Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63561

⸱

10 maja 2022

 ,  ,  , 
1Department of Genetic and Evolution, Federal University of São Carlos, 2Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Streszczenie

Ubikwitylacja to potranslacyjna modyfikacja zachodząca w komórkach eukariotycznych, która jest krytyczna dla regulacji kilku szlaków biologicznych, w tym przetrwania komórek, proliferacji i różnicowania. Jest to odwracalny proces, który polega na kowalencyjnym przyłączeniu ubikwityny do substratu poprzez reakcję kaskadową co najmniej trzech różnych enzymów, składających się z E1 (enzym aktywujący ubikwitynę), E2 (enzym sprzęgający ubikwitynę) i E3 (enzym ligazy ubikwityny). Kompleks E3 odgrywa ważną rolę w rozpoznawaniu substratów i ubikwitylacji. W tym miejscu opisano protokół oceny ubikwitylacji substratu w komórkach ssaków przy użyciu przejściowej kotransfekcji plazmidu kodującego wybrany substrat, ligazy ubikwityny E3 i znakowanej ubikwityny. Przed lizą transfekowane komórki są traktowane inhibitorem proteasomu MG132 (karbobenzoksy-leu-leu-leu-leucinalem), aby uniknąć degradacji proteasomów substratu. Ponadto ekstrakt komórkowy poddaje się immunoprecypitacji na małą skalę (IP) w celu oczyszczenia poliubikwitylowanego substratu w celu późniejszego wykrycia przez western blotting (WB) przy użyciu specyficznych przeciwciał dla znacznika ubikwityny. W związku z tym opisano spójny i nieskomplikowany protokół oznaczania ubikwitylacji w komórkach ssaków, aby pomóc naukowcom w rozwiązaniu problemu ubikwitylacji określonych substratów i ligaz ubikwityny E3.

Wprowadzenie

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) są ważnym mechanizmem regulującym białka, co jest niezbędne dla homeostazy komórek. Ubikwitylacja białek to dynamiczna i skomplikowana modyfikacja, która tworzy asortyment różnych sygnałów, co skutkuje kilkoma wynikami komórkowymi w organizmach eukariotycznych. Ubikwitylacja to odwracalny proces polegający na przyłączeniu białka ubikwityny zawierającego 76 aminokwasów do substratu, zachodzącego w kaskadzie enzymatycznej złożonej z trzech odrębnych reakcji1. Pierwszy etap charakteryzuje się aktywacją ubikwityny, która zależy od hydrolizy ATP w celu wytworzenia wysokoenergetycznej ubikwityny połączonej z tioestrem między C-końcem ubikwityny a resztą cysteiny obecną w miejscu aktywnym enzymu E1. Następnie ubikwityna jest przenoszona do enzymu E2, tworząc tioester podobny do kompleksu z ubikwityną. Następnie ubikwityna jest kowalencyjnie przyłączana do substratu przez E2 lub, częściej, przez enzym E3, który rozpoznaje i oddziałuje z substratem2,3. Czasami enzymy E4 (czynniki wydłużające łańcuch ubikwityny) są niezbędne do promowania składania łańcuchów multiubikwityny3.

Ubikwityna ma siedem reszt lizyny (K6, K11, K27, K29, K33, K48 i K63), co pozwala na tworzenie łańcuchów poliubikwityny, które generują odrębne połączenia w celu wytworzenia różnych trójwymiarowych struktur, które będą rozpoznawane przez kilka białek efektorowych4,5. W związku z tym rodzaj łańcucha poliubikwityny wprowadzony do substratu jest niezbędny do decydowania o losie jego komórki6,7,8. Co więcej, substrat może być również ubikwitynowany przez swoje N-końcowe reszty zwane N-degronami. Specyficzne ligazy ubikwityny E3 są odpowiedzialne za rozpoznawanie N-degronu, umożliwiając poliubikwitylację pobliskich reszt lizyny9.

