Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63543

⸱

4 listopada 2022

 ,  ,  , 
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Streszczenie

Warstwa nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) leży bezpośrednio za fotoreceptorami i skrywa złożony system metaboliczny, który odgrywa kilka kluczowych ról w utrzymaniu funkcji fotoreceptorów. W związku z tym struktura i funkcja RPE są niezbędne do utrzymania prawidłowego widzenia. Niniejszy manuskrypt przedstawia ustalony protokół pierwotnej izolacji mysich komórek RPE. Izolacja RPE jest doskonałym narzędziem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw patologii RPE w różnych mysich modelach zaburzeń oczu. Co więcej, izolacja RPE może pomóc w porównaniu pierwotnych mysich komórek RPE wyizolowanych od myszy typu dzikiego i zmodyfikowanych genetycznie, a także w testowaniu leków, które mogą przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń widzenia. W manuskrypcie przedstawiono krok po kroku protokół izolacji RPE; Cała procedura, od enukleacji do wysiewu, trwa około 4 godzin. Pożywki nie należy zmieniać przez 5-7 dni po wysianiu, aby umożliwić wzrost izolowanych komórek bez zakłóceń. Po tym procesie następuje charakterystyka morfologii, pigmentacji i specyficznych markerów w komórkach za pomocą immunofluorescencji. Komórki mogą być pasażowane maksymalnie trzy lub cztery razy.

Wprowadzenie

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) znajdują się między naczyniówką a siatkówką nerwową, tworząc prostą monowarstwę komórek prostopadłościennych, która znajduje się za komórkami fotoreceptorów (PR)1. RPE odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowego środowiska dla komórek PR, głównie poprzez zmniejszenie nadmiernej akumulacji reaktywnych form tlenu (ROS) i wynikającego z tego uszkodzenia oksydacyjnego1. Komórki RPE nadzorują wiele funkcji, takich jak konwersja i magazynowanie retinoidów, absorpcja rozproszonego światła, transport płynów i jonów oraz fagocytoza błony zewnętrznego segmentu PR zrzucanej PR2, 3. Zmiany w RPE (morfologii/funkcji) mogą upośledzać ich funkcję, prowadząc do retinopatii, co jest wspólną cechą wielu zaburzeń oczu4. Wiele chorób oczu jest związanych ze zmianami w morfologii i funkcji komórek RPE, w tym niektóre choroby genetyczne, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, wrodzona ślepota Lebera i albinizm4,5,6, a także zaburzenia oczu związane z wiekiem, takie jak retinopatia cukrzycowa (DR) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD)7,8. Komórki ludzkie są najbardziej pożądane, dlatego idealnym rozwiązaniem byłoby badanie zaburzeń RPE w pierwotnych ludzkich komórkach RPE do tworzenia monowarstw RPE. Jednak kwestie etyczne i ograniczona dostępność ludzkich dawców wynikająca z faktu, że większość tych zaburzeń prowadzi do zachorowalności9, ale niekoniecznie śmiertelności10, uniemożliwiają tym samym izolację pierwotnych ludzkich komórek RPE. To sprawia, że hodowla komórek RPE od dawców zwierząt innych niż ludzie jest preferowaną alternatywą. Gryzonie, szczególnie myszy, są uważane za świetny model do badania różnych chorób oczu, ponieważ technologia transgeniczna jest szerzej rozpowszechniona u tych gatunków11. Mimo że stosowanie hodowanych pierwotnych komórek RPE ma wiele zalet, trudno było utrzymać rosnące komórki przez wiele pasaży lub przechowywać i ponownie wykorzystywać komórki. Głównym ograniczeniem tego protokołu jest wiek myszy; myszy, które są używane do izolacji RPE, powinny być w bardzo młodym wieku (optymalnie 18-21 dni), ponieważ hodowla komórek RPE od dorosłych myszy była trudna11,12,13. Komórki RPE można wyizolować z oczu myszy w każdym wieku, jednak do czterech przejść komórkowych udało się tylko u młodych myszy (18-21 dni). Izolację RPE z siatkówek myszy, przy użyciu zarówno myszy C57BL6, jak i myszy transgenicznych z delecją receptorów N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR) w komórkach RPE, przeprowadzono w celu zbadania wpływu podwyższonego poziomu homocysteiny aminokwasowej na rozwój i progresję AMD14. Ponadto, wyizolowane pierwotne komórki RPE pomogły w zaproponowaniu celu terapeutycznego dla AMD poprzez hamowanie NMDAR w komórkach RPE14. Istnieją pewne blokery NMDAR, które są zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) i są obecnie stosowane w leczeniu umiarkowanego do ciężkiego splątania (demencji) związanego z chorobą Alzheimera (AD), takich jak memantine16, które mogą być potencjalnym celem terapeutycznym dla AMD14. Ponadto wyizolowane pierwotne mysie komórki RPE wykorzystano do wykrywania markerów stanu zapalnego i zaproponowanej indukcji stanu zapalnego jako mechanizmu leżącego u podstaw cech AMD i AD wywołanych homocysteiną przy użyciu genetycznie zmodyfikowanej myszy (CBS), która wykazuje wysoki poziom homocysteiny16,17.

