Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63541

⸱

14 czerwca 2022

1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Streszczenie

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) jest używany do pomiaru wiązania hemaglutyniny (HA) z dimerem cyjanowiryny-N (CV-N) z podmienioną domeną oraz do monitorowania interakcji między mannozylowanymi peptydami a miejscem wiązania CV-N o wysokim powinowactwie. Doniesiono, że kolce otoczki wirusa gp120, HA i glikoproteina Ebola (GP) 1,2 wiążą zarówno wysokie, jak i niskie powinowactwo na dimerycznym CVN2. Dimannozylowany peptyd HA jest również związany w dwóch miejscach wiązania o niskim powinowactwie do zmodyfikowanej cząsteczki CVN2, która ma miejsce o wysokim powinowactwie do odpowiedniego ligandu i jest zmutowany w celu zastąpienia stabilizującego wiązania dwusiarczkowego w kieszeni wiążącej węglowodany, potwierdzając w ten sposób wiązanie wielowartościowe. Wykazano wiązanie HA z jednym miejscem wiązania pseudoprzeciwciała CVN2 o wysokim powinowactwie przy stałej dysocjacji (KD) wynoszącej 275 nM, która dodatkowo neutralizuje ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) poprzez oligomeryzację. Korelacja liczby mostków dwusiarczkowych w CVN2 z zamianą domeny, które są zmniejszone z 4 do 2 przez podstawienie cystyn do par reszt polarnych kwasu glutaminowego i argininy, powoduje zmniejszenie powinowactwa wiązania do HA. Wśród najsilniejszych oddziaływań, Ebola GP1,2 jest wiązana przez CVN2 z dwoma miejscami wiązania o wysokim powinowactwie w dolnym zakresie nanomolowym przy użyciu glikanu otoczkowego bez domeny transbłonowej. W niniejszym badaniu wiązanie wielospecyficznego monomerycznego CV-N z glikoproteiną kolca (S) koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) mierzy się przyK D = 18,6 μM w porównaniu z nanomolowymK D do tych innych kolców wirusa oraz poprzez domenę wiążącą receptor w średnim zakresie μ-molowym.

Wprowadzenie

Aktywność przeciwwirusowa związana z tetheriną jest indukowana przez interferon-α i obejmuje białkowe wiązania, co prowadzi do zatrzymania w pełni sformowanych wirionów na powierzchniach zakażonych komórek1. Konieczność glikozylacji tetheriny w hamowaniu uwalniania wirusa pozostaje niepewna, co sugeruje znaczenie wzorców glikozylacji glikanów wyrażanych rekombinacyjnie w badaniach in vitro1,2, co zależy od konformacji (w przypadku wirusa grypy) powierzchniowej hemaglutyniny HA wirusa grypy3,4. Zauważono, że modyfikacja oligosacharydu związanego z glikozylacją typu N jest wystarczająca dla tetherina-zależnego ograniczenia uwalniania HIV typu 12, podczas gdy dimeryzacja odgrywa kluczową rolę w zapobieganiu uwalnianiu wirusa, angażując tym samym domenę transbłonową lub kotwicę glikozylopartydyloinozytową (GPI) w celu uwięzienia pączkujących wirionów5. Opisano unikalne cechy ludzkiej i mysiej tetheriny w blokowaniu wielu wirusów otoczkowych, retrowirusów i filowirusów. BST-2/tetherina jest indukowanym przez interferon białkiem przeciwwirusowym odporności wrodzonej1,6, wykazującym szerokie spektrum aktywności przeciwwirusowej, która jest antagonizowana przez glikoproteiny otoczki5 poprzez translokację tetheriny lub zaburzenie jej struktury6. Na przykład powierzchniowa glikoproteina otoczki HA i neuraminidaza wirusa grypy typu A są znane z antagonizowania tetheriny w sposób specyficzny dla szczepu7, co ułatwia rozpoznawanie miejsc wiązania receptorów gospodarza8. Przeciwciała celujące w glikany są badane pod kątem stechiometrii ich oddziaływań z szybko modyfikującymi się osłonami glikanowymi na HA, co przekłada się na powinowactwo wiązania do podtypów H3N2 i H1N1 wirusa grypy A4.

W celu wyjaśnienia mechanizmów wiązania między środkami przeciwwirusowymi a kolcami otoczki wirusa, tj. ligandami węglowodanowymi, przy użyciu komplementarnych metod immunologicznych i spektroskopowych, przeprowadzono chemiczną syntezę motywów mono-, di- i tri-mannozowych. Mannozylocylowane peptydy otrzymano via azidoglikozylację glicozyl {beta}-peracetatów do transformacji 1,2-trans-azydków glikozylowych9, naśladując typowo występującą N-acetyloglukozaminę oraz wysokomannozowe oligosacharydy na powierzchni wirusów zagrażających życiu. Bioizostery triazolowe wykorzystano do naśladowania wiązań tworzących mannozylowaną resztę peptydu HA10 oraz w celu ułatwienia specyficznych oddziaływań z przeciwwirusowymi pochodnymi CV-N w obrębie drugiego miejsca glikozylacji N-łańcuchowej w domenie głowy HA (góra HA z 4 glikanami N-łańcuchowymi N54, N97, N181, N301)8,11,12. Oddziaływania między kwasem glutaminowym (Glu) a argininą (Arg) oraz wynikający z nich dipol helisy wykazały dobrą stabilność zarówno modelowych peptydów, jak i białek, co zostało zwizualizowane za pomocą SPR. W porównaniu z rozpoznawaniem pojedynczego chemicznie zsyntetyzowanego miejsca glikozylacji na HA10 poprzez bezpośrednie hamowanie wiązania receptora na motywach glikanowych, wykazano, że wyższe powinowactwo zmutowanej struktury Fc w czterech miejscach do jej receptora indukuje funkcje efektorowe in vivo, ujawniając, że niezwiązany skład glikanów N-łańcuchowych przyłączonych do mutanta Fc jest określony mechanistycznie13.

