Artykuł metodologiczny

Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

DOI:

10.3791/63547

⸱

21 kwietnia 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroniczne obrazowanie rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana to nowa platforma do wysoce multipleksowanego obrazowania białek opartych na epitopach. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny przewodnik obejmujący przygotowanie przeciwciał, barwienie próbki tkanki, montaż mikroskopu SRS i obrazowanie tkanek epr-SRS.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja szerokiego zakresu specyficznych biomarkerów w tkankach odgrywa istotną rolę w badaniu skomplikowanych organizacji złożonych systemów biologicznych. W związku z tym coraz bardziej doceniane są technologie obrazowania o wysokiej multipleksacji. W tym miejscu opisujemy wyłaniającą się platformę wysoce multipleksowanego obrazowania wibracyjnego specyficznych białek o porównywalnej czułości do standardowej immunofluorescencji za pomocą elektronicznego obrazowania rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana. Metoda ta omija limit kanałów rozwiązywalnych spektralnie w konwencjonalnej immunofluorescencji i zapewnia jednorazowe podejście optyczne do badania wielu markerów w tkankach o rozdzielczości subkomórkowej. Jest ogólnie kompatybilny ze standardowymi preparatami tkankowymi, w tym tkankami utrwalonymi paraformaldehydem, tkankami zamrożonymi i tkankami ludzkimi zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie. Przewidujemy, że platforma ta zapewni bardziej kompleksowy obraz interakcji białkowych w próbkach biologicznych, szczególnie w przypadku grubych, nienaruszonych tkanek. Protokół ten zapewnia przepływ pracy od przygotowania przeciwciał do barwienia próbki tkanki, do montażu mikroskopu SRS i obrazowania tkanek epr-SRS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożone systemy tkankowe składają się z odrębnych subpopulacji komórkowych, których lokalizacje przestrzenne i sieci interakcji są głęboko powiązane z ich funkcjami i dysfunkcjami1,2. Aby odkryć architekturę tkankową i zbadać jej złożoność, niezbędna jest wiedza na temat lokalizacji przestrzennej białek w rozdzielczości pojedynczej komórki. W związku z tym wysoce multipleksowane technologie obrazowania białek są coraz bardziej doceniane i mogą stać się kamieniem węgielnym w badaniach biologii tkanki3,4,5. Obecnie popularne metody obrazowania białek multipleksowanych można podzielić na dwie główne kategorie. Jednym z nich jest seryjne obrazowanie immunofluorescencyjne polegające na wielu rundach barwienia i obrazowania tkanek, a drugim jest obrazowanie cytometrii masowej sprzężonej z przeciwciałami oznaczonymi metalami ciężkimi6,7,8,9,10,11,12.

Tutaj wprowadzana jest alternatywna strategia obrazowania białek opartych na multipleksowanych przeciwciałach. W przeciwieństwie do powszechnej metody obrazowania fluorescencyjnego, która może wizualizować tylko 4-5 kanałów jednocześnie ze względu na szerokie widma wzbudzenia i emisji (pełna szerokość przy połowie maksimum (FWHM) ~500 cm-1), mikroskopia Ramana wykazuje znacznie węższą szerokość linii widmowej (FWHM ~10 cm-1), a zatem zapewnia skalowalną multipleksowość. Niedawno, dzięki wykorzystaniu wąskiego spektrum, opracowano nowatorski schemat mikroskopii Ramanowskiej o nazwie mikroskopia rozpraszania Ramana stymulowanego elektronicznym rezonansem (epr-SRS), zapewniając potężną strategię obrazowania multipleksowego13. Badając elektronicznie sprzężone tryby drgań barwników Ramana, epr-SRS osiąga drastyczny efekt 10-krotnego zwiększenia przekrojów ramanowskich i pokonuje wąskie gardło czułości konwencjonalnej mikroskopii Ramanowskiej (Rysunek 1A)13,14,15. W rezultacie, granica wykrywalności epr-SRS została przesunięta do sub-μM, co umożliwia ramanowską detekcję interesujących markerów molekularnych, takich jak specyficzne białka i organelle wewnątrz komórek13,16. W szczególności, wykorzystując przeciwciała sprzężone z barwnikiem Ramana, obrazowanie epr-SRS specyficznych białek w komórkach i tkankach (zwane immuno-eprSRS) wykazano z porównywalną czułością do standardowej immunofluorescencji (Rysunek 1B) 13,17. Dostrajając długość fali pompy tylko o 2 nm, sygnał epr-SRS będzie całkowicie wyłączony (Rysunek 1B), co pokazuje wysoki kontrast drgań.

