Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Aktywność przeciwwirusowa związana z tetheryną jest indukowana przez interferon-α i składa się z tetherów opartych na białkach, co prowadzi do zatrzymywania w pełni uformowanych wirionów na powierzchni zakażonych komórek¹. Konieczność glikozylacji tetheryny w hamowaniu uwalniania wirusa pozostaje niepewna, co sugeruje znaczenie wzorców glikozylacji na rekombinowanych glikanach w badaniach in vitro^1,2, co zależy od budowy (w przypadku wirusa grypy) hemaglutyniny grypy o ekspresji powierzchniowej HA^3,4. Zauważono, że modyfikacja oligosacharydu związanego z glikozylacją sprzężoną z N jest wystarczająca do ograniczenia uwalniania wirusa HIV typu 1 za pośrednictwem tetheryny², podczas gdy dimeryzacja odgrywa istotną rolę w zapobieganiu uwalnianiu wirusa, angażując w ten sposób domenę transbłonową lub kotwicę glikozylo-fosfatydylo-inozytolu (GPI) do wiązania pączkujących wirionów⁵. Opisano unikalne cechy ludzkiej i mysiej uwięzi w celu blokowania wielu wirusów otoczkowych, retrowirusów i filowirusów. BST-2/tetherin jest indukowanym interferonem białkiem przeciwwirusowym o odporności wrodzonej^1,6, działającym o szerokim spektrum działania przeciwwirusowego i antagonizowanym przez glikoproteiny otoczki⁵ w celu translokacji tetheriny lub zakłócenia struktury tetherin⁶. Na przykład, glikoproteina HA i neuraminidaza o ekspresji powierzchniowej na wirusie grypy A są dobrze znane z antagonizmu tetheryny w sposób specyficzny dla szczepu⁷, ułatwiając rozpoznawanie miejsc wiązania receptora gospodarza⁸. Przeciwciała ukierunkowane na glikany są badane w stechiometrii ich interakcji z szybko dostosowującymi się osłonami glikanowymi na HA, co skutkuje powinowactwem do podtypów grypy A H3N2 i H1N1⁴.

Aby wyjaśnić mechanizmy wiązania między środkami przeciwwirusowymi a kolcami otoczki wirusa, tj. ligandami węglowodanowymi, oraz komplementarnymi metodami immunologicznymi i spektroskopowymi, chemicznie syntetyzowane są ugrupowania mono-, di- i tri-mannozy. Mannozylowane peptydy są tworzone w wyniku azydoglikozylacji {beta}-perracetyniów glikozylu do transformacji azydków glikozylu 1,2-trans sup⁹, naśladując typowo występujące N-acetyloglukozaminę i oligosacharydy o wysokiej zawartości mannozy na powierzchni zagrażających życiu wirusów. Bioizostery triazolowe są wykorzystywane do naśladowania wiązań, które tworzą mannozylowaną resztę peptydu HA¹⁰ i ułatwiają specyficzne dla miejsca interakcje z przeciwwirusowymi pochodnymi CV-N wokół drugiego miejsca glikozylacji sprzężonego z N w domenie głównej HA (góra HA z 4 glikanami sprzężonymi z N N54, N97, N181, N301)^8,11,12. Interakcje między kwasem glutaminowym (Glu) i argininą (Arg) a powstałym dipolem helisy wykazały dobrą stabilność zarówno modelowych peptydów, jak i białek, ale są wizualizowane za pomocą SPR. W porównaniu z rozpoznaniem pojedynczego chemicznie zsyntetyzowanego miejsca glikozylacji na HA¹⁰ poprzez bezpośrednie hamowanie wiązania receptora na ugrupowaniach glikanów, wykazano, że wyższe powinowactwo czteromiejscowej zmutowanej struktury Fc do jej receptora wywołuje funkcje efektorowe in vivo, ujawniając niepowiązany skład glikanów związanych z N przyłączonych do mutanta Fc, który ma być określony mechanistycznie¹³.

CV-N wykazuje działanie przeciwwirusowe przeciwko HIV^14,15, influenza^16, oraz wirusowi Ebola, który jest wywoływany przez wiązanie nanomolowe z modyfikacjami oligosacharydów o wysokiej zawartości mannozy na białkach kolców otoczki^12,17,18,19. Określa się, że wiązanie HA grypy z jednym miejscem wiązania węglowodanów o wysokim powinowactwie (H) w CV-N lub dwoma Hs w kowalencyjnie połączonym dimerycznym CVN2 ma stałe dysocjacji równowagi (K_D) = 5,7 nM (Rysunek 1A) i K_D = 2,7 nM, odpowiednio. Zarówno CV-N, jak i CVN2 zawierają jeszcze jedno lub dwa miejsca wiązania węglowodanów o niskim powinowactwie (L)s^12,17,20,21. Ebola GP1,2 wiąże się z 2H CVN2 z powinowactwem w dolnym zakresie nanomolowym (K_D = 26 nM). Wiązanie CV-N WT z Ebola GP1,2 i HA wykazuje powinowactwo od K_D = 34 nM do K_D = 5,7 nM (A/New York/55/04)¹². Lektyny, takie jak CV-N, które są specyficznie ukierunkowane na glikany o wysokiej zawartości mannozy na otoczkach wirusa, dodatkowo hamują replikację wirusa zapalenia wątroby typu C, SARS-CoV, herpeswirusa, wirusa Marburg i wirusa odry²².

