Artykuł metodologiczny

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63541

⸱

14 czerwca 2022

1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Streszczenie

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) jest używany do pomiaru wiązania hemaglutyniny (HA) z dimerem cyjanowiryny-N (CV-N) z podmienioną domeną oraz do monitorowania interakcji między mannozylowanymi peptydami a miejscem wiązania CV-N o wysokim powinowactwie. Doniesiono, że kolce otoczki wirusa gp120, HA i glikoproteina Ebola (GP) 1,2 wiążą zarówno wysokie, jak i niskie powinowactwo na dimerycznym CVN2. Dimannozylowany peptyd HA jest również związany w dwóch miejscach wiązania o niskim powinowactwie do zmodyfikowanej cząsteczki CVN2, która ma miejsce o wysokim powinowactwie do odpowiedniego ligandu i jest zmutowany w celu zastąpienia stabilizującego wiązania dwusiarczkowego w kieszeni wiążącej węglowodany, potwierdzając w ten sposób wiązanie wielowartościowe. Wykazano wiązanie HA z jednym miejscem wiązania pseudoprzeciwciała CVN2 o wysokim powinowactwie przy stałej dysocjacji (KD) wynoszącej 275 nM, która dodatkowo neutralizuje ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) poprzez oligomeryzację. Korelacja liczby mostków dwusiarczkowych w CVN2 z zamianą domeny, które są zmniejszone z 4 do 2 przez podstawienie cystyn do par reszt polarnych kwasu glutaminowego i argininy, powoduje zmniejszenie powinowactwa wiązania do HA. Wśród najsilniejszych oddziaływań, Ebola GP1,2 jest wiązana przez CVN2 z dwoma miejscami wiązania o wysokim powinowactwie w dolnym zakresie nanomolowym przy użyciu glikanu otoczkowego bez domeny transbłonowej. W niniejszym badaniu wiązanie wielospecyficznego monomerycznego CV-N z glikoproteiną kolca (S) koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) mierzy się przyK D = 18,6 μM w porównaniu z nanomolowymK D do tych innych kolców wirusa oraz poprzez domenę wiążącą receptor w średnim zakresie μ-molowym.

Wprowadzenie

Aktywność przeciwwirusowa związana z tetheryną jest indukowana przez interferon-α i składa się z tetherów opartych na białkach, co prowadzi do zatrzymywania w pełni uformowanych wirionów na powierzchni zakażonych komórek1. Konieczność glikozylacji tetheryny w hamowaniu uwalniania wirusa pozostaje niepewna, co sugeruje znaczenie wzorców glikozylacji na rekombinowanych glikanach w badaniach in vitro1,2, co zależy od budowy (w przypadku wirusa grypy) hemaglutyniny grypy o ekspresji powierzchniowej HA3,4. Zauważono, że modyfikacja oligosacharydu związanego z glikozylacją sprzężoną z N jest wystarczająca do ograniczenia uwalniania wirusa HIV typu 1 za pośrednictwem tetheryny2, podczas gdy dimeryzacja odgrywa istotną rolę w zapobieganiu uwalnianiu wirusa, angażując w ten sposób domenę transbłonową lub kotwicę glikozylo-fosfatydylo-inozytolu (GPI) do wiązania pączkujących wirionów5. Opisano unikalne cechy ludzkiej i mysiej uwięzi w celu blokowania wielu wirusów otoczkowych, retrowirusów i filowirusów. BST-2/tetherin jest indukowanym interferonem białkiem przeciwwirusowym o odporności wrodzonej1,6, działającym o szerokim spektrum działania przeciwwirusowego i antagonizowanym przez glikoproteiny otoczki5 w celu translokacji tetheriny lub zakłócenia struktury tetherin6. Na przykład, glikoproteina HA i neuraminidaza o ekspresji powierzchniowej na wirusie grypy A są dobrze znane z antagonizmu tetheryny w sposób specyficzny dla szczepu7, ułatwiając rozpoznawanie miejsc wiązania receptora gospodarza8. Przeciwciała ukierunkowane na glikany są badane w stechiometrii ich interakcji z szybko dostosowującymi się osłonami glikanowymi na HA, co skutkuje powinowactwem do podtypów grypy A H3N2 i H1N14.