Ten protokół został użyty do izolacji komórek RPE zarówno od myszy C57BL/6 typu dzikiego, jak i myszy transgenicznych, opracowanych w naszym laboratorium jako uproszczona adaptacja innych opublikowanych protokołów izolacji13,18,19 w celu osiągnięcia łatwego do zastosowania i niezawodnego protokołu. W tym protokole nie ma preferencji seksualnych. Podczas gdy wiek myszy ma kluczowe znaczenie dla procesu izolacji, młode, starsze myszy (18-21 dni) i starsze myszy w każdym wieku (do 12 miesięcy) zostały wykorzystane do izolacji RPE. Zauważyliśmy jednak, że komórki RPE wyizolowane od młodych myszy żyły dłużej i można było wykonać do czterech pasaży. Komórki RPE wyizolowane od starszych myszy mogą być pasażowane raz lub dwa razy, po czym przestają rosnąć w normalnym tempie i zmieniają swój kształt na bardziej wydłużone (komórki podobne do fibroblastów). Zaobserwowano również utratę pigmentacji i zmniejszoną przyczepność do płytki hodowli tkankowej, a następnie oderwanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zwierzęta zostały użyte zgodnie z wytycznymi protokołu IACUC dla zwierząt Uniwersytetu w Oakland numer 21063 oraz wytycznymi Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj kompletną pożywkę do hodowli komórek RPE, uzupełniając zmodyfikowaną mieszankę pożywki Eagle / składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco z 25% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1,5% penicyliny/streptomycyny i 0,02% gentamycyny.
  2. Przygotuj enzym A, uzupełniając 741 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) ze 127 μl roztworu podstawowego kolagenazy i 132 μl roztworu podstawowego hialuronidazy. Daje to końcową objętość 1 ml, która może leczyć czworo oczu.
    1. Przygotować roztwór podstawowy kolagenazy, rozpuszczając 1 mg kolagenazy z Clostridium histolyticum w 41 ml HBSS (19,5 jednostki/ml).
    2. Przygotować roztwór podstawowy hialuronidazy, rozpuszczając 1 mg hialuronidazy z jąder bydła w 18,4 ml HBSS (38 jednostek/ml).
  3. Przygotuj enzym B, dodając dwie części 0,25% trypsyny-EDTA do trzech części HBSS. Należy pamiętać, że całkowita objętość zależy od liczby wypreparowanych oczu; 1 ml enzymu B można stosować w leczeniu czworga oczu.

2. Wyłuszczenie

  1. Etycznie poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenkiem węgla (CO2) zgodnie ze standardami IACUC21.
    1. Krótko mówiąc, umieść zwierzę (zwierzęta) w komorze CO2 w celu wprowadzenia 100% CO2 z szybkością napełniania 30%-70% objętości komory na minutęCO2, aby uzyskać utratę przytomności w ciągu 2 do 3 minut, przy minimalnym stresie myszy.
    2. Potwierdź śmierć (brak oddychania i wyblakły kolor oczu), a następnie przenieś mysz z klatki do czystego, wysterylizowanego obszaru chirurgicznego (wyszorowanego alkoholem) wyposażonego w wysterylizowany sprzęt chirurgiczny.
  2. Umieść mysz na sterylnym podkładzie.
  3. Wyłuszczenie oczu poprzez naciśnięcie pęsety w stylu 5/45 w obszarze oczodołu, aby wywołać wytrzeszcz, a następnie przesunięcie pęsety do tylnej części oka. Wyciągnij oczy z nienaruszonym nerwem wzrokowym, delikatnie wyciągając oczy z jamy oczodołu.
  4. Za pomocą kleszczy zanurz oczy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml 5% jodu powidonu. Inkubuj oczy w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.
  5. Wyjmij oczy z roztworu jodu powidonu i umieść je na szalce Petriego. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przemyj oczy HBSS, aż zniknie pomarańczowy kolor jodu powidonu. Zajmuje to około dwóch lub trzech prań.
  6. Umieścić oczy na nowej szalce Petriego o średnicy 60 mm i zanurzyć je w zimnej (2-8 °C) kompletnej pożywce do hodowli komórek RPE przygotowanej w kroku 1.1.