Mała cząsteczka CV-N była dokładnie badana przez ponad 20 lat, ponieważ funkcjonuje w celu wiązania szerokiej gamy wirusów w celu zahamowania wnikania wirusa^16,18. Analizy strukturalne i testy powinowactwa do wiązania wskazują na sieciowanie dwóch L w dimerze CVN2 z zamianą domeny poprzez wiązanie biwalentne w zakresie mikromolowym w celu zwiększenia awidności glikoprotein otoczki wirusa^10,19. Selektywne wiązanie Manα1-2Manα na ramionach Man(8) D1D3 i Man(9) składa się z dwóch miejsc wiązania o różnym powinowactwie zlokalizowanych na przeciwnych protomerach białkowych²⁰, osiągając w ten sposób powinowactwo wiązania nanomolowego (Rysunek 1B). Tak więc CVN2 jest uważany za pseudo-przeciwciało dotyczące jego zastosowania do wiązania epitopów na HIV gp120, podobnie jak przeciwciała neutralizujące wirusa¹⁷. W tym miejscu autor jest zainteresowany badaniem potencjalnego wiązania CVN2 ze szpikulcem SARS-CoV-2 poprzez jego domenę wiążącą receptor (RBD). Krzywe wiązania unieruchomionego ludzkiego enzymu konwertującego angiotensynę (ACE)-2 z RBD SARS-CoV-2 dają wynik K_D = 4,7 nM dla tej biologicznie istotnej interakcji wiążącej23.

Dla kontrastu, wybrane klasy immunoglobulin rozpoznają specyficzne i spójne wzorce białek strukturalnych, które nadają substrat do dojrzewania powinowactwa w zakotwiczonych w błonie regionach HA²⁴. CV-N wykazuje bardzo silną aktywność w prawie wszystkich wirusach grypy A i B¹⁶ i jest szeroko neutralizującym środkiem przeciwwirusowym. Nasza wiedza jest niekompletna na temat lokalizacji docelowych epitopów na łodydze HA1 i HA2, które prawdopodobnie obejmują struktury epitopowe do celowania w glikany przez wysoce neutralizujące przeciwciała i w porównaniu z wiązaniem lektyny ²⁵.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie testu wiązania SPR dla CV-N z kolcami otoczki wirusa. (A) Test SPR na wiązanie CV-N z ligandem: białko HA o pełnej długości (90 kDa). Zestaw danych kinetycznych (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) pokazujący podwójnie referencyjne wiązanie w czasie rzeczywistym z grypą HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Wariant CVN2L0 V2 wiążący się z unieruchomionym ligandem DM w zakresie stężeń od 500 nM do 16 μM. Sekwencja: Reszty L są zaznaczone na żółto. Pozostałości H są zaznaczone na szaro. E58 i R73 są zamiennikiem cystein w białku typu dzikiego i sprawiają, że V2 jest stabilnym fałdem białkowym z trzema zamiast czterech wiązań dwusiarczkowych Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Podczas gdy osłona glikanowa na górnej części błonowo-dystalnej HA indukuje wiązanie o wysokim powinowactwie do CV-N¹², wiązanie CVN2 z HA przylegające do mostka dwusiarczkowego górnej części HA zostało dodatkowo zaobserwowane w miejscach o niskim powinowactwie^10,12. Różne interakcje polarne i miejsca interakcji są identyfikowane w wiązaniu węglowodanów przez CV-N. Interakcje te są weryfikowane poprzez generowanie wariantów nokautujących w miejscu wiązania w celu skorelowania powinowactwa wiązania z glikozylacją przewidywaną in silico ¹². W związku z tym projekt ma na celu porównanie wcześniej testowanych chemicznie mannozylowanych peptydów HA pod względem powinowactwa wiązania i swoistości z krótkimi sekwencjami peptydowymi z kolców 2019-nCoV związanych z SARS i SARS-CoV-2, naturalnie występujących, zmodyfikowanych przez niewielką liczbę różnych miejsc glikozylacji sprzężonych z N i glikozylacji sprzężonej z O. Korzystając z mikroskopii krioelektronowej i testów wiązania, Pinto i współpracownicy donoszą o przeciwciałie monoklonalnym, S309, które potencjalnie rozpoznaje epitop na białku kolca SARS-CoV-2 zawierającym konserwatywny glikan w podrodzaju Sarbecovirus, nie konkurując z receptorem attachment²⁶. Protokół tego badania opisuje, w jaki sposób projektowanie, ekspresja i charakterystyka wariantów CV-N są ważne dla zbadania, w jaki sposób CV-N i CVN2 wiążą się z białkami glikozylowanymi i syntetycznymi peptydami mannozylowanymi przy użyciu technologii SPR^10,12.

Tandem-linked dimer CVN2L0²⁷ i warianty miejsca wiązania (V2-V5) są rekombinowane, a warianty są z zamiennikami wiązań dwusiarczkowych (C58E i C73R) (Rysunek 2A). Przygotowuje się również mutanta z jednopunktową mutacją E41A, ponieważ ta pozycja była postrzegana jako międzycząsteczkowa reszta kontaktowa krzyżowo. Ten mutant jest kolejną interesującą cząsteczką do pomiarów wiązania SPR między lektyną a oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy, rozszyfrowując domeny wiążące i umożliwia porównanie z formą dimeryczną. Struktura krystaliczna CVN2 z zamianą domen wykazuje elastyczny łącznik, który rozciąga się między 49 a 54 resztami. Obie domeny mogą nadal poruszać się wokół zawiasu jako ciała sztywne, rozwijając monomer w wyniku wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań domenowych (domena A -reszty 1-39; 90-101- z domeną B -reszty 40-89) lub dimerem przez międzycząsteczkową zamianę domen [domena A (pierwszego monomeru) z domeną B (drugiej) i domena B (pierwszego monomeru) z domeną A (drugiej kopii)]. Nie ma bliskich interakcji między domenami A i B dwóch protomerów, z wyjątkiem Glu41²⁸. Gen dla CV-N może być opracowany przy użyciu powtarzalnej metody PCR z 40-merowymi syntetyzowanymi oligos²⁹, a następnie jest subklonowany do miejsc NdeI i BamHI pET11a w celu transformacji (elektroporacji) w komórki elektrokompetentne, jak opisano przez Keeffe, J.R.²⁷. Białko, które jest używane do uzyskania odpowiedniej struktury krystalicznej (PDB ID 3S3Y), zawiera N-końcowy znacznik oczyszczania 6-histydyny, po którym następuje miejsce cięcia proteazy czynnika Xa. Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest wykorzystywana do dokonywania mutacji punktowych, przełączania kodonów oraz wstawiania lub usuwania pojedynczych lub wielu zasad lub kodonów w celu wymiany aminokwasów. Przemiany te dostarczają bezcennych informacji na temat funkcji i struktury białek. Rekombinacyjnie eksprymowane i oczyszczone CV-N, CVN2 i CVN3 zostały dobrze przebadane biofizycznie^20,21,27, są tanie w produkcji, a zatem wykorzystywane do charakteryzowania testów wiązania z glikanami unieruchomionymi na chipach czujnika SPR. Konwencjonalny test immunoenzymatyczny (ELISA) zapewnia mniejszą powtarzalność w odniesieniu do techniki immobilizacji ligandów glikanowych i przekształca wiązanie w czasie rzeczywistym różnych wariantów miejsca wiązania, co jest pokazane dla SPR, w testy końcowe.

