Artykuł metodologiczny

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63569

⸱

16 marca 2022

 ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę obrazowania konfokalnego do wykrywania trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Te tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również pocałunkiem i ucieczką), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawaną, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się stopionych pęcherzyków.

Streszczenie

Dynamiczne otwieranie i zamykanie porów fuzji pośredniczy w egzocytozie i endocytozie oraz określa ich kinetykę. W tym miejscu pokazano szczegółowo, w jaki sposób mikroskopia konfokalna została wykorzystana w połączeniu z zapisem patch-clamp do wykrycia trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydła hodowanych w hodowli pierwotnej. Trzy tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również kiss-and-run), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawczą, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się profilu w kształcie Ω generowanego przez fuzję, aż do całkowitego połączenia się z błoną plazmatyczną.

Aby wykryć te tryby fuzji, błona plazmatyczna została oznaczona nadekspresją mNeonGreen przyłączonego do domeny PH fosfolipazy C δ (PH-mNG), która wiąże się z fosfatydyloinozytolem-4,5-bisfosforanem (PtdIns(4,5)P2) w ulotce błony plazmatycznej skierowanej w stronę cytozolu; pęcherzyki zostały załadowane fluorescencyjnym fałszywym neuroprzekaźnikiem FFN511 w celu wykrycia uwolnienia zawartości pęcherzykowej; a Atto 655 zostało włączone do roztworu do kąpieli w celu wykrycia zamknięcia porów fuzyjnych. Te trzy sondy fluorescencyjne były obrazowane jednocześnie z prędkością ~20-90 ms na klatkę w żywych komórkach chromochłonnych w celu wykrycia otwarcia porów fuzyjnych, uwalniania zawartości, zamykania porów fuzyjnych i zmian wielkości pęcherzyków stapianych. Opisano metodę analizy w celu rozróżnienia trzech trybów fuzji z tych pomiarów fluorescencji. Opisana tutaj metoda może w zasadzie mieć zastosowanie do wielu komórek wydzielniczych poza komórkami chromochłonnymi.

Wprowadzenie

Fuzja błonowa pośredniczy w wielu funkcjach biologicznych, w tym w transmisji synaptycznej, homeostazie stężenia glukozy we krwi, odpowiedzi immunologicznej i wnikaniu wirusa1,2,3. Egzocytoza, polegająca na fuzji pęcherzyków na błonie komórkowej, uwalnia neuroprzekaźniki i hormony w celu osiągnięcia wielu ważnych funkcji, takich jak aktywność sieci neuronalnej. Fuzja otwiera pory, aby uwolnić zawartość pęcherzykową, po czym pory mogą się zamknąć, aby odzyskać pęcherzyk łączący, który jest określany jako kiss-and-run1,4. Zarówno nieodwracalne, jak i odwracalne otwarcie porów fuzyjnych można zmierzyć za pomocą zapisów pojemnościowych dołączonych do komórek w połączeniu z zapisami przewodnictwa porowego fuzji pojedynczych pęcherzyków.

To jest często interpretowane jako odzwierciedlenie fuzji pełnego załamania, obejmującej dylatację fuzji aż do spłaszczenia pęcherzyka zgrzewającego, oraz kiss-and-run, obejmującej odpowiednio otwieranie i zamykanie porów fuzji5,6,7,8,9,10,11,12,13. Niedawne badania obrazowania konfokalnego i wymuszonego zubożenia emisji (STED) w komórkach chromochłonnych bezpośrednio zaobserwowały otwieranie i zamykanie porów fuzyjnych (kiss-and-run, zwane również close-fusion), otwieranie porów fuzyjnych, które utrzymuje kształt Ω z otwartym porem przez długi czas, zwane fuzją podtrzymującą, oraz kurczenie się pęcherzyka łączącego, aż do całkowitego połączenia się z błoną plazmatyczną, która zastępuje fuzję pełnego zapadnięcia w celu połączenia pęcherzyków łączących się z błoną plazmatyczną4, 8,14,15,16,17.

W neuronach wykryto otwieranie i zamykanie porów fuzyjnych za pomocą obrazowania pokazującego uwalnianie kropek kwantowych wstępnie załadowanych w pęcherzyki, które są większe niż pory fuzyjne oraz za pomocą pomiarów przewodnictwa porów fuzyjnych na powierzchni uwalniania zakończeń nerwowych5,18,19. Komórki chromochłonne nadnerczy są szeroko stosowane jako model do badania egzo- i endocytozy20,21. Chociaż komórki chromochłonne zawierają duże pęcherzyki o gęstym rdzeniu, podczas gdy synapsy zawierają małe pęcherzyki synaptyczne, białka egzocytozy i endocytozy w komórkach chromochłonnych i synapsach są dość podobne10,11,12,20,21,22,23.

