Artykuł metodologiczny

Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63533

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República (UdelaR), 2Laboratorio de Señalización Celular y Nanobiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Streszczenie

Opisano tutaj metodę charakteryzowania właściwości fizycznych ściany komórkowej komórek naskórka żyjących korzeni Arabidopsis poprzez nanowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) sprzężonego z optycznym mikroskopem fluorescencyjnym z odwróconą lampą piersiową. Metoda polega na przyłożeniu kontrolowanych sił do próbki podczas pomiaru jej odkształcenia, co pozwala na ilościowe określenie parametrów, takich jak pozorny moduł Younga ścian komórkowych w rozdzielczościach subkomórkowych. Wymaga starannego mechanicznego unieruchomienia próbki oraz prawidłowego doboru wgłębników i głębokości wgłębień. Chociaż może być stosowana tylko w tkankach zewnętrznych, metoda ta pozwala scharakteryzować zmiany mechaniczne w ścianach komórkowych roślin podczas rozwoju i umożliwia korelację tych mikroskopijnych zmian ze wzrostem całego narządu.

Wprowadzenie

Komórki roślinne są otoczone ścianą komórkową, która jest złożoną strukturą składającą się z oddziałujących ze sobą sieci polisacharydów, białek, metabolitów i wody, o grubości wahającej się od 0,1 do kilku µm, w zależności od typu komórki i fazy wzrostu1,2. Właściwości mechaniczne ściany komórkowej odgrywają kluczową rolę we wzroście roślin. Niskie wartości sztywności ściany komórkowej są proponowane jako warunek wstępny wzrostu komórek i rozszerzania się ścian komórkowych, a coraz więcej dowodów wskazuje na to, że wszystkie komórki wyczuwają siły mechaniczne w celu pełnienia swoich funkcji. Jednak wciąż przedmiotem dyskusji pozostaje kwestia tego, czy zmiany właściwości fizycznych ściany komórkowej determinują los komórki2,3,4. Ponieważ komórki roślinne nie przemieszczają się podczas rozwoju, ostateczny kształt organu zależy od tego, w jakim stopniu i w którym kierunku rozszerza się komórka. W związku z tym korzeń Arabidopsis jest dobrym modelem do badania wpływu właściwości fizycznych ściany komórkowej na rozszerzanie się komórek, ponieważ w różnych regionach korzenia zachodzą różne typy rozszerzania. Na przykład rozszerzanie anizotropowe jest widoczne w strefie elongacji, a szczególnie wyraźnie w komórkach epidermy5.

Opisana tutaj metoda została wykorzystana do charakterystyki właściwości fizycznych ściany komórkowej komórek epidermy żyjących korzeni Arabidopsis w skali nanometrów, przy użyciu mikroskopu sił atomowych (AFM) sprzężonego z odwróconym fluorescencyjnym mikroskopem fazowym6. W celu uzyskania szczegółowego przeglądu techniki AFM należy zapoznać się z publikacjami7,8,9.

Niniejszy protokół opisuje podstawową metodę przygotowania próbek oraz ogólną metodę pomiaru elastyczności ścian komórkowych roślin z wykorzystaniem AFM.

figure-introduction-1
Rycina 1Schematyczny przegląd eksperymentu siła-wgniecenie w korzeniach Arabidopsis z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych (AFM). Schemat przedstawia przegląd etapów eksperymentu siła-wgłębienie: od przygotowania podłoża w celu stabilnej immobilizacji próbki korzenia (1-2), potwierdzenia żywotności korzenia poprzez barwienie jodkiem propidyny (3), pozycjonowania dźwigary na powierzchni wydłużonej komórki epidermy korzenia głównego (4-5), pomiaru krzywych siły (6) oraz przetwarzania krzywych siły w celu obliczenia pozornego modułu Younga (7-8). EZ: strefa elongacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiału roślinnego i warunki wzrostu

