Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Summary

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Abstract

Opisano tutaj metodę charakteryzowania właściwości fizycznych ściany komórkowej komórek naskórka żyjących korzeni Arabidopsis poprzez nanowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) sprzężonego z optycznym mikroskopem fluorescencyjnym z odwróconą lampą piersiową. Metoda polega na przyłożeniu kontrolowanych sił do próbki podczas pomiaru jej odkształcenia, co pozwala na ilościowe określenie parametrów, takich jak pozorny moduł Younga ścian komórkowych w rozdzielczościach subkomórkowych. Wymaga starannego mechanicznego unieruchomienia próbki oraz prawidłowego doboru wgłębników i głębokości wgłębień. Chociaż może być stosowana tylko w tkankach zewnętrznych, metoda ta pozwala scharakteryzować zmiany mechaniczne w ścianach komórkowych roślin podczas rozwoju i umożliwia korelację tych mikroskopijnych zmian ze wzrostem całego narządu.

Introduction

Komórki roślinne są otoczone ścianą komórkową, która jest złożoną strukturą złożoną z oddziałujących na siebie sieci polisacharydów, białek, metabolitów i wody, której grubość waha się od 0,1 do kilku μm w zależności od typu komórki i fazy wzrostu^1,2. Właściwości mechaniczne ściany komórkowej odgrywają istotną rolę we wzroście roślin. Niskie wartości sztywności ściany komórkowej zostały zaproponowane jako warunek wstępny wzrostu i rozszerzania się ściany komórkowej, a istnieje coraz więcej dowodów na to, że wszystkie komórki odczuwają siły mechaniczne, aby wykonywać swoje funkcje. Jednak nadal jest dyskutowane, czy zmiany we właściwościach fizycznych ściany komórkowej determinują los komórki^2,3,4. Ponieważ komórki roślinne nie poruszają się podczas rozwoju, ostateczny kształt narządu zależy od tego, jak daleko i w jakim kierunku rozszerza się komórka. Tak więc korzeń Arabidopsis jest dobrym modelem do badania wpływu właściwości fizycznych ściany komórkowej na ekspansję komórki, ponieważ różne rodzaje ekspansji występują w różnych regionach korzenia. Na przykład ekspansja anizotropowa jest widoczna w strefie wydłużenia, a szczególnie zauważalnie w komórkach naskórka⁵.

Opisana tutaj metoda została użyta do scharakteryzowania właściwości fizycznych ściany komórkowej komórek naskórka w nanoskali żywych korzeni Arabidopsis za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) sprzężonego z mikroskopem z odwróconą fazą fluorescencji⁶. Aby zapoznać się z obszerną wersją techniki AFM, przeczytaj^7,8,9.

Ten protokół przedstawia podstawową metodę przygotowania próbki oraz ogólną metodę pomiarów elastyczności ścian komórkowych roślin opartej na AFM.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd eksperymentu z wgłębieniami siły w korzeniach Arabidopsis przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM). Schemat zawiera przegląd etapów eksperymentu siła-wgłębienie od przygotowania podłoża w celu mocnego unieruchomienia próbki korzenia (1-2), potwierdzenia żywotności korzenia poprzez barwienie jodkiem propidyny (3), pozycjonowanie wspornika na powierzchni wydłużonej komórki naskórka korzenia pierwotnego (4-5), pomiar krzywych siły (6) i przetwarzanie krzywej siły w celu obliczenia pozornego modułu Younga (7-8). EZ: strefa wydłużenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