CV-N wykazuje aktywność przeciwwirusową przeciwko HIV14,15, grypie16 oraz wirusowi Ebola, co jest zapśredniczone przez nanomolowe wiązanie z modyfikacjami oligosacharydowymi bogatymi w mannozę w białkach kolca otoczki12,17,18,19. Ustalono, że wiązanie HA grypy do jednego miejsca wiążącego węglowodany o wysokim powinowactwie (H) w CV-N lub dwóch miejscach H w kowalencyjnie połączonym dimerycznym CVN2 charakteryzuje się stałymi dysocjacji równowagowej (KD) wynoszącymi odpowiednio 5,7 nM (Rycina 1A) i KD = 2,7 nM. Zarówno CV-N, jak i CVN2 posiadają dodatkowo jedno lub dwa miejsca wiążące węglowodany o niskim powinowactwie (L)s12,17,20,21. Ebola GP1,2 wiąże się z 2H CVN2 z powinowactwem w dolnym zakresie nanomolarnym (KD = 26 nM). Wiązanie CV-N WT do Ebola GP1,2 oraz HA wykazuje powinowactwa od KD = 34 nM do KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lektyny, takie jak CV-N, które specyficznie celują w glikany bogate w mannozę na otoczkach wirusowych, dodatkowo hamują replikację wirusa zapalenia wątroby C, SARS-CoV, herpeswirusa, wirusa Marburg oraz wirusa odry22.

Mała cząsteczka CV-N była szczegółowo badana przez ponad 20 lat ze względu na jej zdolność do wiązania szerokiego spektrum wirusów w celu hamowania ich wnikania do komórek16,18. Analizy strukturalne i testy powinowactwa wiązania wskazują na sieciowanie dwóch L w dimerze CVN2 z wymianą domen poprzez bivalentne wiązanie w zakresie mikromolarnym, co zwiększa awidność względem glikoprotein otoczki wirusowej10,19. Selektywne wiązanie Manα1-2Manα na ramionach D1D3 Man(8) oraz Man(9) obejmuje dwa miejsca wiązania o różnym powinowactwie, zlokalizowane na przeciwległych protomerach białka20, co pozwala na osiągnięcie nanomolarnego powinowactwa wiązania (Rysunek 1B). W związku z tym CVN2 jest uważany za pseudo-przeciwciało w kontekście jego zastosowania do wiązania epitopów na gp120 HIV, podobnie jak przeciwciała neutralizujące wirusy17. W niniejszej pracy autor jest zainteresowany zbadaniem potencjalnego wiązania CVN2 z białkiem spike SARS-CoV-2 via jego domeny wiążącej receptor (RBD). Krzywe wiązania unieruchomionej ludzkiej konwertazy angiotensyny (ACE)-2 z RBD SARS-CoV-2 dają wartość KD = 4.7 nM dla tej biologicznie istotnej interakcji wiązania23.

W przeciwieństwie do nich, wybrane klasy immunoglobulin rozpoznają specyficzne i powtarzalne wzorce białek strukturalnych, co stanowi podłoże dla dojrzewania powinowactwa w regionach HA zakotwiczonych w błonie24. CV-N wykazuje silną aktywność wobec niemal wszystkich wirusów grypy typu A i B16 i jest szeroko neutralizującym środkiem przeciwwirusowym. Nasza wiedza na temat lokalizacji celowanych epitopów na trzonie HA1 i HA2, które mogą obejmować struktury epitopowe dla celowania w glikany przez silnie neutralizujące przeciwciała w porównaniu z wiązaniem lektyn, pozostaje niepełna25.

