Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) są ważnym mechanizmem regulującym białka, co jest niezbędne dla homeostazy komórek. Ubikwitylacja białek to dynamiczna i skomplikowana modyfikacja, która tworzy asortyment różnych sygnałów, co skutkuje kilkoma wynikami komórkowymi w organizmach eukariotycznych. Ubikwitylacja to odwracalny proces polegający na przyłączeniu białka ubikwityny zawierającego 76 aminokwasów do substratu, zachodzącego w kaskadzie enzymatycznej złożonej z trzech odrębnych reakcji¹. Pierwszy etap charakteryzuje się aktywacją ubikwityny, która zależy od hydrolizy ATP w celu wytworzenia wysokoenergetycznej ubikwityny połączonej z tioestrem między C-końcem ubikwityny a resztą cysteiny obecną w miejscu aktywnym enzymu E1. Następnie ubikwityna jest przenoszona do enzymu E2, tworząc tioester podobny do kompleksu z ubikwityną. Następnie ubikwityna jest kowalencyjnie przyłączana do substratu przez E2 lub, częściej, przez enzym E3, który rozpoznaje i oddziałuje z substratem^2,3. Czasami enzymy E4 (czynniki wydłużające łańcuch ubikwityny) są niezbędne do promowania składania łańcuchów multiubikwityny³.

Ubikwityna ma siedem reszt lizyny (K6, K11, K27, K29, K33, K48 i K63), co pozwala na tworzenie łańcuchów poliubikwityny, które generują odrębne połączenia w celu wytworzenia różnych trójwymiarowych struktur, które będą rozpoznawane przez kilka białek efektorowych^4,5. W związku z tym rodzaj łańcucha poliubikwityny wprowadzony do substratu jest niezbędny do decydowania o losie jego komórki^6,7,8. Co więcej, substrat może być również ubikwitynowany przez swoje N-końcowe reszty zwane N-degronami. Specyficzne ligazy ubikwityny E3 są odpowiedzialne za rozpoznawanie N-degronu, umożliwiając poliubikwitylację pobliskich reszt lizyny⁹.

Obecnie scharakteryzowano ponad 40 różnych substratów specyficznych dla SCF. Wśród nich można znaleźć kluczowe regulatory kilku szlaków biologicznych, w tym różnicowania i rozwoju komórek, a także przeżywania i umierania komórek^10,11,12,13. W związku z tym identyfikacja specyficznych substratów każdej ligazy ubikwityny E3 jest niezbędna do zaprojektowania kompleksowej mapy różnych zdarzeń biologicznych. Mimo że identyfikacja prawdziwych substratów jest wyzwaniem biochemicznym, zastosowanie metod opartych na biochemii jest bardzo odpowiednie do oceny specyficzności łańcucha i rozróżnienia między mono- i poliubikwitylacją¹⁴. W badaniu tym opisano kompletny protokół testu ubikwitylacji z wykorzystaniem linii komórkowej ssaków HEK293T nadekspresji substratu UXT-V2 (Wszechobecnie eksprymowana izoforma 2 białka opiekuńczego podobnego do prefoldyny) z kompleksem E3 ubikwityna-ligaza SCF (Fbxo7). UXT-V2 jest niezbędnym kofaktorem dla sygnalizacji NF-κB, a gdy białko to zostanie zniszczone w komórkach, hamuje indukowaną przez TNF-α aktywację NF-κB¹¹. Tak więc, aby wykryć poliubikwitylowany UXT-V2, stosuje się inhibitor proteasomu MG132, ponieważ ma on zdolność blokowania aktywności proteolitycznej podjednostki 26S kompleksu proteasomowego¹⁵. Ponadto ekstrakt komórkowy jest poddawany badaniu IP na małą skalę w celu oczyszczenia substratu, przy użyciu specyficznego przeciwciała unieruchomionego na żywicy agarozowej w celu późniejszego wykrycia przez WB przy użyciu wybranych przeciwciał. Protokół ten jest bardzo przydatny do walidacji ubikwitylacji substratu w środowisku komórkowym, a także może być dostosowany do różnych typów komórek ssaków i innych kompleksów ubikwityna-ligaza E3. Konieczna jest jednak walidacja badanego substratu za pomocą testu ubikwitylacji in vitro, ponieważ oba protokoły uzupełniają się nawzajem pod względem identyfikacji prawdziwych substratów.