1. Przygotowanie materiału roślinnego i warunki wzrostu

1. Aby wytworzyć potrzebny materiał roślinny, wysterylizuj nasiona Arabidopsis typu dzikiego i zmutowanych linii zainteresowania.
   UWAGA: W tym protokole użyliśmy następujących elementów: ttl1: Linie insercji T-DNA Salk_063943 (dla TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) typ dziki; mutant Procuste1 (prc1-1), który składa się z mutacji knock-out (Q720stop) w genie CESA6 (AT5G64740), jak opisano wcześniej w^10,11; oraz podwójnego mutanta TTL1 x PRC1-1.
   1. Umieść przybliżoną objętość 50 μl nasion w mikroprobówce. Dodaj 500 μl 70% etanolu + 0,01% roztworu Tween w temperaturze pokojowej. Wymieszaj i inkubuj przez 7 minut.
   2. Wlej roztwór etanolu i dodaj 500 μl 20% podchlorynu sodu. Wymieszaj i inkubuj przez 7 minut.
   3. Wlej roztwór podchlorynu sodu i umyj nasiona trzy do czterech razy sterylną wodą.
2. Poszycia
   1. Przygotuj wcześniej podstawowy Murashige i Skoog (MS) medium¹² + 1,5% sacharozy + 1% agaru (pH 5,7) (patrz tabela materiałów). Podłoże należy sterylizować w autoklawie. Przygotuj okap z przepływem laminarnym do pracy w sterylnym środowisku i oznacz kwadratowe szalki Petriego potrzebne do eksperymentu. Wlej pożywkę do szalek Petriego i pozwól pożywce zestalać się.
   2. Wysterylizowane nasiona należy ułożyć na kwadratowych szalkach Petriego zawierających pożywkę za pomocą sterylnych końcówek pipet. Rozłóż nasiona równomiernie w dwóch rzędach. Gdy nasiona wyschną, zamknij pokrywki i uszczelnij płytki. Rozwarstwiać nasiona w temperaturze 4 °C w ciemności przez 4 dni.
      UWAGA: Stratyfikacja jest potrzebna do synchronizacji kiełkowania.
   3. Umieść płytki pionowo w komorze wzrostowej w trybie długiego dnia (16 godzin światła/8 godzin ciemności) o natężeniu światła 25 μmol^m2 s⁻¹ i temperaturze 23 °C (dzień/noc). Uprawiaj sadzonki przez 7 dni.

2. Leczenie stresu osmotycznego (opcjonalnie)

UWAGA: Ta sekcja zawiera szczegóły dotyczące wzrostu korzeni Arabidopsis w potencjale osmotycznym -1,2 MPa, oszacowanym przez osmometr krioskopowy (Tabela Materiałów). Ta część może zostać pominięta lub zmieniona w zależności od pytania eksperymentalnego.

1. Przygotować podstawowe podłoże MS + 1,5% sacharozy + 400 mM mannitolu + 1% agaru (pH 5,7). Podłoże należy sterylizować w autoklawie. Wlać pożywkę na kwadratowe szalki Petriego do okapu z przepływem laminarnym i pozostawić pożywkę do zestalenia się.
2. Za pomocą pęsety (tabela materiałów) umieść 5-dniowe sadzonki wyrośnięte w podstawowym podłożu MS + 1,5% sacharozy na kwadratowych szalkach Petriego zawierających pożywkę uzupełnioną 400 mM mannitolem. Umieść płytki pionowo w komorze wzrostowej w takich samych warunkach, jak w kroku 1.2.3. Hoduj sadzonki w tych warunkach stresu osmotycznego przez 7 dni.
   UWAGA: Aby ocenić adaptację korzenia pierwotnego do wzrostu podczas silnego stresu osmotycznego, sugeruje się użycie sadzonek 5 dni po wykiełkowaniu uprawianych w kontrolowanych warunkach, aby upewnić się, że rozmiar merystemu korzeniowego jest już ustalony¹³. Alternatywnie, analizę można przeprowadzić na każdym etapie rozwoju w celu określenia efektu rozwojowego działania stresu osmotycznego.