Aby wyjaśnić mechanizmy wiązania między środkami przeciwwirusowymi a kolcami otoczki wirusa, tj. ligandami węglowodanowymi, oraz komplementarnymi metodami immunologicznymi i spektroskopowymi, chemicznie syntetyzowane są ugrupowania mono-, di- i tri-mannozy. Mannozylowane peptydy są tworzone w wyniku azydoglikozylacji {beta}-perracetyniów glikozylu do transformacji azydków glikozylu 1,2-trans sup9, naśladując typowo występujące N-acetyloglukozaminę i oligosacharydy o wysokiej zawartości mannozy na powierzchni zagrażających życiu wirusów. Bioizostery triazolowe są wykorzystywane do naśladowania wiązań, które tworzą mannozylowaną resztę peptydu HA10 i ułatwiają specyficzne dla miejsca interakcje z przeciwwirusowymi pochodnymi CV-N wokół drugiego miejsca glikozylacji sprzężonego z N w domenie głównej HA (góra HA z 4 glikanami sprzężonymi z N N54, N97, N181, N301)8,11,12. Interakcje między kwasem glutaminowym (Glu) i argininą (Arg) a powstałym dipolem helisy wykazały dobrą stabilność zarówno modelowych peptydów, jak i białek, ale są wizualizowane za pomocą SPR. W porównaniu z rozpoznaniem pojedynczego chemicznie zsyntetyzowanego miejsca glikozylacji na HA10 poprzez bezpośrednie hamowanie wiązania receptora na ugrupowaniach glikanów, wykazano, że wyższe powinowactwo czteromiejscowej zmutowanej struktury Fc do jej receptora wywołuje funkcje efektorowe in vivo, ujawniając niepowiązany skład glikanów związanych z N przyłączonych do mutanta Fc, który ma być określony mechanistycznie13.

CV-N wykazuje działanie przeciwwirusowe przeciwko HIV14,15, influenza16, oraz wirusowi Ebola, który jest wywoływany przez wiązanie nanomolowe z modyfikacjami oligosacharydów o wysokiej zawartości mannozy na białkach kolców otoczki12,17,18,19. Określa się, że wiązanie HA grypy z jednym miejscem wiązania węglowodanów o wysokim powinowactwie (H) w CV-N lub dwoma Hs w kowalencyjnie połączonym dimerycznym CVN2 ma stałe dysocjacji równowagi (KD) = 5,7 nM (Rysunek 1A) i KD = 2,7 nM, odpowiednio. Zarówno CV-N, jak i CVN2 zawierają jeszcze jedno lub dwa miejsca wiązania węglowodanów o niskim powinowactwie (L)s12,17,20,21. Ebola GP1,2 wiąże się z 2H CVN2 z powinowactwem w dolnym zakresie nanomolowym (KD = 26 nM). Wiązanie CV-N WT z Ebola GP1,2 i HA wykazuje powinowactwo od KD = 34 nM do KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lektyny, takie jak CV-N, które są specyficznie ukierunkowane na glikany o wysokiej zawartości mannozy na otoczkach wirusa, dodatkowo hamują replikację wirusa zapalenia wątroby typu C, SARS-CoV, herpeswirusa, wirusa Marburg i wirusa odry22.

Mała cząsteczka CV-N była dokładnie badana przez ponad 20 lat, ponieważ funkcjonuje w celu wiązania szerokiej gamy wirusów w celu zahamowania wnikania wirusa16,18. Analizy strukturalne i testy powinowactwa do wiązania wskazują na sieciowanie dwóch L w dimerze CVN2 z zamianą domeny poprzez wiązanie biwalentne w zakresie mikromolowym w celu zwiększenia awidności glikoprotein otoczki wirusa10,19. Selektywne wiązanie Manα1-2Manα na ramionach Man(8) D1D3 i Man(9) składa się z dwóch miejsc wiązania o różnym powinowactwie zlokalizowanych na przeciwnych protomerach białkowych20, osiągając w ten sposób powinowactwo wiązania nanomolowego (Rysunek 1B). Tak więc CVN2 jest uważany za pseudo-przeciwciało dotyczące jego zastosowania do wiązania epitopów na HIV gp120, podobnie jak przeciwciała neutralizujące wirusa17. W tym miejscu autor jest zainteresowany badaniem potencjalnego wiązania CVN2 ze szpikulcem SARS-CoV-2 poprzez jego domenę wiążącą receptor (RBD). Krzywe wiązania unieruchomionego ludzkiego enzymu konwertującego angiotensynę (ACE)-2 z RBD SARS-CoV-2 dają wynik KD = 4,7 nM dla tej biologicznie istotnej interakcji wiążącej23.

