Method Article

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

DOI:

10.3791/63536

⸱

February 1st, 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&RUN.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie miejsc wiązania białka z chromatyną jest niezbędne do zrozumienia jego funkcji i potencjalnych celów regulacyjnych. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest złotym standardem w określaniu lokalizacji białek od ponad 30 lat i jest definiowana przez użycie przeciwciała do wyciągnięcia interesującego białka z sonikowanej lub trawionej enzymatycznie chromatyny. Ostatnio techniki wiązania przeciwciał stały się popularne do oceny lokalizacji białek na chromatynie ze względu na ich zwiększoną czułość. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) jest pochodną immunorozszczepienia chromatyny (ChIC) w całym genomie i wykorzystuje rekombinowane białko A połączone z nukleazą mikrokokową (pA-MNaza) w celu identyfikacji stałego regionu IgG przeciwciała skierowanego przeciwko białemu zainteresowaniu, umożliwiając w ten sposób specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA flankującego białko będące przedmiotem zainteresowania. CUT&RUN może być stosowany do profilowania modyfikacji histonów, czynników transkrypcyjnych i innych białek wiążących chromatynę, takich jak czynniki przebudowy nukleosomów. Co ważne, projekt CUT&RUN może być wykorzystywany do oceny lokalizacji białek związanych z euchromatycznością lub heterochromatycznością oraz modyfikacji histonów. Z tych powodów CUT&RUN jest skuteczną metodą określania profili wiązania szerokiej gamy białek. Ostatnio CUT&RUN został zoptymalizowany pod kątem profilowania czynników transkrypcyjnych w niskich populacjach komórek i pojedynczych komórkach, a zoptymalizowany protokół został nazwany ultra-niskim wkładem CUT&RUN (uliCUT&RUN). W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół profilowania czynnikowego jednokomórkowego za pomocą uliCUT&RUN w ręcznym formacie 96-dołkowym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele białek jądrowych funkcjonuje poprzez interakcję z chromatyną, aby promować lub zapobiegać aktywności szablonowej DNA. Aby określić funkcję tych białek oddziałujących z chromatyną, ważne jest zidentyfikowanie lokalizacji genomowych, w których te białka są związane. Od czasu swojego opracowania w 1985 roku, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest złotym standardem w określaniu, gdzie białko wiąże się z chromatyną1,2. Tradycyjna technika ChIP ma następujący podstawowy przebieg pracy: komórki są zbierane i sieciowane (zwykle formaldehydem), chromatyna jest ścinana (zwykle przy użyciu ostrych metod sonikacji, co wymaga sieciowania), białko będące przedmiotem zainteresowania jest immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciała, które celuje w białko (lub znakowane białko), a następnie przeciwciało drugorzędowe (sprzężone z agarozą lub kulkami magnetycznymi), sieciowanie jest odwrócone, białko i RNA są trawione w celu oczyszczenia DNA, a to wzbogacone DNA ChIP jest używane jako szablon do analizy (przy użyciu radioznakowanych sond1,2, qPCR3, microarrays5,6, lub sequencing4). Wraz z pojawieniem się mikromacierzy i masowo równoległego głębokiego sekwencjonowania, ChIP-chip5,6 i ChIP-seq4 zostały niedawno opracowane i pozwalają na identyfikację lokalizacji białek na chromatynie w całym genomie. Sieciowanie ChIP jest potężną i niezawodną techniką od czasu jego pojawienia się wraz ze znacznymi postępami w rozwiązywaniu problemów dzięki ChIP-exo7 i ChIP-nexus8. Równolegle z rozwojem ChIP-seq ustanowiono natywne (niesieciujące) protokoły dla ChIP (N-ChIP), które wykorzystują trawienie nukleazy (często przy użyciu nukleazy mikrokokowej lub MNazy) do fragmentacji chromatyny, w przeciwieństwie do sonikacji wykonywanej w tradycyjnych technikach sieciowania ChIP9. Jednak jedną z głównych wad zarówno technologii sieciowania ChIP, jak i N-ChIP było wymaganie dużej liczby komórek ze względu na niską wydajność DNA po eksperymentalnej manipulacji. Dlatego w ostatnich latach wiele wysiłków skierowano na optymalizację technologii ChIP pod kątem niskiego nakładu ogniw. Wysiłki te zaowocowały opracowaniem wielu potężnych technologii opartych na ChIP, które różnią się pod względem możliwości zastosowania i wymagań wejściowych10,11,12,13,14,15,16,17,18. Brakowało jednak technologii opartych na jednokomórkowym sekwencjonowaniu ChIP, zwłaszcza w przypadku białek niehistonowych.