  1. Aby uzyskać potrzebny materiał roślinny, wysterylizuj nasiona Arabidopsis typu dzikiego oraz wybranych linii mutantów.
    UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano następujące linie: ttl1: linie z insercją T-DNA Salk_063943 (dla TTL1; AT1G530) - typ dziki Columbia-0 (Col-0); mutant Procuste1 (prc1-1), który posiada mutację typu knock-out (Q720stop) w genie CESA6 (AT5G64740), zgodnie z wcześniejszym opisem w10,1; oraz podwójnego mutanta ttl1 x prc1-1 .
    1. Umieść objętość około 50 μL nasion w mikroprobowce. Dodaj 50 μL roztworu 70% etanolu + 0,01% Tween w temperaturze pokojowej. Wymieszaj i inkubuj przez 7 min.
    2. Odlej roztwór etanolu i dodaj 50 μL 20% podchlorynu sodu. Wymieszaj i inkubuj przez 7 min.
    3. Odlej roztwór podchlorynu sodu i wypłucz nasiona trzy-cztery razy sterylną wodą.
  2. Wysiewanie
    1. Przygotuj wcześniej podstawową pożywkę Murashige i Skoog (MS)12 + 1,5% sacharozy + 1% agaru (pH 5,7) (patrz Tabela materiałów). Autoklawuj pożywkę. Przygotuj komorę z laminarnym przepływem powietrza, aby pracować w sterylnych warunkach, i opisz kwadratowe szalki Petriego niezbędne do eksperymentu. Wlej pożywkę do szalek Petriego i poczekaj, aż stężeje.
    2. Wysiej wysterylizowane nasiona na kwadratowe szalki Petriego z pożywką, używając sterylnych końcówek do pipet. Rozmieść nasiona równomiernie w dwóch rzędach. Po wyschnięciu nasion zamknij pokrywki i szczelnie zamknij szalki. Stratyfikuj nasiona w temperaturze 4 °C w ciemności przez 4 dni.
      UWAGA: Stratyfikacja jest konieczna do synchronizacji kiełkowania.
    3. Umieść szalki pionowo w komorze wzrostowej w reżimie długiego dnia (16 h światła/8 h ciemności) przy natężeniu światła 25 μmol m2 s−1 i temperaturze 23 °C (dzień/noc). Hoduj siewki przez 7 dni.

2. Obróbka stresem osmotycznym (opcjonalnie)

UWAGA: Ta sekcja zawiera szczegółowe informacje na temat wzrostu korzeni Arabidopsis  w potencjale osmotycznym -1,2 MPa, określonym za pomocą osmometru krioskopowego (Tabela materiałów). Część ta może zostać pominięta lub zmieniona w zależności od stawianego pytania badawczego.

  1. Przygotować podstawową pożywkę MS z dodatkiem 1,5% sacharozy, 400 mM mannitolu i 1% agaru (pH 5,7). Pożywkę poddać autoklawowaniu. Rozlać pożywkę do kwadratowych szalek Petriego w komorze z laminarnym przepływem powietrza i pozostawić do zastygnięcia.
  2. Za pomocą pęsety (Tabela materiałów), umieść 5-dniowe siewki, uprzednio wyhodowane na podłożu MS podstawowym z 1,5% sacharozą, w kwadratowych szalkach Petri zawierających podłoże uzupełnione o 400 mM mannitolu. Umieść szalki pionowo w komorze wzrostowej w tych samych warunkach, co w kroku 1.2.3. Hoduj siewki w tych warunkach stresu osmotycznego przez 7 dni.
    UWAGA: Aby ocenić adaptację wzrostu korzenia głównego podczas silnego stresu osmotycznego, zaleca się wykorzystanie siewek 5 dni po kiełkowaniu, hodowanych w kontrolowanych warunkach, aby zapewnić, że rozmiar merystemu korzenia został już ustalony13Alternatywnie analizę można przeprowadzić na każdym etapie rozwoju, aby określić wpływ stresu osmotycznego na proces rozwoju.

