczenia wielu chorób oka wewnętrznego. Miejscowe wstrzyknięcie do określonego przedziału gałki ocznej dotkniętego chorobą może być bardziej skutecznym i ukierunkowanym podejściem do dostarczania leków2. Jednak działania niepożądane wynikające z powtarzających się wstrzyknięć mogą komplikować strategie podawania. Idealnie byłoby, gdyby terapia utrzymywała długoterminową skuteczność terapeutyczną po jednorazowym podaniu. Tak więc terapia genowa jest obiecującą opcją dla zminimalizowania liczby wymaganych wstrzyknięć i zapewnienia trwałej ekspresji transgenu w leczeniu chorób oczu3,4.

Liczne wektory wirusowe i niewirusowe są dostępne do terapii genowej; jednak wektory AAV cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich doskonały profil bezpieczeństwa. AAV to mały, jednoniciowy, bezotoczkowy wirus DNA, który został początkowo odkryty jako zanieczyszczenie preparatu adenowirusowego w 1965 roku przez Atchison et al.5,6 AAV został następnie zaprojektowany jako wydajny wektor wirusowy do dostarczania genów w latach 1980. i stał się wektorem terapii genowej z wyboru w wielu chorobach, w tym zaburzeniach oczu, w ciągu ostatnich kilku dekad. Najbardziej godnym uwagi z nich jest pierwszy komercyjnie dostępny lek terapii genowej, voretigene neparvovec, który został zatwierdzony przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków do leczenia wrodzonej ślepoty Lebera, rzadkiej choroby tylnego odcinka oka. Chociaż voretigene neparvovec z powodzeniem pokonał bariery w rozwoju klinicznym, nadal istnieją wyzwania związane z komercjalizacją dodatkowych ocznych terapii genowych. Na przykład woretigene neparwowek podaje się pacjentom, którzy zachowują żywe komórki siatkówki poprzez wstrzyknięcie podsiatkówkowe. W związku z tym pacjenci z bardziej zaawansowanymi postaciami choroby, którzy nie mają żywotnych komórek siatkówki, nie kwalifikują się do leczenia, ponieważ nie przyniosłoby ono żadnych korzyści klinicznych. Ponadto zaobserwowano znane powikłania związane z procedurą wstrzyknięcia podsiatkówkowego, w tym zapalenie oka, zaćmę, rozdarcie siatkówki, makulopatię i ból7,8. Inne obawy związane z tą procedurą obejmują możliwość krwotoku, odwarstwienia siatkówki, zapalenia wnętrza gałki ocznej i cofnięcia uprzywilejowanego statusu odporności oka poprzez zniszczenie tkanki oka9,10,11,12. W związku z tym coraz ważniejsze stają się wysiłki mające na celu zbadanie mniej inwazyjnych dróg dostarczania genów, takich jak wstrzyknięcie SCJ13,14,15,16,17.

Spojówka to cienka błona zawierająca 3-5 warstw komórek łącząca przednie oko z wewnętrzną powieką. Zastrzyki SCJ są stosowane klinicznie do dostarczania leków okulistycznych zarówno do przedniego, jak i / lub tylnego odcinka oka w leczeniu chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, jaskra, zapalenie siatkówki i zapalenie tylnego odcinka błony naczyniowej oka18,19. Są one stosunkowo proste do wykonania, rutynowo stosowane do dostarczania leków okulistycznych w warunkach ambulatoryjnych20, są nieco bezbolesne, nie naruszają przywilejów immunologicznych oka i umożliwiają rozprzestrzenianie się podawanych leków przez duży obszar okołooczodołowy, który obejmuje nerw wzrokowy. W związku z tym zastrzyki SCJ są atrakcyjną drogą podawania do zastosowań w terapii genowej AAV. Naturalne serotypy AAV podawane przez wstrzyknięcie SCJ myszom zostały wcześniej scharakteryzowane pod kątem bezpieczeństwa, skuteczności transdukcji, immunogenności surowicy, biodystrybucji i swoistości tkankowej13,16,21. Dane te wykazały, że dostarczanie genów do poszczególnych tkanek oka poprzez podawanie SCJ jest formalną możliwością.