Po stronie sondy, do koniugacji przeciwciał opracowano zestaw tęczowych sond Ramanowskich zwanych barwnikami rozpraszania Ramana na Manhattanie (MARS) do koniugacji przeciwciał13,18,19,20. Ta unikalna paleta Ramana składa się z nowych barwników zawierających π sprzężone wiązania potrójne (materiał uzupełniający), z których każdy wykazuje pojedynczy i wąski pik epr-SRS w bioortogonalnym zakresie widma Ramana (Rysunek 1C). Modyfikując strukturę chromoforu rdzenia i izotopowo edytując oba atomy wiązania potrójnego (materiał uzupełniający), opracowano spektralnie rozdzielone sondy Ramana. Wykorzystując skalowalną multipleksowość, mikroskopia epr-SRS w połączeniu z paletą barwników MARS oferuje optyczną strategię jednorazowego obrazowania białek multipleksowych w komórkach i tkankach.

Immuno-eprSRS stanowi alternatywną strategię dla obecnych metod obrazowania białek multipleksowych o unikalnych mocnych stronach. W porównaniu z podejściami fluorescencyjnymi z cyklicznym barwieniem, obrazowaniem i usuwaniem sygnału, ta platforma oparta na Ramanie zapewnia barwienie i obrazowanie w jednej rundzie. W związku z tym omija praktyczną złożoność procedur cyklicznych i znacznie upraszcza protokół, otwierając w ten sposób nowe terytoria multipleksowanego obrazowania białek. Na przykład, wykorzystując protokół oczyszczania tkanek dostosowany do barwnika Raman, immuno-eprSRS został rozszerzony do trzech wymiarów w celu wysoce multipleksowanego mapowania białek w grubych, nienaruszonych tkankach17. Zwizualizowano ponad 10 celów białkowych wzdłuż tkanki mózgowej myszy o grubości milimetra17. Niedawno, łącząc immuno-eprSRS ze zoptymalizowanym protokołem mikroskopii ekspansji retencji biomolekuł (ExM)21, zademonstrowano również jednostrzałowe obrazowanie wielu celów w nanoskali22. W porównaniu do obrazowania spektroskopii mas4,9, epr-SRS jest nieniszczący i ma naturalną zdolność do cięcia optycznego. Co więcej, epr-SRS jest bardziej efektywny czasowo w skanowaniu tkanek. Zazwyczaj obszar tkanki o wielkości 0,25mm2 i rozmiarze piksela 0,5 μm potrzebuje zaledwie kilku minut, aby zobrazować pojedynczy kanał epr-SRS. Na przykład całkowity czas obrazowania czterech kanałów SRS plus czterech kanałów fluorescencyjnych w Rysunek 4 wynosi około 10 minut.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został przeprowadzony zgodnie z protokołem eksperymentalnym na zwierzętach (AC-AABD1552) zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Columbia.