Dla kontrastu, wybrane klasy immunoglobulin rozpoznają specyficzne i spójne wzorce białek strukturalnych, które nadają substrat do dojrzewania powinowactwa w zakotwiczonych w błonie regionach HA24. CV-N wykazuje bardzo silną aktywność w prawie wszystkich wirusach grypy A i B16 i jest szeroko neutralizującym środkiem przeciwwirusowym. Nasza wiedza jest niekompletna na temat lokalizacji docelowych epitopów na łodydze HA1 i HA2, które prawdopodobnie obejmują struktury epitopowe do celowania w glikany przez wysoce neutralizujące przeciwciała i w porównaniu z wiązaniem lektyny 25.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie testu wiązania SPR dla CV-N z kolcami otoczki wirusa. (A) Test SPR na wiązanie CV-N z ligandem: białko HA o pełnej długości (90 kDa). Zestaw danych kinetycznych (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) pokazujący podwójnie referencyjne wiązanie w czasie rzeczywistym z grypą HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Wariant CVN2L0 V2 wiążący się z unieruchomionym ligandem DM w zakresie stężeń od 500 nM do 16 μM. Sekwencja: Reszty L są zaznaczone na żółto. Pozostałości H są zaznaczone na szaro. E58 i R73 są zamiennikiem cystein w białku typu dzikiego i sprawiają, że V2 jest stabilnym fałdem białkowym z trzema zamiast czterech wiązań dwusiarczkowych Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Podczas gdy osłona glikanowa na górnej części błonowo-dystalnej HA indukuje wiązanie o wysokim powinowactwie do CV-N12, wiązanie CVN2 z HA przylegające do mostka dwusiarczkowego górnej części HA zostało dodatkowo zaobserwowane w miejscach o niskim powinowactwie10,12. Różne interakcje polarne i miejsca interakcji są identyfikowane w wiązaniu węglowodanów przez CV-N. Interakcje te są weryfikowane poprzez generowanie wariantów nokautujących w miejscu wiązania w celu skorelowania powinowactwa wiązania z glikozylacją przewidywaną in silico 12. W związku z tym projekt ma na celu porównanie wcześniej testowanych chemicznie mannozylowanych peptydów HA pod względem powinowactwa wiązania i swoistości z krótkimi sekwencjami peptydowymi z kolców 2019-nCoV związanych z SARS i SARS-CoV-2, naturalnie występujących, zmodyfikowanych przez niewielką liczbę różnych miejsc glikozylacji sprzężonych z N i glikozylacji sprzężonej z O. Korzystając z mikroskopii krioelektronowej i testów wiązania, Pinto i współpracownicy donoszą o przeciwciałie monoklonalnym, S309, które potencjalnie rozpoznaje epitop na białku kolca SARS-CoV-2 zawierającym konserwatywny glikan w podrodzaju Sarbecovirus, nie konkurując z receptorem attachment26. Protokół tego badania opisuje, w jaki sposób projektowanie, ekspresja i charakterystyka wariantów CV-N są ważne dla zbadania, w jaki sposób CV-N i CVN2 wiążą się z białkami glikozylowanymi i syntetycznymi peptydami mannozylowanymi przy użyciu technologii SPR10,12.

Tandem-linked dimer CVN2L027 i warianty miejsca wiązania (V2-V5) są rekombinowane, a warianty są z zamiennikami wiązań dwusiarczkowych (C58E i C73R) (Rysunek 2A). Przygotowuje się również mutanta z jednopunktową mutacją E41A, ponieważ ta pozycja była postrzegana jako międzycząsteczkowa reszta kontaktowa krzyżowo. Ten mutant jest kolejną interesującą cząsteczką do pomiarów wiązania SPR między lektyną a oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy, rozszyfrowując domeny wiążące i umożliwia porównanie z formą dimeryczną. Struktura krystaliczna CVN2 z zamianą domen wykazuje elastyczny łącznik, który rozciąga się między 49 a 54 resztami. Obie domeny mogą nadal poruszać się wokół zawiasu jako ciała sztywne, rozwijając monomer w wyniku wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań domenowych (domena A -reszty 1-39; 90-101- z domeną B -reszty 40-89) lub dimerem przez międzycząsteczkową zamianę domen [domena A (pierwszego monomeru) z domeną B (drugiej) i domena B (pierwszego monomeru) z domeną A (drugiej kopii)]. Nie ma bliskich interakcji między domenami A i B dwóch protomerów, z wyjątkiem Glu4128. Gen dla CV-N może być opracowany przy użyciu powtarzalnej metody PCR z 40-merowymi syntetyzowanymi oligos29, a następnie jest subklonowany do miejsc NdeI i BamHI pET11a w celu transformacji (elektroporacji) w komórki elektrokompetentne, jak opisano przez Keeffe, J.R.27. Białko, które jest używane do uzyskania odpowiedniej struktury krystalicznej (PDB ID 3S3Y), zawiera N-końcowy znacznik oczyszczania 6-histydyny, po którym następuje miejsce cięcia proteazy czynnika Xa. Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest wykorzystywana do dokonywania mutacji punktowych, przełączania kodonów oraz wstawiania lub usuwania pojedynczych lub wielu zasad lub kodonów w celu wymiany aminokwasów. Przemiany te dostarczają bezcennych informacji na temat funkcji i struktury białek. Rekombinacyjnie eksprymowane i oczyszczone CV-N, CVN2 i CVN3 zostały dobrze przebadane biofizycznie20,21,27, są tanie w produkcji, a zatem wykorzystywane do charakteryzowania testów wiązania z glikanami unieruchomionymi na chipach czujnika SPR. Konwencjonalny test immunoenzymatyczny (ELISA) zapewnia mniejszą powtarzalność w odniesieniu do techniki immobilizacji ligandów glikanowych i przekształca wiązanie w czasie rzeczywistym różnych wariantów miejsca wiązania, co jest pokazane dla SPR, w testy końcowe.