3. Eksperymenty z nanoindentacją w mikroskopii sił atomowych (AFM)

1. Przygotowanie próbki do eksperymentów z nanotwardością
   UWAGA: Jest to kluczowy krok w zastosowaniu AFM do badania żywych próbek biologicznych. Próbka musi być mocno przymocowana do podłoża, aby była mechanicznie stabilna podczas pomiarów wgłębień. Jednocześnie należy zachować właściwości strukturalne próbki. Skuteczną strategią stabilizacji dużej próbki pod kątem AFM jest użycie klejów. Klej musi szybko schnąć i nie może być toksyczny ani reaktywny z otaczającym medium. W tym protokole jako podłoże użyto polistyrenowych szalek Petriego, a do związania siewek rzodkiewnika użyto niekwaśnego kleju silikonowego (Tabela materiałów).
   1. Rozprowadź cienką warstwę kleju silikonowego na szalce Petriego za pomocą szkiełka nakrywkowego. Pozostaw klej na powietrzu na 45 sekund.
   2. Za pomocą pęsety umieść sadzonkę na kleju, ustawiając ją w kierunku, który pozwala uniknąć kontaktu między wystającymi częściami sadzonki a wspornikiem. Następnie delikatnie dociśnij korzeń do warstwy kleju silikonowego, aby mocno go związać. Pozostaw sadzonkę w kontakcie z klejem na 45 sekund przed przystąpieniem do kolejnych kroków protokołu.
   3. Inkubować dołączone sadzonki z 2 μg/ml jodku propidyny (PI; Tabela materiałów) przez 5 minut w ciemności i ostrożnie umyć je trzykrotnie 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (tabela materiałów).
   4. Umieść sadzonki inkubowane przez PI w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym sprzężonym z AFM. Aby zaobserwować fluorescencję, ustaw długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 572 nm i 617 nm. Brak fluorescencji wewnątrz komórek naskórka potwierdza żywotność korzeni.
   5. Przykryj sadzonkę 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
2. Protokół wcięć
   UWAGA: Wszystkie pomiary AFM należy wykonać w ciągu 1 godziny po unieruchomieniu próbki na jej podłożu w temperaturze pokojowej. W pomieszczeniu, w którym znajduje się AFM, należy utrzymywać temperaturę 25 °C z klimatyzatorem. Roztwór PBS powinien mieć tę samą temperaturę.
   1. Zamontuj standardowy wspornik z azotku krzemu z piramidalną końcówką (patrz Tabela materiałów) w uchwycie sondy AFM do płynu (Tabela materiałów).
   2. Ustaw laser na wsporniku blisko pozycji końcówki. Następnie przesuń fotodiodę, aby umieścić plamkę lasera w środku detektora.
   3. Aby skalibrować czułość ugięcia, umieść polistyrenową szalkę Petriego z 1x PBS pod AFM.
      UWAGA: Ten krok jest potrzebny do obliczenia wcięcia. Gdy pomiar siły jest wykonywany na twardej powierzchni, nie ma wgłębienia w powierzchni, więc każda zmiana przemieszczenia skanera z odpowiada ugięciu wspornika. Dlatego bardzo ważne jest, aby skalibrować czułość ugięcia na twardej powierzchni. Użycie miękkiej powierzchni spowoduje przeszacowanie czułości ugięcia, co spowoduje, że stałe sprężystości będą zbyt niskie.
   4. Wyreguluj fotodetektor tak, aby odchylenie bezdotykowe było bliskie 0 V. Skalibruj czułość ugięcia, wykonując wgłębienie (krzywą siły) o wielkości rampy 3 μm, szybkości wgłębiania i cofania 0,6 μm/s i progu wyzwalania 0,5 V.
   5. Aby skalibrować stałą sprężystości wspornika, należy użyć narzędzia Thermal Tune w oprogramowaniu AFM (Tabela materiałów) zalecanego dla sond o stałych sprężystości mniejszych niż około 5 N/m lub użyć metody opisanej w reference¹⁴. Przed aktywacją funkcji Thermal Tune w oprogramowaniu upewnij się, że sonda nie wchodzi w interakcję z próbką.
      1. Wprowadź temperaturę wspornika. Kliknij na Calibrate > Thermal Tune lub na ikonę Thermal Tune na pasku narzędzi NanoScope. Wybierz zakres częstotliwości (1-100 Hz).
      2. Kliknij opcję Obtain Data (Uzyskaj dane) w panelu Thermal Tune (Dostrajanie termiczne). Poczekaj, aż AFM pobierze dane, a następnie kliknij przycisk Prosty oscylator harmoniczny (płyn).
      3. Dostosuj medianę szerokości filtra do 3. Dostosuj szerokość kosza PSD, aby zredukować szum w pozyskanych danych poprzez uśrednianie. Ustal granice dopasowania wokół pierwszego piku rezonansowego.
      4. Kliknij Oblicz stałą sprężystości k, a następnie kliknij Tak w wyskakującym okienku z pytaniem, czy użytkownik chce użyć tej wartości.
      5. Powtórz opisane powyżej kroki trzy razy i ręcznie zmierz średnią wartości stałej sprężystości. Wprowadź tę średnią wartość w polu Stała sprężystości na liście parametrów Rampa w widoku PicoForce. W tym momencie kalibracja się kończy.
   6. Używając odwróconego mikroskopu optycznego przy powiększeniu okularu 10x, 20x i 40x, umieść sondę AFM na powierzchni czwartej wydłużonej komórki naskórka korzenia pierwotnego, upewniając się, że znajduje się w środku komórki.
   7. Za pomocą obliczonej wartości stałej sprężystości (krok 3.2.5.5) uzyskaj krzywe siły o wielkości rampy 3 μm, progu wyzwalania 11 nN i szybkości wciskania i cofania 0,6 μm/s w wybranych punktach.
      UWAGA: Poprzednia praca^15,16 wykazała, że niska częstotliwość wciskania i chowania pomaga zminimalizować histerezę i siłę oporu.
   8. Uzyskaj krzywe siły z trzech komórek na korzeń dla każdego zabiegu (użyj trzech kontrprób biologicznych na zabieg). Uchwyć co najmniej 150 krzywych siły dla każdego pierwiastka.