Ten artykuł opisuje prosty i adaptowalny protokół wstrzykiwania SCJ w celu dostarczania wektorów AAV w modelu mysim. Aby zapewnić powtarzalność tego podejścia, opisano system iniekcji składający się z mikroskopu stereoskopowego, programowalnej pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania (która umożliwia stałą i precyzyjną prędkość i ciśnienie wstrzykiwania) oraz gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. System ten można dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego, takich jak wstrzyknięcia dostromalne, dokomorowe, doszklistkowe i podsiatkówkowe u małych zwierząt. Ponadto często stosuje się barwnik fluoresceinowy, aby umożliwić wizualizację miejsca wstrzyknięcia AAV. Szczegółowo omówione zostaną kluczowe kroki praktyczne na drodze podawania, konfiguracja platformy iniekcyjnej, przygotowanie do wstrzyknięcia oraz wskazówki wynikające z bezpośredniego doświadczenia. Na koniec pokrótce omówione zostaną powszechne techniki walidacji w celu potwierdzenia dostarczenia AAV do pożądanych tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill. Stosowanie wektorów AAV stanowi zagrożenie biologiczne na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1. Podczas obchodzenia się z AAV należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary. W opisanym w niniejszym eksperymencie wykorzystano rekombinowany wektor AAV zapakowany w kapsyd serotypu 8 i kodujący generyczny wszechobecny promotor wirusa cytomegalii (CMV) kontrolujący ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP).

1. Obsługa i przechowywanie wektorów AAV

  1. Wirusa należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach o pojemności 100 μl w silikonowanych lub nisko retencyjnych probówkach wirówkowych.
  2. Przed użyciem rozmrozić wszystkie wektorowe roztwory podstawowe na lodzie.
    UWAGA: Barwniki, takie jak roztwór fluoresceiny sodu (o końcowym stężeniu 0,1-2%) są często mieszane z wektorami AAV w celu wizualizacji wstrzykniętego roztworu. Dodatkowo wizualizacja wstrzykiwanych roztworów pomaga wykrywać pęcherzyki powietrza i monitorować dystrybucję AAV i/lub wyciek po wstrzyknięciu.