Wariant powinowactwa do wiązania CVN2L0-V2 (nienaruszony fałd homodimerycznego CV-N z podstawieniem mostka dwusiarczkowego10) jest wyrażany za pomocą znacznika Hisa w Escherichia coli (E. coli), oczyszczany przez kolumnę Ni-NTA za pomocą chromatografii powinowactwa i testowany pod kątem wiązania z HA (H3N2), monomannozylowanym peptydem HA i dimannozylonym peptydem HA przy użyciu SPR. Chemicznie mannozylowane peptydy, czyli białko HA i S, wszystkie są sprzężone ligandami i aminami do hydrofilowej powierzchni chipa za pomocą reaktywnych estrów lub inżynierii białkowej biotyny i streptawidyny. Ta sama procedura sekwencyjnych przebiegów jest stosowana do tych ligandów, wstrzykując różne rozcieńczenia CV-N i warianty CV-N (i CVN2) w celu uzyskania informacji kinetycznej do analiz oddziaływań molekularnych, jak opisano poniżej30. Chip czujnika SPR immobilizowany przez RBD służy do badań wiązania peptydów CV-N do S, a powinowactwa porównuje się do wiązania SARS-CoV-2 z ludzkim ACE2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Na potrzeby niniejszego badania, w testach immunoenzymatycznych zamiast CV-N zastosowano białko fuzyjne CVN-małego modyfikatora ubikwityny (SUMO) i jest ono odpowiednie do testów komórkowych. Rekombinowane białko HA H3 wirusa grypy A o pełnej długości jest uzyskiwane komercyjnie (patrz tabela materiałów) lub wyrażane w liniach komórkowych HEK293 ssaków i komórkach owadów zakażonych bakulowirusem zgodnie ze standardowymi protokołami12. Białko kolca Wuhan-1 ulega ekspresji w komórkach HEK293 ssaków. Synteza peptydu monomannozylowanego (MM) i peptydu dimannozylowanego (DM) pozwala na wykrycie jednorodnych ligandów do CVN2 i monomannozylowanych małych cząsteczek10.

1. Tworzenie konstrukcji CV-N

  1. Dla każdego z wariantów CVN2 i białka CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) należy uzyskać konstrukt genu z N-końcową sekwencją lidera pelB i znacznikiem Hisa w wektorze pET27b(+) ze źródeł komercyjnych (patrz Tabela materiałów, Plik uzupełniający 1).
  2. Uzyskaj CVN2L0 i jego warianty (V2, V3, V4 i V5; Rysunek 2A,C) w tle genu szablonowego CVN2L0 składającego się z dwóch odrębnych sekwencji DNA dla każdego powtórzenia CV-N.
  3. Rozpuścić liofilizowane plazmidowe DNA w sterylnej dejonizowanej wodzie destylowanej (ddH2O) do końcowego stężenia 100 ng/μL.

2. Przygotowanie płytek LB-agar z komórkami przekształconymi w plazmidowe DNA

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną LB-Lennox, rozpuszczając 10 g/l peptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 5 g/l NaCl w ddH2O (patrz tabela materiałów) i dostosować pH do 7,4. Przeprowadź transformację w kompetentną E. coli BL21 (DE3) dla każdego wariantu (V2-V5) metodą chemiczną zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem10.
  2. Podzielić roztwór (900 μl i 100 μl), przenieść 100 μl na płytki LB-agar (50 μg/ml kanamycyny) i delikatnie użyć sterylnego rozsiewacza komórek. Inkubować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C.

3. Klonowanie

  1. Subklonować gen dla CV-N do miejsc NdeI i BamHI pET11a (patrz Tabela materiałów) w celu przekształcenia (elektroporacji) w komórki elektrokompetentne zgodnie z odniesieniem27.

4. Mutageneza kierowana na stronę

  1. Aby wygenerować CVN2L029 i zmutowany CVN-E41A w tle genu szablonu CVN2L0 zawierającego dwie wyróżnione sekwencje DNA dla każdego CV-N repeat27.
  2. Dokonać mutacji za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce (patrz tabela materiałów) i specyficznych starterów mutagennych 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' i 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' do uruchomienia klasy PCR31.
    1. Rozpocznij serię reakcji próbek przy użyciu wielu stężeń matrycy dwuniciowego DNA (dsDNA) w zakresie od 5 do 50 ng (np. 5, 10, 20 i 50 ng matrycy dsDNA). Utrzymuj stałe stężenie podkładu.
      UWAGA: Mieszanina PCR i protokół cykli termicznych są zwykle używane zgodnie z opisem w instrukcji obsługi zestawu do mutagenezy skierowanej na miejsce32.
  3. Dodać enzym restrykcyjny Dpn I (1 μL, 10 U/μL, patrz Tabela Materiałów) poniżej nakładki oleju mineralnego. Dokładnie i delikatnie wymieszać reakcje, odwirować w mikrowirówce stołowej przez 1 minutę i natychmiast inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wytrawienia rodzicielskiego superskręconego dsDNA.