4. Zmierz pozorny moduł Younga

1. Dopasuj każdą krzywą siły do następującego modelu dla wgłębień piramidalnych¹⁷: , gdzie E jest pozornym modułem Younga próbki, to moduł Poissona próbki, a α to półkąt do wierzchołka. Odrzucić pasowania o współczynniku korelacji (r²) < 0,99. Rozważ współczynnik Poissona dla materiału całkowicie nieściśliwego: = 0,5 i geometrię wgłębnika podaną przez producentów.
   UWAGA: Użyj pierwszych 100 nm od punktu styku krzywej obciążenia, aby złączka była jak najbardziej wrażliwa na mechanikę ściany komórkowej i zmniejszyła wpływ ciśnienia turgoru na pozorne wartości modułu Younga⁸. Dopasowanie zostało wykonane za pomocą niestandardowego programu MATLAB (dostępnego na osobiste życzenie po napisaniu do J. C. B), który umożliwia ustawienie określonej głębokości wcięcia od punktu styku krzywej obciążenia.
2. Utwórz znormalizowany histogram z pozornymi danymi modułu Younga i dopasuj go do rozkładu Gaussa. Odrzuć punkty danych poza 95% przedział ufności i ponownie oblicz zarówno histogram, jak i dopasowanie Gaussa. Obliczyć i podać średnią i odchylenie standardowe pozornego modułu Younga.
3. Określ znaczenie porównań między grupami za pomocą wielu testów porównawczych, takich jak ANOVA.

Results

Eksperymenty z siłą wcięcia
Poniższy tekst przedstawia niektóre wyniki oczekiwane po przeprowadzeniu eksperymentu z wcięciem siłowym, aby pokazać typowe wyjście, którego można się spodziewać, gdy protokół jest dobrze wykonany.

Krzywe siły-przemieszczenia
Reprezentatywne wykresy wgłębień sił, które uzyskano wciskając żywe próbki w pozycji umieszczonej w środku komórki strefy wydłużenia korzenia, przedstawiono na rysunku Rysunek 2

Discussion

Mechanika komórek i ścian komórkowych staje się coraz bardziej istotna dla uzyskania wglądu w to, jak mechanika wpływa na procesy wzrostu. Ponieważ siły fizyczne rozchodzą się na znaczne odległości w tkankach stałych, badanie zmian we właściwościach fizycznych ściany komórkowej oraz tego, jak są one wyczuwane, kontrolowane, dostrajane i wpływają na wzrost rośliny, staje się ważnym polem badań ^2,3,8.

P...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)			Zawiera chlorek sodu i bufor fosforanowy i jest opracowany w celu zapobiegania szokowi osmotycznemu i utrzymania równowagi wodnej w żywych komórkach.
Oprogramowanie AFM	Bruker, Billerica, MA, USA
Mikroskopia sił atomowych (AFM)	BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Katalizator Uchwyt sondy	Bruker, Billerica, MA, USA	CAT-FCH	do katalizatora Bioscope, przeznaczony do pracy z płynem w trybie kontaktowym lub stukania.  Kompatybilny również z zasilaniem pneumatycznym.
Osmometr krioskopowy; model OSMOMAT 030	Gonotech, Berlin, Niemcy
Murashige & Skoog Medium	Duchess Biochemie	M0221	Oryginalne stężenie, (1962)
Optyczny mikroskop odwrócony sprzężony z AFM	Olympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMIL	ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentyna	100429	Neutralny, niekwaśny klej silikonowy
szalki Petriego	Deltalab	200201.B	Polistyren, 55 x 14 mm, sterylny promieniowanie.
Jodek propidyny	Sigma	P4170	Do testu żywotności korzeni.
Sonda z azotku krzemu, DNP-10, wspornikowa A	Bruker, Billerica, MA, USA	DNP-10/A	Do mikroskopii modulacji siły w pracy z cieczą. Promień końcówki sondy 20-60 nm. 175-μ M-długi trójkątny wspornik,  o stałej sprężystości 0,35 N/m.
Pęseta	Sigma	T4537