3. Sekcja

  1. Pod mikroskopem chirurgicznym użyj pęsety typu M5S i nożyczek Vannas, aby usunąć tkankę łączną i mięśnie zewnątrzgałkowe.
    UWAGA: Sekcja odbywa się pod kapturem na chusteczki w całkowicie sterylnym środowisku. Jednak dla celów wideo mikroskop preparacyjny został umieszczony na zewnątrz maski, aby uzyskać wyższą jakość demonstracji/filmowania. Umieszczenie małego kawałka niestrzępiącej się bibuły pod okiem poprawia stabilność podczas sekcji. Oczy można następnie tymczasowo (nie dłużej niż 1 godzinę) zatrzymać w zimnej pożywce do hodowli komórek RPE. Jednak lepiej jest przejść bezpośrednio do następnego kroku natychmiast po oczyszczeniu oczu.
  2. Przenieść oczy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml roztworu enzymu A na każde cztery oczy. Następnie inkubować oczy w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
  3. Wyjmij oczy z inkubatora i probówki do mikrowirówki. Następnie przenieś je do nowej probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml roztworu enzymu B na każde cztery oczy. Inkubować probówkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 50 minut.
  4. Umieść oczy w nowym naczyniu do hodowli zawiesiny o średnicy 60 mm zawierającym 10 ml kompletnej pożywki do wzrostu komórek RPE. Następnie inkubować oczy w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  5. Umieść naczynie pod mikroskopem chirurgicznym i rozpocznij preparację.
  6. Usuń przednią część oka (rogówkę, tęczówkę i soczewkę) z tylnej części muszli ocznej (tylnej siatkówki).
    1. Chwyć oko kleszczami w stylu M5S i wykonaj nacięcie w sekcji ora serrata (najbardziej przednia część siatkówki, gdzie kończy się jasnoniebieski) za pomocą ostrza #11 lub igły strzykawki.
    2. Chwyć wewnętrzną część nacięcia jedną parą kleszczy i chwyć rogówkę drugą parą kleszczy. Zacznij powoli ciągnąć lub odrywać rogówkę od siatkówki. Pamiętaj, aby rozdzierać w małych odstępach i przesuwać się w dół rozdarcia podczas usuwania rogówki, aby upewnić się, że RPE pozostaje w większości nienaruszona i skutkuje czystszym rozdarciem.
      UWAGA: Po całkowitym odłączeniu rogówki można zobaczyć tęczówkę i soczewkę.
    3. Oddziel rogówkę i tęczówkę.
  7. Oddziel soczewkę od muszli ocznej, delikatnie uciskając tylną połowę oka.
  8. Aby usunąć siatkówkę nerwową z warstwy RPE, chwyć zewnętrzną warstwę muszli ocznej jedną parą pęsety i umieść ramię drugiej pary pęsety między RPE a warstwami nerwowymi. Stamtąd delikatnie pociągnij lub zgarnij siatkówkę nerwową z warstwy RPE. Wyrzuć siatkówkę nerwową.
    UWAGA: Na filmie siatkówka nerwowa i soczewka są usunięte razem. Jednak dla początkujących łatwiej będzie usunąć każdy z osobna. To, co pozostaje, to RPE, naczyniówka i twardówka.
  9. Wyrzuć rogówkę, tęczówkę, soczewkę i siatkówkę nerwową. Przenieś pozostałą muszlę oczną w nowe miejsce na naczyniu, wolne od zanieczyszczeń.
  10. Aby oddzielić RPE od naczyniówki i twardówki, delikatnie zeskrob wnętrze muszli ocznej pęsetą typu 5/45, aby zapewnić oddzielenie komórek RPE. Komórki RPE wydają się mętne, gdy są zawieszone w kompletnym pożywce do wzrostu komórek RPE.
  11. Odessać komórki za pomocą sterylnej pipety transferowej o pojemności 3,2 ml i przenieść do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej kompletną pożywkę do wzrostu komórek RPE.