Tutaj opisana jest metoda pomiaru tych trzech trybów fuzji za pomocą metody obrazowania konfokalnego połączonego z elektrofizjologią w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydła (Rysunek 1). Metoda ta polega na załadowaniu fluorescencyjnych fałszywych neuroprzekaźników (FFN511) do pęcherzyków w celu wykrycia egzocytozy; dodanie Atto 655 (A655) do roztworu kąpieli w celu wypełnienia profilu w kształcie Ω generowanego przez fuzję i znakowanie błony plazmatycznej domeną PH fosfolipazy C δ (PH), która wiąże się z PtdIns(4,5)P2 na błonie plazmatycznej8,15,24. Dynamikę porów fuzyjnych można wykryć poprzez zmiany intensywności fluorescencji. Chociaż opisana tutaj zasada działania tej metody może być szeroko stosowana do wielu komórek wydzielniczych, znacznie wykraczających poza komórki chromochłonne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Procedura wykorzystania zwierząt była zgodna z wytycznymi NIH i została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIH.

1. Hodowla komórek chromochłonnych bydła

  1. Przygotować roztwór Locke'a (Tabela 1) i narzędzia do autoklawu 1 dzień przed hodowlą komórek chromofinowych.
  2. Zaopatrz się w nadnercza bydlęce z lokalnej rzeźni w dniu hodowli i zanurz je w lodowatym roztworze Locke'a przed preparacją.
    UWAGA: Nadnercza to od 21-27 miesięcy, zdrowe, czarne Angus obojga płci (głównie samce) o masie ciała około 1,400 funtów (~635 kg).
  3. Przygotować 30 ml (na 3 nadnercza) świeżego roztworu enzymatycznego zawierającego kolagenazę P, inhibitor trypsyny i albuminę surowicy bydlęcej (Tabela 1) przed sekcją i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Wybierz 3 nienaruszone gruczoły bez nacięć i krwawień na powierzchni i usuń tkankę tłuszczową nożyczkami (Rysunek 1A). Przemyj gruczoły przez perfuzję roztworem Locke'a, aż krew nie wypłynie. Aby to osiągnąć, napompuj gruczoł przez żyłę nadnerczy (Rysunek 1B) za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml dołączonej z filtrem 0,22 μm tyle razy, ile potrzeba25.
    UWAGA: Około 150 ml roztworu Locke'a jest zwykle potrzebne do umycia 3 gruczołów.
  5. W celu trawienia należy wstrzyknąć roztwór enzymu przez żyłę nadnerczy za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml dołączonej do filtra 0,22 μm, aż gruczoł zacznie puchnąć. Następnie pozostaw gruczoły w temperaturze 37 °C na 10 minut. Wstrzyknąć ponownie i pozostawić gruczoły w temperaturze 37 °C na kolejne 10 minut.
    UWAGA: Do strawienia 3 gruczołów potrzeba około 30 ml roztworu enzymatycznego.
  6. Po strawieniu przetnij gruczoł wzdłuż od żyły do drugiego końca nożyczkami, aby rozłożyć gruczoł (Rysunek 1C). Wyizoluj rdzeń, wsuwając pęsetę z białego rdzenia na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór Locke'a.
    UWAGA: Porównanie wnętrza gruczołu przed i po trawieniu jest pokazane w Rysunek 1C. Szczegóły dotyczące trawienia i izolacji rdzenia są podane wcześniej23,25.
  7. Pokrój i zmiel rdzeń na małe kawałki nożyczkami (Rysunek 1D). Przefiltrować zawiesinę rdzenia za pomocą siatki nylonowej o grubości 80-100 μm do zlewki. Następnie przenieść filtrat do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu odwirowania w temperaturze pokojowej 48 × g przez 3 minuty ze spowolnieniem 3,
    UWAGA: Mielenie rdzeni trwa zwykle ~10 min. Aby uzyskać dobrą wydajność komórek, zmielone kawałki muszą być bardzo małe, aż nie będzie można ich wyciąć pęsetą.
  8. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy roztworem Locke'a przez pipetowanie. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o średnicy 80-100 μm i odwirować w temperaturze pokojowej 48 x g przez 3 minuty ze spowolnieniem 3.
  9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 30 ml pożywki hodowlanej (tabela 1). Określ numer komórki za pomocą komór zliczających hemacytometr25.

