Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisano tutaj metodę charakteryzowania właściwości fizycznych ściany komórkowej komórek naskórka żyjących korzeni Arabidopsis poprzez nanowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) sprzężonego z optycznym mikroskopem fluorescencyjnym z odwróconą lampą piersiową. Metoda polega na przyłożeniu kontrolowanych sił do próbki podczas pomiaru jej odkształcenia, co pozwala na ilościowe określenie parametrów, takich jak pozorny moduł Younga ścian komórkowych w rozdzielczościach subkomórkowych. Wymaga starannego mechanicznego unieruchomienia próbki oraz prawidłowego doboru wgłębników i głębokości wgłębień. Chociaż może być stosowana tylko w tkankach zewnętrznych, metoda ta pozwala scharakteryzować zmiany mechaniczne w ścianach komórkowych roślin podczas rozwoju i umożliwia korelację tych mikroskopijnych zmian ze wzrostem całego narządu.
Wprowadzenie
Komórki roślinne są otoczone ścianą komórkową, która stanowi złożoną strukturę złożoną z oddziałujących ze sobą sieci polisacharydów, białek, metabolitów i wody, a jej grubość waha się od 0,1 do kilku µm w zależności od typu komórki i fazy wzrostu1,2. Właściwości mechaniczne ściany komórkowej odgrywają kluczową rolę we wzroście roślin. Niskie wartości sztywności ściany komórkowej są uznawane za warunek wstępny wzrostu komórek i rozszerzania się ściany komórkowej; coraz więcej dowodów wskazuje na to, że wszystkie komórki wyczuwają siły mechaniczne w celu pełnienia swoich funkcji. Nadal jednak dyskutuje się nad tym, czy zmiany właściwości fizycznych ściany komórkowej determinują los komórki2,3,4. Ponieważ komórki roślinne nie przemieszczają się podczas rozwoju, ostateczny kształt organu zależy od tego, jak bardzo i w jakim kierunku rozszerza się komórka. Z tego powodu korzeń Arabidopsis jest dobrym modelem do badania wpływu właściwości fizycznych ściany komórkowej na rozszerzanie się komórek, ponieważ w różnych regionach korzenia występują różne typy rozszerzania. Na przykład rozszerzanie anizotropowe jest widoczne w strefie elongacji, a w szczególności w komórkach epidermy5.
Opisana tutaj metoda została wykorzystana do charakterystyki właściwości fizycznych ścian komórkowych komórek epidermy żywych korzeni Arabidopsis w nanoskali, przy użyciu mikroskopu sił atomowych (AFM) sprzężonego z odwróconym mikroskopem fluorescencyjno-fazowym6. W celu uzyskania szczegółowego przeglądu techniki AFM należy zapoznać się z publikacjami7,8,9.
Niniejszy protokół opisuje podstawową metodę przygotowania próbek oraz ogólną metodę pomiarów elastyczności ścian komórkowych roślin z wykorzystaniem AFM.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd eksperymentu siła-wgłębienie w korzeniach Arabidopsis przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM). Schemat przedstawia etapy eksperymentu siła-wgłębienie, od przygotowania podłoża do trwałej immobilizacji próbki korzenia (1-2), potwierdzenia żywotności korzenia poprzez barwienie jodkiem propidynyum (3), pozycjonowania wspornika na powierzchni wydłużonej komórki epidermy korzenia głównego (4-5), pomiaru krzywych siły (6), oraz przetwarzania krzywych siły w celu obliczenia pozornego modułu Younga (7-8). EZ: strefa elongacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie materiału roślinnego i warunki wzrostu
- Aby uzyskać niezbędny materiał roślinny, wysterylizuj nasiona dzikiego typu Arabidopsis oraz wybranych linii mutantów.
UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano następujące linie: ttl1: linie z insercją T-DNA Salk_063943 (dla TTL1; AT1G53300) - typ dziki Columbia-0 (Col-0); mutant Procuste1 (prc1-1), który posiada mutację typu knock-out (Q720stop) w genie CESA6 (AT5G64740), zgodnie z wcześniejszym opisem w10,11; oraz podwójnego mutanta ttl1 x prc1-1 .- Umieść objętość około 50 μL nasion w mikroprobówce. Dodaj 500 μL roztworu 70% etanolu + 0,01% Tween w temperaturze pokojowej. Wymieszaj i inkubuj przez 7 min.
- Odlej roztwór etanolu i dodaj 500 μL 20% podchlorynu sodu. Wymieszaj i inkubuj przez 7 min.