UWAGA: Przegląd protokołu testu ubikwitylacji w komórkach ssaków jest przedstawiony w Rysunek 1.

Rysunek 1. Przegląd procedury oznaczania ubikwitylacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Hodowla komórkowa

1. Hoduj linię komórkową HEK293T w naczyniu hodowlanym poddanym działaniu TC o średnicy 100 mm do 80%-90% konfluencji w pożywkach wzrostowych (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną (100 jednostek), streptomycyną (100 μg) i L-glutaminą (0,292 mg / ml)). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 5% CO₂ .
2. Aby przejść przez komórki, odessać pożywkę z szalki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej. Umyj komórki raz 1 ml wysterylizowanej soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS 1x).
3. Odłącz komórki, dodając 1 ml roztworu trypsyny/EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego). Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zawiesić komórki za pomocą pipety serologicznej w 2 ml pożywki wzrostowej.
4. Przenieść zawiesinę komórkową do świeżej i czystej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć supernatant, ostrożnie go wylewając. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 3 ml pożywki wzrostowej, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.
5. Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do 100-milimetrowej płytki hodowlanej poddanej działaniu TC, zawierającej 9 ml pożywki wzrostowej.
   UWAGA: Jeśli komórki są w dobrych warunkach, każde naczynie hodowlane HEK293T, w którym konfluencja wynosi 80%-90%, może wygenerować trzy szalki hodowlane z 80% konfluencją 2 dni po pasażu.

2. Transfekcja komórek

UWAGA: Nie zaleca się transfekcji hodowli komórkowej, jeśli osiągnięta konfluencja jest mniejsza niż 80%.

1. Przed transfekcją należy sprawdzić, czy komórki są wolne od zanieczyszczeń i znajdują się w odpowiednim momencie zbiegu dla transfekcji przejściowych.
2. Dla każdej próbki transfekcyjnej należy przygotować kompleksy DNA-polietyleniminy (PEI 1 μg/μL przy pH 7,2) w następujący sposób:
   1. Rozcieńczyć 3 μg każdego plazmidu w 100 μl pożywki opti-MEM I zredukowanej surowicy bez suplementacji i delikatnie wymieszać, pipetując roztwór w górę iw dół.
      UWAGA: W tym przypadku komórki transfekowano 4 μg każdego plazmidu: pustego wektora (pcDNA3) lub konstruktów FLAG-Fbxo7 i UXT-V2-HA, z lub bez 6xHis-myc-ubikwityny. Całkowita zawartość DNA wynosiła 12 μg.
   2. Rozmrozić PEI w temperaturze pokojowej i dodać go do roztworu w proporcji 3 μl PEI na 1 μg DNA. Homogenizować roztwór, pipetując w górę i w dół. Następnie inkubuj go przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić tworzenie kompleksów DNA-PEI.
      UWAGA: Optymalna proporcja objętości PEI na ilość DNA różni się w zależności od wybranej linii komórkowej.
3. Dodaj całkowitą objętość kompleksów DNA-PEI do każdej płytki zawierającej kulturę komórkową i delikatnie wymieszaj, kołysząc płytką w przód iw tył. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 5% CO₂ .
4. Wymień pożywkę wzrostową po 5 godzinach, ponieważ długotrwała ekspozycja na PEI może być toksyczna dla komórek HEK293T. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w stężeniu 5% CO_{2 przez} 36 godzin.