2. Transfekcja z elektroporacją

  1. Przenieś 2,8 × 106 komórek do probówki o pojemności 15 ml. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 48 × g przez 2 minuty ze spowolnieniem 3. Do osadu komórkowego dodać 100 μl buforu transfekcyjnego (patrz Tabela Materiałów) dostarczonego przez producenta, a następnie dodać 2 μg plazmidu PH-mNG.
    UWAGA: Plazmid PH-mNG został stworzony przez zastąpienie wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) mNG w PH-EGFP15 (patrz Tabela materiałów).
  2. Delikatnie wymieszać zawiesinę, pipetując roztwór w górę i w dół, a następnie niezwłocznie przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji (Rysunek 1E). Natychmiast przenieś kuwetę do elektroporatora (patrz Tabela materiałów), wybierz program O-005 z listy ekranowej i naciśnij Enter, aby wykonać elektroporację.
    UWAGA: Przygotować zawiesinę komórkową do transfekcji w kapturze do hodowli komórkowych. Nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do zawiesiny na etapie mieszania. Bezzwłocznie przejdź do następnego kroku.
  3. Po elektroporacji natychmiast dodać 1,8 ml pożywki do kuwety i delikatnie wymieszać za pomocą mikropipetora wyposażonego w sterylną końcówkę. Następnie dodać 300 μl zawiesiny elektroporowanych komórek na wierzchu szkiełka nakrywkowego (patrz tabela materiałów) w każdym naczyniu, posiewając w sumie 5-6 szalek na jedną reakcję elektroporacji.
  4. Ostrożnie przenieść naczynia do nawilżonego inkubatora w temperaturze 37 °C z 9% CO2 przez 30 minut, a po 30 minutach delikatnie dodać 2 ml podgrzanej pożywki do każdego naczynia.
  5. Przechowywać transfekowane komórki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 9% CO2 przez 2-3 dni przed eksperymentem.
    UWAGA: Wyhodowane komórki wytrzymają tydzień. Najlepiej jest używać hodowanych komórek w dniach 2-3.

3. Przygotowanie do zapisu metodą patch-clamp i obrazowania konfokalnego

UWAGA: Ten protokół został wykonany za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i wzmacniacza patch-clamp z zapisem napięcie-clamp wraz ze wzmacniaczem lock-in do rejestracji pojemnościowej. Obrazowanie konfokalne w płaszczyźnie XY w stałej płaszczyźnie Z (skanowanie stałe XY/Z) wykorzystano do jednoczesnego zobrazowania wszystkich trzech sygnałów fluorescencyjnych. Płaszczyzna Z była skoncentrowana na dnie komórki, gdzie błona plazmatyczna przylegała do szkiełek nakrywkowych.

  1. W dniu eksperymentu z patch-clampem i obrazowaniem obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Użyj jasnego pola, aby upewnić się, że hodowla komórkowa nie jest zanieczyszczona (Rysunek 1F) i epifluorescencji, aby sprawdzić prawidłową ekspresję białka znakowanego fluorescencyjnie.
    UWAGA: Na przykład PH-mNG ulega ekspresji w błonie plazmatycznej ~20-30% komórek.
  2. Przygotować pipety do plastrów z kapilar ze szkła borokrzemianowego. Aby to zrobić, pociągnij pipety za pomocą ściągacza do pipet, pokryj ich końcówki płynnym woskiem i wypoleruj je mikrokuźnią (patrz Tabela materiałów).
  3. Włącz nagrywanie patch-clamp amplifier i uruchom oprogramowanie do nagrywania patch-clamp (patrz Tabela materiałów). Ustaw odpowiednie parametry dla zapisu prądu wapniowego i pojemności w oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów).
    1. Ustaw protokół nagrywania trwający łącznie 60 s, gdzie stymulacja rozpoczyna się po 10 s.
    2. Ustaw potencjał podtrzymania dla nagrywania cęgów napięcia na -80 mV. Ustaw depolaryzację 1 s od -80 mV do 10 mV jako bodziec do wywołania napływu wapnia i skoku pojemności.
    3. W przypadku pomiarów pojemności należy ustawić częstotliwość bodźca sinusoidalnego w zakresie 1 000-1 500 Hz przy napięciu międzyszczytowym nie większym niż 50 mV.
  4. Zapisz protokół i utwórz nowy plik do nagrywania.
  5. Włącz system mikroskopu konfokalnego i ustaw odpowiednie parametry w oprogramowaniu (patrz Tabela Materiałów).
    1. Włącz lasery, w tym 458 nm, 514 nm i 633 nm, i ustaw zakres zbierania emisji dla każdego lasera zgodnie z każdą sondą fluorescencyjną, jak pokazano poniżej. FFN511: długość fali wzbudzenia (EX), 458 nm; długość fali emisji (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
    2. Użyj obrazowania sekwencyjnego dla FFN511 i mNG, aby uniknąć przesłuchów między tymi dwiema sondami. Ustaw czas poklatkowy o czasie trwania 1 minuty dla nagrywania obrazu (Rysunek 1G).