Obecnie scharakteryzowano ponad 40 różnych substratów specyficznych dla SCF. Wśród nich można znaleźć kluczowe regulatory kilku szlaków biologicznych, w tym różnicowania i rozwoju komórek, a także przeżywania i umierania komórek10,11,12,13. W związku z tym identyfikacja specyficznych substratów każdej ligazy ubikwityny E3 jest niezbędna do zaprojektowania kompleksowej mapy różnych zdarzeń biologicznych. Mimo że identyfikacja prawdziwych substratów jest wyzwaniem biochemicznym, zastosowanie metod opartych na biochemii jest bardzo odpowiednie do oceny specyficzności łańcucha i rozróżnienia między mono- i poliubikwitylacją14. W badaniu tym opisano kompletny protokół testu ubikwitylacji z wykorzystaniem linii komórkowej ssaków HEK293T nadekspresji substratu UXT-V2 (Wszechobecnie eksprymowana izoforma 2 białka opiekuńczego podobnego do prefoldyny) z kompleksem E3 ubikwityna-ligaza SCF (Fbxo7). UXT-V2 jest niezbędnym kofaktorem dla sygnalizacji NF-κB, a gdy białko to zostanie zniszczone w komórkach, hamuje indukowaną przez TNF-α aktywację NF-κB11. Tak więc, aby wykryć poliubikwitylowany UXT-V2, stosuje się inhibitor proteasomu MG132, ponieważ ma on zdolność blokowania aktywności proteolitycznej podjednostki 26S kompleksu proteasomowego15. Ponadto ekstrakt komórkowy jest poddawany badaniu IP na małą skalę w celu oczyszczenia substratu, przy użyciu specyficznego przeciwciała unieruchomionego na żywicy agarozowej w celu późniejszego wykrycia przez WB przy użyciu wybranych przeciwciał. Protokół ten jest bardzo przydatny do walidacji ubikwitylacji substratu w środowisku komórkowym, a także może być dostosowany do różnych typów komórek ssaków i innych kompleksów ubikwityna-ligaza E3. Konieczna jest jednak walidacja badanego substratu za pomocą testu ubikwitylacji in vitro, ponieważ oba protokoły uzupełniają się nawzajem pod względem identyfikacji prawdziwych substratów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Przegląd protokołu analizy ubikwitynacji w komórkach ssaków przedstawiono na Rysunku 1.

Schemat procesu oczyszczania białek; konfiguracja transfekcji, inkubacja komórek, SDS-PAGE, immunoblotting.
Rysunek 1. Przegląd procedury badania ubikwitynacji. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

1. Hodowla komórkowa

  1. Hodować linię komórkową HEK293T w 100 mm naczyniu hodowlanym traktowanym TC do uzyskania 80%-90% konfluencji w pożywce wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę (100 units), streptomycynę (100 µg) i L-glutaminę (0.292 mg/mL)). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 5% CO2.
  2. W celu pasażowania komórek, odessać pożywkę z naczynia hodowlanego za pomocą pipety serologicznej. Przemyć komórki raz 1 mL sterylnego 1x roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS 1x).
  3. Odczepić komórki, dodając 1 mL roztworu trypsyny/EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego). Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 5 min. Resuspender komórki za pomocą pipety serologicznej w 2 mL pożywki wzrostowej.
  4. Przenieść zawiesinę komórkową do nowej, czystej probówki 15 mL i odwirować przy 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć nadsącz, ostrożnie go wylewając. Delikatnie resuspender osad komórkowy w 3 mL pożywki wzrostowej, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.
  5. Przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej do 100 mm naczynia hodowlanego traktowanego TC zawierającego 9 mL pożywki wzrostowej.
    UWAGA: Jeśli komórki są w dobrym stanie, każde naczynie hodowlane z HEK293T o konfluencji 80%-90% może dać trzy naczynia hodowlane z konfluencją 80% dwa dni po pasażowaniu.

2. Transfekcja komórek

UWAGA: Nie zaleca się transfekcji hodowli komórkowej, jeśli osiągnięta konfluencja jest mniejsza niż 80%.