Wariant powinowactwa do wiązania CVN2L0-V2 (nienaruszony fałd homodimerycznego CV-N z podstawieniem mostka dwusiarczkowego¹⁰) jest wyrażany za pomocą znacznika Hisa w Escherichia coli (E. coli), oczyszczany przez kolumnę Ni-NTA za pomocą chromatografii powinowactwa i testowany pod kątem wiązania z HA (H3N2), monomannozylowanym peptydem HA i dimannozylonym peptydem HA przy użyciu SPR. Chemicznie mannozylowane peptydy, czyli białko HA i S, wszystkie są sprzężone ligandami i aminami do hydrofilowej powierzchni chipa za pomocą reaktywnych estrów lub inżynierii białkowej biotyny i streptawidyny. Ta sama procedura sekwencyjnych przebiegów jest stosowana do tych ligandów, wstrzykując różne rozcieńczenia CV-N i warianty CV-N (i CVN2) w celu uzyskania informacji kinetycznej do analiz oddziaływań molekularnych, jak opisano poniżej³⁰. Chip czujnika SPR immobilizowany przez RBD służy do badań wiązania peptydów CV-N do S, a powinowactwa porównuje się do wiązania SARS-CoV-2 z ludzkim ACE2.

Na potrzeby niniejszego badania, w testach immunoenzymatycznych zamiast CV-N zastosowano białko fuzyjne CVN-małego modyfikatora ubikwityny (SUMO) i jest ono odpowiednie do testów komórkowych. Rekombinowane białko HA H3 wirusa grypy A o pełnej długości jest uzyskiwane komercyjnie (patrz tabela materiałów) lub wyrażane w liniach komórkowych HEK293 ssaków i komórkach owadów zakażonych bakulowirusem zgodnie ze standardowymi protokołami¹². Białko kolca Wuhan-1 ulega ekspresji w komórkach HEK293 ssaków. Synteza peptydu monomannozylowanego (MM) i peptydu dimannozylowanego (DM) pozwala na wykrycie jednorodnych ligandów do CVN2 i monomannozylowanych małych cząsteczek¹⁰.

1. Tworzenie konstrukcji CV-N

1. Dla każdego z wariantów CVN2 i białka CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) należy uzyskać konstrukt genu z N-końcową sekwencją lidera pelB i znacznikiem Hisa w wektorze pET27b(+) ze źródeł komercyjnych (patrz Tabela materiałów, Plik uzupełniający 1).
2. Uzyskaj CVN2L0 i jego warianty (V2, V3, V4 i V5; Rysunek 2A,C) w tle genu szablonowego CVN2L0 składającego się z dwóch odrębnych sekwencji DNA dla każdego powtórzenia CV-N.
3. Rozpuścić liofilizowane plazmidowe DNA w sterylnej dejonizowanej wodzie destylowanej (_ddH2O) do końcowego stężenia 100 ng/μL.

2. Przygotowanie płytek LB-agar z komórkami przekształconymi w plazmidowe DNA

1. Przygotować pożywkę hodowlaną LB-Lennox, rozpuszczając 10 g/l peptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 5 g/l NaCl w ddH₂O (patrz tabela materiałów) i dostosować pH do 7,4. Przeprowadź transformację w kompetentną E. coli BL21 (DE3) dla każdego wariantu (V2-V5) metodą chemiczną zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem¹⁰.
2. Podzielić roztwór (900 μl i 100 μl), przenieść 100 μl na płytki LB-agar (50 μg/ml kanamycyny) i delikatnie użyć sterylnego rozsiewacza komórek. Inkubować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C.

3. Klonowanie

1. Subklonować gen dla CV-N do miejsc NdeI i BamHI pET11a (patrz Tabela materiałów) w celu przekształcenia (elektroporacji) w komórki elektrokompetentne zgodnie z odniesieniem²⁷.

4. Mutageneza kierowana na stronę

1. Aby wygenerować CVN2L0²⁹ i zmutowany CVN-E41A w tle genu szablonu CVN2L0 zawierającego dwie wyróżnione sekwencje DNA dla każdego CV-N repeat²⁷.
2. Dokonać mutacji za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce (patrz tabela materiałów) i specyficznych starterów mutagennych 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' i 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' do uruchomienia klasy PCR31.
   1. Rozpocznij serię reakcji próbek przy użyciu wielu stężeń matrycy dwuniciowego DNA (dsDNA) w zakresie od 5 do 50 ng (np. 5, 10, 20 i 50 ng matrycy dsDNA). Utrzymuj stałe stężenie podkładu.
      UWAGA: Mieszanina PCR i protokół cykli termicznych są zwykle używane zgodnie z opisem w instrukcji obsługi zestawu do mutagenezy skierowanej na miejsce³².
3. Dodać enzym restrykcyjny Dpn I (1 μL, 10 U/μL, patrz Tabela Materiałów) poniżej nakładki oleju mineralnego. Dokładnie i delikatnie wymieszać reakcje, odwirować w mikrowirówce stołowej przez 1 minutę i natychmiast inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wytrawienia rodzicielskiego superskręconego dsDNA.