1. Przygotowanie przeciwciał sprzężonych z barwnikiem Ramana

  1. Przygotować bufor koniugacyjny jako ~0,1 MNaHCO3 w buforze PBS, pH = 8,3, przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować roztwór sondy MARS (materiał uzupełniający) z funkcją N-hydroksysukcynimidy (NHS) z estrami w postaci 3 mM w bezwodnym DMSO. Synteza sond MARS może być odniesiona do wcześniejszych raportów13,17,18.
    UWAGA: Do celów przechowywania roztwór estru barwnika NHS należy chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Rozpuścić stałe przeciwciała w buforze koniugacyjnym do stężenia 2 mg/ml. W przypadku przeciwciał, które są rozpuszczone w innych, należy je wymienić na bufor koniugacyjny do stężenia 1-2 mg/ml z filtrami odśrodkowymi.
    UWAGA: Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciała drugorzędowe są preferowane do barwienia multipleksowego w celu zminimalizowania reaktywności międzygatunkowej. Zastosowane przeciwciała drugorzędowe są wymienione w Tabeli 1 i Tabeli Materiałów.
  4. Przeprowadź reakcję koniugacji.
    1. W przypadku przeciwciał drugorzędowych dodać 15-krotny molowy nadmiar roztworu barwnika do roztworu przeciwciała w szklanej fiolce powoli, mieszając. Na przykład w 0,5 ml roztworu przeciwciał 2 mg/ml dodaj 35 μl 3 mM roztworu barwnika.
    2. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze pokojowej (RT) mieszając przez 1 godzinę. Chronić reakcję przed światłem.
  5. oczyszczanie.
    1. Przygotować zawiesinę żelowej żywicy filtracyjnej (tabela materiałów) w buforze PBS, wykonując czynności 1.5.2-1.5.4.
    2. Dodaj 10 ml żelowej żywicy filtracyjnej w proszku do 40 ml buforu PBS w probówce o pojemności 50 ml.
    3. Roztwór należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 90 °C przez 1 godzinę.
    4. Zdekantować supernatant i ponownie dodać PBS do 40 ml. Przechowywać gnojowicę w temperaturze 4 °C.
    5. Kolumnę wykluczającą wielkość (średnica 1 cm, kolumny grawitacyjnie) należy wypełnić roztworem gnojowicy na wysokość 10-15 cm.
    6. Przepłukać i umyć kolumnę ~10 ml buforu PBS, aby dalej zapakować żywicę.
    7. Odpipetować mieszaninę z reakcji koniugacji (~0,5 ml) do kolumny. Natychmiast dodać 1 ml buforu PBS jako bufor elucyjny, gdy cała mieszanina reakcyjna jest załadowana. Stale uzupełniać bufor elucyjny (PBS) do kolumny.
    8. Zebrać eluat roztworu sprzężonego, patrząc na kolor na kolumnie (barwniki MARS mają barwy od jasnozielonego do niebieskiego) lub mierząc absorbancję przy 280 nm (A280).
  6. Zebrany roztwór stężyć do 1-2 mg/ml z filtrem odśrodkowym.
  7. Określić stężenie i średni stopień znakowania (DOL, stosunek barwnika do białka), mierząc widmo widzialne w ultrafiolecie (UV-Vis) roztworu sprzężonego za pomocą czytnika płytek Nano.
    UWAGA: Materiał uzupełniający zapewnia właściwości estrów NHS barwnika MARS do obliczeń. Prawidłowy DOL dla przeciwciała drugorzędowego wynosi około 3.