  1. Przed transfekcją należy upewnić się, że komórki nie są zanieczyszczone i osiągnęły odpowiednią konfluencję dla transfekcji przejściowych.
  2. Dla każdej próbki do transfekcji przygotować kompleksy DNA-poliethylenimina (PEI 1 µg/µL przy pH 7,2) w następujący sposób:
    1. Rozcieńczyć 3 µg każdego plazmidu w 100 µL medium Opti-MEM I z obniżoną zawartością surowicy, bez dodatków, i delikatnie wymieszać, pipetując roztwór w górę i w dół.
      UWAGA: W tym przypadku komórki zostały transfekowane 4 µg każdego plazmidu: pustego wektora (pcDNA3) lub konstruktów FLAG-Fbxo7 oraz UXT-V2-HA, z lub bez 6xHis-myc-ubiquityny. Całkowita zawartość DNA wynosiła 12 µg.
    2. Rozmrozić PEI w temperaturze pokojowej i dodać do roztworu, zachowując proporcję 3 µL PEI na 1 µg DNA. Homogenizować roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA-PEI.
      UWAGA: Optymalna proporcja objętości PEI do ilości DNA różni się w zależności od wybranej linii komórkowej.
  3. Dodać całą objętość kompleksów DNA-PEI do każdej płytki z hodowlą komórkową i delikatnie wymieszać, kołysząc płytką przód-tył. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 5% CO2.
  4. Wymienić medium hodowlane po 5 h, ponieważ przedłużona ekspozycja na PEI może być toksyczna dla komórek HEK293T. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 5% CO2 przez 36 h.

3. Lizaza komórek i immunoprecypitacja

  1. Po okresie inkubacji i na 6 h przed lizą komórek, potraktuj transfekowane komórki 10 µM inhibitora proteasomów MG-132. Ponownie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do kultur komórkowych przy 5% CO2.
  2. Odsaj cały medium z każdej płytki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej i wypłucz ją raz 1 mL 1x PBS. Odklej komórki, dodając 1 mL trypsyny i inkubując płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min. Resuspenduj komórki w 1 mL medium wzrostowego.
  3. Przenieś zawiesinę komórkową do świeżej i czystej probówki 15 mL i odwiruj przy 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Usuń supernatant, ostrożnie go wylewając. Delikatnie resuspenduj pellet komórkowy w 200 µL schłodzonego do temperatury lodowej buforu do lizy NP-40 (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 225 mM KCl i 1% NP-40), uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteaz i fosfataz (10 mM NaF i 1 mM Na3VO4), a następnie przenieś roztwór do czystej mikroprobówki 1,5 mL.
  5. Inkubuj lizat komórkowy przez 30 min na lodzie. Po inkubacji odwiruj lizaty komórkowe przy 16 900 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.
  6. W międzyczasie wyrównaj stan równowagi kulek agarozowych anti-HA w schłodzonym do temperatury lodowej buforze do lizy NP-40. Użyj 15 µL kulek agarozowych anti-HA dla każdej próbki. Wypłucz kulki 200 µL buforu do lizy NP-40, wirując w mikroprobówce przy 3 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety bardzo ostrożnie odessaj i usuń supernatant; powtórz ten proces trzy razy. Następnie przechowuj zrównoważone kulki na lodzie do momentu użycia.