5. Transformacja komórek bakteryjnych

  1. Delikatnie rozmrozić nadkompetentne ogniwa XL1-Blue (patrz tabela materiałów) na lodzie. Aby przekształcić każdą reakcję kontrolną i próbkę, należy podwielokrotnić nadkompetentne komórki (50 μl) do wstępnie schłodzonej polipropylenowej probówki okrągłodennej (14 ml).
    1. Przenieść 1 μl jednoniciowego DNA (ssDNA) poddanego działaniu Dpn I z każdej reakcji kontrolnej i próbki (zmutowany ssDNA) do oddzielnych podwielokrotności komórek nadkompetentnych, które syntetyzują nić komplementarną. Ostrożnie zamieszać reakcje przemiany, aby wymieszać i inkubować reakcje na lodzie przez 30 min.
      UWAGA: Przed przeniesieniem DNA poddanego działaniu Dpn I do reakcji przemiany zaleca się ostrożne usunięcie resztek oleju mineralnego z końcówki pipety. Jako opcjonalną kontrolę, wydajność transformacji nadkompetentnych ogniw XL1-Blue musi być sprawdzona przez zmieszanie 0,1 ng/μl plazmidu kontrolnego pUC18 (1 μl) z 50 μl podwielokrotności komórek nadkompetentnych.
  2. Zastosować impuls cieplny do reakcji przemiany w temperaturze 42 °C przez 45 s, a następnie umieścić reakcje na lodzie na 2 min.
    UWAGA: Zastosowany impuls cieplny został już zoptymalizowany dla wymienionych warunków w probówkach okrągłodennych z polipropylenu (14 ml).
  3. Dodać 0,5 ml bulionu NZY+ (zawierającego na litr: 10 g aminy NZ (hydrolizatu kazeiny), 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl2, 12,5 ml 1 MMgSO4, 10 ml 2 M glukozy, pH 7,5 i podgrzanego do 42 °C) i inkubować reakcje przemiany w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225-250 obr./min przez 1 godzinę. Pokryć odpowiednią objętość każda reakcja przemiany (5 μL z kontrolnej przemiany plazmidowej; 250 μL z przemiany próbki) na płytkach agarowych LB-ampicyliny.
    UWAGA: W celu kontroli przemiany i mutagenezy, rozprowadzić komórki na płytkach agarowych LB-ampicyliny zawierających 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd (X-gal, 80 μg/ml) i izopropylo-1-tio-β-D-galaktopiranozyd (IPTG, 20 mM) (patrz Tabela materiałów). Zaszczepić 50 ml kultur komórkowych pojedynczą kolonią przekształconego E. komórki coli w celu oczyszczenia zmutowanego plazmidowego DNA do analiz. Mutagenezę potwierdza się przez sekwencjonowanie DNA w zewnętrznej placówce.

6. Ekspresja i oczyszczanie białek

  1. W przypadku hodowli na dużą skalę należy zaszczepić niewielką ilość LB (zawierającej ampicylinę) pojedynczą kolonią z przekształconej płytki.
  2. Używając kultury nocnej, zaszczepić kulturę ekspresyjną dodatkami, takimi jak 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 i 20 mM glukozy, rozcieńczając kulturę nasion do 1/100.
    1. Hodować komórki, energicznie wstrząsając w temperaturze 37 °C. Hodować komórki do Abs 600 nm między 0,4-0,6 (środkowa faza logarytmiczna) przed schłodzeniem komórek do 20 °C. Indukować za pomocą 1 mM IPTG i rosnąć przez noc.
    2. Następnie zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  3. Zawiesić osad komórkowy w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie odwirować przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić pozostały osad w 10 ml buforu do lizy i inkubować zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Skład buforu do lizy: (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/ml lizozymu, 1 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF), 1 mM ditiotreitolu, 1 mM MgCl2, pH 8, patrz tabela materiałów).
    1. Mieszaninę należy poddać dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania (-80 °C). Oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przeanalizować je za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), w szczególności dodecylosiarczanu sodu (SDS)-PAGE33(Rysunek 2B,C).