3. Eksperymenty nanoindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)

  1. Przygotowanie próbki do eksperymentów z nanoindentacją
    UWAGA: Jest to kluczowy etap zastosowania AFM w badaniu żywych próbek biologicznych. Próbka musi być mocno przytwierdzona do podłoża, aby zachować stabilność mechaniczną podczas pomiarów wgłębienia. Jednocześnie należy zachować cechy strukturalne próbki. Skuteczną strategią stabilizacji dużej próbki do AFM jest zastosowanie środków adhezyjnych. Środek adhezyjny musi szybko schnąć i nie może być toksyczny ani reaktywny w stosunku do otaczającego medium. W niniejszym protokole jako podłoże wykorzystano polistyrenowe szalki Petriego oraz niekwaśny klej silikonowy (Tabela materiałów) użyto do unieruchomienia siewek Arabidopsis.
    1. Nanieś cienką warstwę kleju silikonowego do szalki Petriego z szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw klej do wyschnięcia przez 45 s.
    2. Za pomocą pincety należy umieścić siewkę na kleju, orientując ją w taki sposób, aby uniknąć kontaktu wystających części siewki z belką. Następnie należy delikatnie docisnąć korzeń do warstwy kleju silikonowego, aby zapewnić trwałe połączenie. Pozostawić siewkę w kontakcie z klejem przez 45 s przed przejściem do kolejnych kroków protokołu.
    3. Inkubować przymocowane siewki z 2 μg/mL jodek propidyny (PI; Tabela materiałów) przez 5 min w ciemności, a następnie ostrożnie przemyć je trzykrotnie 1x roztworem soli w soli buforze fosforanowym (PBS) (Tabela materiałów).
    4. Umieść sadzonki inkubowane z PI w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym sprzężonym z AFM. W celu obserwacji fluorescencji ustaw długość fali wzbudzenia na 572 nm, a długość fali emisji na 617 nm. Brak fluorescencji wewnątrz komórek epidermy potwierdza żywotność korzeni.
    5. Przykryć siewkę 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).
  2. Protokół wcięcia
    UWAGA: Wszystkie pomiary AFM należy przeprowadzić w ciągu 1 h od unieruchomienia próbki na podłożu w temperaturze pokojowej. W pomieszczeniu, w którym znajduje się AFM, powinna być utrzymywana 25 °C z użyciem klimatyzatora. Roztwór PBS powinien znajdować się w tej samej temperaturze.
    1. Zamontuj standardowy wspornik z azotku krzemu z wierzchołkiem o kształcie piramidy (patrz Tabela materiałów) do uchwytu sondy AFM do pracy w cieczy (Tabela materiałów).
    2. Ustaw wiązkę lasera na wsporniku w pobliżu pozycji końcówki. Następnie przesuń fotodiodę tak, aby plamka lasera znalazła się w centrum detektora.
    3. Aby skalibrować czułość ugięcia, należy umieścić pod AFM polistyrenową płytkę Petriego z 1x PBS.
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny do obliczenia wgłębienia. Podczas pomiaru siły na twardej powierzchni nie dochodzi do wgłębienia się w powierzchnię, zatem każda zmiana przemieszczenia skanera z odpowiada ugięciu wspornika. Dlatego bardzo ważne jest skalibrowanie czułości ugięcia na twardej powierzchni. Użycie miękkiej powierzchni spowoduje przeszacowanie czułości ugięcia, co doprowadzi do uzyskania zbyt niskich stałych sprężystości.
    4. Wyreguluj fotodetektor w taki sposób, aby defleksja bezkontaktowa wynosiła blisko 0 V. Skalibruj czułość defleksji, wykonując wcięcie (krzywa siły), przy rozmiarze rampy wynoszącym 3 μm, szybkość wciskania i wycofywania o 0.6 μm/soraz próg wyzwalania wynoszący 0,5 V.
    5. Aby skalibrować stałą sprężystości wspornika, należy użyć Regulacja termiczna użyteczność oprogramowania AFM (Tabela materiałów) zalecane dla sond o stałej sprężystości mniejszej niż około 5 N/m lub należy zastosować metodę opisaną w literaturze przedmiotu14Przed aktywacją Dostrojenie termiczne W oprogramowaniu należy upewnić się, że sonda nie wchodzi w interakcję z próbką.
      1. Wprowadź temperaturę wspornika. Kliknij w Kalibrować > Regulacja Termiczna lub na Regulacja termiczna ikona w NanoScope pasek narzędzi. Wybierz zakres częstotliwości (1-10 Hz).
      2. Kliknij w Pozyskiwanie danych w Regulacja termiczna panel. Należy odczekać, aż AFM pobierze dane, a następnie kliknąć w Prosty oscylator harmoniczny (ciecz) przycisk
      3. Dostosuj Szerokość filtru medianowego na 3Dostosuj Szerokość przedziału PSD w celu redukcji szumów w pozyskanych danych poprzez uśrednianie. Wyznacz granice dopasowania wokół pierwszego piku rezonansowego.
      4. Kliknij w Obliczanie stałej sprężystości k, a następnie kliknij Tak w oknie wyskakującym z pytaniem, czy użytkownik chce użyć tej wartości.
      5. Powtórz opisane powyżej kroki trzykrotnie, a następnie ręcznie oblicz średnią wartość stałej sprężystości. Wprowadź tę średnią wartość do Stała sprężystości pudełko w Rampa lista parametrów w PicoForce widok. Na tym etapie kalibracja dobiega końca.
    6. Korzystając z odwróconego mikroskopu optycznego przy powiększeniu okularowym 10x, 20x i 40x, należy umieścić sondę AFM na powierzchni czwartej wydłużonej komórki epidermy korzenia głównego, upewniając się, że znajduje się ona w centrum komórki.
    7. Wykorzystując obliczoną wartość stałej sprężystości (krok 3.2.5.5), uzyskaj krzywe siły z rozmiarem rampy wynoszącym 3 µm, próg wyzwalania wynoszący 1 nN oraz prędkość wgniatania i wycofania wynoszącą 0.6 μm/s w wybranych punktach.
      ​UWAGA: Poprzednie prace15,16 stwierdzono, że niska częstotliwość wciskania i wycofywania pomaga zminimalizować histerezę i siłę oporu.
    8. Uzyskaj krzywe siły z trzech komórek na korzeń dla każdego wariantu (użyj trzech powtórzeń biologicznych na wariant). Zbierz co najmniej 150 krzywych siły dla każdego korzenia.