  7. Po odwiruciu lizatów komórkowych odzyskaj supernatant. Oznacz zawartość białka w całkowitym lizacie metodą Bradforda16.
  8. Upewnij się, że każda próbka poddana immunoprecypitacji zawiera równą ilość białka. Inkubuj odpowiednią objętość lizatu komórkowego z zrównoważonymi kulkami agarozowymi anti-HA przez 4 h, delikatnie rotując w inkubatorze rotacyjnym w temperaturze 4 °C, co pozwoli na związanie UXT-V2-HA z kulkami agarozowymi anti-HA.
  9. Zbierz kulki agarozowe anti-HA, wirując je w mikroprobówce przy 3 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessaj i usuń supernatant. Wypłucz kulki trzy razy schłodzonym do temperatury lodowej buforem do lizy komórek NP-40 i dwa razy schłodzonym do temperatury lodowej buforem FLAG/HA (10 mM Hepes pH 7.9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl i 0,1% NP-40).
  10. Po ostatnim płukaniu ostrożnie usuń cały supernatant za pomocą pipety i eluuj poliuubikwitylowane białko peptydem HA (300 µg/mL) rozcieńczonym w buforze FLAG/HA. Inkubuj kulki agarozowe anti-HA z peptydem HA przez 1 h w temperaturze 4 °C na platformie wstrząsowej.
  11. Odwiruj kulki przy 3 000 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C i ostrożnie pobierz pipetą supernatant zawierający białka poliuubikwitylowane. W razie potrzeby przechowuj eluat w świeżej i czystej mikroprobówce w temperaturze -20 °C.
  12. Rozdziel eluaty i lizaty komórkowe w 10% SDS-PAGE (elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu)17 i przeprowadź immunoblotting.
  13. W niniejszym badaniu wykonano mokry transfer WB. W przypadku tego rodzaju transferu umieść żel w kanapce transferowej składającej się z papieru filtracyjnego, żelu, membrany i papieru filtracyjnego, zabezpiecz ją podkładkami i zaciśnij za pomocą siatki wspierającej. Umieść ten układ pionowo w komorze wypełnionej buforem do transferu, pomiędzy elektrodami ze stali nierdzewnej/drutu platynowego. Transfer odbywa się przez 90 min przy 150 V w mokrym buforze do transferu (glicyna 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% metanol).
    UWAGA: Ponieważ ekstrakty komórkowe zostały skwantyfikowane (krok 3.7), przeprowadź SDS-PAGE z równą ilością białka dla każdej próbki. Ponadto, aby rozdzielić eluat, nałóż równe objętości każdej próbki.
  14. Przeanalizuj membranę immunoblotową przy użyciu wybranych przeciwciał 11. Upewnij się, że w eluacie z poliuubikwitylowanego substratu wyizolowanego w procesie IP wykryto sygnał w formie rozmycia (smear), stosując przeciwciało anti-myc w próbkach zawierających białko E3 ligazy typu dzikiego, substrat oraz myc-ub. W lizacie komórkowym (input) upewnij się, że wykryto sygnał z wybranego substratu, białka Fbxo7, białek ubikwitylowanych oraz białka referencyjnego (np. GAPDH i β-aktyny), aby zagwarantować taką samą ilość białek w każdej ścieżce.
    UWAGA: Rozcieńczenie każdego użytego przeciwciała przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