2. Przygotowanie próbki tkanki

  1. Paraformaldehyd utrwala tkanki mózgowe myszy.
    1. Znieczulenie myszy (C57BL/6J, samica, 25 dni po porodzie) izofluranem. Oceń prawidłowe znieczulenie za pomocą testu szczypania palców u stóp.
    2. Zabij myszy przez przemieszczenie szyjki macicy. Myszy należy natychmiast przeprowadzić transsercyjnie perfuzję z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS.
    3. Zbierz mózg myszy, wykonując kroki 2.1.4-2.1.5
    4. Przeciąć w górę od pnia mózgu wzdłuż szwu strzałkowego. Oderwij dwie połówki czaszki na bok i zgarnij mózg pęsetą.
    5. Utrwalić pobrany mózg w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Następnie przemyć mózg w buforze PBS w temperaturze 4 °C przez 24 godziny w celu usunięcia nadmiaru PFA.
    6. Umieścić stałą agarozę w wodzie do końcowego stężenia 7% (w/v) w zlewce z luźną pokrywką. Wymieszaj roztwór za pomocą szklanego pręta do mieszania. Podgrzej zawiesinę w kuchence mikrofalowej, aż roztwór będzie klarowny.
    7. Pozostawić agarozę do ostygnięcia do temperatury 45–55 °C.
    8. Wlej płynną agarozę do małej komory, a następnie przenieś mózg z PBS do płynnej agarozy i ustaw go za pomocą szpatułki, aby osadzić mózg. Poczekaj, aż blok tkankowo-agarozowy stwardnieje.
    9. Pokrój arozę tkankową na plastry koronalne o grubości 40 μm za pomocą wibratomu.
    10. Przenieś tkankę na płytkę 4-dołkową w celu następnego barwienia. Usuń agarozę pęsetą. Umyj chusteczkę trzykrotnie 1 ml PBS.
  2. Naprawiono zamrożone tkanki trzustki myszy.
    1. Utrwalić trzustkę myszy w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C z kołysaniem przez 16-20 godzin.
    2. Przemyć próbkę w 1 ml PBS (4 °C) trzy razy w celu usunięcia PFA.
    3. Osadź próbkę (o wielkości ~0,3-0,5 cm) w blokach złożonych o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Wlej 2 krople OCT do plastikowej krioformy. Umieść tkankę we właściwej orientacji i wylej OCT na chusteczki, aż żadna z tkanek nie pozostanie odsłonięta.
    4. Pokrój trzustkę na plastry o grubości 8 μm i unieruchomij je na szkiełku podstawowym do wiązania tkanek, przechowuj w temperaturze -80 °C.
    5. Przed barwieniem należy zrównoważyć próbkę z RT. Umyj tkankę PBS, aby usunąć bloki OCT.
  3. Próbki FFPE.
    1. Piec szkiełko bibułkowe FFPE w temperaturze 60 °C przez 10 minut.
    2. Deparafinizacja i ponowne nawodnienie: Umieścić próbki kolejno w następujących roztworach w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej przez 3 minuty za każdym razem, delikatnie wstrząsając:
      Ksylen dwa razy,
      etanol dwa razy,
      95% (obj./obj.) etanol w wodzie dejonizowanej dwa razy,
      70% (obj./obj.) etanol w wodzie dejonizowanej dwukrotnie,
      50% (obj./obj.) etanol w wodzie dejonizowanej jednorazowo,
      woda dejonizowana jednorazowo.
    3. Przenieść próbkę do 20 mM cytrynianu sodu (pH 8,0) w temperaturze 100 °C w szklanym słoiku. Upewnij się, że tkanki są zanurzone w roztworze.
    4. Umieść słoik w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C na 45 minut.
    5. Przemyć próbkę wodą dejonizowaną o temperaturze pokojowej przez 5 minut.

3. Barwienie tkanek metodą immuno-eprSRS

  1. Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować granicę wokół odcinków tkanki na szkiełku.
    UWAGA: Słoik do barwienia szkiełek służy do śledzenia etapów inkubacji tkanki na szkiełku. Pływające tkanki (skrawki mózgu myszy o grubości 40 μm) są barwione w płytkich studzienkowych.
  2. Inkubować tkanki z 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 w PBS) przez 10 minut.
  3. Inkubować tkanki z buforem blokującym (5% surowicy osła, 0,5% Triton X-100 w PBS) przez 30 minut.
  4. Przygotować pierwotny roztwór barwiący: dodać wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe do 200-500 μl buforu barwiącego (2% surowicy osła, 0,5% Triton X-100 w PBS) w żądanych stężeniach. Odwirować pierwotny roztwór barwiący o stężeniu 13 000 x g przez 5 minut. Stosować supernatant tylko wtedy, gdy wytrąca się osad.
  5. Inkubować tkankę w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni.
    UWAGA: W przypadku barwienia skrawków tkanki na szkiełku należy umieścić próbkę w pudełku do barwienia z wilgotną chusteczką, aby utrzymać wilgotność.
  6. Umyj szkiełka trzykrotnie 0,3-0,5% PBST w temperaturze pokojowej przez 5 minut każde. Użyj 1 ml PBST do tkanek pływających. W przypadku chusteczek znajdujących się na szkiełku należy je umyć w słoiku do barwienia szkiełek i upewnić się, że wszystkie chusteczki są zanurzone w roztworze.
  7. Inkubować tkankę w 200-500 μl buforu blokującego przez 30 minut.
  8. Przygotować wtórny roztwór barwiący: dodać wszystkie przeciwciała drugorzędowe (i lektyny, jeśli są wymagane) do 200-500 μl buforu barwiącego o pożądanych stężeniach (zwykle 10 μg/ml). Odwirować wtórny roztwór barwiący o stężeniu 13 000 x g przez 5 minut. Stosować supernatant tylko wtedy, gdy wytrąca się osad.
  9. Inkubować tkanki w 200-500 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni.
  10. Umyj szkiełka dwukrotnie 0,3-0,5% PBST w temperaturze pokojowej przez 5 minut każde.
  11. Inkubować z 200-500 μl roztworu DAPI przez 30 minut.
  12. Umyj szkiełka trzy razy za pomocą PBS w temperaturze RT przez 5 minut każde.
  13. W przypadku pływających skrawków tkanek przenieś je na szkiełka podstawowe za pomocą szklanej pipety. Rozprowadź chusteczkę za pomocą szczoteczki do chusteczek i w razie potrzeby wyczyść otoczenie chusteczkami.
  14. Zamontuj chusteczkę w kropli odczynników zapobiegających blaknięciu za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego i zabezpiecz ją lakierem do paznokci.