2. Wstrzyknięcie podspojówkowe (SCJ)

  1. Zmontuj układ wtryskowy.
    1. Aby zmontować system iniekcyjny, należy umieścić mikroskop stereoskopowy i pompę strzykawkową w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Do wykonywania iniekcji z dużą precyzją potrzebna jest pompa infuzyjna. W tym przypadku stosowana jest standardowa programowalna pompa strzykawkowa do zaparzania/pobierania (patrz tabela materiałów), która zawiera mocny uchwyt i bezpieczny zacisk strzykawki do strzykawek o objętości od 0,5 μl do 60 ml. Pompa ta oferuje również zwiększoną wydajność przepływu z wysoką dokładnością i płynnymi natężeniami przepływu od 1,28 pl/min do 88,28 ml/min.
    2. Przyciąć rurkę polietylenową na długość około 50 cm (patrz Tabela materiałów).
    3. Włóż końcówkę piasty igły 36 G do jednego z końców rurki.
      UWAGA: Wsuń końcówkę piasty igły do rurki na ~3 mm, aby upewnić się, że nie dojdzie do wycieku. Igła 36 G jest używana do kolejnego wstrzyknięcia SCJ. Igły o wadze od 32 G do 36 G są najczęściej używanymi rozmiarami do wstrzykiwań SCJ. Zdecydowanie zaleca się stosowanie hemostatu w celu wspomagania tego etapu, aby uniknąć potencjalnego ryzyka zranienia ostrymi narzędziami.
    4. Napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 3 ml sterylną wodą; włóż tę jednorazową strzykawkę z boku rurki przeciwnej do igły i przepłucz wodę przez rurkę/igłę. Powtórz ten krok z 70% alkoholem.
    5. Powtórz krok 2.1.4 jeszcze trzy razy, naprzemiennie spłukując sterylną wodą i 70% alkoholem, aby zdezynfekować rurkę i upewnić się, że nie ma wycieków, zatkań ani uszkodzeń w całym przewodach.
    6. Użyj jednorazowej strzykawki o pojemności 3 ml, aby napełnić rurkę sterylną wodą i pozostaw rurkę podłączoną do jednorazowej strzykawki.
    7. Umieść kawałek parafilmu na powierzchni ławki i dodaj do niego kałużę sterylnej wody (~1 ml). Zanurz część rurki podłączoną do igły w kałuży sterylnej wody. Wyciągnąć jednorazową strzykawkę z otworu rurki na przeciwległym końcu, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do systemu przewodów/igieł po wyjęciu strzykawki. Pozostaw część rurki podłączoną do igły zanurzoną w kałuży wody.
      UWAGA: Procedury od 2.1.4 do 2.1.7 należy wykonać w okapie laminarnym.
    8. Napełnij strzykawkę/igłę Hamiltona o pojemności 10 μl sterylną wodą i unikaj przedostawania się powietrza do strzykawki. Podłącz strzykawkę/igłę Hamiltona do pozostałego otwartego końca rurki, zanurzając rurkę i końcówkę igły strzykawki Hamilton w kałuży sterylnej wody na parafilmie.
    9. Nacisnąć przycisk szybkiego cofania na ekranie pompy, aby przesunąć blok popychacza do przybliżonej długości strzykawki. Odkręcić wspornik clamppokrętła, aby poluzować wsporniki mocujące na popychaczu i blokach uchwytu strzykawki. Załadować strzykawkę Hamilton na blok uchwytu strzykawki i zabezpieczyć strzykawkę zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Aby zabezpieczyć strzykawkę, zacisk cylindra strzykawki powinien być mocno przylegający do cylindra strzykawki; Nie należy jednak dokręcać zbyt mocno, zwłaszcza w przypadku używania szklanych strzykawek. Tłok strzykawki powinien być zabezpieczony wspornikiem mocującym blok popychacza.
    10. Dostosuj parametry na ekranie ustawień pompy.
      1. Naciśnij przycisk Force i ustaw poziom siły na 30%. Zaakceptuj zmiany, aby wrócić do ekranu ustawień.
      2. Naciśnij przycisk szybkiego startu i wybierz Metoda | Zaparz/wycofaj.
      3. Do strzykawki wybierz Hamilton 1700, szkło, 10 μL. Wybrać szybkość infuzji i wycofania oraz objętość wstrzyknięcia.
        UWAGA: Poziom siły jest ustawiany w zależności od typu/materiału/pojemności/producenta strzykawki; Zapoznaj się z instrukcjami producenta fabrycznego, aby uzyskać informacje na temat sugerowanej siły dla każdej strzykawki. Prędkość wstrzykiwania użyta w tym eksperymencie wynosiła 200 nL/s. Zastrzyki SCJ są stosunkowo bezpieczne i istnieje mniejsza obawa o indukcję podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) wynikającego z wstrzyknięcia. Mniejsza prędkość wstrzykiwania jest często pożądana w przypadku niektórych zastosowań, aby uniknąć refluksu do igły i utrzymać spójność wstrzyknięć u zwierząt.
    11. Usunąć wodę ze strzykawki Hamiltona, ale pozostawić rurkę i igłę do wstrzykiwań pełne wody. Lekko pociągnąć strzykawkę Hamiltona, naciskając przycisk Reverse, aby wprowadzić mały pęcherzyk powietrza do rurki/igły.
      UWAGA: Pęcherzyk powietrza będzie służył jako bariera między wodą w rurce a lekiem terapeutycznym (w tym przypadku AAV), zapewniając dokładność podawanej dawki.
    12. Usunąć wirusa, umieszczając igłę do wstrzykiwań w podwielokrotności zapasu wirusa. Upewnij się, że między wirusem a wodą w rurce pozostał widoczny pęcherzyk powietrza.
      UWAGA: Wektory AAV mogą wiązać się z plastikową rurką i metalową igłą, prowadząc do utraty wirusa i/lub niedokładnych schematów dawkowania. Dlatego, aby zapewnić rygor, powtarzalność i dokładną dawkę AAV, zaleca się wstępne powlekanie powierzchni, które następnie stykają się z AAV. Aby pokryć system rurkowo-igły wirusem, należy pobrać roztwór wektora wirusa do rurki/igły i inkubować go w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić nasycenie wirusa wiążącego się ze ścianką igły i/lub rurki. Odrzuć wirusa.
  2. Wstrzyknięcie wirusa