UXT (ubiquitously expressed transcript) jest białkiem podobnym do prefoldyny, które tworzy powszechnie występujące kompleksy fałdujące białka w tkankach myszy i człowieka, takich jak serce, mózg, mięśnie szkieletowe, łożysko, trzustka, nerka i wątroba18. Opisano dwie izoformy splicingowe UXT, nazwane UXT-V1 i UXT-V2, które pełnią odrębne funkcje i znajdują się w różnych lokalizacjach subkomórkowych. UXT-V1 lokalizuje się głównie w cytoplazmie oraz wewnątrz mitochondriów i bierze udział w apoptozie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ubikwitylacja jest istotną modyfikacją potranslacyjną, która reguluje poziomy kilku białek i odgrywa kluczową rolę w wielu szlakach sygnałowych i procesach biologicznych, zapewniając zdrowe środowisko wewnątrzkomórkowe. System ubikwityna-proteasom (UPS) jest jednym z głównych celów najnowszych badań farmaceutycznych, zapewniając możliwość stabilizacji supresorów nowotworowych lub indukowania degradacji produktów onkogennych22. Na przykład nieprawidłowa proliferacja nowotworów komórek plazmatycznyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

F.R.T jest wspierany przez grant FAPESP o numerze 2020/15771-6 oraz CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P i V.S są obsługiwane przez CAPES. C.R.S.T.B.C był wspierany przez stypendium FAPESP nr 2019/23466-1. Dziękujemy Sandrze R. C. Maruyamie (FAPESP 2016/20258-0) za wsparcie materialne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml mikroprobówkaAxygenPMI110-06A
100 mm poddane działaniu TCCorning430167
probówka 15 mlCorning430766
96-dołkowa płytkaCralplast655111
Agaroza-anty-HAPrzeciwciało Sigma-AldrichE6779
Anti MouseSeracare5220-0341Kozie przeciwciało anty-mysie IgG
anty króliczeSeracare5220-0337Kozie przeciwciało anty-królicze IgG
antyaktynoweSigma-AldrichA3853Zastosowane rozcieńczenie: 1:2000
Przeciwciało anty-Fbxo7Sigma-AldrichSAB1407251Zastosowane rozcieńczenie: 1:1000
Przeciwciało anty-HASigma-AldrichH3663Zastosowane rozcieńczenie: 1:1000
Przeciwciało anty-MycSygnalizacja komórkowa2272Użyte rozcieńczenie: 1:1000
Odczynnik BradfordSigma-AldrichB6916-500ML
BSASigma-AldrichA9647-100GSurowica bydlęca Inkubator komórek albuminowych
NuaireNU-4850
Eppendorf5804R500 x g przez 5 min
ChemiDocBioRad
Cyfrowy pH-metrKasviK39-2014B
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s MediumCorning10-017-CRVWysoki poziom glukozy
Płodowa surowica bydlęcaGibcoF4135Filtrat przed użyciem
PeptydHA Sigma-AldrichI2149
HEK293T komórkiATCCCRL-3216
HepesGibco15630080
KClVWR Life Science0365-500G
Kline rotatorGlobal Trade TechnologyGT-2OIBD
MG-132Boston BiochemI-130
MikrowirówkaEppendorf5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
Membrana nitrocelulozowaGE Healthcare
NP40 (IGEPAL CA-630)Sigma-AldrichI8896-100ML
Mikroskop optycznyMikroskopy OPTIKASN510768
Opti-MEMGibco31985-070
pcDNA3InvitrogenV79020Do ekspresji ssaków
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7  Uprzejmie podarowane przez Dr. Marcelo Damá Tag 2xFlag (N-terminal). Enzymy restrykcyjne: EcoRI i XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-Δ Skrzynka F  Uprzejmie podarowane przez Dr. Marcelo Damá Tag 2xFlag (N-terminal). Enzymy restrykcyjne: EcoRI i XhoI. Złącze Delta; 335-367
pcDNA3-UXTV2-HA  Uprzejmie podarowane przez Dr. Marcelo Damá Tag HA (zacisk C). Enzymy restrykcyjne: EcoRI i XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin  Uprzejmie podarowane przez Dr. Marcelo Damá Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Enzymy restrykcyjne: EcoRI i KpnI
Pen Strep Glutamina 100xGibco10378-016
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10xAccuGENE51226Aby uzyskać 1x PBS, rozcieńczyć 10x PBS w ultraczystej wodzie
Polietyleniminy (PEI)Sigma-Aldrich9002-98-6
Ponceau SVWR Life Science0860-50G
Koktajl inhibitorów proteazy SIGMAFASTSigma-AldrichS8820
Wytrząsarka bujanaKasvi19010005
System SDS-PAGEBioRad165-8004
Homogenizator roztworuPhoenix LufercoAP-22
Baza TrizmaSigma-AldrichT6066-500G
Trypsyna (TrypLe Express)Gibco12605-028
Odczynnik Western Blotting LuminolSanta Cruz BiotechnologySC-2048
Naczynie hodowlane 10600016 rio rio rio rio

Bibliografia

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  2. Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
  3. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  4. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).
  5. Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
  6. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
  7. Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
  8. Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
  9. Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
  10. Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
  11. Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).
  12. Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
  13. Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
  14. van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
  15. Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
  16. Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
  18. Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
  19. Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
  20. Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
  21. Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
  22. Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
  23. Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
  24. Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
  25. Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
  26. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  27. Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
  28. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  29. Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
  30. Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
  31. Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza immunoprecypitacjiWestern blottinginhibitor proteasomubia ko poliubikwitynowanetransfekcja przej ciowalizy kom rkowabia ko F box
Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.