4. Zespół mikroskopu SRS

UWAGA: Komercyjny system fluorescencji konfokalnej jest używany w tandemowym obrazowaniu fluorescencji SRS. Więcej opisów można znaleźć w poprzednim raporcie17. Protokół ten skupi się na stronie obrazowania SRS przy użyciu wzbudzenia wąskopasmowego.

  1. Przygotuj izolowany wibracją stół optyczny w pomieszczeniu z regulacją temperatury.
  2. Umieść zsynchronizowany system podwójnego lasera (pompa i Stokes) na stole optycznym (Rysunek 2A) z podłączonym agregatem chłodniczym.
    UWAGA: Podstawowy laser w systemie podwójnego lasera zapewnia wyjściowy ciąg impulsów o długości fali 1064 nm z szerokością impulsu 6 ps i częstotliwością powtarzania 80 MHz. Wiązka Stokesa pochodzi z lasera podstawowego. Natężenie wiązki Stokesa było modulowane sinusoidalnie przez wbudowany elektrooptyczny modulator amplitudy (EOM) na częstotliwości 8 MHz z głębokością modulacji powyżej 90%. Druga część lasera podstawowego jest podwojona pod względem częstotliwości do 532 nm, która jest dalej wykorzystywana do synchronicznego inicjowania pikosekundowego optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) w celu wytworzenia ciągu impulsów z blokadą modów o szerokości impulsu 5-6 ps (wiązka luźna OPO jest zablokowana filtrem interferometrycznym). Długość fali wyjściowej OPO jest przestrajana w zakresie 720-950 nm, która służy jako wiązka pompy.
  3. Zamontuj zwierciadła (zakres długości fal: 750-1100 nm), dichroiczne rozdzielacze wiązki (DBS, filtr długoprzepustowy 980 nm, prostokątny) i soczewkę (achromatyczną, powłokę AR dla 650-1050 nm) do odpowiednich mocowań. Używaj bardzo stabilnych mocowań luster kinematycznych do luster i dichroicznych rozdzielaczy wiązki.
  4. Zmierz wysokość wyjścia lasera i rozmiary wiązki pompy i wiązek Stokesa. Dostosuj wysokość luster i soczewek, aby światło padało na środek wszystkich elementów optycznych.
  5. Umieść lustro M1 na stole optycznym i ustaw je pod kątem ~45° do wyjścia lasera (Rysunek 2B). Użyj pokręteł na uchwycie kinematycznym do regulacji przechyłu i nachylenia. Upewnij się, że światło dociera na tę samą wysokość wzdłuż stołu i w linii prostej w stosunku do stołu.
  6. Umieść i wyrównaj rozdzielacze wiązki dichroicznej (filtry długoprzepustowe 980 nm) i lustra, aby rozdzielić pompę i belki Stokesa ( Rysunek 2A-B).
  7. Umieść i wyrównaj pary soczewek (L1, L2 i L3, L4) na każdej ze ścieżek wiązki, aby skolimować wiązki i rozszerzyć średnice wiązki, aby dopasować je do tylnej źrenicy obiektywu (Rysunek 2A-B).
  8. Użyj luster M7 i M8, aby wyrównać połączone wiązki laserowe w mikroskopie (Rysunek 2C). Najpierw ustaw jedną wiązkę w mikroskopie i użyj par luster na drugiej wiązce, aby zapewnić przestrzenne zachodzenie na siebie dwóch wiązek.
  9. Skonfiguruj część wykrywania.
    1. Załóż skraplacz oleju pokryty powłoką podczerwieni (1.4-NA), aby zebrać pompę skierowaną do przodu i wiązki Stokesa po przejściu przez próbki ( Rysunek 2C).
    2. Zamontuj wielkopowierzchniową fotodiodę Si na ekranowanej obudowie ze złączami BNC (Rysunek 2E). Dodaj zasilacz 64 V DC do zamontowanej fotodiody, aby zwiększyć jej próg nasycenia i pasmo odpowiedzi.
    3. Odbijaj światło skierowane do przodu za pomocą 2-calowego lustra. Ponownie skoncentruj światło na fotodiodzie za filtrem optycznym, aby zablokować modulującą wiązkę Stokesa (Rysunek 2D).
    4. Wyślij prąd wyjściowy fotodiody do szybkiego wzmacniacza typu lock-in zakończonego liczbą 50 w celu demodulacji sygnału. Wyślij wyzwalacz 8 MHz do wzmacniacza lock-in jako sygnał odniesienia.
    5. Wyślij w fazie składową X wzmacniacza lock-in do skrzynki interfejsu analogowego mikroskopu.
  10. Zoptymalizuj nakładanie się czasowe z wbudowanym zmotoryzowanym stopniem opóźniającym, mierząc sygnał SRS czystej cieczy D2O pod mikroskopem.