    1. Znieczulić mysz znieczuleniem wziewnym (izofluran) lub dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy/ksylazyny/acepromazyny. Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia poprzez brak reakcji na mocne szczypanie palca.
      UWAGA: Używaj samic i/lub samców myszy C57BL/6J lub BALB/c, które mają co najmniej 6 tygodni. Dawki ketaminy/ksylazyny/acepromazyny są następujące: ketamina w dawce 70 mg/kg, ksylazyna w dawce 7 mg/kg mc. i acepromazyna w dawce 1,5 mg/kg.
    2. Zastosować znieczulenie miejscowe do oka, które otrzyma wstrzyknięcie.
      UWAGA: Do znieczulenia miejscowego należy stosować 0,1% chlorowodorek proparakainy i/lub roztwór okulistyczny chlorowodorku tetrakainy (0,5%).
    3. Nałóż miejscowo maść na drugie oko, które nie zostanie wstrzyknięte, aby zapobiec wysuszeniu i obrażeniom.
    4. Umieść mysz na mikroskopijnym stoliku i wystaw oko myszy pod mikroskopem stereoskopowym.
    5. Połóż dwa palce na powiece i lekko odciągnij ją od oka myszy, aby odsłonić spojówkę, czyli wewnętrzną błonę łączącą powiekę z twardówką.
    6. Chwyć spojówkę kleszczami.
    7. Zwolnij powiekę i przytrzymaj igłę skosem skierowanym do góry, używając dominującej ręki.
    8. Wbić igłę do spojówki. Wbić igłę, aż skos zostanie całkowicie pokryty błoną spojówkową. Przyłóż igłę do kuli ziemskiej.
      UWAGA: Ponieważ spojówka jest przezroczystą błoną, końcówka/skos igły jest dobrze widoczna.
    9. Wstrzyknięcie należy rozpocząć od naciśnięcia przycisku Start za pomocą przełącznika nożnego.
      UWAGA: Ruch powietrza i tłoka Hamiltona jest zsynchronizowany; Każde opóźnienie wskazuje na nadmiar powietrza w układzie iniekcyjnym lub ewentualnie luźne połączenie między elementami rurki, igły i/lub strzykawki.
    10. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy przytrzymać igłę na miejscu przez 10 s przed wyjęciem igły ze spojówki, aby zmniejszyć ryzyko przepływu wstecznego.
      UWAGA: Często zdarza się, że w miejscu wstrzyknięcia SCJ pojawia się pęcherzyk. Takie pęcherzyki zwykle ustępują całkowicie w ciągu kilku godzin po wstrzyknięciu.
    11. Nałóż kroplę miejscowego żelu nawilżającego na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu/urazowi oka, a następnie umieść mysz na poduszce grzewczej, aby wyzdrowieć.
    12. Wykonaj badania okulistyczne, takie jak wytwarzanie łez, ciśnienie wewnątrzgałkowe i badanie lampą szczelinową w połączeniu z barwieniem fluoresceiną rogówki, aby ocenić nieprawidłowości w oku po wstrzyknięciu.
      UWAGA: Produkcja łez jest mierzona za pomocą testu czerwonej nici fenolowej, a tonometr jest często używany do badania ciśnienia wewnątrzgałkowego oka myszy. Poinformowano, że niektóre wstrzyknięcia dogałkowe, takie jak iniekcje doszklistkowe, mogą powodować znaczny wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego; jednak zmiany IOP po wstrzyknięciu SCJ nie są oczywiste13,22,23,24.
  3. Badanie skuteczności biodystrybucji i transdukcji AAV po iniekcji podspojówkowej
    1. Aby zbadać biodystrybucję genomu wirusa i/lub profil transdukcji wektorów AAV dostarczanych przez SCJ, należy poddać myszy eutanazji metodą zatwierdzoną przez AVMA.
      UWAGA: W tym eksperymencie myszy zostały uśmiercone 8 tygodni po wstrzyknięciu.
    2. Aby uzyskać biodystrybucję i ekspresję transgenu w docelowych przedziałach ocznych, należy przeanalizować odpowiednią tkankę będącą przedmiotem zainteresowania, taką jak powieki, rogówka, spojówka, mięsień oka, siatkówka i nerw wzrokowy. Błyskawiczne zamrożenie wszystkich tkanek i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Aby zbadać biodystrybucję AAV w całym ciele, należy pobrać narządy, takie jak węzły chłonne podżuchwowe i wątroba, a następnie błyskawicznie zamrozić i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    3. Korzystając z zestawu do ekstrakcji DNA/RNA, zbierz gDNA i RNA z tej samej próbki, aby zbadać odpowiednio ekspresję transgenu i biodystrybucję AAV. Jeśli pożądana jest tylko biodystrybucja wektorów, użyj zestawu do ekstrakcji DNA do ekstrakcji gDNA.
    4. Wykonaj standardowe qPCR i RT-qPCR, aby określić biodystrybucję wektora AAV i obfitość cDNA za pomocą starterów/sond specyficznych dla transgenu wektora13,25.
    5. Do analizy histologicznej unieruchom oczy, zanurz je w parafinie i przekrój na grubość 5 μm. Wykonaj standardowe barwienie immunofluorescencyjne, aby ujawnić ekspresję transgenu26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Roztwór wstrzyknięty do przestrzeni podspojówkowej prezentuje się jako pęcherzyk w zależności od objętości wstrzyknięcia.
W tym eksperymencie 7 μl AAV (7 × 109 genomów wirusa (vg) / oko) zmieszanych z fluoresceiną w końcowym stężeniu 0,1% wstrzyknięto igłą 36 G pod mikroskopem stereoskopowym, a prędkość/ciśnienie wstrzyknięcia utrzymywano na stałym poziomie 1 μl / s. Po wstrzyknięciu może pojawić się pęcherzyk (strzałka). Mikroskopowy widok podawania wektora AAV do mysiego przedziału SCJ p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Terapia genowa za pośrednictwem AAV ma ogromny potencjał w leczeniu chorób oczu. Obecna oczna terapia genowa opiera się na dwóch głównych drogach podawania miejscowego, iniekcjach do ciała szklistego i podsiatkówkowych. Niestety, obie drogi są inwazyjne i mogą powodować poważne powikłania, w tym odwarstwienie siatkówki, powstawanie zaćmy i zapalenie wnętrza gałki ocznej. W związku z tym badanie stosunkowo mniej inwazyjnych dróg, takich jak wstrzyknięcie SCJ, jest bardzo interesujące.