W 2004 roku opracowano alternatywną technologię określania obecności białek na chromatynie, zwaną Endogennym Rozszczepieniem Chromatyny (ChEC) i Immunorozszczepieniem Chromatyny (ChIC)19. Te techniki pojedynczego locus wykorzystują fuzję MNazy z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (ChEC) lub z białkiem A (ChIC) w celu bezpośredniego cięcia DNA sąsiadującego z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W ostatnich latach zarówno ChEC, jak i ChIC zostały zoptymalizowane pod kątem profilowania białek w całym genomie na chromatynie (odpowiednio ChEC-seq i CUT&RUN)20,21. Podczas gdy ChEC-seq jest potężną techniką określania lokalizacji czynnika, wymaga opracowania białek fuzyjnych MNazy dla każdego celu, podczas gdy ChIC i jego odmiana obejmująca cały genom, CUT&RUN, opierają się na przeciwciałie skierowanym w kierunku białka będącego przedmiotem zainteresowania (jak w przypadku ChIP) i rekombinowanej białku A-MNazy, w którym białko A może rozpoznać stały region IgG przeciwciała. Jako alternatywę opracowano białko fuzyjne A / białko G-MNaza (pA / G-MNaza), które może rozpoznawać szerszy zakres regionów stałych przeciwciał 22. CUT&RUN szybko stał się popularną alternatywą dla ChIP-seq do określania lokalizacji białek w całym genomie chromatyny.

Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), odmiana CUT&RUN, która umożliwia korzystanie z niskich i jednokomórkowych wejść, została opisana w 201923. W tym miejscu opisano metodologię ręcznego stosowania pojedynczej komórki w formacie 96-dołkowym. Należy zauważyć, że od czasu opracowania uliCUT&RUN opracowano dwie alternatywy dla profilowania histonów, CUT&Tag i iACT-seq, zapewniające solidne i wysoce równoległe profilowanie białek histonowych24,25. Ponadto scCUT&Tag został zoptymalizowany pod kątem profilowania wielu czynników w jednej komórce (multiCUT&Tag) oraz do stosowania do białek niehistonowych26. Podsumowując, CUT&RUN stanowi atrakcyjną alternatywę dla niskonakładowego sekwencjonowania ChIP, gdzie uliCUT&RUN może być wykonywany w dowolnym laboratorium biologii molekularnej, które ma dostęp do sortownika komórek i standardowego wyposażenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Biuro Bezpieczeństwa Biologicznego ds. Ochrony Badań na Uniwersytecie w Pittsburghu.

1. Przygotuj koraliki magnetyczne

UWAGA: Wykonaj przed sortowaniem komórek i przytrzymaj na lodzie aż do użycia.

  1. Odpipetować 30 μl zawiesiny kulek paramagnetycznych sprzężonych z ConA, wymieszać na reakcję ze świeżą probówką do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i dodać 850 μl buforu wiążącego, delikatnie pipetując, aby wymieszać.
    UWAGA: Mikrosfery paramagnetyczne sprzężone z ConA to pokryte lektyną kulki magnetyczne, które umożliwiają wiązanie błony lipidowej.
  2. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom namagnesować się przez 1-2 minuty. Po usunięciu supernatantu należy go usunąć i wyrzucić, nie naruszając kulek.
  3. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i umyj koraliki, ponownie zawieszając je w 1 ml buforu wiążącego.
  4. Powtórz kroki 1.2 i 1.3.
  5. Namagnesuj koraliki przez 2 minuty i usuń supernatant do wyrzucenia.
  6. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 30 μl buforu wiążącego na reakcję.
  7. Trzymaj umytą mieszankę kulek na lodzie, aż komórki zostaną posortowane.

2. Zbieraj komórki

UWAGA: Ten krok jest napisany dla komórek przylegających i zoptymalizowany dla mysich embrionalnych komórek macierzystych E14. Hodowla i pobieranie komórek zależy od typu komórki.