4. Wirowanie

  1. Umieścić probówkę wirówkową o pojemności 15 ml zawierającą pierwotne komórki RPE w wirówce i odwirować komórki o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad z 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej RPE. Kompletna pożywka wzrostowa RPE jest bardziej specyficzna dla wzrostu RPE niż inne komórki zanieczyszczające, takie jak komórki Müllera lub komórki śródbłonka naczyniówki. Komórki Müllera wymagają pożywki o wysokiej zawartości glukozy, podczas gdy komórki śródbłonka naczyniówki wymagają specyficznych czynników wzrostu. Zmieniając pożywkę i pasażując hodowlę, tylko komórki RPE będą nadal rosły.

5. Hodowla komórkowa

  1. Umieść zawieszone pierwotne komórki RPE na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm i przenieś je do inkubatora (po sprawdzeniu czystości przez barwienie komórek specyficznymi markerami komórek RPE/Müllera, jak wskazano w Rysunek 1E-N). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Użyte znaczniki są wymienione w Tabeli Materiałów. Ten krok jest wykonywany po ustaleniu kultury.
  2. Inkubuj komórki przez około 5 dni, aby rosły. W tym czasie nie należy zmieniać pożywki, naruszać komórek ani przesuwać płytki do hodowli komórkowej (jest to krytyczny krok w protokole; po izolacji komórki powinny być inkubowane i nie być zakłócane przez 5 dni).
    UWAGA: Liczba komórek zależy od liczby oczu użytych do izolacji. Większa liczba odizolowanych oczu da większą liczbę komórek. Izolacja RPE z dwojga oczu pozwoli uzyskać ~ 440 000-880 000 komórek, czyli 5%-10% 100 mm szalki Petriego, która może pomieścić 8,8 miliona komórek.

6. Przejście

  1. Odessać podłoże i przemyć 2 ml PBS. Następnie odessać PBS.
  2. Dodaj 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA (1x) lub tyle, aby pokryć dno potrawy. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodaj 8 ml wstępnie podgrzanej pożywki RPE lub dwukrotność objętości trypsyny użytej w kroku 6.2. Następnie zbierz komórki i umieść je w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
  4. Wirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki do hodowli komórek RPE. Umieść całą zawiesinę na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm.
    UWAGA: Komórki mogą być przechodzić do czterech lub pięciu razy18. Jednak najbardziej spójne wyniki eksperymentu znajdują się po dwóch lub trzech przejściach. Po dwóch, czterech przejściach komórki zmieniły swój kształt (jak pokazano na Rysunek 1D) na bardziej wydłużone, zgromadziły się na środku płytki, przestały rosnąć i oderwały się.
  5. Użyj protokołów immunofluorescencyjnych, zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami8,14,15,16, aby zabarwić i zweryfikować swoistość RPE.

7. Immunofluorescencja

UWAGA: Immunofluorescencję przeprowadzono zgodnie z poprzednio opublikowanymi metodami8,14,15,16,17,18 w celu zabarwienia i sprawdzenia specyfiki RPE. Barwienie pierwotnych komórek RPE było zwykle wykonywane w przejściach P1 i P2. W tym miejscu przedstawiono krótki przegląd protokołu immunofluorescencyjnego.

  1. Zasiać komórki na szkiełku w komorze do hodowli komórek (30 000 komórek na studzienkę dla szkiełka z 8 dołkami).
  2. Hodować komórki w kompletnych pożywkach do hodowli komórek RPE w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24–48 godzin.
  3. Gdy komórki zlewają się w 80%-90%, odessać pożywkę i umyć szkiełko komory 1x PBS.
  4. Przymocuj szkiełko 4% paraformaldehydem na 10-15 minut.
  5. Odessać 4% paraformaldehydu, a następnie zablokować roztworem blokującym (patrz Tabela materiałów).
  6. Odessać roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe, RPE65, i inkubować przez trzy godziny w temperaturze 37 °C (przy stężeniu przeciwciała w zakresie 1:200-1:250 w buforze blokującym, w objętości 150-200 μl/szkiełko). Następnie umyj trzykrotnie PBS/TX-100 (5-10 min każde pranie).
  7. Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i dodać przeciwciało drugorzędowe (o stężeniu przeciwciał 1:1,000 w buforze blokującym, w objętości 150-200 μl/szkiełko). Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C.
  8. Odessać przeciwciało wtórne. Umyj trzy razy PBS/Trtion X-100 (5-10 min każde pranie).
  9. Dodaj kroplę podłoża montażowego DAPI, aby oznaczyć jądra i umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Upewnij się, że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza.
  10. Następnie należy wykonać zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, w towarzystwie kamery mikroskopu o wysokiej rozdzielczości (HRM) i oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja specyficzności, czystości oraz funkcji i formowania bariery przez izolowane komórki RPE
Izolowane komórki zbadano pod mikroskopem świetlnym w celu weryfikacji ich żywotności, morfologii i pigmentacji. Wykonano zdjęcia z P0 i P1 (Rysunek 1A,B) oraz zdjęcia z P0 i P4 (Rysunek 1C,D), aby przedstawić zmiany w kształcie, wielkości i pigmentacji komórek wraz z kolejnymi pasażami aż do czwartego pasażu (czarne strzałki wsk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół jest zgłoszoną, zmodyfikowaną i uproszczoną szczegółową procedurą izolacji RPE od oczu myszy. Protokół obejmuje enukleację, preparację, zbieranie, wysiewanie, hodowlę i charakterystykę komórek RPE wyizolowanych z oczu myszy.