Spektroskopia rezonansu plazmonów powierzchniowych; wiązanie białek wirusowych przez CV-N; analiza kinetyczna; schemat.
Rysunek 1: Schematyczny opis badania wiązania SPR dla CV-N do kolców otoczki wirusa. (A) Analiza SPR wiązania CV-N do ligandu: pełnowymiarowe białko HA (90 kDa). Zbiór danych kinetycznych (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) pokazujący w czasie rzeczywistym podwójnie referencyjne wiązanie do HA grypy A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Wiązanie wariantu V2 białka CVN2L0 do unieruchomionego ligandu DM w zakresie stężeń od 500 nM do 16 µM. Sekwencja: reszty L są zaznaczone na żółto. Reszty H są zaznaczone na szaro. E58 i R73 zastępują cysteiny w białku typu dzikiego, co sprawia, że V2 jest stabilną strukturą białkową z trzema zamiast czterech mostków disiarczkowych Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Podczas gdy tarcza glikanowa na dystalnej części błonowej HA indukuje wiązanie o wysokim powinowactwie do CV-N12, zaobserwowano również wiązanie CVN2 do HA w sąsiedztwie mostka dwusiarczkowego górnej części HA w jego miejscach o niskim powinowactwie10,12. W procesie wiązania węglowodanów przez CV-N zidentyfikowano różne oddziaływania polarne oraz miejsca interakcji. Oddziaływania te zostały zweryfikowane poprzez generowanie wariantów z knock-outem w miejscu wiązania, aby skorelować powinowactwa wiązania z glikozylacją przewidzianą in silico12. Tym samym projekt ma na celu porównanie wcześniej badanych chemicznie mannozylanych peptydów HA pod kątem powinowactwa i specyficzności wiązania z krótkimi sekwencjami peptydowymi z białek kolca SARS-related 2019-nCoV oraz SARS-CoV-2, naturalnie zmodyfikowanych przez niewielką liczbę różnych miejsc glikozylacji typu N oraz glikozylacji typu O. Wykorzystując kriomikroskopię elektronową i testy wiązania, Pinto i współpracownicy zgłosili przeciwciało monoklonalne S309, które potencjalnie rozpoznaje epitop na białku kolca SARS-CoV-2 zawierający konserwatywny glikan w obrębie podrodzaju Sarbecovirus, nie konkurując przy tym z przyłączaniem receptora26. Protokół niniejszego badania opisuje, w jaki sposób projektowanie, ekspresja i charakterystyka wariantów CV-N są istotne dla badania sposobu, w jaki CV-N i CVN2 wiążą się z glikozylowanymi białkami i syntetycznymi mannozylowanymi peptydami przy użyciu technologii SPR10,12.

Tandemowy dimer CVN2L027 oraz warianty miejsca wiązania (V2-V5) są ekspresowane rekombinacyjnie, a warianty te posiadają zamiany mostków dwusiarczkowych (C58E i C73R) (Rysunek 2A). Przygotowano również mutant z pojedynczą mutacją punktową E41A, ponieważ pozycja ta została zidentyfikowana jako reszta uczestnicząca w międzycząsteczkowych kontaktach krzyżowych. Mutant ten stanowi kolejną interesującą cząsteczkę do pomiarów wiązania metodą SPR pomiędzy lektyną a oligosacharydami wysokomannozowymi w celu rozszyfrowania domen wiążących i umożliwia porównanie z formą dimeryczną. Krystaliczna struktura CVN2 z zamianą domen wykazuje elastyczny łącznik, który obejmuje od 49 do 54 resyd). Dwie domeny mogą poruszać się wokół zawiasu jako ciała sztywne, tworząc albo monomer poprzez wewnątrzczeząsteczkowe oddziaływania domen (domena A – reszty 1-39; 90-101 – z domeną B – reszty 40-89), albo dimer poprzez międzycząsteczkową zamianę domen [domena A (pierwszego monomeru) z domeną B (drugiego) oraz domena B (pierwszego monomeru) z domeną A (drugiej kopii)]. Nie występują bliskie oddziaływania między domenami A i B obu protomerów, z wyjątkiem Glu4128. Gen CV-N można opracować za pomocą repetycyjnej metody PCR z wykorzystaniem syntetycznych oligosów o długości 40 merów29, a następnie podklonować do miejsc NdeI i BamHI wektora pET11a w celu transformacji (elektroporacji) do komórek elektrokompetentnych zgodnie z opisem Keeffe, J.R.27. Białko, które posłużyło do uzyskania odpowiedniej struktury krystalicznej (PDB ID 3S3Y), zawiera N-końcowy tag oczyszczający składający się z 6 histydyn, a następnie miejsce cięcia dla proteazy Factor Xa. Do wprowadzania mutacji punktowych, zmiany kodonów oraz wstawiania lub usuwania pojedynczych bądź wielu zasad lub kodonów w celu wymiany aminokwasów wykorzystuje się mutagenezę celowaną. Transformacje te dostarczają nieocenionych informacji na temat funkcji i struktury białek. Rekombinacyjnie ekspresowane i oczyszczone CV-N, CVN2 oraz CVN3 zostały dobrze przebadane biofizycznie20,21,27, są tanie w produkcji i dlatego wykorzystywane są do charakteryzacji testów wiązania z glikanami unieruchomionymi na chipach sensorycznych SPR. Konwencjonalny enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA) wykazuje mniejszą powtarzalność w zakresie techniki unieruchamiania ligandów glikanowych i przekształca wiązanie różnych wariantów miejsc wiążących w czasie rzeczywistym, co jest możliwe w SPR, w testy końcowe.