  1. Wyjąć komórki z inkubatora o temperaturze 37 °C i zbadać je pod mikroskopem w celu zapewnienia jakości.
  2. Odessać pożywkę z płytki komory i przepłukać 5 ml 1x PBS.
  3. Odessać PBS z płytki i pobrać komórki (przy użyciu tradycyjnych metod pobierania komórek, które różnią się w zależności od typu komórki). Zawiesinę jednokomórkową uzyskać poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół pipetą serologiczną do szalki hodowlanej, jeśli to konieczne.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować w tempie 200 x g przez 5 minut.
  5. Odessać pożywkę, aby wyrzucić i przepłukać osad komórkowy 5 ml PBS + 1% FBS.
  6. Odwirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml PBS + 1% FBS.
  7. Policz komórki i przenieś 1 ml 1 x 106 komórek do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
  8. Dodać 5 μl 7-amino-aktynomycyny D (7-AAD), odwrócić probówkę do wymieszania, a następnie umieścić próbkę w sortowniku komórek, aby posortować żywe pojedyncze komórki do pojedynczych dołków na 96-dołkowej płytce.
    UWAGA: Barwnik 7-AAD jest wykluczony z żywych komórek i dlatego może być stosowany w sortowaniu żywych komórek.

3. Sortowanie i liza komórek

  1. Przed sortowaniem komórek należy przygotować 96-dołkową płytkę kompatybilną z sortownikiem komórek ze 100 μl buforu do ekstrakcji jądrowej (NE) w każdym dołku.
  2. Posortuj komórki na płytki 96-dołkowe zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Szybko obróć płytkę (600 x g przez 30 s), aby upewnić się, że komórki znajdują się w buforze w studzienkach.
    UWAGA: Warto przetestować we wstępnym doświadczeniu, czy używane ogniwa są niezawodnie sprowadzane na dno studni.
  4. Próbki należy trzymać na lodzie przez 15 minut.
  5. Odwirowywać próbki o masie 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie pipetować w celu usunięcia supernatantu (pozostawiając 5 μl).
  6. Zawiesić każdą próbkę w 55 μl buforu NE i dodać 30 μl wstępnie przemytych mikrosfer paramagnetycznych sprzężonych z ConA (od kroku 1.7; w buforze wiążącym) do każdej reakcji.
  7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

4. Wstępnie zablokuj próbki, aby zapobiec wczesnemu trawieniu przez MNazę

  1. Umieść płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, pozwól kulkom związać się przez co najmniej 5 minut, a następnie wyjmij i wyrzuć supernatant.
  2. Dodać 100 μl buforu blokującego do kulek związanych z jądrem i wymieszać delikatnie pipetując.
  3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

5. Dodanie przeciwciała pierwszorzędowego

  1. Umieścić płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, pozostawić supernatant do usunięcia przez co najmniej 5 minut, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.
  2. Wyjąć płytkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić kulki w 100 μl buforu do przemywania na reakcję, delikatnie pipetując.
  3. Umieść płytkę z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, poczekaj, aż supernatant się oczyści, a następnie wyjmij i wyrzuć supernatant.
  4. Zawiesić kulki w 25 μl buforu do przemywania na reakcję, delikatnie pipetując.
  5. Przygotować główną mieszankę przeciwciał pierwszorzędowych: 25 μl buforu płuczącego + 0,5 μl przeciwciała na reakcję.
  6. Delikatnie wirując kulki związane z jądrami, dodać 25 μl głównej mieszanki przeciwciał do każdej próbki poddanej działaniu przeciwciała skierowanego do białka będącego przedmiotem zainteresowania (zwykle końcowe rozcieńczenie 1:100). Dodać 25 μl buforu do przemywania bez przeciwciał, jeśli wykonujesz kontrolę.
  7. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Umieścić próbki na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, pozostawić supernatant do oczyszczenia przez co najmniej 5 minut, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.
  9. Wyjmij płytkę ze stojaka magnetycznego i umyj kulki 100 μl buforu do mycia, a następnie ponownie zawiesić przez pipetowanie.

6. Dodanie pA-MNazy lub pA/G-MNazy

UWAGA: Białko A ma wysokie powinowactwo do cząsteczek IgG niektórych gatunków, takich jak króliki, ale nie jest odpowiednie dla IgG innych gatunków, takich jak myszy czy szczury. Alternatywnie można zastosować białko A/G-MNazę. Ta hybryda wiąże IgG królików, myszy i szczurów, unikając potrzeby stosowania przeciwciał drugorzędowych, gdy stosowane są przeciwciała pierwszorzędowe myszy lub szczura.