3. Liza komórek i immunoprecypitacja

1. Po okresie inkubacji i 6 godzin przed lizą komórek należy potraktować transfekowane komórki 10 μM inhibitora proteasomu MG-132. Ponownie inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 5% CO₂ .
2. Odessać pożywkę z każdej płytki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej i przemyć ją raz 1 ml 1x PBS. Odłącz komórki, dodając 1 ml trypsyny i inkubując naczynie w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki wzrostowej.
3. Przenieść zawiesinę komórkową do świeżej i czystej probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Usunąć supernatant, ostrożnie go wylewając. Delikatnie zawieś ponownie osad komórkowy w 200 μl lodowatego buforu do lizy NP-40 (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl i 1% NP-40), uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy (10 mM NaF i 1 mM Na₃VO₄) i przenieś roztwór do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
5. Inkubować lizat komórkowy przez 30 minut na lodzie. Po inkubacji odwirować lizaty komórkowe w temperaturze 16 900 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
6. W międzyczasie zrównoważ kulki agarozowo-anty-HA lodowatym buforem do lizy NP-40. Na każdą próbkę należy użyć 15 μl kulek agarozowo-anty-HA. Przepłukać kulki 200 μl buforu do lizy NP-40, pulsując go w probówce mikrowirówkowej o sile 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety odessać i bardzo ostrożnie wyrzucić supernatant; Powtórz ten proces trzy razy. Następnie utrzymuj kulki równo na lodzie aż do użycia.
7. Po odwirowaniu lizatów komórkowych odzyskaj supernatant. Określ ilościowo zawartość białka w całkowitym lizacie za pomocą metody Bradforda¹⁶.
8. Upewnij się, że każda próbka poddana immunoprecypitacji zawiera równą ilość białka. Inkubować niezbędną objętość lizatu komórkowego za pomocą zrównoważonych kulek agarozowo-anty-HA przez 4 godziny, delikatnie obracając w inkubatorze obrotowym w temperaturze 4 °C, co umożliwia UXT-V2-HA związanie się z kulkami agarozowo-anty-HA.
9. Zebrać kulki anty-HA agarozy, pulsując nimi w probówce mikrowirówkowej o stężeniu 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Przemyj kulki trzykrotnie lodowatym buforem do lizy komórek NP-40 i dwukrotnie lodowatym buforem FLAG/HA (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl i 0,1% NP-40).
10. Po ostatnim płukaniu ostrożnie usunąć cały sklaratyk za pomocą pipety i wymyć poliubikwitylowane białko peptydem HA (300 μg/ml) rozcieńczonym na buforze FLAG/HA. Inkubować kulki agarozowo-anty-HA z peptydem HA przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na kołyszącej się platformie wytrząsającej.
11. Odwirować kulki o gramaturze 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i ostrożnie odpipetować supernatant zawierający białka poliubikwitynowe. W razie potrzeby należy przechowywać eluat w świeżej i czystej mikroprobówce w temperaturze -20 °C.
12. Rozpuścić eluaty i lizaty komórkowe w 10% SDS-PAGE (elektroforeza w żelu dodecylosiarczanu sodu-poliakrylamidu)¹⁷ i immunoblotting.
13. W tym badaniu wykonano badanie WB z mokrym transferem. W przypadku tego rodzaju transferu umieść żel w kanapce transferowej składającej się z bibuły filtracyjnej, żelu, membrany i bibuły filtracyjnej, wyściełaj ją podkładkami i dociśnij do siebie za pomocą siatki nośnej. Umieść ten system pionowo w zbiorniku wypełnionym buforem transferowym i między elektrodami ze stali nierdzewnej/platyny. Transfer odbywa się przez 90 minut przy napięciu 150 V w mokrym buforze transferowym (glicyna 192 mM, zasada trisowa 25 mM, 0,025% SDS, 20% metanol).
    UWAGA: Ponieważ ekstrakty komórkowe zostały określone ilościowo (krok 3.7), uruchom SDS-PAGE z równą ilością białka dla każdej próbki. Ponadto, aby rozpuścić eluat, należy uruchomić równe objętości każdej próbki.
14. Zbadaj błonę immunoblot za pomocą wybranych przeciwciał ¹¹. Upewnij się, że w eluacie z poliubikwitylowanego substratu wyciągniętego w procesie IP wykryty jest sygnał rozmazu przy użyciu przeciwciała anty-myc w próbkach zawierających ligazę E3 typu dzikiego, substrat i myc-ub. W lizacie komórkowym (wejściu) upewnij się, że wykryty jest sygnał z wybranego substratu, białka Fbxo7, ubikwitylowanych białek i białka porządkowego (np. GAPDH i β-aktyny), aby zagwarantować taką samą ilość białek na każdym pasie.
    UWAGA: Rozcieńczenie dla każdego użytego przeciwciała zostało przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta.