5. Akwizycja i analiza obrazu

  1. Wykonywanie wielokanałowego obrazowania epr-SRS z sekwencyjnym dostrajaniem długości fali pompy.
    1. Ustaw moc lasera na pompę P = 10-40 mW i PStokes = 40-80 mW na panelu sterowania lasera.
    2. Ustaw czas zatrzymania pikseli na 2-4 μs i używaj wielu klatek, zwykle średnio 10-20 klatek w oprogramowaniu mikroskopowym.
      UWAGA: Należy unikać kombinatorycznego stosowania wysokiej mocy lasera (pompa P> 40 mW, PStokes> 80 mW) i małego rozmiaru piksela (<0,2 μm), które prawdopodobnie powodują "efekt wybielania" barwników Ramana z powodu wzbudzenia wielofotonowego.
    3. Ustaw stałe czasowe wzmacniacza uzależnionego od urządzenia na połowę czasu przebywania pikseli.
  2. Liniowe mieszanie spektralne.
    UWAGA: epr-SRS jest zgodny ze ścisłą liniową zależnością sygnału do stężenia w całym zakresie stężeń; W związku z tym liniowe rozmieszanie widmowe jest skuteczne w usuwaniu wszelkich potencjalnych przesłuchów między kanałami. W przypadku N-kanałowego pomiaru epr-SRS za pomocą sond N MARS, mierzone sygnały (S) mogą być wyrażone jako S = MC, gdzie C to stężenia sondy MARS, a M to matryca N x N wyznaczona przez przekroje ramanowskie sond MARS.
    1. Zmierz matrycę M na jednokolorowych próbkach immuno-eprSRS znakowanych różnymi sondami MARS.
    2. Użyj równania C = M−1·S, aby wyznaczyć matrycę stężeń sondy MARS z pomiarem sygnału próbki multipleksowej S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 pokazuje przykładowe obrazy epr-SRS w różnych próbkach, w tym w stałych komórkach (Rysunek 3A), Rysunek 3B) oraz próbki ludzkie z zatopioną w parafinie (FFPE) (Rysunek 3C). Rozdzielczość przestrzenna mikroskopii SRS jest ograniczona dyfrakcją, typowa rozdzielczość boczna wynosi ~300 nm, a rozdzielczość osiowa wynosi 1-2 μm przy użyciu światła bliskiej podczerwieni do wzbudzeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół immuno-eprSRS, który ma szerokie zastosowanie do typowych typów tkanek, w tym świeżo zakonserwowanych tkanek myszy, tkanek ludzkich FFPE i zamrożonych tkanek myszy. Immuno-eprSRS został zwalidowany dla panelu epitopów w komórkach i tkankach, jak wymieniono w Tabeli 1. Ta jednorazowa platforma jest szczególnie przydatna w zastosowaniach, w których strategie cykliczne nie działają dobrze. Na przykład fluorescencja cykliczna jest wymagająca dla grubych tkanek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ruth A. Singer i Richardowi K.P. Benningerowi za dostarczenie tkanek trzustki myszy. W.M. dziękuje za wsparcie ze strony NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) i US Army (W911NF-19-1-0214).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% paraformaldehyd,mikroskopia elektronowa15710
&alfa-tubulinaAbcamab18251Przeciwciała pierwszorzędowe
&alfa;-tubulinaBioLegend625902Przeciwciała pierwszorzędowe
β-III-tubulinaBioLegend657402Przeciwciała pierwszorzędowe
β-III-tubulinaAbcamab41489Przeciwciała pierwszorzędowe
i beta;-tubulinaAbcamab131205Przeciwciała pierwszorzędowe
Agaroza, niska temperatura gellinguSigma AldrichA9414Do osadzania w mózgu
przeciwciała anty-a-tubuliny wytwarzane w króliku (&alfa;-tubulina)Abcamab52866Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-kalbindynowe wytwarzane u myszy (Calbindin)Abcamab82812Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciała anty-GABA B receptor R2  wytwarzane u świnki morskiej (receptor GABA B R2)Przeciwciała pierwszorzędoweMillipore SigmaAB2255
Przeciwciała anty-GFAP wytwarzane u kóz (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-glukagon  wytwarzane u myszy (Glukagon)Santa Cruz Biotechnologysc-514592Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciała antyinsulinowe wytwarzane u świnki morskiej (insulina)DAKOIR00261-2Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-MBP wytwarzane u szczurów (MBP)Abcamab7349Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciała anty-NeuN wytwarzane u królika (NeuN)Thermo ScientificPA5-78639Przeciwciała