Wariant o zmodyfikowanym powinowactwie wiązania CVN2L0-V2 (zachowana struktura trzeciorzędowa homodimeru CV-N z substytucją mostka dwusiarczkowego)10) jest ekspresjonowane z oznakowaniem His-tag w Escherichia coli (E. coli), oczyszczone na kolumnie Ni-NTA z zastosowaniem chromatografii powinowactwa, a następnie przetestowane pod kątem wiązania z HA (H3N2), monomannozylowanym peptydem HA oraz dimannozylowanym peptydem HA przy użyciu SPR. Ligandami są chemicznie mannozylowane peptydy lub białka HA i S, które zostały sprzężone aminowo z hydrofilową powierzchnią chipa poprzez reaktywne estry lub inżynieria białek z wykorzystaniem układu biotyna-streptawidyna. Tę samą procedurę sekwencyjnych pomiarów zastosowano w przypadku tych ligandów, wstrzykując różne rozcieńczenia CV-N oraz wariantów CV-N (i CVN2), aby uzyskać informacje kinetyczne dla analiz oddziaływań molekularnych, opisanych poniżej30Do badań wiązania CV-N z peptydami S wykorzystano chip sensoryczny SPR z unieruchomionym RBD, a uzyskane powinowactwa porównano z wiązaniem SARS-CoV-2 z ludzkim ACE2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W niniejszym badaniu w testach immunoenzymatycznych zamiast CV-N zastosowano białko fuzyjne CVN-small ubiquitin-like modifier (SUMO), które jest odpowiednie do testów komórkowych. Rekombinowane białko HA H3 wirusa grypy A o pełnej długości jest pozyskiwane komercyjnie (patrz Tabela materiałów) lub otrzymywane poprzez ekspresję w ssaczych liniach komórkowych HEK293 oraz w komórkach owadziech zainfekowanych bakulowirusami zgodnie ze standardowymi protokołami12. Białko spike szczepu Wuhan-1 jest eksponowane w ssaczych komórkach HEK293. Synteza peptydów monomannozylowanych (MM) i dimannozylowanych (DM) pozwala na wykrywanie jednorodnych ligandów dla CVN2 oraz monomannozylowanych małych cząsteczek10.

1. Tworzenie konstruktów CV-N

  1. Dla każdego z wariantów CVN2 oraz białka CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) należy pozyskać konstrukt genowy z N-końcową sekwencją sygnałową pelB i znacznikiem His w wektorze pET27b(+) z źródeł komercyjnych (patrz Tabela materiałów, Plik uzupełniający 1).
  2. Należy pozyskać CVN2L0 oraz jego warianty (V2, V3, V4 i V5; Rysunek 2A,C) na bazie genu matrycowego CVN2L0 składającego się z dwóch odrębnych sekwencji DNA dla każdego powtórzenia CV-N.
  3. Liofilizowane plazmidowe DNA należy rozpuścić w sterylnej dejonizowanej wodzie destylowanej (ddH2O) do stężenia końcowego 100 ng/µL.

2. Przygotowanie płytek z agarem LB z komórkami transformowanymi plazmidowym DNA

  1. Przygotować pożywkę LB-Lennox, rozpuszczając 10 g/L peptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego oraz 5 g/L NaCl w ddH2O (patrz Tabela materiałów), a następnie ustawić pH na 7,4. Przeprowadzić transformację kompetentnych komórek E. coli BL21 (DE3) dla każdego wariantu (V2-V5) metodą chemiczną zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą10.
  2. Rozdzielić roztwór (900 µL i 100 µL), przenieść 100 µL na płytki z agarem LB (50 µg/mL kanamycyny) i delikatnie rozprowadzić za pomocą sterylnego rozpylacza. Inkubować płytki z agarem przez noc w temperaturze 37 °C.

3. Klonowanie

  1. Subklonuj gen CV-N do miejsc NdeI i BamHI wektora pET11a (patrz Tabela materiałów) w celu transformacji (elektroporacji) do komórek elektrokomepetentnych zgodnie z referencją27.

4. Mutageneza celowana

  1. Aby wygenerować CVN2L029 oraz mutant CVN-E41A w tle genu matrycowego CVN2L0 zawierającego dwie rozróżnialne sekwencje DNA dla każdej powtórzenia CV-N27.
  2. Wprowadzić mutacje przy użyciu zestawu do mutogenezy ukierunkowanej (patrz Tabela materiałów) i specyficznych starterów mutagennych 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' oraz 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' do przeprowadzenia reakcji PCR31.
    1. Rozpocząć serię reakcji próbnych z użyciem różnych stężeń matrycy dwuniciowego DNA (dsDNA) w zakresie od 5-50 ng (np. 5, 10, 20 i 50 ng matrycy dsDNA). Utrzymać stałe stężenie starterów.
      UWAGA: Mieszanina PCR oraz protokół cykli termicznych są zazwyczaj stosowane zgodnie z instrukcją obsługi zestawu do mutogenezy ukierunkowanej32.
  3. Dodać enzym restrykcyjny Dpn I (1 µL, 10 U/µL, patrz Tabela materiałów) pod warstwę oleju mineralnego. Dokładnie i delikatnie wymieszać reakcje, odwirować w mikrowirówce stołowej przez 1 min i niezwłocznie inkubować w 37 °C przez 1 h w celu strawienia rodzicielskiego superzwiniętego dsDNA.