UXT (wszechobecnie wyrażony transkrypt) to białko podobne do prefoldyny, które tworzy wszechobecne kompleksy fałdowania białek w tkankach mysich i ludzkich, takich jak serce, mózg, mięśnie szkieletowe, łożysko, trzustka, nerki i wątroba18. Opisano dwie izoformy splicingowe UXT, które noszą nazwy UXT-V1 i UXT-V2, pełniące różne funkcje i lokalizacje subkomórkowe. UXT-V1 jest zlokalizowany głównie w cytoplazmie i wewnątrz mitochondriów i jest zaangażowany w apoptozę indukowaną przez TNF-α i tworzenie przeciwwirusowych sygnałosomów19,20. Większość badań koncentrowała się na UXT-V2, który jest głównie zlokalizowany w jądrze i działa jako kofaktor dla wielu czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w regulację proliferacji komórek, różnicowanie i szlaki zapalne. UXT-V2 bierze udział w szlaku sygnałowym NF-κB, działając jako niezbędny koaktywator w wzmacniaczu NF-κB21. Wykazano, że UXT-V2 jest kanonicznym substratem ligazy ubikwityny E3 SCF(Fbxo7), pośredniczącym w jego poliubikwitylacji i degradacji przez proteasom, a w konsekwencji hamującym szlak sygnałowy NF-κB11.

Specyficzna poliubikwitylacja UXT-V2-HA, w której pośredniczy Fbxo7 w komórkach, została zaobserwowana po zbadaniu eluatu z anty-HA IP za pomocą przeciwciała anty-myc, które wykrywa myc-ub sprzężony z substratem (Rysunek 2). Specyficzność anty-myc dla substratu poliubikwitylowanego uwidoczniono na torach 1 i 2 ( Figura 2), w których rozmaz poliubikwitylowanych białek nie został wykryty, gdy komórki były kotransfekowane Fbxo7 i myc-ub przy braku plazmidu UXT-V2-HA ( Rysunek 2, tor 1). Dodatkowo, nie uwidoczniono rozmazu odpowiadającego poliubikwitynacji białek w połączeniu Fbxo7 i UXT-V2-HA bez plazmidu myc-ub (Rysunek 2, pas 2). Aby udowodnić, że w poliubikwitylacji UXT-V2 pośredniczył Fbxo7, w połączeniu z UXT-V2-HA i myc-ub transfekowano pusty wektor pcDNA3, mutant Fbxo7 lub Fbxo7-ΔF-box, który nie jest w stanie złożyć aktywnego kompleksu SCF z powodu braku domeny F-box, która jest odpowiedzialna za interakcję z SKP1. Silny sygnał rozmazu poliubikwitylowanego UXT-V2 zaobserwowano tylko w obecności dzikiego typu Fbxo7 (Rysunek 2, linia 4), co sugeruje, że UXT-V2 był poliubikwitylowany przez kompleks SCF (Fbxo7) w komórkach w porównaniu z kontrolami (Rysunek 2, pasy 3 i 5). Obecność słabego sygnału rozmazu poliubikwitylowanego UXT-V2 w obecności tych kontroli ujemnych może wskazywać na działanie endogennej Fbxo7 lub innej aktywności ligazy ubikwityny E3.

Rysunek 2. Test ubikwitylacji w komórkach: Przejściowa transfekcja komórek HEK293T ze wskazanymi plazmidami. Po lizie komórek ekstrakty komórkowe (wejścia) poddano immunoprecypitacji kulkami agarozowo-anty-HA. Próbki eluowane i wejściowe rozdzielono za pomocą SDS-PAGE, a western blot sondowano specyficznymi przeciwciałami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.