5. Transformacja komórek bakteryjnych

1. Delikatnie rozmrozić nadkompetentne ogniwa XL1-Blue (patrz tabela materiałów) na lodzie. Aby przekształcić każdą reakcję kontrolną i próbkę, należy podwielokrotnić nadkompetentne komórki (50 μl) do wstępnie schłodzonej polipropylenowej probówki okrągłodennej (14 ml).
   1. Przenieść 1 μl jednoniciowego DNA (ssDNA) poddanego działaniu Dpn I z każdej reakcji kontrolnej i próbki (zmutowany ssDNA) do oddzielnych podwielokrotności komórek nadkompetentnych, które syntetyzują nić komplementarną. Ostrożnie zamieszać reakcje przemiany, aby wymieszać i inkubować reakcje na lodzie przez 30 min.
      UWAGA: Przed przeniesieniem DNA poddanego działaniu Dpn I do reakcji przemiany zaleca się ostrożne usunięcie resztek oleju mineralnego z końcówki pipety. Jako opcjonalną kontrolę, wydajność transformacji nadkompetentnych ogniw XL1-Blue musi być sprawdzona przez zmieszanie 0,1 ng/μl plazmidu kontrolnego pUC18 (1 μl) z 50 μl podwielokrotności komórek nadkompetentnych.
2. Zastosować impuls cieplny do reakcji przemiany w temperaturze 42 °C przez 45 s, a następnie umieścić reakcje na lodzie na 2 min.
   UWAGA: Zastosowany impuls cieplny został już zoptymalizowany dla wymienionych warunków w probówkach okrągłodennych z polipropylenu (14 ml).
3. Dodać 0,5 ml bulionu NZY+ (zawierającego na litr: 10 g aminy NZ (hydrolizatu kazeiny), 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl₂, 12,5 ml 1 M_MgSO4, 10 ml 2 M glukozy, pH 7,5 i podgrzanego do 42 °C) i inkubować reakcje przemiany w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225-250 obr./min przez 1 godzinę. Pokryć odpowiednią objętość każda reakcja przemiany (5 μL z kontrolnej przemiany plazmidowej; 250 μL z przemiany próbki) na płytkach agarowych LB-ampicyliny.
   UWAGA: W celu kontroli przemiany i mutagenezy, rozprowadzić komórki na płytkach agarowych LB-ampicyliny zawierających 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd (X-gal, 80 μg/ml) i izopropylo-1-tio-β-D-galaktopiranozyd (IPTG, 20 mM) (patrz Tabela materiałów). Zaszczepić 50 ml kultur komórkowych pojedynczą kolonią przekształconego E. komórki coli w celu oczyszczenia zmutowanego plazmidowego DNA do analiz. Mutagenezę potwierdza się przez sekwencjonowanie DNA w zewnętrznej placówce.

6. Ekspresja i oczyszczanie białek

1. W przypadku hodowli na dużą skalę należy zaszczepić niewielką ilość LB (zawierającej ampicylinę) pojedynczą kolonią z przekształconej płytki.
2. Używając kultury nocnej, zaszczepić kulturę ekspresyjną dodatkami, takimi jak 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ i 20 mM glukozy, rozcieńczając kulturę nasion do 1/100.
   1. Hodować komórki, energicznie wstrząsając w temperaturze 37 °C. Hodować komórki do Abs 600 nm między 0,4-0,6 (środkowa faza logarytmiczna) przed schłodzeniem komórek do 20 °C. Indukować za pomocą 1 mM IPTG i rosnąć przez noc.
   2. Następnie zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
3. Zawiesić osad komórkowy w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie odwirować przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić pozostały osad w 10 ml buforu do lizy i inkubować zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Skład buforu do lizy: (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/ml lizozymu, 1 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF), 1 mM ditiotreitolu, 1 mM MgCl₂, pH 8, patrz tabela materiałów).
   1. Mieszaninę należy poddać dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania (-80 °C). Oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przeanalizować je za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), w szczególności dodecylosiarczanu sodu (SDS)-PAGE³³(Rysunek 2B,C).
      UWAGA: Komórki mogą być lizowane na kilka sposobów, takich jak zamrażanie i rozmrażanie, sonikacja, homogenizacja, liza enzymatyczna lub kombinacja tych metod. Oczyszczanie z ciał inkluzyjnych jest zalecane w celu uzyskania wysokiej wydajności białka²⁶.
4. Oczyść białka za pomocą chromatografii kolumnowej Ni-NTA (patrz tabela materiałów). Załadować frakcję rozpuszczalną do zregenerowanej kolumny perełkowej Ni-NTA (1 ml/min). Umyj układ buforem TBS (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodu, pH 7,5) przed rozpoczęciem gradientu (0-100% 500% imidazolu w TBS przez 60 min) i zbieraniem frakcji (1 ml/min). Dializuj oczyszczone białka w celu charakterystyki biochemicznej w stosunku do 100 mM PBS (Rysunek 2C, D).
5. Alternatywnie, użyj żelu powinowactwa His-Select Ni²⁺ (patrz tabela materiałów) w probówkach o pojemności 14 ml, aby związać i ponownie zawiesić rekombinowany CV-N wyrażony przez niego w roztworach buforowych z odpowiednio 20 mM imidazolem i 250 mM imidazolem. Inkubować partiami przez co najmniej 30 minut.
   UWAGA: Umieść te częściowo oczyszczone białka w jednorazowej, wstępnie wypełnionej kolumnie w celu wymiany buforu i oczyszczenia próbek biologicznych, na przykład węglowodanów i białek, które mogą załadować 1-1,5 ml eluatu z chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali.
6. Przenieść roztwory białkowe do probówek wirówkowych z filtrem odcinającym o sile 10 kDa (patrz tabela materiałów) i zagęścić je przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 4 500 x g i w temperaturze 4 °C. W przypadku pomiarów SPR roztwory analitu należy wymienić na 10 mM HEPES, 150 mM chlorku sodu, 3 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), patrz tabela materiałów).
   1. Dodać ten bufor SPR do współczynnika rozcieńczenia 1:10 i odwirować czterokrotnie do objętości początkowej przez 10 minut w temperaturze 4 500 x g i w temperaturze 4 °C.
7. Określić stężenie białka przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis NanoDrop (patrz tabela materiałów) na podstawie obliczonego współczynnika ekstynkcji (20 440 ^{M-1 cm-1}) dla głównego białka CVN2L0 o wielkości 23 474 Da³⁴. Użyj buforu PBS (100 mM, pH 7,0) lub SPR jako ślepej próby i zmierz stężenie białka w trzech krokach rozcieńczania (1:1, 1:10 i 1:100).