      UWAGA: Komórki mogą być lizowane na kilka sposobów, takich jak zamrażanie i rozmrażanie, sonikacja, homogenizacja, liza enzymatyczna lub kombinacja tych metod. Oczyszczanie z ciał inkluzyjnych jest zalecane w celu uzyskania wysokiej wydajności białka26.
  4. Oczyść białka za pomocą chromatografii kolumnowej Ni-NTA (patrz tabela materiałów). Załadować frakcję rozpuszczalną do zregenerowanej kolumny perełkowej Ni-NTA (1 ml/min). Umyj układ buforem TBS (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodu, pH 7,5) przed rozpoczęciem gradientu (0-100% 500% imidazolu w TBS przez 60 min) i zbieraniem frakcji (1 ml/min). Dializuj oczyszczone białka w celu charakterystyki biochemicznej w stosunku do 100 mM PBS (Rysunek 2C, D).
  5. Alternatywnie, użyj żelu powinowactwa His-Select Ni2+ (patrz tabela materiałów) w probówkach o pojemności 14 ml, aby związać i ponownie zawiesić rekombinowany CV-N wyrażony przez niego w roztworach buforowych z odpowiednio 20 mM imidazolem i 250 mM imidazolem. Inkubować partiami przez co najmniej 30 minut.
    UWAGA: Umieść te częściowo oczyszczone białka w jednorazowej, wstępnie wypełnionej kolumnie w celu wymiany buforu i oczyszczenia próbek biologicznych, na przykład węglowodanów i białek, które mogą załadować 1-1,5 ml eluatu z chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali.
  6. Przenieść roztwory białkowe do probówek wirówkowych z filtrem odcinającym o sile 10 kDa (patrz tabela materiałów) i zagęścić je przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 4 500 x g i w temperaturze 4 °C. W przypadku pomiarów SPR roztwory analitu należy wymienić na 10 mM HEPES, 150 mM chlorku sodu, 3 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), patrz tabela materiałów).
    1. Dodać ten bufor SPR do współczynnika rozcieńczenia 1:10 i odwirować czterokrotnie do objętości początkowej przez 10 minut w temperaturze 4 500 x g i w temperaturze 4 °C.
  7. Określić stężenie białka przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis NanoDrop (patrz tabela materiałów) na podstawie obliczonego współczynnika ekstynkcji (20 440 M-1 cm-1) dla głównego białka CVN2L0 o wielkości 23 474 Da34. Użyj buforu PBS (100 mM, pH 7,0) lub SPR jako ślepej próby i zmierz stężenie białka w trzech krokach rozcieńczania (1:1, 1:10 i 1:100).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Sekwencje i wyrażenie CV-N. (A) CVN2 bez łącznika między każdym powtórzeniem CV-N (po 101 aminokwasów) a czterema mostkami dwusiarczkowymi jest wyrażony w wektorze pET11a w E. coli. (B) Ekspresja dwóch niezależnych kolonii dla CV-N (monomer) i CVN2 (dimer). (C) Warianty wiązań dwusiarczkowych są oczyszczane i analizowane na SDS-PAGE. Jako odniesienie stosuje się marker o niskiej masie cząsteczkowej (6 μl). WT = CVN2L0 z czterema mostkami dwusiarczkowymi, jak oznaczono w (A). V2 to wariant z wiązaniem dwusiarczkowym zastąpionym pozostałościami polarnymi w pozycjach 58 i 73. V3-V5 to warianty z dwoma pozostałymi wiązaniami S-S i polarnymi (C58E-C73R) lub niepolarnymi (C58W-C73M) podstawieniami aminokwasów lub kombinacją tych podstawień par reszt. (D) Chromatogramy HPLC oczyszczonego CVN2L0 eluuje się z szybkością przepływu 1 ml/min z gradientem liniowym od 5%-65% buforu B w buforze A przez 30 min. Bufor A to: 0,1% (v/v) kwas trifluorooctowy w ddH2O, bufor B to: 0,08% (v/v) kwas trifluorooctowy w acetonitrylu. Białko analizuje się na wysokowydajnym żelu krzemionkowym 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) przy 214 nm i 280 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Spektroskopia SPR