4. Zapis z użyciem zacisku krosowego i obrazowanie konfokalne

  1. Wybierz naczynie o dobrym stanie komórek i prawidłowej ekspresji i dodaj 2 μl fluorescencyjnego fałszywego neuroprzekaźnika FFN511 (10 mM zapasu, roztwór roboczy 1:1,000) do pożywki. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 20 minut. Alternatywnie załaduj FFN511 po kroku 3.2 i wykonaj kroki 3.3-3.5, czekając, aby zaoszczędzić czas.
  2. Po zakończeniu ładowania FFN511 przygotuj komorę zapisu i dodaj 2 μl barwnika fluorescencyjnego A655 do 500 μl roztworu kąpieli (Rysunek 2A i Tabela 1). Przenieś szkiełko nakrywkowe z naczynia do komory zapisu (patrz Tabela Materiałów) za pomocą pęsety i natychmiast dodaj roztwór do kąpieli zawierający A655 (Rysunek 2B).
    UWAGA: A655 jest przechowywany w temperaturze -20 °C przy stężeniu 10 mM, a stężenie robocze wynosi 40 μM.
    UWAGA: Nosić rękawice, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu skóry z FFN511 lub A655.
  3. Umieść kroplę oleju (współczynnik załamania światła: 1,518; patrz tabela materiałów) na obiektywie 100x zanurzonym w oleju (apertura numeryczna = 1,4). Zamontuj komorę w mikroskopie i za pomocą pokrętła regulacyjnego spraw, aby olej po prostu zetknął się z dolną częścią szkiełka nakrywkowego, a następnie zanurz końcówkę przewodu uziemiającego w roztworze kąpieli (Rysunek 2C, D).
    UWAGA: Wybierz olejek immersyjny odpowiedni do pracy w temperaturze pokojowej. Przełączanie między obiektywem o małym i dużym powiększeniu nie jest konieczne. Podczas nagrywania temperatura w pomieszczeniu jest utrzymywana na poziomie około 20-22 °C.
  4. Ustaw ostrość komórek i użyj obrazowania w jasnym polu i konfokalnym, aby znaleźć dobrą komórkę z ekspresją mNG. Powiększ zaznaczoną komórkę i dostosuj ją do środka widoku, aby zminimalizować puste obszary.
    UWAGA: Schematyczny rysunek znakowania fluorescencyjnego jest pokazany na Rysunek 3A. Dobra komórka ma zwykle gładką błonę i czystą krawędź (Rysunek 3B). W przypadku obrazowania epifluorescencyjnego lub konfokalnego dobra komórka wydaje się mieć duże i płaskie dno z jasną ekspresją mNG ( Rysunek 3C).
    Rozmiar piksela wynosi ~50 nm, w zakresie ~40-80 nm w zależności od różnych rozmiarów komórek i współczynnika powiększenia.
  5. Skonfiguruj parametry obrazowania konfokalnego w płaszczyźnie XY na stałej płaszczyźnie Z (stałe skanowanie XY/Z) FFN511, PH-mNG i A655, ze zminimalizowanym interwałem czasu. Ustaw ostrość na dole komórki za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji.
    UWAGA: PH-mNG sygnalizuje kontur błony komórkowej komórki w konfokalnym przekroju poprzecznym płaszczyzny XY (z wyjątkiem dna komórki). W pobliżu dna błony komórkowej można zaobserwować plamki A655, które odbijają wgłębienia błony w kształcie Ω lub Λ. Jeśli płaszczyzna ogniskowej Z znajduje się niżej niż dno komórki, intensywność całej fluorescencji stanie się słabsza.
  6. Dostosuj moc lasera wzbudzającego w oprogramowaniu, aby znaleźć ustawienie, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu i uniknąć znacznego wybielania fluorescencyjnego. Aby to zrobić, zacznij od początkowej wartości testowej 2,5 mW mocy dla FFN511 wzbudzonego przy 458 nm i 1 mW dla mNG wzbudzonego przy 514 nm. W przypadku A655 wzbudzonego przy długości fali 633 nm za pomocą lasera HeNe, należy użyć wysokiej mocy lasera, ~12-15 mW (tj. 70%-80% maksymalnej), która przy ciągłym wzbudzeniu może wybielić cały fluorescencyjny A655 wewnątrz profilu w kształcie Ω, gdy jego pory są zamknięte.
    UWAGA: Jeśli moc lasera jest zbyt wysoka, fluorescencja PH-mNG i FFN511 zostanie szybko wybielona. Jeśli moc lasera jest zbyt niska, sygnały będą zbyt słabe lub zaszumione, aby można je było przeanalizować.
  7. Dodać 9 μl roztworu wewnętrznego (Tabela 1) do pipety krosowej i przymocować pipetę do uchwytu w patch-clamp amplifier stage (patrz Tabela materiałów).
  8. Zastosować niewielką ilość nadciśnienia za pomocą strzykawki i przesunąć końcówkę pipety, aby dotknąć roztworu do kąpieli za pomocą mikromanipulatora. Upewnij się, że wzmacniacz pokazuje, że rezystancja pipety wynosi ~2-4 MΩ za pomocą testu impulsów napięciowych. Naciśnij LJ/Auto, aby anulować złącze cieczy.
  9. Przesuń pipetę w kierunku wybranej komórki za pomocą mikromanipulatora. Aby utworzyć tryb z podłączoną komórką, przesuń końcówkę pipety, aby dotknąć kuwety (opór wzrośnie); delikatnie stosując podciśnienie strzykawką (rezystancja wzrośnie do ponad 1 GΩ), zmień potencjał trzymania z 0 na -80 mV.
  10. Gdy rezystancja przekroczy 1 GΩ, poczekaj ~30 s, aż konfiguracja się ustabilizuje. Naciśnij C-fast/Auto, aby skompensować dużą pojemność.
  11. Aby utworzyć tryb całego ogniwa, zastosuj impulsowe, krótkie, ale silne podciśnienie za pomocą strzykawki, aby rozerwać membranę (kształt impulsu prądowego zmienia się wraz z naładowanym i rozładowanym kondensatorem membranowym). Naciśnij C-slow/Auto, aby skompensować niską pojemność.
  12. Nieznacznie dostosuj ostrość obrazowania, aby ustawić ostrość na dnie komórki. Rozpocznij jednocześnie konfokalne obrazowanie poklatkowe i nagrywanie patch-clamp, klikając przyciski Start w dwóch różnych aplikacjach w tym samym czasie.
    UWAGA: Oprogramowanie do obrazowania konfokalnego tworzy film z szybkością ~20-90 ms/klatkę. Zapis patch-clamp obejmuje stan spoczynku przez 10 s, stymulację depolaryzacyjną 1 s i dodatkowe 49 s po stymulacji. Konfiguracja patch-clamp pozwala na rejestrację prądu wapniowego, skoku pojemności i zaniku indukowanego depolaryzacją 1 s od -80 do +10 mV (Rysunek 3D).
  13. Po zakończeniu nagrywania upewnij się, że dane zostały zapisane. Zmień potencjał podtrzymania z powrotem na 0 mV. Wyjąć pipetę z roztworu do kąpieli i wyrzucić ją.
  14. Powtórz kroki 4.7-4.13, aby nagrać kolejną komórkę w naczyniu. Po 1 godzinie nagrywania zmień naczynie na inne do nagrywania.
    UWAGA: Po 1 godzinie nagrywania wskaźnik powodzenia nagrywania z zaciskiem krosowym znacznie się zmniejsza. Aby zwiększyć efektywność zbierania danych, zaleca się nagrywanie tylko przez 1 godzinę w każdym daniu.