- Odlej roztwór podchlorynu sodu i wypłucz nasiona trzy- cztery razy sterylną wodą.
- Wysiewanie
- Przygotuj wcześniej podstawową pożywkę Murashige i Skoog (MS)12 + 1,5% sacharozy + 1% agaru (pH 5,7) (patrz Tabela materiałów). Poddaj pożywkę autoklawowaniu. Przygotuj komorę z laminarnym przepływem powietrza, aby pracować w środowisku sterylnym, i opisz kwadratowe szalki Petriego niezbędne do eksperymentu. Wlej pożywkę do szalek Petriego i poczekaj, aż stężeje.
- Wysiej wysterylizowane nasiona na kwadratowe szalki Petriego z pożywką, używając sterylnych końcówek do pipet. Rozmieść nasiona równomiernie w dwóch rzędach. Po wyschnięciu nasion zamknij pokrywki i szczelnie zamknij szalki. Poddaj nasiona stratyfikacji w temperaturze 4 °C w ciemności przez 4 dni.
UWAGA: Stratyfikacja jest konieczna w celu synchronizacji kiełkowania. - Umieść szalki pionowo w komorze wzrostowej w reżimie długiego dnia (16 h światła/8 h ciemności) przy natężeniu światła 25 μmol m2 s−1 i temperaturze 23 °C (dzień/noc). Hoduj siewki przez 7 dni.
2. Traktowanie stresem osmotycznym (opcjonalnie)
UWAGA: Niniejsza sekcja zawiera szczegółowe informacje na temat wzrostu korzeni Arabidopsis w potencjale osmotycznym wynoszącym -1,2 MPa, oszacowanym za pomocą osmometru krioskopowego (Tabela materiałów). Tę część można pominąć lub zmienić w zależności od stawianego pytania badawczego.
- Przygotować podstawową pożywkę MS z dodatkiem 1,5% sacharozy, 400 mM mannitolu i 1% agaru (pH 5,7). Pożywkę poddać autoklawowaniu. Rozlać pożywkę do kwadratowych szalek Petriego w komorze z laminarnym przepływem powietrza i pozostawić do stężenia.
- Za pomocą pęsety (Tabela materiałów), umieść 5-dniowe siewki, uprzednio wyhodowane na pożywce bazowej MS z dodatkiem 1,5% sacharozy, w kwadratowych szalkach Petri zawierających pożywkę uzupełnioną o 400 mM mannitolu. Umieść szalki pionowo w komorze wzrostowej w tych samych warunkach, co w kroku 1.2.3. Hoduj siewki w tych warunkach stresu osmotycznego przez 7 dni.
UWAGA: Aby ocenić adaptację wzrostu korzenia głównego podczas silnego stresu osmotycznego, sugeruje się wykorzystanie siewek 5 dni po kiełkowaniu, hodowanych w kontrolowanych warunkach, aby upewnić się, że rozmiar merystemu korzenia został już ukształtowany13Alternatywnie analizę można przeprowadzić na każdym etapie rozwoju, aby określić wpływ stresu osmotycznego na proces rozwoju.
3. Eksperymenty nanoindentacji z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych (AFM)
- Przygotowanie próbki do eksperymentów z nanoindentacją
UWAGA: Jest to kluczowy etap stosowania AFM w badaniach żywych próbek biologicznych. Próbka musi być mocno przytwierdzona do podłoża, aby zachować stabilność mechaniczną podczas pomiarów wgniecenia. Jednocześnie należy zachować cechy strukturalne próbki. Skuteczną strategią stabilizacji dużej próbki do AFM jest zastosowanie środków klejących. Klej musi szybko schnąć oraz nie może być toksyczny ani reagować z otaczającym środowiskiem. W niniejszym protokole jako podłoża wykorzystano polistyrenowe szalki Petriego oraz niekwaśny klej silikonowy (Tabela materiałów) wykorzystano do unieruchomienia siewek Arabidopsis.- Nanieś cienką warstwę kleju silikonowego do szalki Petriego z szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw klej do wyschnięcia na powietrzu przez 45 s.
- Za pomocą pęsety należy umieścić siewkę na kleju, orientując ją w taki sposób, aby uniknąć kontaktu między wystającymi częściami siewki a belką wspornikową. Następnie należy delikatnie docisnąć korzeń do warstwy kleju silikonowego, aby go mocno związać. Siewkę należy pozostawić w kontakcie z klejem przez 45 s przed przejściem do kolejnych etapów protokołu.
- Inkubować przymocowane siewki z 2 μg/mL jodek propidyny (PI; Tabela materiałów) przez 5 min w ciemności, a następnie ostrożnie przemyć je trzykrotnie roztworem 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) (Tabela materiałów).