  1. Umieścić płytkę z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, pozostawić supernatant do usunięcia przez co najmniej 5 minut, a następnie wyjąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.
  2. Zdjąć płytkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić każdą próbkę w 25 μl buforu do mycia.
  3. Przygotować główną mieszaninę pA-MNazy (25 μl buforu płuczącego + zoptymalizowana ilość pA-MNazy na reakcję).
  4. Podczas delikatnego wirowania dodać 25 μl głównej mieszanki pA-MNazy do każdej próbki, w tym do próbek kontrolnych.
    UWAGA: Stężenie pA-MNazy różni się w zależności od przygotowania, jeśli jest domowej roboty, i powinno być testowane przed użyciem przy każdym niezależnym oczyszczaniu. W przypadku pA/G-MNazy należy użyć 2,5 μl 20-krotnego zapasu.
  5. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umieścić płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, pozostawić supernatant do usunięcia przez co najmniej 5 minut, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.
  7. Wyjmij płytkę ze stojaka magnetycznego i umyj kulki 100 μl buforu do mycia, a następnie ponownie zawiesić przez delikatne pipetowanie.

7. Ukierunkowane trawienie DNA

  1. Umieścić płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, pozostawić supernatant do usunięcia przez co najmniej 5 minut, a następnie wyjąć i wyrzucić supernatant.
  2. Wyjmij próbki ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 50 μl buforu do płukania, delikatnie pipetując.
  3. Równoważyć próbki do temperatury 0 °C w mieszaninie lodu i wody przez 5 minut.
  4. Wyjąć próbki z łaźni lodowo-wodnej o temperaturze 0 °C i dodać 1 μl 100 mM CaCl2 za pomocą pipety wielokanałowej. Dobrze wymieszać (3-5 razy) z delikatnym pipetowaniem za pomocą pipety wielokanałowej o większej objętości, a następnie przywrócić próbki do temperatury 0 °C.
    UWAGA: Dobre wymieszanie jest tutaj niezbędne. CaCl2 jest dodawany w celu aktywacji trawienia MNazy DNA otaczającego białko będące przedmiotem zainteresowania.
  5. Uruchom 10-minutowy timer, gdy tylko talerz znajdzie się z powrotem w łaźni lodowo-wodnej.
  6. Zatrzymać reakcję, pipetując 50 μl buforu 2XRSTOP+ do każdej studzienki, w tej samej kolejności, w jakiej dodano CaCl2.
    UWAGA: Przygotuj bufor 2XRSTOP+ przed zakończeniem 10-minutowego trawienia, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu.

8. Frakcjonowanie próbki

  1. Inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Obracać płytkę w temperaturze 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Umieścić płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, pozostawić supernatant do oczyszczenia przez co najmniej 5 minut i przenieść supernatanty na nową 96-dołkową płytkę. Wyrzuć koraliki.

9. Ekstrakcja DNA

  1. Dodać 1 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 0,83 μl 20 mg/ml proteinazy K do każdej próbki.
    UWAGA: Proszek SDS jest szkodliwy w przypadku wdychania. Użytkownicy powinni używać w dobrze wentylowanych pomieszczeniach, nosząc okulary, rękawice i respirator klasy N95, obchodząc się z nimi ostrożnie.
  2. Wymieszać próbki przez delikatne pipetowanie.
  3. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze 70 °C.
  4. Przywróć płytkę do temperatury pokojowej i dodaj 46,6 μl 5 M NaCl i 90 μl 50% PEG 4000. Wymieszać delikatnie pipetując.
  5. Do każdej próbki dodać 33 μl kulek polistyrenowo-magnetytowych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Pamiętaj, aby doprowadzić kulki styropianowo-magnetytowe do temperatury pokojowej (~30 min) i dobrze wymieszać przed użyciem.
  6. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym i pozwól supernatantowi oczyścić się przez ~5 minut, a następnie ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając kulek.
  7. Spłukać 2x 150 μl 80% etanolu bez naruszania kulek.
    UWAGA: Etanol jest wysoce łatwopalny i powoduje podrażnienie skóry, oczu i płuc. Wykonaj ten krok w odpowiedniej odzieży laboratoryjnej i w wentylowanym kapturze.
  8. Obracaj płytkę krótko przy 1000 x g przez 30 s. Umieść płytkę z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i usuń wszystkie resztki EtOH bez naruszania kulek.
  9. Suszyć próbki na powietrzu przez ~2-5 min.
    UWAGA: Nie susz koralików dłużej niż 5 minut. Jeśli sumiennie usuniesz EtOH, wystarczy 2-3 minuty suszenia.
  10. Ponownie zawiesić kulki w 37,5 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Umieść talerz na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom związać się przez 5 minut.
  12. Przenieść 36,5 μl supernatantu na świeżą płytkę 96-dołkową kompatybilną z termocyklerem. Wyrzuć koraliki.
    UWAGA: Eksperyment można zatrzymać w tym miejscu, przechowując próbki w temperaturze -20 °C lub kontynuować budowanie biblioteki (kroki 10-15).