5. Analiza danych z zacisku krosowego

  1. Otwórz odpowiednie oprogramowanie (patrz tabela materiałów) do analizy danych. Kliknij przycisk PPT | Załaduj plik PULSE | File przyciski, aby załadować plik .dat. Kliknij Zrób to, a cztery ścieżki zostaną automatycznie wykreślone na jednym wykresie, w tym ścieżki prądu wapniowego i pojemności.
  2. Kliknij przycisk Windows | Nowy wykres, wybierz Pulse_1_1_1, pierwszą falę w Falach Y, a następnie kliknij przycisk Zrób to, aby wykreślić wykres prądu wapnia. Kliknij przycisk Windows | Nowa tabela, wybierz Pulse_1_1_1 i kliknij przycisk Zrób to, aby wyświetlić nieprzetworzone dane prądu wapniowego, które można wykorzystać do wykreślenia uśrednionego śladu wielu komórek.
  3. Narysuj odpowiednio kwadrat na wykresie prądu wapnia, kliknij prawym przyciskiem myszy i rozwiń bieżący sygnał, aby uwzględnić linię bazową i szczyt prądu wapnia. Kliknij pozycję Wykres | Pokaż informacje, aby wyświetlić kursory A i B i przenieść je odpowiednio do linii bazowej i szczytu. Informacje z wykresu zostaną pokazane na dole, a parametry można oszacować.
  4. Powtórz krok 5.2, ale wybierz Pulse_1_1_1_Cm, drugą falę w falach Y, aby wykreślić ścieżkę pojemności. Powtórz krok 5.3 i umieść kursory A i B w odpowiedniej pozycji, aby zmierzyć parametry pojemności, takie jak linia bazowa, amplituda i szybkość zaniku.
  5. Skopiuj surowe dane z kroku 5.2 do arkusza kalkulacyjnego, oblicz średnią i błąd standardowy średniej dla grupy zarejestrowanych komórek, a następnie wykreśl uśrednione ślady prądu wapnia i pojemności membrany (Rysunek 3E) w odpowiednim oprogramowaniu.