5. Transformacja komórek bakteryjnych

  1. Powoli rozmrozić superkompetentne komórki XL1-Blue (patrz Tabela materiałów) na lodzie. W celu przeprowadzenia transformacji każdej reakcji kontrolnej i próbnej, przenieść alikwot komórek superkompetentnych (50 µL) do schłodzonej wcześniej polipropylenowej probówki o okrągłym dnie (14 mL).
    1. Przenieść 1 µL jednoniciowego DNA (ssDNA) poddanego działaniu Dpn I z każdej reakcji kontrolnej i próbnej (zmutowany ssDNA) do oddzielnych alikwotów komórek superkompetentnych, w których dojdzie do syntezy nici komplementarnej. Ostrożnie wymieszać zawartość probówek ruchem wirowym i inkubować reakcje transformacyjne na lodzie przez 30 min.
      UWAGA: Przed przeniesieniem DNA poddanego działaniu Dpn I do reakcji transformacyjnej zaleca się ostrożne usunięcie resztek oleju mineralnego z końcówki pipety. Opcjonalnie, w celu kontroli, należy sprawdzić wydajność transformacji komórek superkompetentnych XL1-Blue, mieszając 0,1 ng/µL plazmidu kontrolnego pUC18 (1 µL) z 50 µL alikwotem komórek superkompetentnych.
  2. Poddać reakcje transformacyjne szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 45 s, a następnie umieścić probówki na lodzie na 2 min.
    UWAGA: Parametry szoku termicznego zostały zoptymalizowane dla wymienionych warunków w polipropylenowych probówkach o okrągłym dnie (14 mL).
  3. Dodać 0,5 mL pożywki NZY+ (zawierającej na litr: 10 g aminy NZ (hydrolizatu kazeiny), 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 12,5 mL 1 M MgCl2, 12,5 mL 1 M MgSO4, 10 mL 2 M glukozy, pH 7,5, uprzednio podgrzanej do 42 °C) i inkubować reakcje transformacyjne w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 225-250 rpm przez 1 h. Wysiać odpowiednią objętość z każdej reakcji transformacyjnej (5 µL z transformacji plazmidu kontrolnego; 250 µL z transformacji próbnej) na płytki z agarem LB-ampcyklina.
    UWAGA: W przypadku kontroli transformacji i mutagenezy, komórki należy wysiać na płytki z agarem LB-ampcyklina zawierającym 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-galaktopiranozyd (X-gal, 80 µg/mL) i izopropyl-1-tio-β-D-galaktopiranozyd (IPTG, 20 mM) (patrz Tabela materiałów). Zaszczepić 50 mL kultur komórkowych pojedynczą kolonią transformowanych komórek E. coli w celu oczyszczenia zmutowanego DNA plazmidowego do dalszych analiz. Mutagenezę potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA w zewnętrznym laboratorium.

6. Ekspresja i oczyszczanie białka

  1. W celu uzyskania hodowli na dużą skalę, zaszczep niewielką ilość pożywki LB (zawierającej ampicylinę) pojedynczą kolonią z płytki po transformacji.
  2. Wykorzystując hodowlę nocną, zaszczep hodowlę ekspresyjną z dodatkami, takimi jak 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 oraz 20 mM glukozy, rozcieńczając hodowlę startową w stosunku 1/100.
    1. Hoduj komórki przy intensywnym wytrząsaniu w temperaturze 37 °C. Hoduj komórki do osiągnięcia wartości Abs 600 nm w zakresie 0,4-0,6 (środkowa faza logarytmiczna) przed schłodzeniem komórek do 20 °C. Indukuj ekspresję za pomocą 1 mM IPTG i hoduj przez noc.
    2. Następnie zbierz komórki poprzez wirowanie przy 4,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C i usuń nadsącz za pomocą pipety.
  3. Resuspenduj osad komórkowy w buforze fosforanowym z solą (PBS) i ponownie wiruj przy 4,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Następnie usuń nadsącz za pomocą pipety. Resuspenduj pozostały osad w 10 mL buforu lizującego i inkubuj zawiesinę przez 1 h w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Skład buforu lizującego: (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/mL lizozymu, 1 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF), 1 mM ditiotreitolu, 1 mM MgCl2, pH 8, patrz Tabela materiałów).
    1. Poddaj mieszaninę dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania (-80 °C). Rozdziel frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne poprzez wirowanie przy 4,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C i przeanalizuj je za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE), w szczególności SDS-PAGE33 (Rycina 2B,C).
      UWAGA: Lizę komórek można przeprowadzić na kilka sposobów, takich jak zamrażanie i rozmrażanie, sonikacja, homogenizacja, liza enzymatyczna lub kombinacja tych metod. W celu uzyskania wysokiej wydajności białka zaleca się oczyszczanie z ciałek inkluzyjnych26.
  4. Oczyść białka za pomocą chromatografii kolumnowej Ni-NTA (patrz Tabela materiałów). Nałóż frakcję rozpuszczalną na zregenerowaną kolumnę z ziarnami Ni-NTA (1 mL/min). Przemyj układ buforem TBS (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodu, pH 7,5) przed rozpoczęciem gradientu (0-100% 500 mM imidazolu w TBS przez 60 min) i zbieraniem frakcji (1 mL/min). Dializuj oczyszczone białka przeciwko 100 mM PBS w celu charakteryzacji biochemicznej (Rycina 2C,D).
  5. Alternatywnie, użyj żelu powinowactwa His-Select Ni2+ (patrz Tabela materiałów) w probówkach 14 mL, aby związać i resuspendować rekombinacyjnie wyrażone CV-N z tagiem His w roztworach buforowych zawierających odpowiednio 20 mM imidazolu i 250 mM imidazolu. Inkubuj w trybie wsadowym przez co najmniej 30 min.
    UWAGA: Zastosuj te częściowo oczyszczone białka w jednorazowej kolumnie wstępnie napełnionej do wymiany buforu i oczyszczania próbek biologicznych, na przykład węglowodanów i białek, która może pomieścić 1-1,5 mL eluatu z chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali.
  6. Przenieś roztwory białek do probówek wirówkowych z filtrem o progu odcięcia 10 kDa (patrz Tabela materiałów) i zagęść je poprzez wirowanie przez 10 min przy 4,500 x g i 4 °C. Do pomiarów SPR wymień roztwory analitów na 10 mM HEPES, 150 mM chlorku sodu, 3 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), patrz Tabela materiałów).
    1. Dodaj ten bufor roboczy do SPR do uzyskania współczynnika rozcieńczenia 1:10 i wiruj czterokrotnie do objętości początkowej przez 10 min przy 4,500 x g i 4 °C.
  7. Wyznacz stężenie białka przy 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis NanoDrop (patrz Tabela materiałów) na podstawie obliczonego współczynnika ekstynkcji (20,440 M-1 cm-1) dla głównego białka CVN2L0 o masie 23,474 Da34. Jako próbkę ślepą wykorzystaj PBS (100 mM, pH 7,0) lub bufor SPR i zmierz stężenie białka w trzech stopniach rozcieńczenia (1:1, 1:10 i 1:100).