10. Naprawa końcowa, fosforylacja, adenylacja

UWAGA: Odczynniki pochodzą z Tabeli Materiałów. Poniższy protokół jest zgodny z podobną metodą do zestawu komercyjnego, takiego jak zestaw NEBNext Ultra DNA II.

  1. Rozcieńczyć 5 U / μL polimerazy DNA T4 w stosunku 1:20 w 1x buforze ligazy DNA T4.
  2. Przygotować naprawę końcową/3'A master mix: 2 μL 10x bufor ligazy DNA T4, 2,5 μL 10 mM dNTPs, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL 40% PEG 4000, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL rozcieńczonej polimerazy T4 DNA, 0,5 μL 5U/μL polimerazy DNA Taq, o całkowitej objętości 13,5 μL na reakcję.
    UWAGA: Przed pipetowaniem należy doprowadzić 40% PEG 4000 do temperatury pokojowej.
  3. Dodać 13,5 μl mieszanki końcowej do naprawy końcówki/3'A master do 36,5 μl DNA.
  4. Wymieszaj reakcję przez szybki wir, a następnie szybkie wirowanie (500 x g przez 10 s).
  5. Inkubować w następujących warunkach reakcji we wstępnie schłodzonym termocyklerze z podgrzewaną pokrywą w temperaturze >20 °C. Stosować warunki reakcji: 12 °C przez 15 min, 37 °C przez 15 min, 72 °C przez 20 min, utrzymywać w temperaturze 4 °C.

11. Podwiązanie adaptera

UWAGA: Trzymaj próbki na lodzie podczas ustawiania następującej reakcji. Przed pipetowaniem należy odczekać, aż bufor ligazy osiągnie temperaturę pokojową. Rozcieńczyć adapter (patrz tabela materiałów) w roztworze 10 mM Tris-HCl zawierającym 10 mM NaCl (pH 7,5). Ze względu na niską wydajność nie należy wstępnie oznaczać ilościowo DNA wzbogaconego w CUT&RUN. Zamiast tego należy wygenerować 25-krotne rozcieńczenia adaptera, używając końcowego stężenia roboczego adaptera 0,6 μM.

  1. Przygotować główną mieszankę ligacji: 55 μl buforu ligazy (2x), 5 μl ligazy DNA T4 i 5 μl rozcieńczonego adaptora, o całkowitej objętości 65 μl na reakcję.
  2. Dodać 65 μl głównej mieszanki ligacyjnej do 50 μl DNA z kroku 10.5.
  3. Mieszaj przez szybkie wirowanie, a następnie szybkie wirowanie (500 x g przez 10 s).
  4. Inkubować w temperaturze 20 °C w termocyklerze (bez podgrzewanej pokrywy) przez 15 min.
    UWAGA: Przejdź natychmiast do następnego kroku.

12. Trawienie UŻYTKOWNIKA

  1. Dodać 3 μl enzymu USER do każdej próbki, wirować i wirować (500 x g przez 10 s).
  2. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 15 minut (podgrzewana pokrywa ustawiona na 50 °C).

13. Czyszczenie kulek polistyrenowo-magnetytowych po reakcji podwiązania

UWAGA: Pozwól kulkom styropianowo-magnetytowym zrównoważyć się w temperaturze pokojowej (~30 min). Wirować, aby homogenizować roztwór kulki przed użyciem. Wykonaj następujące czynności w temperaturze pokojowej.