- Umieść siewki inkubowane z PI w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym sprzężonym z AFM. Aby zaobserwować fluorescencję, ustaw długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio na 572 nm i 617 nm. Brak fluorescencji wewnątrz komórek epidermy potwierdza żywotność korzeni.
- Przykryć siewkę 1x roztworem soli fosforanowo-buforowanej (PBS).
- Protokół wgłębienia
UWAGA: Wszystkie pomiary AFM należy przeprowadzić w ciągu 1 h po unieruchomieniu próbki na podłożu w temperaturze pokojowej. W pomieszczeniu, w którym znajduje się AFM, należy utrzymywać 25 °C przy użyciu klimatyzatora. Roztwór PBS powinien być w tej samej temperaturze.- Zamontuj standardowy wspornik z azotku krzemu z ostrzem w kształcie piramidy (patrz Tabela materiałów) do uchwytu sondy AFM do pracy w cieczy (Tabela materiałów).
- Ustaw wiązkę lasera na wsporniku w pobliżu pozycji końcówki. Następnie przesuń fotodiodę tak, aby plamka lasera znalazła się w centrum detektora.
- Aby skalibrować czułość ugięcia, należy umieścić pod AFM polistyrenową szalkę Petriego z 1x PBS.
UWAGA: Ten krok jest niezbędny do obliczenia wgłębienia. Podczas pomiaru siły na twardej powierzchni nie dochodzi do wgłębienia w głąb materiału, zatem każda zmiana przemieszczenia skanera osi z odpowiada ugięciu wspornika. Dlatego bardzo ważne jest skalibrowanie czułości ugięcia na twardej powierzchni. Użycie powierzchni miękkiej doprowadzi do przeszacowania czułości ugięcia, co w konsekwencji spowoduje uzyskanie zbyt niskich wartości stałych sprężystości. - Wyreguluj fotodetektor w taki sposób, aby odchylenie bezkontaktowe wynosiło około 0 V. Skalibruj czułość odchylenia, wykonując wcięcie (krzywa siły), przy rozmiarze rampy wynoszącym 3 μm, szybkość wciskania i wycofywania rylca wynosząca 0.6 μm/sor próg wyzwalania wynoszący 0,5 V.
- Aby skalibrować stałą sprężystości wspornika, należy użyć Dostrajanie termiczne użyteczność oprogramowania AFM (Tabela materiałów) zalecane dla sond o stałych sprężystości mniejszych niż około 5 N/m lub należy zastosować metodę opisaną w literaturze przedmiotu14Przed aktywacją Dostrajanie termiczne W oprogramowaniu należy upewnić się, że sonda nie wchodzi w interakcję z próbką.
- Wprowadź temperaturę wspornika. Kliknij w Kalibrować > Optymalizacja termiczna lub na Regulacja termiczna ikona w NanoScope pasek narzędzi. Wybierz zakres częstotliwości (1–100 Hz).
- Kliknij w Pozyskiwanie danych w Regulacja termiczna panel. Należy poczekać, aż AFM pobierze dane, a następnie kliknąć w Prosty oscylator harmoniczny (ciecz) przycisk
- Dostosować Szerokość filtra medianowego na 3Dostosuj Szerokość przedziału PSD aby zredukować szum w uzyskanych danych poprzez uśrednianie. Wyznacz granice dopasowania wokół pierwszego piku rezonansowego.
- Kliknij w Oblicz stałą sprężystości ka następnie kliknij Tak w oknie wyskakującym z pytaniem, czy użytkownik chce użyć tej wartości.
- Powtórz opisane powyżej kroki trzykrotnie i oblicz ręcznie średnią wartość stałej sprężystości. Wprowadź tę średnią wartość do Stała sprężystości pudełko w Rampa lista parametrów w PicoForce widok. W tym miejscu kalibracja dobiega końca.
- Używając odwróconego mikroskopu optycznego przy powiększeniu okularów 10x, 20x i 40x, ustaw sondę AFM na powierzchni czwartej wydłużonej komórki epidermy korzenia głównego, dbając o to, aby umieścić ją w centrum komórki.
- Wykorzystując obliczoną wartość stałej sprężystości (krok 3.2.5.5), należy uzyskać krzywe siły przy rozmiarze rampy wynoszącym 3 µm, próg wyzwalania wynoszący 11 nN oraz szybkość wciskania i wycofywania wynoszącą 0.6 μm/s w wybranych punktach.