Struktura dimeryczna CV-N z zamianą domen, wyniki SDS-PAGE oraz analiza chromatogramu absorpcyjnego.
Rysunek 2: Sekwencje i ekspresja CV-N. (A) CVN2 bez łącznika między powtórzeniami CV-N (każde po 101 aminokwasów) i z czterema mostkami dwusiarczkowymi jest ekspresowany w wektorze pET11a w E. coli. (B) Ekspresja dwóch niezależnych kolonii dla CV-N (monomer) i CVN2 (dimer). (C) Warianty wiązań dwusiarczkowych są oczyszczane i analizowane za pomocą SDS-PAGE. Jako referencję zastosowano marker niskich mas cząsteczkowych (6 µL). WT = CVN2L0 posiadający cztery mostki dwusiarczkowe, zaznaczone w (A). V2 to wariant z zastąpieniem wiązania dwusiarczkowego resztami polarnymi w pozycjach 58 i 73. V3-V5 to warianty z dwoma pozostałymi wiązaniami S-S i albo polarnymi (C58E-C73R) lub niepolarnymi (C58W-C73M) aminokwasami zastępującymi, albo kombinacją tych substytucji par reszt. (D) Chromatogramy HPLC oczyszczonego CVN2L0; elucja prowadzona z szybkością przepływu 1 mL/min z liniowym gradientem od 5%-65% buforu B w buforze A przez 30 min. Bufor A to: 0,1% (v/v) kwasu trifluorooctowego w ddH2O, bufor B to: 0,08% (v/v) kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Białko analizowano na kolumnie wysokosprawnej silica gel 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) przy 214 nm i 280 nm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

7. Spektroskopia SPR

  1. Użyć systemu Dual Channel SPR (patrz Tabela materiałów) z buforem roboczym HBS-EP(+) oraz 10 mM glicyną w HCl o pH 1,5-1,6 jako buforem regenerującym. Włączyć instrument, odgazowywacz, auto-sampler oraz pompę i przemyć cały system wodą ddH20 przez 1 h. Gotowy bufor roboczy umieścić w oddzielnej butelce.
  2. Nanieść olej imersyjny na detektor i zamontować szklany chip sensoryczny (patrz Tabela materiałów) powlekany cienką warstwą złota i funkcjonalizowany od strony górnej hydrożelem z karboksymetylodekstranu bezpośrednio na detektorze pod trójdrożną celą przepływową. Zablokować ustawienie, opuszczając uchwyt.
    UWAGA: C19RBDHC30M 200 nm streptavidin derivatized carboxymethyldextran hydrogel z umiarkowaną gęstością biotynilowanego białka RBD wirusa zespołu ostrych niewydolności oddechowych SARS-CoV-2 jest gotowym do użycia chipem sensorycznym z uprzednio unieruchomionym ligandem.