Rysunek 2: Sekwencje i wyrażenie CV-N. (A) CVN2 bez łącznika między każdym powtórzeniem CV-N (po 101 aminokwasów) a czterema mostkami dwusiarczkowymi jest wyrażony w wektorze pET11a w E. coli. (B) Ekspresja dwóch niezależnych kolonii dla CV-N (monomer) i CVN2 (dimer). (C) Warianty wiązań dwusiarczkowych są oczyszczane i analizowane na SDS-PAGE. Jako odniesienie stosuje się marker o niskiej masie cząsteczkowej (6 μl). WT = CVN2L0 z czterema mostkami dwusiarczkowymi, jak oznaczono w (A). V2 to wariant z wiązaniem dwusiarczkowym zastąpionym pozostałościami polarnymi w pozycjach 58 i 73. V3-V5 to warianty z dwoma pozostałymi wiązaniami S-S i polarnymi (C58E-C73R) lub niepolarnymi (C58W-C73M) podstawieniami aminokwasów lub kombinacją tych podstawień par reszt. (D) Chromatogramy HPLC oczyszczonego CVN2L0 eluuje się z szybkością przepływu 1 ml/min z gradientem liniowym od 5%-65% buforu B w buforze A przez 30 min. Bufor A to: 0,1% (v/v) kwas trifluorooctowy w ddH₂O, bufor B to: 0,08% (v/v) kwas trifluorooctowy w acetonitrylu. Białko analizuje się na wysokowydajnym żelu krzemionkowym 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) przy 214 nm i 280 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Spektroskopia SPR

1. Jako bufor regeneracyjny należy stosować dwukanałowy system SPR (patrz tabela materiałów) z pracującym buforem HBS-EP(+) i 10 mM glicyny HCl o pH 1,5-1,6. Włącz urządzenie, odgazowywacz, automatyczny sampler i pompę i myj cały system za pomocą ddH₂0 przez 1 godzinę. Umieść gotowy do użycia bufor do biegania w osobnej butelce.
2. Upuść olej emersyjny na detektor i zamontuj szklany chip czujnika (patrz Tabela materiałów) pokryty cienką złotą folią, a na górnej stronie funkcjonalizowany hydrożelem karboksymetylodekstranu bezpośrednio na detektorze poniżej trzyportowej komory przepływowej. Napraw ustawienie, pociągając w dół handling.
   UWAGA: C19RBDHC30M 200 nm derywatyzowany hydrożel karboksymetylodekstranowy o długości fali streptawidyny o średniej gęstości biotynylowanego białka RBD koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej jest gotowym do użycia chipem czujnikowym ze wstępnie unieruchomionym ligandem.