Chociaż t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Vector Core z University of North Carolina za dostarczenie wektorów scAAV8-GFP użytych w tym badaniu, CGIBD Histology Core, oraz laboratorium Dr. Briana C. Gilgera za pomoc w ocenie klinicznej tego badania. Badanie to było wspierane przez Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship oraz Career Development Award od American Society of Gene & Cell Therapy i Cystic Fibrosis Foundation. Odpowiedzialność za treść spoczywa wyłącznie na autorach i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy American Society of Gene & Cell Therapy lub Cystic Fibrosis Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
36 G NanoFil IgłyWorld Precision InstrumentsNF36BV-2
AAV wektor  Uniwersytet Karoliny Północnej w Chapel Hill  /
AcepromazineHenry ScheinNDC 11695-0079-8
przeciwciało anty-GFPAVES labs Inc.
Aparat cyfrowyCannonCannon EOS T5i
DNA/RNAQiagen80204
  KleszczeFine Science ToolsF6521
Strzykawka HamiltonHamilton7654-01
Indiaatrament StatLabNC9903975
Roztwór do wstrzykiwań chlorowodorku ketaminyHenry ScheinNDC 0409-2051-05
Folia odporna na wilgoćParafilm807-6
Rurki polietylenoweBecton Dickinson i Firma427401
Proparakaina 0,1%Bausch Health USNDC 24208-730-06
Tonometr odbiciaTonovet/
roztwór fluoresceiny soduSigma-Aldich46960
Standardowa pompa do zaparzania/pobierania 11 Programowalna pompa strzykawkowa Pico Plus EliteHarvard Bioscience70-4504
Mikroskopia stereoskopowaLeicaMz6
Chlorowodorek tetrakainy Roztwór okulistyczny 0,5%Bausch i LombRx Tylko
maść do stosowania miejscowegoGenTealNDC 0078-0429-47
KsylazynaAkornNDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 gwintówZONE-QUICKPO6448
zestaw do ekstrakcji

Bibliografia

  1. Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
  2. Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10(2021).
  3. Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
  4. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  5. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  6. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
  7. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
  8. Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
  9. Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
  10. Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
  11. Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
  12. Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
  13. Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
  14. Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
  15. Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
  16. Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956(2015).
  17. Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
  18. Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. Ocular drug delivery. AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).
  19. Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
  20. Stevens, S. Administering a subconjunctival injection. Community Eye Health. 22 (69), 15(2009).
  21. Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
  22. de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248(2020).
  23. Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
  24. Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
  25. Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864(2019).
  26. Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
  27. Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
  28. Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
  29. Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
  30. Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wstrzykni cie podsp conjunktywwektory AAVterapia genowa okasystem wstrzykiwaniapompa strzykawkowaig y do mikroiniekcjibarwienie immunofluorescencyjneilo ciowy PCRdostarczanie lek w do oka

Powiązane artykuły