  1. Dodaj 39 μl (0,33x) roztworu kulek polistyrenowo-magnetytowych do każdej studzienki zawierającej DNA ligowane adaptorowo.
  2. Dokładnie wymieszać przez pipetowanie, a następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić wiązanie DNA z kulkami.
  3. Umieścić próbki na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i inkubować przez 5 minut, aż supernatant będzie klarowny.
  4. Trzymaj płytkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij i wyrzuć supernatant, nie naruszając kulek.
  5. Przepłucz kulki 200 μl 80% EtOH, nie naruszając kulek.
  6. Inkubować przez 30 s na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, aby roztwór się oczyścił.
  7. Usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.
  8. Powtórz kroki 13.5-13.7, aby uzyskać łącznie dwa prania.
  9. Obracaj płytkę krótko przy 500 x g przez 10 s, umieść płytkę z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i usuń resztki EtOH bez naruszania kulek.
  10. Trzymaj płytkę na stojaku magnetycznym i susz próbki na powietrzu przez 2 min.
    UWAGA: Nie susz koralików zbyt mocno.
  11. Wyjmij płytkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 28,5 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    UWAGA: Kwas solny jest bardzo. Użytkownicy powinni obchodzić się z nim ostrożnie w osłonie przeciwchemicznej, nosząc okulary, rękawice i fartuch laboratoryjny.
  12. Dokładnie zawiesić kulki przez pipetowanie, uważając, aby nie powstały pęcherzyki.
  13. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  14. Umieść płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i pozwól roztworowi oczyścić się przez 5 minut.
  15. Przenieść 27,5 μl supernatantu na nową płytkę PCR i wyrzucić kulki.

14. Wzbogacanie biblioteki

UWAGA: Podkłady są rozcieńczane tym samym roztworem co adapter. W przypadku tej kompilacji biblioteki należy użyć końcowego stężenia startera roboczego wynoszącego 0,6 μM.

  1. Do każdej próbki dodać 5 μl rozcieńczonego indeksowanego startera (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Każda próbka wymaga innego indeksu, aby można ją było zidentyfikować po sekwencjonowaniu.
  2. Przygotuj główną mieszankę PCR: 10 μl 5x buforu PCR o wysokiej wierności, 1,5 μl 10 mM dNTP, 5 μl rozcieńczonego startera uniwersalnego, 1 μl polimerazy 1 U hot start o wysokiej wierności, o całkowitej objętości mieszanki głównej 17,5 μl na próbkę.
  3. Dodać 17,5 μl mieszanki PCR do 32,5 μl oczyszczonego DNA ligowanego adaptorowo (w tej objętości znajduje się 5 μl indeksowanego startera).
  4. Wymieszać roztwór, pipetując.
  5. Inkubować w termocyklerze, stosując następujące warunki reakcji z maksymalną szybkością narastania 3 °C/s: 98 °C przez 45 s, 98 °C przez 45 s, 60 °C przez 10 s, powtórzyć drugi i trzeci etap 21 razy, 72 °C przez 1 minutę, utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.