  1. Jako bufor regeneracyjny należy stosować dwukanałowy system SPR (patrz tabela materiałów) z pracującym buforem HBS-EP(+) i 10 mM glicyny HCl o pH 1,5-1,6. Włącz urządzenie, odgazowywacz, automatyczny sampler i pompę i myj cały system za pomocą ddH20 przez 1 godzinę. Umieść gotowy do użycia bufor do biegania w osobnej butelce.
  2. Upuść olej emersyjny na detektor i zamontuj szklany chip czujnika (patrz Tabela materiałów) pokryty cienką złotą folią, a na górnej stronie funkcjonalizowany hydrożelem karboksymetylodekstranu bezpośrednio na detektorze poniżej trzyportowej komory przepływowej. Napraw ustawienie, pociągając w dół handling.
    UWAGA: C19RBDHC30M 200 nm derywatyzowany hydrożel karboksymetylodekstranowy o długości fali streptawidyny o średniej gęstości biotynylowanego białka RBD koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej jest gotowym do użycia chipem czujnikowym ze wstępnie unieruchomionym ligandem.

8. Test wiązania SPR dla wiązania CV-N z białkiem HA, S i RBD

  1. Unieruchomić ligandy białkowe na chipach czujnika, wykonując poniższe czynności.
    1. Otwórz tabelę uruchamiania, klikając Formularz na pasku menu i Uruchom Edytor tabel w zintegrowanym oprogramowaniu SPRAutoLink (patrz Spis materiałów). Wybierz i kliknij BASIC_Immobilization z listy dostępnych tabel uruchamiania i postępuj zgodnie z instrukcjami procedury eksperymentalnej na ekranie komputera. Odpowiedni używany edytor próbek jest pokazany w prawym górnym rogu.
    2. Kliknij na Edytor zestawu próbek w sekcji Formularz, aby wypełnić listę odczynników dla dwóch stojaków umieszczonych w autosamplerze w celu dalszych analiz. Kliknij Autosampler Direct Control jako "Narzędzie" na pasku menu, aby przesunąć stojaki do przodu lub do tyłu. Jako temperaturę roboczą wybierz 4 °C.
      UWAGA: Oprogramowanie SPR pozwala na "SPR Instrument Direct Control" i "Pump Direct Control" poprzez wybór odpowiednich narzędzi, a także obsługę automatycznego samplera i kliknięcie na Form; Do przeprowadzenia analizy danych można również wybrać opcję Uruchom edytor tabel, Wykres danych lub Przetwarzanie końcowe. Pliki są zapisywane bezpośrednio w katalogu domyślnym i eksportowane jako scrubber.files z okna Post-Processing.
  2. Uruchom pompę, aby zainparować ddH20 klikając Narzędzia i Pump Direct Control i zapisz dane klikając na SPR Instrument Direct Control i za każdym razem Start w nowo pojawiających się oknach. Umieścić odczynniki sprzęgające (krok 8.3) do fiolek o pojemności 300 μl, umieścić je w stojakach automatycznego podajnika próbek i uruchomić tabelę przebiegów, klikając Run.
    UWAGA: Powierzchnie chipów są kondycjonowane 10 mM buforem glicyny o pH 9,0 lub mogą być przepłukiwane 1 M chlorkiem sodu, 0,1 M buforem boranu sodu pH 9,0 w celu kondycjonowania powierzchni chipa z derytytylu karboksylu do aktywacji EDC/NHS mix30.
  3. Do tej prostej interakcji białko-białko użyj chipa CMD500D (patrz tabela materiałów), aby wygenerować jednostki mikroindeksu załamania światła (μRIU) = 2500 - 3000 komora przepływowa z unieruchomionym HA i μRIU = 400 komórka przepływowa z białkiem kolca. Przy natężeniu przepływu wlewu wynoszącym 15 μl/min wstrzyknąć wodną i równą mieszaninę 0,4 M chlorowodorku N-etylo-N'-(dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC*HCl) i 0,1 M N-hydroksysukcynimidu (NHS), wykonując następujące sekwencje.
    1. Napełnij pompę z prędkością 25 000 μl/min, wykonaj regulację linii bazowej przez 30 s, wstrzyknij 90 μl roztworu aktywującego próbkę (EDC/NHS) przez 6 minut kontaktu, a następnie przytrzymaj przez kolejne 5 minut.
    2. Powtórz ten cykl po linii bazowej, biegnąc przez 1 minutę przy 10 μl/min tylko na lewej komórce przepływowej (niebieskiej), aby wstrzyknąć i unieruchomić chemicznie syntetyzowane peptydy10, HA i białko kolca przy 20 μg/ml i pozwól na późniejszą korektę linii podstawowej za pomocą ddH2O przez 1,5 minuty przed schłodzeniem aktywowanej powierzchni chipa 1 M etanoloaminą HCl pH 8,5.
  4. Przełączyć probówki z próbnika cieczy do odgazowywacza z ddH20 do butelki z HBS-EP(+) (rysunek uzupełniający 1).
  5. Przeanalizuj sensorgramy SPR.
    1. Do wykonania badań kinetycznych należy stosować różne stężenia analitu (10-5-10-8 M), z etapem regeneracji po każdym wstrzyknięciu i ślepymi pomiarami po różnych analitach. Zmienić natężenie przepływu na 10 μl/min i rozpocząć iniekcję na 4 minuty kontaktu, następnie 5 minut generowania linii podstawowej i dwa etapy regeneracji po 2 minuty każdy w odstępie 30 s.
    2. Wstrzyknąć roztwór buforowy do ślepych pomiarów, których sensorgramy są odejmowane od serii próbek w celu normalizacji różnych stężeń białka.
  6. Kliknij Formularz, przewiń w dół i przejdź do "Przetwarzanie końcowe", klikając ten tryb operacji. Kliknij przycisk Dodaj, aby wybrać krzywe wiążące wygenerowane w czasie w formularzu wykresu danych dla każdej komórki przepływu i wyeksportować nakładkę jako plik suwaka (.ovr). Kliknij Plik, aby otworzyć opcje zapisywania plików. Krzywe odpowiedzi można uzyskać, wyrównując krzywą lewą i prawą oraz odejmując sygnały drugiego kanału odniesienia od sygnałów kanału liganda.
    UWAGA: Dane są obsługiwane w "Post-Processing" poprzez obliczeniowe definiowanie sensorgramów. Jest on umieszczany w nakładce sensorgramów z lewej i prawej komórki przepływowej lub reprezentowany jako sensorgramy z różnicy obu kanałów.