UWAGA: Poprzednie prace15,16 stwierdzono, że niska częstotliwość wciskania i wycofywania pomaga zminimalizować histerezę oraz siłę oporu. - Należy uzyskać krzywe siły z trzech komórek na korzeń dla każdej serii badawczej (stosując trzy powtórzenia biologiczne na serię). Dla każdego korzenia należy zarejestrować co najmniej 150 krzywych siły.
4. Pomiar pozornego modułu Younga
- Dopasuj każdą krzywą siły do następnego modelu dla indentorów piramidalnych17:
, gdzie E to pozorny moduł Younga próbki, 
to moduł Poissona próbki, a α to kąt półwierzchołkowy. Odrzuć dopasowania o współczynniku korelacji (r2) < 0,99. Przyjmij współczynnik Poissona dla materiału całkowicie nieściśliwego: = 0,5 oraz geometrię indentora podaną przez producentów.
UWAGA: Do dopasowania wykorzystaj pierwsze 100 nm od punktu kontaktu krzywej obciążania, aby analiza była jak najczulsza na mechanikę ścian komórkowych i aby zredukować wpływ ciśnienia turgorowego na wartości pozornego modułu Younga8. Dopasowanie wykonano przy użyciu niestandardowego programu MATLAB (dostępnego na osobistą prośbę, wysyłając wiadomość do J. C. B), który umożliwia ustawienie konkretnej głębokości wciśnięcia od punktu kontaktu krzywej obciążania. - Stwórz znormalizowany histogram z danych pozornego modułu Younga i dopasuj do niego rozkład Gaussa. Odrzuć punkty danych znajdujące się poza 95-procentowym przedziałem ufności, a następnie ponownie oblicz histogram i dopasowanie Gaussa. Oblicz i podaj średnią oraz odchylenie standardowe pozornego modułu Younga.
- Określ istotność porównań między grupami za pomocą testów wielokrotnych porównań, takich jak ANOVA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Eksperymenty wskaźnika siła-wgniecenie
Poniższy tekst przedstawia wyniki oczekiwane podczas przeprowadzenia eksperymentu wskaźnika siła-wgniecenie, obrazując typowy rezultat uzyskiwany przy prawidłowej realizacji protokołu.
Krzywe siła-przemieszczenie
Na Rysunku 2 przedstawiono reprezentatywne wykresy wciskania siłowego, uzyskane poprzez wciskanie w żywe próbki w pozycji znajdującej się w centrum komórki strefy elongacji k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mechanika komórek i ścian komórkowych staje się coraz bardziej istotna dla uzyskania wglądu w to, jak mechanika wpływa na procesy wzrostu. Ponieważ siły fizyczne rozchodzą się na znaczne odległości w tkankach stałych, badanie zmian we właściwościach fizycznych ściany komórkowej oraz tego, jak są one wyczuwane, kontrolowane, dostrajane i wpływają na wzrost rośliny, staje się ważnym polem badań 2,3,8.
P...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Skrypt MATLAB używany do dopasowywania danych jest dostępny na osobiste żądanie po napisaniu do J. C. B.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez CSIC I+D 2018, grant nr 95 (Mariana Sotelo Silveira).; CSIC Grupos (Omar Borsani) oraz PEDECIBA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Zawiera chlorek sodu i bufor fosforanowy i jest opracowany w celu zapobiegania szokowi osmotycznemu i utrzymania równowagi wodnej w żywych komórkach. | ||
| Oprogramowanie AFM | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Mikroskopia sił atomowych (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Katalizator Uchwyt sondy | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | do katalizatora Bioscope, przeznaczony do pracy z płynem w trybie kontaktowym lub stukania. Kompatybilny również z zasilaniem pneumatycznym. |
| Osmometr krioskopowy; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Niemcy | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Oryginalne stężenie, (1962) |
| Optyczny mikroskop odwrócony sprzężony z AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentyna | 100429 | Neutralny, niekwaśny klej silikonowy |
| szalki Petriego | Deltalab | 200201.B | Polistyren, 55 x 14 mm, sterylny promieniowanie. |
| Jodek propidyny | Sigma | P4170 | Do testu żywotności korzeni. |
| Sonda z azotku krzemu, DNP-10, wspornikowa A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | Do mikroskopii modulacji siły w pracy z cieczą. Promień końcówki sondy 20-60 nm. 175-μ M-długi trójkątny wspornik, o stałej sprężystości 0,35 N/m. |
| Pęseta | Sigma | T4537 |
Bibliografia
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. Root development. The Arabidopsis Book. 1, 0101(2002).
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236(2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711(2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317(2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916(2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