15. Czyszczenie kulek styropianowo-magnetytowych

  1. Dodać 60 μl (1,2x) kulek polistyrenowo-magnetytowych do każdej próbki.
  2. Zawiesić kulki przez pipetowanie i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż roztwór będzie klarowny.
  4. Wyrzucić supernatant i przepłukać kulki 200 μl 80% EtOH, nie naruszając przy tym kulek.
  5. Powtórz etap prania, aby uzyskać łącznie dwa prania 80% EtOH.
  6. Obracaj płytkę o wymiarach 500 x g przez 10 s, umieść płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i pozwól kulkom związać się przez 5 minut.
  7. Odpipetować w celu usunięcia nadmiaru EtOH bez naruszania kulek i pozostawić kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 2 min.
    UWAGA: Nie susz koralików zbyt mocno.
  8. Zawiesić kulki w 21 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym i pozwól roztworowi oczyścić się przez 5 minut.
  10. Przenieść 20 μl supernatantu na nową płytkę.
    UWAGA: W tym miejscu eksperyment można przerwać, przechowując próbkę w temperaturze -20 °C.
  11. Określić ilościowo stężenia biblioteczne za pomocą fluorometru (patrz Tabela materiałów), używając 1x odczynnika HS.
  12. Jeśli stężenie na to pozwala, uruchom 30 ng próbki na 1,5% żelu agarozowym z drabinką o niskiej masie cząsteczkowej w celu wizualizacji. Alternatywnie, wizualizuj na analizatorze fragmentów lub powiązanym instrumencie.
  13. Biblioteki sekwencji na platformie Illumina, aby uzyskać ~50 000-100 000 unikalnie zmapowanych odczytów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół profilowania białek jednokomórkowych na chromatynie przy użyciu 96-dołkowego formatu manualnego uliCUT&RUN. Chociaż wyniki będą się różnić w zależności od profilowanego białka (ze względu na obfitość białka i jakość przeciwciał), typu komórki i innych czynników przyczyniających się do tej techniki, przewidywane wyniki dla tej techniki omówiono tutaj. Jakość komórek (wygląd komórek i procent komórek zdolnych do życia) oraz sortowanie pojedynczych komórek powinny być oceniane pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN to skuteczny protokół do określania lokalizacji białek na chromatynie. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi protokołami, w tym: 1) wysoki stosunek sygnału do szumu, 2) szybki protokół i 3) wymagane niskie pokrycie odczytu sekwencjonowania, co prowadzi do oszczędności kosztów. Zastosowanie białka A lub białka A/G-MNazy umożliwia stosowanie CUT&RUN z dowolnym dostępnym przeciwciałem; W związku z tym ma potencjał do szybkiego i łatwego profilowania wielu białek. Jednak adaptacja do pojedynczej komórki w celu dowolne...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów związanych z tym projektem.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom Hainer Lab za przeczytanie i komentarze do wcześniejszej wersji tego manuskryptu. W ramach tego projektu wykorzystano NextSeq500 dostępny w Rdzeniu Sekwencjonowania Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Pittsburghu w Szpitalu Dziecięcym UPMC w Pittsburghu do sekwencjonowania, ze specjalnymi podziękowaniami dla jego dyrektora, Williama MacDonalda. Badania te były częściowo wspierane przez University of Pittsburgh Center for Research Computing poprzez udostępnione zasoby komputerowe. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (dla S.J.H.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przezroczyste probówki do mikrofug o pojemności 1,5 mlThermoFisher Scientific90410
Stojak magnetyczny w probówce 1,5 mlThermoFisher Scientific12321D
1,5 ml kompatybilna z probówką Zimna wirówkaEppendorf5404000537
10 cm sterylne płytki do hodowli tkankowychThermoFisher Scientific150464
10X T4 Lufor ligazy DNANowość Anglia BiolabsB0202S
15 ml probówki stożkoweVWR89039-656
1X TE buforThermoFisher Scientific12090015
200 µ L Probówki do PCREppendorf951010022
2X szybki bufor ligazyNew England BiolabsM2200Bufor ligazy
5X KAPA Bufor HiFiRoche7958889001 5X wysokiej jakości bufor PCR
7-amino-aktynomycyna D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
96-dołkowy stojak magnetycznyThermoFisher Scientific12027 lub 12331D
Płytka 96-dołkowaVWR82006-636
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterA63881kulki polistyrenowo-magnetytowe; Ze względu na potencjalną zmienność między partiami ściegu AMPure XP zaleca się kalibrację roztworu AMPure Bead. Zobacz dane producenta s instrukcje
Przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowaniaróżnią się
ATPThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus Koraliki Concanavalin APolysciences86057-10Mikrosfery paramagnetyczne sprzężone z ConA
BSA
Chlorek wapnia (CaCl2)Fisher ScientificAAJ62905AP
Sortownik komórek Sortownikkomórek BD FACSAria IIWymaga szkolenia
Pożywki specyficzne dla komórek do hodowli komórkowychRóżni się
ChloroformThermoFisher ScientificC298-500Chloroform działa drażniąco na skórę i działa szkodliwie w przypadku połknięcia; Obsługa w oparach chemicznych za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów
Komputer z procesorem 64-bitowym i dostępem do klastraDo analiz obliczeniowych wynikowych zestawów danych sekwencjonowania
Kolumny wirowe DNAEpoka Nauki przyrodnicze1920-250
zestaw dNTPNew England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
Sprzęt do elektroforezyróżni się
EtanolFisher Scientific22032601100% obj. / obj. etanol jest wysoce łatwopalny; obchodzić się z dygestoriami chemicznymi za pomocą rękawiczek, fartuch laboratoryjny, i gogle
Kwas etylenodiaminotetraoctowy  Panie przewodniczący, panie i panowie!Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
GlicerolFisher ScientificBP229-1
GlikogenVWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