8. Test wiązania SPR dla wiązania CV-N z białkiem HA, S i RBD

1. Unieruchomić ligandy białkowe na chipach czujnika, wykonując poniższe czynności.
   1. Otwórz tabelę uruchamiania, klikając Formularz na pasku menu i Uruchom Edytor tabel w zintegrowanym oprogramowaniu SPRAutoLink (patrz Spis materiałów). Wybierz i kliknij BASIC_Immobilization z listy dostępnych tabel uruchamiania i postępuj zgodnie z instrukcjami procedury eksperymentalnej na ekranie komputera. Odpowiedni używany edytor próbek jest pokazany w prawym górnym rogu.
   2. Kliknij na Edytor zestawu próbek w sekcji Formularz, aby wypełnić listę odczynników dla dwóch stojaków umieszczonych w autosamplerze w celu dalszych analiz. Kliknij Autosampler Direct Control jako "Narzędzie" na pasku menu, aby przesunąć stojaki do przodu lub do tyłu. Jako temperaturę roboczą wybierz 4 °C.
      UWAGA: Oprogramowanie SPR pozwala na "SPR Instrument Direct Control" i "Pump Direct Control" poprzez wybór odpowiednich narzędzi, a także obsługę automatycznego samplera i kliknięcie na Form; Do przeprowadzenia analizy danych można również wybrać opcję Uruchom edytor tabel, Wykres danych lub Przetwarzanie końcowe. Pliki są zapisywane bezpośrednio w katalogu domyślnym i eksportowane jako scrubber.files z okna Post-Processing.
2. Uruchom pompę, aby zainparować ddH₂0 klikając Narzędzia i Pump Direct Control i zapisz dane klikając na SPR Instrument Direct Control i za każdym razem Start w nowo pojawiających się oknach. Umieścić odczynniki sprzęgające (krok 8.3) do fiolek o pojemności 300 μl, umieścić je w stojakach automatycznego podajnika próbek i uruchomić tabelę przebiegów, klikając Run.
   UWAGA: Powierzchnie chipów są kondycjonowane 10 mM buforem glicyny o pH 9,0 lub mogą być przepłukiwane 1 M chlorkiem sodu, 0,1 M buforem boranu sodu pH 9,0 w celu kondycjonowania powierzchni chipa z derytytylu karboksylu do aktywacji EDC/NHS mix³⁰.
3. Do tej prostej interakcji białko-białko użyj chipa CMD500D (patrz tabela materiałów), aby wygenerować jednostki mikroindeksu załamania światła (μRIU) = 2500 - 3000 komora przepływowa z unieruchomionym HA i μRIU = 400 komórka przepływowa z białkiem kolca. Przy natężeniu przepływu wlewu wynoszącym 15 μl/min wstrzyknąć wodną i równą mieszaninę 0,4 M chlorowodorku N-etylo-N'-(dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC*HCl) i 0,1 M N-hydroksysukcynimidu (NHS), wykonując następujące sekwencje.
   1. Napełnij pompę z prędkością 25 000 μl/min, wykonaj regulację linii bazowej przez 30 s, wstrzyknij 90 μl roztworu aktywującego próbkę (EDC/NHS) przez 6 minut kontaktu, a następnie przytrzymaj przez kolejne 5 minut.
   2. Powtórz ten cykl po linii bazowej, biegnąc przez 1 minutę przy 10 μl/min tylko na lewej komórce przepływowej (niebieskiej), aby wstrzyknąć i unieruchomić chemicznie syntetyzowane peptydy¹⁰, HA i białko kolca przy 20 μg/ml i pozwól na późniejszą korektę linii podstawowej za pomocą ddH₂O przez 1,5 minuty przed schłodzeniem aktywowanej powierzchni chipa 1 M etanoloaminą HCl pH 8,5.
4. Przełączyć probówki z próbnika cieczy do odgazowywacza z ddH₂0 do butelki z HBS-EP(+) (rysunek uzupełniający 1).
5. Przeanalizuj sensorgramy SPR.
   1. Do wykonania badań kinetycznych należy stosować różne stężenia analitu (10-5-10-8 M), z etapem regeneracji po każdym wstrzyknięciu i ślepymi pomiarami po różnych analitach. Zmienić natężenie przepływu na 10 μl/min i rozpocząć iniekcję na 4 minuty kontaktu, następnie 5 minut generowania linii podstawowej i dwa etapy regeneracji po 2 minuty każdy w odstępie 30 s.
   2. Wstrzyknąć roztwór buforowy do ślepych pomiarów, których sensorgramy są odejmowane od serii próbek w celu normalizacji różnych stężeń białka.
6. Kliknij Formularz, przewiń w dół i przejdź do "Przetwarzanie końcowe", klikając ten tryb operacji. Kliknij przycisk Dodaj, aby wybrać krzywe wiążące wygenerowane w czasie w formularzu wykresu danych dla każdej komórki przepływu i wyeksportować nakładkę jako plik suwaka (.ovr). Kliknij Plik, aby otworzyć opcje zapisywania plików. Krzywe odpowiedzi można uzyskać, wyrównując krzywą lewą i prawą oraz odejmując sygnały drugiego kanału odniesienia od sygnałów kanału liganda.
   UWAGA: Dane są obsługiwane w "Post-Processing" poprzez obliczeniowe definiowanie sensorgramów. Jest on umieszczany w nakładce sensorgramów z lewej i prawej komórki przepływowej lub reprezentowany jako sensorgramy z różnicy obu kanałów.
7. Oczyść całą fluidykę za pomocą 50-100 mM buforu glicyny o pH 9,5, wody i 20% etanolu przed i po pomiarach wiązania, aby usunąć ślady soli lub jakiegokolwiek zanieczyszczenia białkami, lub bardziej rygorystycznie, z 0,5% SDS i glicyną.
   UWAGA: Aby zapobiec uszkodzeniu instrumentu, zaleca się sprawdzenie stabilności mechanicznej szklanego chipa przed ponownym włożeniem wkładu z chipem do instrumentu, jeśli wióry były przechowywane w buforze lub przy 100% wilgotności.

Cząsteczka CVN2L0 z dimeryczną domeną jest testowana pod kątem wiązania z górnym regionem HA w trzech oddzielnych eksperymentach SPR, a powinowactwo wiązania jest prezentowane w wartościach KD. Zakłada się, że domena B zawiera miejsca wiązania H, na które wpływa zamiana wiązania dwusiarczkowego na reszty jonowe, a domena A tworzy L10,18. Pojedyncze wstrzyknięcia CVN2L0 i wariantów V2 (trzy mostki dwusiarczkowe) i V5 (dwa mostki dwusiarczkowe) są najpierw testowane pod kątem wiązania z chipem czujnika sprzężonego z HA w celu oszacowania zdolności wiązania przed skonfigurowaniem pomiaru kinetyki za pomocą automatycznego podajnika próbek i edytora stołu roboczego (Rysunek 3A i rysunek uzupełniający 2). Wielokrotne wstrzyknięcia są zautomatyzowane dla serii CVN2L0, V2 i V5 w różnych stężeniach w zakresie nanomolowym i μ-molowym w systemie w czasie (Rysunek 3B-D). Korelując liczbę nienaruszonych wiązań Cys-Cys, CVN2L0 wiąże unieruchomiony HA przyK D = 255 nM po osiągnięciu dobrego nasycenia. W tym przypadku obie wartości KD, obliczone albo na podstawie danych kinetycznych, albo przez dopasowanie danych równowagi do izotermy wiązania Langmuira, są umiarkowanie zgodne (Tabela 1 i Dodatkowa Rysunek 3, Rysunek uzupełniający 4).