Istnieją pewne ograniczenia i krytyczne kroki, które muszą być spełnione, aby pomyślnie wyizolować RPE, takie jak wiek myszy, liczba wypreparowanych oczu, rozmiar płytki lub szalki do hodowli tkankowej oraz ostrzeżenia po wysiewie, przechowywaniu i pasażowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do dyspozycji oświadczeń o konflikcie interesów, które miałyby związek z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Eye Institute (NEI) i National Eye Institute (NEI) fund R01 EY029751-04. Chcielibyśmy podziękować dr Pameli Martin za jej pomoc w początkowych etapach izolacji RPE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka: 100 mlKIMAX14000
Kolagenaza z Clostridium histolyticum Sigma-AldrichC7657-25MGDo enzymu roboczego,
jednorazowe pipety do przenoszenia z podziałką: 3,2 ml Sterylne13-711-20
DMEM / F12  Gibco 11330Pożywki do hodowli komórek RPE 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)gibco26140079Do kompletnych pożywek do hodowli komórek RPE
Roztwór odczynnika gentamycynygibco15750-060Do kompletnych pożywek do hodowli komórek RPE
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo Scientific88284Do enzymów roboczych (A& B) 
Inkubator CO2 Heracell VISO 160iThermo Scientific50144906
Hialuronidaza z jąder bydlęcychSigma-AldrichH3506-500MGDo pracy enzymu A
KimwipesKimberly-Clark34155
Strzykawka Luer-Lok z dołączoną igłą 21 G x 1 1/2 cala, sterylna, jednorazowego użytku, 3 mlB-D309577
Mikrowirówka Probówka: 2 mlGrainger11L819
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-RPE65 Abcam, Cambridge, MA, USAab78036Do barwienia IF 
DługopisStrep gibco15140-122Do kompletnych pożywek do hodowli komórek RPE
Pęseta o pozytywnym działaniu, styl 5/45Nożyczki Dumont72703-DZ
Iris Standard Prosta 11,5 cmGARANA INDUSTRIES2595
Wirówka Sorvall St8ThermoScientific75007200
Stemi 305 MikroskopZeissn/a
Ostrze chirurgiczne, #11, stal nierdzewnaBard-Parker371211
Zawieszenie Naczynie do hodowli bakterii 60mm x 15mm Styl Corning430589
Naczynie do kultur tkankowych: 100x20mm w styluCorning353003
Tornado Probówki: 15mLMidsciC15B
Probówki Tornado: 50mLMidsciC50R
Trypsyna EDTA (1x) 0,25% gibco2186962Do pracy z enzymem B
Pęseta 5MS, 8.2cm, prosta, 0.09x0.05mm KońcówkiPęseta Dumont501764
Positive Action Style 5, biologiczna, Dumostar, polerowane wykończenie, 110 mmMikroskopia elektronowa OAL Sciences Dumont50-241-57
Podkładki, umiarkowane: 23" X 36"McKesson4033
Vannas Nożyczki sprężynowe Vannas - 2.5mm NajnowocześniejszyFST15000-08
Zeiss AxioImager Z2Zeissn/a
Zeiss Zen Blue 2.6Zeissbrak danych

Bibliografia

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356(2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393(2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259(2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119(2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).

Tagi

Izolacja kom rek RPEkom rki RPE myszyizolacja pierwotnych kom rekmodele chor b oczubarwienie immunofluorescencyjnemarker RPE65barwienie F aktynyusuwanie siatk wki neuronalnejpo ywki do hodowli kom rkowych
Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.