Heterologiczny S. cerevisiae DNA kolcerobotyPrzygotowany z usieciowanego, trawionego przez MNazę i wyekstrahowanego żelu agarozowego genomowego DNA oczyszczonego z białka/RNA i rozcieńczonego do 10 ng/ml. Zalecamy genomowe DNA drożdży, ale w razie potrzeby można użyć innych organizmów.
Kwas solny  (HCl)KwasScientific A144-212jest bardzo; obchodź się z nim w kapturze oparów chemicznych za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i gogli
Wiadro na lódróżni
Platforma sekwencjonowania Illumina (np. NextSeq500)Inkubator Illumina
z kontrolą temperatury i atmosferyThermoFisher Scientific51030284
Polimeraza DNA KAPA HotStart HiFi z 5X buforem KAPA HiFiRoche7958889001hotstart polimeraza o wysokiej wierności
Okap z przepływem laminarnymFirma piekarniczaSG404
Chlorek manganu (MnCl2)Sigma Aldrich244589
Rainin Benchmark MinifugeScientificC1012
Adapter NEB NewEngland BiolabsE6612AVIALAdapter
NEB Uniwersalny podkładNew England BiolabsE6611AVIALUniwersalny podkład
NEBNext Multiplex Oligos do zestawu IlluminaNew England BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/LIndeksowane startery
Przeciwciała przeciwko kontroli ujemnejPrzeciwciała-OnlineABIN101961
Woda wolna od nukleazNew England BiolabsB1500S
Termocykler PCREppendorf2231000666
Rurki blokujące fazęQiagen129046
Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (PCI)ThermoFisher Scientific15593049Fenol jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub kontaktu ze skórą; obsługiwać w osłonie oparów chemicznych za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych
Sól fizjologiczna buforowana przez fosfatum (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
PipetaDrummond Scientific# 4-000-100
Glikol polietylenowy (PEG) 4000VWRA16151
Chlorek potasu (KCl)Sigma AldrichP3911
Wodorotlenek potasu (KOH)Fisher ScientificP250-1UWAGA KOH działa drażniąco na oczy/skórę w postaci stałej i w roztworze. Trzymaj się w chemicznym kapturze oparowym w rękawicach, fartuchu laboratoryjnym i okularach
Inhibitory proteazyThermoFisher Scientific78430
Białko A/G-MNazaEpicypher15-1016pA/G-MNaza
BiałkoA-MNaza, oczyszczone z pK19pA-MNAddgene86973
Proteinaza KNew England BiolabsP8107S
Qubit 1X dsDNA HS Zestaw testowyThermoFisher ScientificQ33230
Probówki do oznaczania kubitówThermoFisher ScientificQ32856
Fluorometr kubitowyThermoFisher ScientificQ33238
Szybka ligaza z 2X szybkim buforem ligazyNew England BiolabsM2200S
RNase ANew England BiolabsT3010
Octan sodu  (NaOAc)ThermoFisher ScientificBP333-500
Chlorek sodu (NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
Dodecylosiarczan sodu (SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS jest trujący w przypadku wdychania; należy obchodzić się z nim ostrożnie w dobrze wentylowanych pomieszczeniach, używając rękawic, ochrony oczu i respiratora klasy N95 podczas obchodzenia się z
wodorotlenkiem sodu (NaOH)Fisher ScientificS318-1NaOH działa drażniąco na oczy / skórę w postaci stałej i w roztworze. Obsługa w osłonie oparów chemicznych za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów
SpermidineSigma AldrichS2626
Standardowy mikroskop ze światłem odwróconymLeica11526213
Standardowe materiały laboratoryjne żelu agarozowegoRóżni się
Standardowe materiały laboratoryjne, takie jak pipety serologiczne i końcówki do pipetRóżni
Ligaza DNA T4Nowość Anglia BiolabsM0202S
T4 Polimeraza DNANowa Anglia BiolabsM0203S
T4 PNKNowa Anglia BiolabsM0201S
Wirownik stołowyFisher Scientific2215414
Taq Polimeraza DNANew England BiolabsM0273S
ThermomixerEppendorf5384000020Alternatywnie, można korzystać z kąpieli wodnej
Baza TrisFisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 jest niebezpieczny; używaj fartucha laboratoryjnego, rękawic i okularów do pracy z
trypsynąFisher ScientificMT25052
Rotator rurkowyVWR10136084
USER enzymNew England BiolabsM5505S
superkomputerowego domowej solny Fisher się Zestaw mikropipet Zestaw 30386597 się

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  2. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  3. Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
  4. Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
  5. Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
  6. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  7. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  8. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
  9. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  10. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  11. Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
  12. Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
  13. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  14. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  15. Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
  16. Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232(2013).
  17. Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083(2015).
  18. Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033(2015).
  19. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  20. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733(2015).
  21. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856(2017).
  22. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314(2019).
  23. Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
  24. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  25. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  26. Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
  27. Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
  28. Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
  29. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  30. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell CUT RUNChromatin Protein LocalizationUltra Low InputTranscription Factor ProfilingChromatin ImmunoprecipitationAntibody TetheringProtein A MNase96 Well FormatDNA ExtractionEmbryonic Stem Cells

Related Articles