Rysunek 3: Test wiązania SPR dla wiązania ligandów poprzez oddziaływania wielowartościowe. CVN2 (WT) i warianty miejsca wiązania V2 i V5 z substytucjami dwusiarczkowymi w kieszeni wiążącej węglowodany o wysokim powinowactwie są testowane pod kątem wiązania kowalencyjnie unieruchomionego HA. (A) Krzywe wiązania lewej i prawej komórki przepływowej CVN2, V2 i V5 można wyodrębnić z protokołu uruchamiania SPR, a sensorgramy są podsumowywane w nakładce. (B) Sensorgram z konwencjonalnego eksperymentu SPR pokazany jako analiza kinetyczna wiązania CVN2L0 z HA, wstrzykiwanie stężeń analitu od 10-4 do 10-8 M. CVN2L0 mierzy się do najwyższego stężenia przy 1,5 μM (górna linia) i do 500 nM (dolna linia), dla których nie osiąga się nasycenia na powierzchni chipa ani wiązania równowagowego. RU = jednostki odpowiedzi. Używany jest CMD500D chip czujnika. (C) Sensorgram SPR dla wiązania V2 z HA. (D) Wiązanie V5 z HA. Rysunek (B-D) jest reprodukowany za zgodą reference10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Powinowactwo wiązania CVN2 i wariantów do HA mierzone za pomocą SPR. Scrubber 2.0 (oprogramowanie BioLogic) jest wykorzystywany do dopasowywania krzywych asocjacji i dysocjacji SPR w czasie rzeczywistym oraz do obliczania stałych dysocjacji równowagi (KD) na podstawie danych kinetycznych i równowagowych. Ka = stała współczynnika asocjacji. Kd = stała szybkości dysocjacji.

Podczas gdy wartości KD dla wiązania CVN2L0 i V2 z HA mieszczą się w zakresie nanomolowym, V5 jest zmniejszone w wiązaniu (Tabela 1). W V5 dwa wiązania dwusiarczkowe są zastępowane resztami parowania jonów, które przekwalifikowują potencjalne interakcje jonowe między zmutowanymi resztami Glu i Arg (Rysunek 2A,3D). Dane pierwotne są analizowane zgodnie ze zintegrowanymi równaniami szybkości asocjacji i szybkości dysocjacji, które opisują kinetykę wiązania oddziaływania rozpuszczalnego CV-N z unieruchomionym ligandem oraz dysocjację utworzonego kompleksu z powierzchni chipa. Wykonywane są dwa niezależne pomiary i analizowane są sensorgramy równoważne z tymi uzyskanymi z powtórzeń. KD oblicza się jako iloraz koff/kon (Tabela uzupełniająca 1)10,35. Jednak KD jest powiązane z danymi równowagi, które pasują do wiązania Langmuira isotherm36, gdzie równowagowa odpowiedź wiązania jest wykreślana jako funkcja stężenia analitu (rysunek uzupełniający 3A,4A,3B,4B). W sposób zależny od stężenia, stała szybkości dysocjacji kd jest określana po analizach i włączana do dopasowania fazy asocjacyjnej (kon) w celu oszacowania stałej szybkości asocjacji ka. (Tabela 1, Rysunek uzupełniający 3C, Rysunek uzupełniający 4C).

Następnie, wiązanie CV-N z HA jest porównywane z jego interakcją z RBD. Wiązanie CV-N WT z RBD SARS-CoV-2 mierzy się przy słabszym powinowactwie (KD = 260 μM, Rysunek 4A) w porównaniu z wiązaniem z HA (KD = 5,7 nM) 8,10,12 i wiązanie z białkiem S (KD = 18,6 μM, Rysunek 5). Stężenie w stosunku do odpowiedzi jest wykreślane dla wiązania CV-N WT z RBD, przy założeniu specyficznego ukierunkowania na możliwie konserwatywne węglowodany na podjednostce RBD S1 (Figura 4A). Ten sam wykres powinowactwa pokazano dla wiązania CVN2L0-V4 z DM, którego nie można już analizować z powodu zastąpienia wiązań dwusiarczkowych, które zakłócają wiązanie o wysokim powinowactwie do małych peptydów glikozylowanych (Figura 4B).

CVN2L0-V4 (2 wiązania dwusiarczkowe przeciwne do niesymetrycznego zastąpienia reszt cysteiny przez reszty Glu-Arg lub amfipatyczne aminokwasy Trp i Met) mogą tworzyć niepolarne sieci wiązań wodorowych wokół pseudo-domeny B miejsca wiązania węglowodanów10. Większa gęstość glikanów na białku HA osiąga wiązanie z polarnymi resztami Glu-Arg zamiast cystyn (tabela uzupełniająca 1) oraz związek z mannozylowanymi peptydami (KD = 10 μM dla DM) między CVN2L0 a modyfikacjami do Glu-Arg, ale wykazuje nieciągłą dysocjację wariantów tego monoglikozylowanego peptydu, w szczególności, gdy H jest modyfikowany na obu monomerach. W przypadku interakcji między CVN2L0-V4 a DM, odpowiedź 56 μM wstrzyknięcia CVN2L0-V4 daje wyższą odpowiedź niż Rmax. (Rysunek 4B). V5 (2x Glu-Arg) nie udaje się w dysocjacji od DM związanego z powierzchnią (dane nie pokazane). Podsumowując, krzywe odpowiedzi o niższych stężeniach zmniejszają się przed zakończeniem wstrzykiwania dla wszystkich sensorgramów na CVN2 wiążących się z peptydem bez natywnego wiązania H i monomeru z RBD.