pierwszorzędowePrzeciwciało anty-Polipeptydowe trzustki (PP) wytwarzane u kóz- Polipeptyd trzustkowy (PP)Sigma AldrichSAB2500747Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-Pdx1 wytwarzane u królika (Pdx1)Milipore06-1379Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-somatostatyny wytwarzane u szczura (Somatostatyna)Abcamab30788Przeciwciała pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-wimentynowe wytwarzane u kurczaka ( Vimentin)Abcamab24525Przeciwciała pierwotne
Filtr pasmowo-przepustowyKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 OhmTerminator Mini obwodyBNC STRM-50
koncentrycznyThorlabs2249-C, BNC męski / męski
Szerokopasmowe lustro dielektryczneThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
Myszy C57BL/6JJackson Laboratory000664
Wirówka skraplacz
Cytokeratyna 18Abcamab7797Przeciwciała pierwszorzędowe
Cytokeratyna 18Abcamab24561Przeciwciała pierwotne
Zasilacz prądu stałegoTopWard6302DNapięcie polaryzacji: 64 V
Montaż dichroicznyThorlabsKM100CLMocowanie kinematyczne do 1,3" (33 mm) wysokości Prostokątna optyka, leworęczny
osioł anty-Chicken IgY (H+L)Jackson ImmunoResearch703-005-155Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS
Osioł anty-kozi IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-005-147Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS Przeciwciała
anty-gwinejskie IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-005-148Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS
Przeciwciała anty-mysie IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-005-151Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS
Przeciwciała anty-królicze IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-005-152Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS
Przeciwciała anty-szczurze IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-005-153Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS
Przeciwciała anty-owcze IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch713-005-147Wtórne przeciwciała do koniugacji MARS
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916Przeciwciała pierwszorzędowe
EtanolSigma Aldrich443611
Szybki wzmacniacz look-inZurich InstrumentsHF2LIDC - 50 MHz
FFPE Próbka nerkiUSBiomaxHuFPT072
FibrillarinAbcamab5821Przeciwciała pierwszorzędowe
GiantinAbcamab24586Przeciwciała pierwszorzędowe
GlukagonSanta Cruz Biotechnologysc-514592Przeciwciała pierwszorzędowe
H2BAbcamab1790Przeciwciała pierwszorzędowe
HeLaATCCATCC CCL-2
Filtr pasmowoprzepustowy o wysokiej średnicy zewnętrznejChroma TechnologiaET890/220mFiltruj wiązkę Stokesa i przesyłaj wiązkę pompy
Długopis hydrofobowyFisher ScientificNC1384846
InsulinaThermoFisher701265Przeciwciała pierwotne
Zintegrowany system laserowy SRSFizyka stosowana i Elektronika, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD zapewnia wyjściowy ciąg impulsów o długości fali 1,064 nm z szerokością impulsu 6 ps i częstotliwością powtarzania 80 MHz, który służy jako wiązka Stokesa. Wiązka o podwójnej częstotliwości przy 532 nm jest używana do synchronicznego inicjowania pikosekundowego optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) w celu wytworzenia ciągu impulsów z blokadą modów o szerokości impulsu pięć ~ 6 ps (wiązka luźna OPO jest zablokowana filtrem interferometrycznym). Długość fali wyjściowej OPO jest przestrajana od 720– 950 nm, który służy jako belka pompy. Intensywność wiązki Stokesa 1,064 nm jest modulowana sinusoidalnie przez wbudowany EOM na częstotliwości 8 MHz z głębokością modulacji ponad 90%. Belka pompy nakłada się przestrzennie na belkę Stokesa za pomocą dichroicznego lustra wewnątrz pikoEMERALD. Czasowe nakładanie się między pompą a ciągami impulsów Stokesa jest osiągane dzięki wbudowanemu stopniowi opóźniającemu i optymalizowane przez sygnał SRS czystego D2O pod mikroskopem.