  7. Oczyść całą fluidykę za pomocą 50-100 mM buforu glicyny o pH 9,5, wody i 20% etanolu przed i po pomiarach wiązania, aby usunąć ślady soli lub jakiegokolwiek zanieczyszczenia białkami, lub bardziej rygorystycznie, z 0,5% SDS i glicyną.
    UWAGA: Aby zapobiec uszkodzeniu instrumentu, zaleca się sprawdzenie stabilności mechanicznej szklanego chipa przed ponownym włożeniem wkładu z chipem do instrumentu, jeśli wióry były przechowywane w buforze lub przy 100% wilgotności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Cząsteczka CVN2L0 z dimeryczną domeną jest testowana pod kątem wiązania z górnym regionem HA w trzech oddzielnych eksperymentach SPR, a powinowactwo wiązania jest prezentowane w wartościach KD. Zakłada się, że domena B zawiera miejsca wiązania H, na które wpływa zamiana wiązania dwusiarczkowego na reszty jonowe, a domena A tworzy L10,18. Pojedyncze wstrzyknięcia CVN2L0 i wariantów V2 (trzy mostki dwusiarczkowe) i V5 (dwa mostki dwusiarczkowe) są najpie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powinowactwo wiązania CV-N jest skorelowane z liczbą funkcjonalnych miejsc wiązania [2H na domenach B i 2L na domenach A, gdy są zaprojektowane jako dimer z zamianą domen]. Wariant o zmienionym powinowactwie wiązania (CVN2L0-V2, homodimeryczny stabilny fałd CV-N zawierający nokaut mostka dwusiarczkowego) ulega ekspresji w E. coli, jest oczyszczany i pozytywnie testowany pod kątem wiązania z białkiem HA (H3N2) przy użyciu SPR10 i wykazuje zmianę konformacyjną po związaniu HA z miejscami wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Autor dziękuje Dr. Christianowi Derntlowi z Wydziału Biotechnologii i Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu oraz Wydziałowi Medycyny III, Oddziału Nefrologii i Dializy Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu, szczególnie Dr. Markusowi Wahrmannowi za wsparcie techniczne i naukowe. Ekspresja białek w komórkach ssaków była wspierana przez Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Zasobów Naturalnych i Nauk Przyrodniczych (BOKU) w Wiedniu. Autorka pragnie wyrazić swoje głębokie podziękowania dla dr Nico Dankbara z XanTec bioanalytics w Duesseldorfie w Niemczech za pomocne dyskusje naukowe na temat wykonywania testów wiązania SPR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ä kta primeplusCytiva
Probówki AmiconMerckC7715
AmpillicinSigma-AldrichA5354
Beckmann Coulter Cooler Wirówka Allegra X-30R BeckmanCoulterB06320
Rozsiewacz komórekSigma-AldrichHS86655srebrny stal nierdzewna, pręt L 33  mm
Niestandardowe Oligonukleotydy DNASigma-AldrichOLIGO
Niestandardowa Gensynteza GenScript#1390661 wektor klonowania: pET27b(+) 
Cytiva  HBS-EP+ Bufor 10, 4x50mLThermo Scientific50-105-5354
Dionex UlitMate 3000Thermo ScientificIQLAAAGABHFAPBMBFB
Enzym restrykcyjny Dpn I (10 U/μ L) Fisher ScientificER1701
DTTMerckDTT-RO
EDCMerck39391
EDTAMerckE9884
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120086
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120094
Eppendorf  Minispin  i osobista mikrowirówka MiniSpin PlusSigma-AldrichZ606235
EtanolMerck51976
Etanoloamina HClMerckE6133
Falcon 50mL Stożkowe probówkiFisher Scientific14-432-22
Falcon 14 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiem, sterylna, 25/opakowanieCorning352057
GlukozaMerckG8270
Glicyna HClMerck55097
HA H3 białkoAbcamab69751
HEPESMerckH3375
His-select Ni2 +MerckH0537
ImidazolMerckI2399
IPTGMerckI6758
Kanamycyna ASigma-AldrichK1377
Kromasil 300-5-C4Nouryon
LBMerck52062
LB agarMerck19344
LB LennoxMerckL3022
LizozymMerck10837059001
Chlorek magnezuMerckM8266
Siarczan magnezuMerckM7506
NaH2P04MerckS0751
NanoDrop UV-Vis2000cThermo ScientificND2000CLAPTOP
NaOHMerckS5881
NHSMerck130672
NZ amina ( hydrolizat kazeiny)MerckC0626
PBSMerck806552
PD MidiTrap G-10Sigma-AldrichGE28-9180-11
PeptonMerck70171
pET11aMerck Millipore (Novagen)69436 
PMSFMerckPMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)Pakiet oprogramowania Qiagen27106X4
Reichert Autolink1-1-9
SPR SR7500DC
Merck11667289001
Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, w tym plazmid kontrolny pUC18Stratagene#200518
Chlorek soduMerckS9888
Octan sodu. TrójwodzianMerck236500
SPR C19RBDHC30MXanTec bioanalyticsSCR C19RBDHC30M
SPR CMD500DXanTec bioanalyticsSCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Szalki PetriegoThermo Scientific101R20
TBSMerckT591210x, roztwór
Triton-X100MerckT8787
TryptonMerck93657
Tween20MerckP1379
Mikser Vortex-Genie 2MerckZ258423
X-galMerckXGAL-RO
XL1-Niebieskie superkompetentne komórkiStratagene#200236
Ekstrakt drożdżowyMerckY1625
wirówkowe Agar Dwukanałowy system Reichert Reichert Scrubber2-2012-09-04 do analizy danych Reichert SDS Chip czujnika Chip czujnika

Bibliografia

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26(2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621(2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

In ynieria rodk w przeciwwirusowychwi zanie hemaglutyninydimer cyjanowiryny Npeptydy manozylowaneglikoproteiny otoczki wirusaoddzia ywanie bia ko ligandbiosensing SPRwi zanie o wysokim powinowactwieekspresja bia ek rekombinowanych

Powiązane artykuły