8. Analiza wiązania SPR w celu zbadania wiązania CV-N do HA, białka S oraz RBD

  1. Unieruchom ligandy białkowe na chipach sensorycznych zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Otwórz tabelę serii, klikając w Formularz w pasku menu i Uruchom edytor tabel w zintegrowanym oprogramowaniu SPRAutoLink (patrz Tabela materiałów). Wybierz i kliknij w PODSTAWY_Unieruchomienie z listy dostępnych tabel przebiegów i postępuj zgodnie z krokami procedury eksperymentalnej wyświetlanymi na ekranie komputera. W prawym górnym rogu widoczny jest użyty odpowiedni Edytor Próbek (Sample Editor).
    2. Kliknij w Edytor zestawów próbek w sekcji Formularz, aby wypełnić listę odczynników dla dwóch statywów umieszczonych w autoprobniku do dalszych analiz. Kliknij w Bezpośrednie sterowanie autopróbnikiem jako „Narzędzie” w pasku menu, aby przesunąć statiwy do przodu lub powrócić do pozycji początkowej. Wybierz 4 °C jako temperaturę roboczą.
      UWAGA: Oprogramowanie SPR umożliwia „Bezpośrednią kontrolę instrumentu SPR” oraz „Bezpośrednią kontrolę pompy” poprzez wybór odpowiednich narzędzi, a także obsługa autosamplera, a następnie kliknięcie w Formularz; ponadto Uruchom Edytor Tabel, Wykres Danychlub Obróbka końcowa można wybrać do przeprowadzenia analizy danych. Pliki są zapisywane bezpośrednio w katalogu domyślnym i eksportowane jako scrubber.files z okna Post-Processing.
  2. Uruchom pompę w celu infuzji ddH20 poprzez kliknięcie w Narzędzia i Bezpośrednie sterowanie pompą i zapisz dane, klikając w Bezpośrednia kontrola instrumentu SPRi za każdym razem Start w nowo pojawiających się oknach. Dodać odczynniki sprzęgające (krok 8.3) do 300 µL fiolki, umieść je w statywach autopróbnika i uruchom tabelę pomiarową, klikając w Uruchom.
    UWAGA: Powierzchnie chipów są kondycjonowane buforem glicynowym 10 mM o pH 9,0 lub mogą zostać przepłukane 1 M chlorkiem sodu i buforem boranowym 0,1 M o pH 9,0 w celu kondycjonowania karboksylowo modyfikowanej powierzchni chipa przed zastosowaniem mieszaniny aktywacyjnej EDC/NHS30.
  3. W przypadku tej prostej interakcji białko-białko należy użyć chipa CMD500D (patrz Tabela materiałów) w celu wygenerowania mikrojednostek współczynnika załamania światła (µRIU) = 2500 - 3000 komórka przepływowa z unieruchomionym HA i µRIU = 400 komórka przepływowa z białkiem kolca. Przy szybkości infuzji wynoszącej 15 µL/minnastępnie wstrzyknij wodną, równomolową mieszaninę 0,4 M chlorku N-etylo-N'-(dimetylaminopropylo)karbodiimidu (EDC*HCl) i 0,1 M N-hydroksysukcynimidu (NHS), wykonując następujące kroki sekwencyjne.
    1. Uzupełnij pompę w punkcie 25,000 µL/minwykonać regulację linii bazowej przez 30 s, wstrzyknąć 90 µL roztworu aktywującego próbkę (EDC/NHS) przez 6 min czasu kontaktu, a następnie pozostawić na kolejne 5 min.
    2. Powtórz ten cykl po przeprowadzeniu pomiaru linii bazowej przez 1 min w 10 µL/min wyłącznie w lewej celi przepływowej (niebieskiej), aby wstrzyknąć i unieruchomić chemicznie syntetyzowane peptydy10, HA oraz białko kolca w 20 µg/mLor umożliwiają one późniejszą korektę linii bazowej za pomocą ddH2O2inkubuj przez 1,5 min, a następnie zneutralizuj aktywowaną powierzchnię chipa za pomocą 1 M etanolaminy HCl o pH 8,5.
  4. Przełącz probówki z próbników cieczy na odgazowywacz z ddH2O20 do butelki z HBS-EP(+) (Rycina uzupełniająca 1).
  5. Przeanalizuj sensorgramy SPR.
    1. Aby przeprowadzić badania kinetyczne, należy zastosować różne stężenia analitytu (10-5-10-8 M), z etapem regeneracji po każdym wtrysku i pomiarami tła po różnych analitach. Zmienić szybkość przepływu na 10 µL/min następnie rozpocząć wtryskiwanie z czasem kontaktu wynoszącym 4 min, po czym przeprowadzić 5-minutową generację linii bazowej oraz dwa kroki regeneracji po 2 min każdy, z przerwą 30 s pomiędzy nimi.
    2. Wstrzyknij roztwór buforu do pomiarów ślepych, których sensorgramy są odejmowane od serii pomiarowych z próbką w celu normalizacji różnych stężeń białek.
  6. Kliknij w Formularzprzewiń w dół i zmień tryb na „Post-Processing” (obróbka końcowa), klikając ten tryb pracy. Kliknij Dodaj należy wybrać krzywe wiązania wygenerowane w czasie w formularzu wykresu danych (Data Plot Form) dla każdej komórki przepływowej i wyeksportować nałożone krzywe jako plik scrubbera (.ovr). Kliknij Plik, aby otworzyć opcje zapisywania plików. Uzyskaj krzywe odpowiedzi poprzez wyrównanie krzywych lewej i prawej oraz odjęcie sygnałów z drugiego kanału referencyjnego od sygnałów z kanału ligandu.
    UWAGA: Dane są przetwarzane w ramach „postprocessingu” poprzez obliczeniowe definiowanie sensorgramów. Są one przedstawiane w formie nałożonych na siebie sensorgramów z lewej i prawej celi przepływowej lub jako sensorgramy będące różnicą obu kanałów.
  7. Przed i po pomiarach wiązania należy przemyć cały układ płynowy buforem glicynowym 50–100 mM o pH 9,5, wodą i 20% etanolem w celu usunięcia pozostałości soli lub zanieczyszczeń białkowych, bądź w sposób bardziej rygorystyczny, przy użyciu 0,5% SDS i glicyny.