Rysunek 4: Analizy SPR wiązania monomeru (A) CV-N WT z RBD. KD oblicza się przez dopasowanie danych kinetycznych (lewa strona, KD = 260 μM) i porównuje z danymi powinowactwa (prawa strona) przy użyciu prostego modelu biomolekularnego dla wiązania 1:1 między ligandem a analitem (K D equil = 274 μM). Równowagowa odpowiedź wiązania lub zdolność wiązania jest wykreślana jako funkcja stężenia w porównaniu z krzywymi wiązania SPR (0-605 μM CVN). H = miejsce wiązania o wysokim powinowactwie. L = miejsce wiązania o niskim powinowactwie. Oba znajdują się na CV-N i CVN2L0. (B) Dimeryczne wiązanie CVN2L0-V4 z DM, przy założeniu 2L bez analizowanego KD. Stężenia CVN2L0-V4 wynoszą 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3,5 μM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Zmutowane CVN-E41A i CV-N WT wiążą się z glikoproteiną (A) S. Strzałki wskazują początek fazy asocjacji i dysocjacji. (B) CVN-E41A wiążący się z RBD na SARS-CoV-2. Ligandy są wstępnie unieruchomione na polikarboksylanu HC i CMD500D chipach czujników. Podjednostka Covid-19 S1 [Pinto, D. i wsp.26; oraz Barnes, C. et al.37] służy do unieruchomienia RBD. Przepływ: 30 μl/min, 25 °C; Wykreślone nieprzetworzone dane. Dla porównania, przedstawiono wiązanie przeciwciał w surowicy ludzkiej krwi z RBD ze współczynnikiem rozcieńczenia 1:200. (C) Test SPR wiązania CV-N WT z glikoproteiną S, która jest unieruchomiona do poziomu odpowiedzi 400 μRIU w celu wychwycenia CV-N. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykazano wcześniej, że monomeryczny CV-N z pojedynczym L nie może wystarczająco związać gp120, ale zdolność neutralizacji CV-N wymaga sieciowania dwóch miejsc wiążących węglowodany i jest głównie przywracana przez dimeryzację do funkcjonalizacji za pomocą 2H12,19. W związku z tym ulega ekspresji monomeryczny mutant CVN-E41A, który podejrzewa się o destabilizację pseudo-domeny B lub może przerywać łączność z drugą domeną A, taką jak znajdująca się w CV-N WT. MONOMER CVN-E41A wykazuje stabilność po związaniu się z białkiem S podobnym do monomeru CV-N. Chociaż odpowiedź SPR dla stężeń analitu 605-680 μM skutkuje jednostkami wysokiej odpowiedzi i typowymi sensorgramami SPR odpowiednio dla wiązania CV-N WT i E41A, mutant jest niestabilny po rozcieńczeniu (Rysunek 5).

Rysunek uzupełniający 1: Sensorgram SPR do wychwytywania mimikry DM jako części grypy HA top. Zrzut ekranu: Wykres danych SPR pokazujący protokół uruchamiania SPR do immobilizacji DM na chipie czujnika SPR CMD500D, który jest pokryty hydrożelem karboksymetylodekstranowym o długości 500 nm i nadaje się do analiz kinetycznych analitów o niskiej masie cząsteczkowej na dużej gęstości ligandów. Chipy czujników są montowane bezpośrednio na detektorze za pomocą oleju emersyjnego i mocowane pod trzyportową komorą przepływową. Po schłodzeniu aktywowanej powierzchni chipa 1 M etanoloaminą HCl pH 8,5, CVN2 jest wstrzykiwany dwukrotnie (stężenie = odpowiednio 1 μM i 2 μM). Fioletowy: różnica między komórką przepływu 1 a komórką przepływu 2; odpowiedź jest rejestrowana w odstępie 0,2 s. Niebieski: Komórka przepływowa 1: 3000-4000 jednostek mikroindeksu załamania światła (μRIU) pokrytych roztworem liganda DM o stężeniu 400 nM na aktywowaną powierzchnię karboksylowaną. Czerwony: Referencyjna komórka przepływowa 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Ręczne uruchamianie na chipie czujnika CMD500D z funkcją HA, pokazujące wiązanie dimerycznych CVN2L0-V5, V2 i CVN2L0. Przy natężeniach przepływu infuzji od 30-50 μl/min, CVN2L0 i warianty wiązań dwusiarczkowych wyrażone znacznikiem His i oczyszczone przez Ni-NTA są wstrzykiwane w średnim zakresie μM i badane pod kątem wiązania z HA w fazie asocjacji trwającej 3 minuty i fazie dysocjacji trwającej 2 minuty. Wstrzyknięcia to V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 subklonowane z białka fuzyjnego SUMO (1 μM) i CVN2L0 (2 μM). We wszystkich eksperymentach w temperaturze 25 °C stosuje się bufor biegowy o pH fizjologicznym. Wszystkie roztwory są odgazowywane i filtrowane (0,2 μm) przed wstrzyknięciem do układu. Fioletowy: różnica między komórką przepływu 1 a komórką przepływu 2; odpowiedź jest rejestrowana w odstępie 0,2 sekundy. Niebieski: Komórka przepływowa 1: 2540 μRIU HA. Czerwony: Referencyjna komórka przepływowa 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Wiązanie CVN2 z HA. Analizy sensorgramów, gdy krzywe są automatycznie wyrównywane. (A) Sensorgramy wyzerowane i wyrównane za pomocą oprogramowania Scrubber (po lewej) i izotermy wiążącej pokazujące krzywą odpowiedzi zależną od stężenia na związane anality (po prawej). (B) Izoterma wiążąca wyrażona w procentach pojemności. (C) Obliczeniowo dopasowane teoretyczne krzywe asocjacji i dysocjacji. (D) Dane kinetyczne na sensorgramach SPR bez dopasowanych krzywych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Powiązanie CVN2 z HA. Analizy sensorgramów przy ręcznym wyrównywaniu krzywych. (A) Sensorgramy wyzerowane i wyrównane za pomocą oprogramowania Scrubber (po lewej) i izotermy wiążącej pokazujące krzywą odpowiedzi zależną od stężenia na związane anality (po prawej). (B) Izoterma wiążąca wyrażona w procentach pojemności. (C) Obliczeniowo dopasowane teoretyczne krzywe asocjacji i dysocjacji. (D) Dane kinetyczne na sensorgramach SPR bez dopasowanych krzywych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Dane kinetyczne uzyskane z sensorgramów SPR dla wiązania CVN2L0 i wariantów wiązania Cys-Cys V2, V4 i V5 z HA przy użyciu modelu wiązania Langmuir 1:1. KD [M] = kwył./kwłączony lub kd/ka. Wszystkie dane są generowane w temperaturze 25 °C w buforze HBS-EP(+): Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Autor nie ma nic do zdradzienia.