Odwrócony laserowy mikroskop skaningowyOlympusFV1200MPE
Kinematyczny montaż lustrzanyThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Niskoprofilowe regulatory sześciokątne
Lektyna z Triticum vulgaris (pszenica)Sigma AldrichL0636-5 mg
Długoprzepustowy dichroiczny rozdzielacz wiązkiSemrockDi02-R980-25x36980 nm laser BrightLine  jednoostrzowy, laserowo-płaski dichroiczny rozdzielacz wiązki
MAP2BioLegend801810Przeciwciała pierwotne
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowegoOlympusFluoView
NanoQuant PlateTecanDo analiz małych objętości opartych na absorbancji w czytniku płytek.
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121
Odczynnik NucBlue Fixed Cell ReadyProbes (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4-dołkowe naczyniaFisher Scientific12-566-300
Soczewka obiektywowaOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, odległość robocza =  2 i cienkie; mm
Pędzel
malarski Zespół peryskopowyThorlabsRS99zawiera górną i dolną jednostkę, oraz Oslash; Słupek 1" i widelec mocujący.
pH-metr
Czytnik płytekTecanInfinite 200 PROŁatwy w obsłudze wielomodowy czytnik płytek. Możliwości pomiaru absorbancji w zakresie spektralnym 230– 1000 nm.
Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong GoldThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900Przeciwciała pierwszorzędowe
Sephadex G-25 MediumGE Life Sciences17-0033-01żelowa żywica filtracyjna do odsalania i wymiany buforu Skrzynka
ekranowana ze złączami BNCPomona Electronics2902Aluminiowa skrzynka z pokrywą, BNC żeńska/żeńska
Si fotodiodaThorlabsFDS1010350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm Obszar aktywny
Synapsin 2ThermoFisherOSS00073GPrzeciwciała pierwszorzędowe
Ścieżka tkankowa Szkiełka Superfrost Plus Gold FisherScientific22-035813Szkiełko adhezyjne do przyciągania i chemicznego wiązania świeżych lub utrwalonych formaliną skrawków tkanek z powierzchnią szkiełka (szkiełka wiążące tiisue)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
VibratomeLeicaVT1000
VimentinAbcamab8069Przeciwciała pierwszorzędowe
KsylenySigmaAldrich 214736
klasy EM Nauki Olympus zanurzenie w oleju, 1.4 N.A.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  3. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  4. Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
  5. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
  6. Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657(2018).
  7. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
  8. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  9. Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851(2019).
  10. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982(2013).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455(2020).
  13. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465(2017).
  14. Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
  15. Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
  16. Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
  17. Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
  18. Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518(2021).
  19. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003(2019).
  20. Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115(2022).
  21. Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
  22. Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
  23. Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537(2018).
  24. Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
  25. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  26. Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multiplexed Tissue ImagingRaman DyesStimulated Raman ScatteringProtein Marker ImagingImmunofluorescence AlternativeTissue ClearingSubcellular ResolutionAntibody ConjugationSize Exclusion ChromatographyBrain Tissue Imaging

Powiązane artykuły