    UWAGA: Aby zapobiec uszkodzeniu instrumentu, zaleca się sprawdzenie stabilności mechanicznej szklanego chipu przed ponownym włożeniem kasety z chipem do instrumentu, jeśli chipy były przechowywane w buforze lub przy 100% wilgotności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dimericzną cząsteczkę CVN2L0 z zamianą domen testuje się pod kątem wiązania z górnym regionem HA w trzech oddzielnych eksperymentach SPR, a powinowactwo wiązania przedstawiono w KD wartości. Przyjmuje się, że domena B składa się z miejsc wiązania H, na które wpływa zastąpienie wiązania dwusiarczkowego resztami jonowymi, a domena A tworzy L10,18W celu oszacowania pojemności wiązania przed przeprowadzeniem pomiarów kinetyki z wykorzystaniem autosamplera ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powinowactwo wiązania CV-N jest skorelowane z liczbą funkcjonalnych miejsc wiązania [2H na domenach B i 2L na domenach A, gdy są zaprojektowane jako dimer z zamianą domen]. Wariant o zmienionym powinowactwie wiązania (CVN2L0-V2, homodimeryczny stabilny fałd CV-N zawierający nokaut mostka dwusiarczkowego) ulega ekspresji w E. coli, jest oczyszczany i pozytywnie testowany pod kątem wiązania z białkiem HA (H3N2) przy użyciu SPR10 i wykazuje zmianę konformacyjną po związaniu HA z miejscami wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Autor dziękuje Dr. Christianowi Derntlowi z Wydziału Biotechnologii i Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu oraz Wydziałowi Medycyny III, Oddziału Nefrologii i Dializy Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu, szczególnie Dr. Markusowi Wahrmannowi za wsparcie techniczne i naukowe. Ekspresja białek w komórkach ssaków była wspierana przez Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Zasobów Naturalnych i Nauk Przyrodniczych (BOKU) w Wiedniu. Autorka pragnie wyrazić swoje głębokie podziękowania dla dr Nico Dankbara z XanTec bioanalytics w Duesseldorfie w Niemczech za pomocne dyskusje naukowe na temat wykonywania testów wiązania SPR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ä kta primeplusCytiva
Probówki AmiconMerckC7715
AmpillicinSigma-AldrichA5354
Beckmann Coulter Cooler Wirówka Allegra X-30R BeckmanCoulterB06320
Rozsiewacz komórekSigma-AldrichHS86655srebrny stal nierdzewna, pręt L 33  mm
Niestandardowe Oligonukleotydy DNASigma-AldrichOLIGO
Niestandardowa Gensynteza GenScript#1390661 wektor klonowania: pET27b(+) 
Cytiva  HBS-EP+ Bufor 10, 4x50mLThermo Scientific50-105-5354
Dionex UlitMate 3000Thermo ScientificIQLAAAGABHFAPBMBFB
Enzym restrykcyjny Dpn I (10 U/μ L) Fisher ScientificER1701
DTTMerckDTT-RO
EDCMerck39391
EDTAMerckE9884
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120086
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120094
Eppendorf  Minispin  i osobista mikrowirówka MiniSpin PlusSigma-AldrichZ606235
EtanolMerck51976
Etanoloamina HClMerckE6133
Falcon 50mL Stożkowe probówkiFisher Scientific14-432-22
Falcon 14 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiem, sterylna, 25/opakowanieCorning352057
GlukozaMerckG8270
Glicyna HClMerck55097
HA H3 białkoAbcamab69751
HEPESMerckH3375
His-select Ni2 +MerckH0537
ImidazolMerckI2399
IPTGMerckI6758
Kanamycyna ASigma-AldrichK1377
Kromasil 300-5-C4Nouryon
LBMerck52062
LB agarMerck19344
LB LennoxMerckL3022
LizozymMerck10837059001
Chlorek magnezuMerckM8266
Siarczan magnezuMerckM7506
NaH2P04MerckS0751
NanoDrop UV-Vis2000cThermo ScientificND2000CLAPTOP
NaOHMerckS5881
NHSMerck130672
NZ amina ( hydrolizat kazeiny)MerckC0626
PBSMerck806552
PD MidiTrap G-10Sigma-AldrichGE28-9180-11
PeptonMerck70171
pET11aMerck Millipore (Novagen)69436 
PMSFMerckPMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)Pakiet oprogramowania Qiagen27106X4
Reichert Autolink1-1-9
SPR SR7500DC
Merck11667289001
Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, w tym plazmid kontrolny pUC18Stratagene#200518
Chlorek soduMerckS9888
Octan sodu. TrójwodzianMerck236500
SPR C19RBDHC30MXanTec bioanalyticsSCR C19RBDHC30M
SPR CMD500DXanTec bioanalyticsSCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Szalki PetriegoThermo Scientific101R20
TBSMerckT591210x, roztwór
Triton-X100MerckT8787
TryptonMerck93657
Tween20MerckP1379
Mikser Vortex-Genie 2MerckZ258423
X-galMerckXGAL-RO
XL1-Niebieskie superkompetentne komórkiStratagene#200236
Ekstrakt drożdżowyMerckY1625
wirówkowe Agar Dwukanałowy system Reichert Reichert Scrubber2-2012-09-04 do analizy danych Reichert SDS Chip czujnika Chip czujnika

Bibliografia

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26(2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621(2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inżynieria środków przeciwwirusowychwiązanie hemaglutyninydimer cyjanowiryny-Npeptydy manozylowaneglikoproteiny otoczki wirusaoddziaływanie białko-ligandbiosensing SPRwiązanie o wysokim powinowactwieekspresja białek rekombinowanych
Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.