6. Analiza danych obrazowania konfokalnego

  1. Otwórz pliki obrazowania RAW za pomocą dowolnego oprogramowania dostarczonego przez producenta (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Niektóre inne bezpłatne programy, takie jak ImageJ lub Fiji, mogą być wykorzystane do przetwarzania danych i ilościowego określania obrazów uzyskanych w sekcji 4.
  2. Kliknij opcję Process (Proces) | ProcessTools i używaj narzędzi do generowania plików średniej kroczącej (np. średniej kroczącej dla każdych 4 obrazów) dla każdego obrazu poklatkowego i zapisywania tych plików.
    UWAGA: Po uśrednieniu kroczącym można dokonać odpowiedniej regulacji jasności i tła, aby lepiej pokazać zmiany fluorescencji trzech kanałów, co może pomóc w identyfikacji zdarzeń fuzji. Sprawdzenie intensywności fluorescencji w niektórych regionach, w których nie występują fuzje, może pomóc w odróżnieniu sygnału fluorescencyjnego zdarzeń fuzji od sygnałów tła.
  3. Kliknij przyciski Kwantyfikacja | Narzędzia | Stack Profile, sprawdź punkty czasowe przed i po stymulacji, aby zidentyfikować zmiany fluorescencji w każdym kanale. Kliknij przycisk Rysuj elipsę, aby zakreślić obszary zainteresowania (ROI) dla zdarzeń fuzji. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i kliknij Zapisz ROI, aby zapisać ROIs.
    UWAGA: Wielkość ROI, która obejmuje wszystkie trzy sygnały fluorescencyjne, była podobna do wielkości pęcherzyków w komórkach chromochłonnych24. Do analizy wykorzystano surowe dane, podczas gdy dane uśredniania kroczącego, które zwiększają stosunek sygnału do szumu, zostały dostarczone, aby wyraźnie pokazać trzy sygnały.
  4. Kliknij Otwórz projekty, aby zlokalizować plik raw, kliknij prawym przyciskiem myszy obraz i kliknij Załaduj ROI, aby załadować plik ROI do plików obrazowania RAW w celu zmierzenia intensywności fluorescencji.
    UWAGA: Surowy sygnał fluorescencyjny zostanie wykorzystany do wykreślenia śladów różnych kanałów. Dla każdego zwrotu z inwestycji linia bazowa jest definiowana jako intensywność przed stymulacją, a ślady intensywności można znormalizować do wartości wyjściowej.
  5. Kliknij Narzędzia | Sortuj ROI w oprogramowaniu i narysuj ślady dla wszystkich trzech kanałów każdego ROI. Kliknij przycisk Raport, aby zapisać dane ROI, w tym dane cyfrowe i ślady obrazowania dla każdego ROI, w folderze plików.
    1. Zidentyfikuj zdarzenie fuzji na podstawie jednoczesnego wzrostu intensywności fluorescencji punktowej PH-mNG (FPH) i A655 (F655) (w jednej klatce), któremu towarzyszy spadek fluorescencji punktowej FFN511 (FFFN).
    2. Zwróć uwagę na pojawienie się FPH i F655, co wskazuje na tworzenie się plamek PH-mNG / A655 w wyniku profilu Ω generowanego przez fuzję, umożliwiającego dyfuzję PH-mNG z błony plazmatycznej i trwałą dyfuzję A655 z kąpieli.
    3. Zwróć uwagę na spadek FFFN, który wskazuje na jego uwolnienie z pęcherzyka z powodu otwarcia porów fuzyjnych i wyklucza możliwość, że pojawienie się FPH i F655 może wynikać z wgłębienia błony spowodowanego endocytozą.
    4. Sprawdźstałe obrazy poklatkowe XY/Z, które pokazują zdarzenia fuzji zachodzące na dnie komórki. Przeanalizuj trzy tryby zdarzeń fuzji: 1) fuzja bliska, 2) fuzja podtrzymująca i 3) fuzja skurczająca.
      UWAGA: Zdarzenia fuzji były rzadko obserwowane przed depolaryzacją, podczas gdy dziesiątki zdarzeń fuzji można było zaobserwować po depolaryzacji. Po fuzji profil Ω może zamknąć swoje pory, utrzymać otwarte pory lub skurczyć się, aby połączyć się z błoną plazmatyczną.