4. Pomiar pozornego modułu Younga

  1. Dopasuj każdą krzywą siły do następującego modelu dla wgłębiaczy piramidalnych17: figure-protocol-1, gdzie E jest pozorny moduł Younga próbki, figure-protocol-2 jest współczynnikiem Poissona próbki, a α jest półkątem wierzchołkowym. Należy odrzucić dopasowania o współczynniku korelacji (r2) < 0.9. Rozważyć współczynnik Poissona dla materiału całkowicie nieściśliwego: figure-protocol-3 = 0,5 oraz geometria wgłębnika podana przez producentów.
    UWAGA: Do dopasowania należy użyć pierwszych 100 nm od punktu kontaktu krzywej obciążania, aby uzyskać jak największą czułość na mechanikę ściany komórkowej oraz ograniczyć wpływ turgoru na pozorne wartości modułu Younga8Dopasowanie wykonano przy użyciu specjalistycznego programu w środowisku MATLAB (dostępnego na osobne żądanie po skierowaniu zapytania do J. C. B), który umożliwia ustawienie konkretnej głębokości wcięcia od punktu styku na krzywej obciążenia.
  2. Utwórz znormalizowany histogram dla danych dotyczących pozornego modułu Younga i dopasuj do niego rozkład Gaussa. Odrzuć punkty danych znajdujące się poza 95-procentowym przedziałem ufności, a następnie ponownie oblicz histogram oraz dopasowanie gaussowskie. Oblicz i podaj średnią oraz odchylenie standardowe pozornego modułu Younga.
  3. Określ istotność porównań między grupami za pomocą testów wielokrotnych porównań, takich jak ANOVA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Doświadczenia z pomiaru siły wciskania
Poniższy tekst przedstawia wyniki oczekiwane po przeprowadzeniu eksperymentu z pomiaru siły wciskania, aby ukazać typowy rezultat uzyskany przy prawidłowej realizacji protokołu.