      1. Aby zidentyfikować ściemnianie F 655, poszukaj ściemniania F655, ponieważ zamknięcie porów fuzyjnych zapobiega wymianie kąpieli A655, podczas gdyF PH utrzymuje się, odzwierciedlając ciągłą konwersję PtdIns(4,5)P 2 w PtdIns(4)P, lub FPH rozpada się z opóźnieniem, odzwierciedlając ściśnięcie pęcherzyka (bliskie zlanie, Rysunek 4A,B).
      2. Poszukaj trwałych FPH i F655, aby zidentyfikować fuzję podtrzymującą (Rysunek 4C).
      3. Szukaj równoległych spadków FPH i F655, wskazujących na skurcz profilu Ω, aby zidentyfikować fuzję skurczową (Rysunek 4D).
        UWAGA: Sprawdź oryginalne pliki obrazowania, aby sprawdzić ślady obrazowania, jeśli nie masz pewności co do typu zdarzenia. Sprawdzenie intensywności fluorescencji w niektórych regionach, w których nie ma fuzji, może pomóc w odróżnieniu sygnału fluorescencyjnego zdarzeń fuzji od sygnałów tła.
  6. Wykreślić reprezentatywne ślady zmian intensywności dla tych trzech kanałów: FFN511, PH-mNG i A655. Określ ilościowo procent różnych trybów fuzji w każdej komórce i wykreśl liczby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z procedurami eksperymentalnymi przedstawionymi na Rysunku 1 oraz Rysunku 2, komórki chromafinne z nadnerczy bydlęcych przetransfekowano PH-mNG w celu oznakowania błony plazmatycznej; do roztworu kąpieli dodano A655 w celu wykrycia zamknięcia poru fuzyjnego; a do pęcherzyków wprowadzono fluorescencyjny fałszywy neuroprzekaźnik FFN511 w celu wykrycia uwalniania. Następnie wykonano konfokalne obrazowanie timelapse w płaszczyźnie XY dla FFN511, PH-mNG oraz ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano metodę obrazowania pod mikroskopem konfokalnym w celu wykrycia dynamiki porów fuzyjnych i uwalniania nadajnika, a także trzech trybów fuzji: fuzji zamkniętej, fuzji podtrzymującej i fuzji skurczowej w komórkach chromochłonnych nadnerczybydła 4,24. Opisano elektrofizjologiczną metodę depolaryzacji komórki, a tym samym wywołania egzo- i endocytozy. Systematyczne przetwarzanie obrazu konfokalnego dostarcza informacji o różnych trybach zachowania porów w przy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Wewnętrznym Programom Badawczym NINDS (ZIA NS003009-13 i ZIA NS003105-08) za wsparcie tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól magnezowa adenozyno-5'-trifosforanuSigmaA9187-500MGATP do przygotowania roztworu wewnętrznego
Atto 655ATTO-TEC GmbHAD 655-21Barwnik Atto do oznaczania roztworu do kąpieli
Podstawowy nukleofektor dla neuronów pierwotnychLonzaVSPI-1003Bufor do transfekcji elektroporacyjnej wraz z zestawem
Pipeta ze szkła kapilarnego boroscilicateWarner Instrumenty64-0795Standardowa ścianka z żarnikiem OD=2,0 mm ID=1,16 mm Długość=7,5 cm
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153-50GOdczynnik do trawienia gruczołów
Chlorek wapnia 2 MJakość Biologiczna351-130-721Odczynnik do przygotowania roztworu do kąpieli
Sitka komórkowe, 100 &mikro; mFalcon352360Materiał do filtracji zawiesiny komórek chromochłonnych
Roztwór wodorotlenku cezuSigma232041Odczynnik do przygotowania roztworu wewnętrznego i buforu zapasowego Cs-glutaminianu/Cs-EGTA
Kolagenaza PSigma11213873001Enzym do trawienia gruczołów
Szkiełko nakrywkoweNeuvitroGG-14-LamininGG-14-Laminin, średnica 14 mm#1 grube 60 sztuk Laminin powlekane niemieckie szkiełka nakrywkowe
D-(+)-GlucoseSigmaG8270-1KGOdczynnik do przygotowania Locke'a' s roztwór i roztwór do kąpieli
DMEMThermoFisher Scientific11885092Odczynnik do przygotowania pożywki hodowlanej
EGTASigma324626-25GMOdczynnik do przygotowania buforu podstawowego Cs-EGTA do kąpieli roztworu
Elektroporacja i NucleofectorAmaxa BiosystemsNucleofector IITransfekcja plazmidów do komórek
Surowica bydlęca płoduThermoFisher Scientific10082147Odczynnik do przygotowania pożywki
hodowlanej FFN511Abcamab120331Fluorescencyjny fałszywy neuroprzekaźnik do znakowania pęcherzyków
Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozynySigmaG8877-250MGGTP do przygotowania roztworu wewnętrznego
HEPESSigmaH3375-500GOdczynnik do przygotowania Locke'a s rozwiązanie
Igor ProWaveMetricsIgor proOprogramowanie do analizy patch-clamp i prezentacji danych obrazowych
Oprogramowanie Leica Application Suite XLeicaLAS XKonfokalne oprogramowanie do zbierania i analizy danych obrazowych
Leica TCS SP5 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy LeicaLeica TCS SP5Mikroskop konfokalny do zbierania
danych obrazowychKwas L-glutaminowySigma49449-100GOdczynnik do przygotowania buforu podstawowego Cs-glutaminianu do roztworu do kąpieli
Wzmacniacz typu lock-inHekaLock-inOprogramowanie do zapisu pojemnościowego
Chlorek magnezu 1 MJakość Biologiczna351-033-721EAOdczynnik do przygotowania roztworu wewnętrznego i roztworu do kąpieli
Hemacytometr metalizowany Hausser Bright-LineHausser Scientific3120Komora licząca
MicroforgeNarishigeMF-830Polskie pipety poprawiające tworzenie i stabilność uszczelek giga-omowych
Filtr strzykawkowy Millex-GP, 0,22 i mikro; mMilliporeSLGPR33RBMateriał do płukania i trawienia gruczołów
mNG (mNeonGreen)Allele BiotechnologyABP-FP-MNEONSBSzablon do konstrukcji PH-mNeonGreen
Siatka nylonowa 100 mikronówEIKO filtrująca co03-100/32Materiał do filtracji zawiesiny rdzenia
Zacisk krosowy EPC-10HekaEPC-10Wzmacniacz do danych patch-clamp kolekcja
PH-EGFPAddgenePlasmid #51407Szkielet do konstrukcji PH-mNeonGreen
Ściągacz do pipetSutter InstrumentP-97Zrób pipety do nagrywania patch-clamp
Chlorek potasuSigmaP5404-500GOdczynnik do przygotowania Locke'a s roztwór i roztwór do kąpieli
Oprogramowanie impulsoweHekaPulseSoftware do zbierania danych o patch-clampach
Komora nagraniowaWarner Instruments64-1943/QR-40LPkomora nakrywkowa, nałóż pipetę krosową na żywe komórki
Chlorek soduSigmaS7653-1KGOdczynnik do przygotowania Locke'a s roztwór, roztwór do kąpieli i roztwór wewnętrzny
Wodorotlenek soduSigmaS5881-500GOdczynnik do przygotowania Locke'a' s roztwór
Fosforan sodu dwuzasadowySigmaS0876-500GOdczynnik do przygotowania Locke'a s roztwór
Fosforan sodu jednozasadowySigmaS8282-500GOdczynnik do przygotowania Locke'a s roztwór
Mieszanie płyty grzejnejBarnsted/Thermolynetyp 10100Grzałka do powlekania pipet woskiem
Strzykawka, 30 mlBecton Dickinson302832Materiał do mycia gruczołów i trawienia
Chlorek tetraetyloamonuSigmaT2265-100GHERBATA do przygotowania roztworu do kąpieli
Inhibitor trypsynySigmaT9253-5GOdczynnik do trawienia gruczołów
Typ F Płyn zanurzeniowyLeica195371-10-9Olej do montażu konfokalnego Leica
Oprogramowanie

Bibliografia

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356(2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503(2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604(2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Patch clampegzocytozaendocytozaotwieranie poru fuzyjnegozamykanie poru fuzyjnegosondy fluorescencyjnepierwotna hodowla kom rektryby fuzji p cherzyk w

Powiązane artykuły