Krzywe siła-przemieszczenie
Na Rysunku 2 przedstawiono reprezentatywne wykresy indentacji siłowej, uzyskane podczas wbijania próbki w pozycji umieszczonej w centrum komórki strefy elongacji korzenia. W mom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mechanika komórek i ścian komórkowych staje się coraz bardziej istotna dla uzyskania wglądu w to, jak mechanika wpływa na procesy wzrostu. Ponieważ siły fizyczne rozchodzą się na znaczne odległości w tkankach stałych, badanie zmian we właściwościach fizycznych ściany komórkowej oraz tego, jak są one wyczuwane, kontrolowane, dostrajane i wpływają na wzrost rośliny, staje się ważnym polem badań 2,3,8.

P...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Skrypt MATLAB używany do dopasowywania danych jest dostępny na osobiste żądanie po napisaniu do J. C. B.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez CSIC I+D 2018, grant nr 95 (Mariana Sotelo Silveira).; CSIC Grupos (Omar Borsani) oraz PEDECIBA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Zawiera chlorek sodu i bufor fosforanowy i jest opracowany w celu zapobiegania szokowi osmotycznemu i utrzymania równowagi wodnej w żywych komórkach.
Oprogramowanie AFMBruker, Billerica, MA, USA
Mikroskopia sił atomowych (AFM)BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Katalizator Uchwyt sondyBruker, Billerica, MA, USACAT-FCHdo katalizatora Bioscope, przeznaczony do pracy z płynem w trybie kontaktowym lub stukania.  Kompatybilny również z zasilaniem pneumatycznym.
Osmometr krioskopowy; model OSMOMAT 030Gonotech, Berlin, Niemcy
Murashige & Skoog MediumDuchess BiochemieM0221Oryginalne stężenie, (1962)
Optyczny mikroskop odwrócony sprzężony z AFMOlympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMILANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentyna100429Neutralny, niekwaśny klej silikonowy
szalki PetriegoDeltalab200201.BPolistyren, 55 x 14 mm, sterylny promieniowanie.
Jodek propidynySigmaP4170Do testu żywotności korzeni.
Sonda z azotku krzemu, DNP-10, wspornikowa ABruker, Billerica, MA, USADNP-10/ADo mikroskopii modulacji siły w pracy z cieczą. Promień końcówki sondy 20-60 nm. 175-μ M-długi trójkątny wspornik,  o stałej sprężystości 0,35 N/m.
PęsetaSigmaT4537
płynnej Uchwyt sondy

Bibliografia

  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
  3. Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
  4. Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
  5. Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. Root development. The Arabidopsis Book. 1, 0101(2002).
  6. Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236(2021).
  7. Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
  8. Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
  9. Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
  10. Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
  11. Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
  12. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
  13. Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
  14. Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711(2016).
  15. Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
  16. Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
  17. Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
  18. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317(2014).
  19. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
  20. Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

W a ciwo ci ciany kom rkowejtechnika nanoindentacjimodu Youngaunieruchomienie mechanicznekrzywe si ywg bnik piramidowyodwr cony mikroskop fluorescencyjny

Powiązane artykuły