Artykuł metodologiczny

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63581

⸱

10 maja 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, UNC-Chapel Hill

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Streszczenie

Badania nad rekrutacją i funkcjonowaniem komórek odpornościowych w tkankach były bardzo aktywną dziedziną w ciągu ostatnich dwóch dekad. Neutrofile są jednymi z pierwszych komórek odpornościowych, które docierają do miejsca zapalenia i uczestniczą we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej podczas infekcji lub uszkodzenia tkanek. Do tej pory migrację neutrofili udało się zobrazować za pomocą różnych systemów eksperymentalnych in vitro opartych na jednolitej stymulacji lub ograniczonej migracji pod agarozą lub kanałami mikroprzepływowymi. Modele te nie oddają jednak złożonego mikrośrodowiska, z którym neutrofile spotykają się in vivo. Rozwój technik opartych na mikroskopii wielofotonowej (MPM), takich jak mikroskopia subkomórkowa przykomórkowa (ISMic), oferuje unikalne narzędzie do wizualizacji i badania dynamiki neutrofili w rozdzielczościach subkomórkowych w warunkach fizjologicznych. W szczególności ucho żywej, znieczulonej myszy zapewnia eksperymentalną przewagę w śledzeniu migracji śródmiąższowej neutrofili w czasie rzeczywistym ze względu na łatwość dostępu i brak ekspozycji chirurgicznej. ISMic zapewnia rozdzielczość optyczną, szybkość i głębokość akwizycji niezbędne do śledzenia zarówno procesów komórkowych, jak i, co ważniejsze, subkomórkowych w 3D w czasie (4D). Co więcej, multimodalne obrazowanie mikrośrodowiska śródmiąższowego (tj. naczyń krwionośnych, komórek rezydentnych, macierzy zewnątrzkomórkowej) można łatwo przeprowadzić przy użyciu kombinacji myszy transgenicznych wykazujących ekspresję wybranych markerów fluorescencyjnych, znakowania egzogennego za pomocą sond fluorescencyjnych, wewnętrznej fluorescencji tkanek oraz sygnałów generowanych przez drugą/trzecią harmoniczną. Protokół ten opisuje: 1) przygotowanie neutrofili do adoptywnego transferu do ucha myszy, 2) różne ustawienia dla optymalnego obrazowania subkomórkowego, 3) strategie minimalizacji artefaktów ruchu przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedzi fizjologicznej, 4) przykłady przebudowy błony obserwowanej w neutrofilach przy użyciu ISMic oraz 5) przepływ pracy do analizy ilościowej przebudowy błony u migrujących neutrofili in vivo.

Wprowadzenie

Ukierunkowana migracja komórek jest krytycznym wydarzeniem występującym podczas różnych procesów fizjologicznych i patologicznych, w tym rozwoju, odpowiedzi immunologicznej, naprawy tkanek oraz inicjacji, progresji i rozprzestrzeniania się nowotworu1,2. Proces ten opiera się na specyficznych zewnątrzkomórkowych sygnałach chemotaktycznych wyczuwanych przez pokrewne receptory na błonie plazmatycznej, a następnie przekształcanych w skomplikowane sygnały wewnątrzkomórkowe. Te szlaki z kolei aktywują migrację komórek poprzez szereg reakcji, w tym lokalną aktywację cytoszkieletu, transport i przebudowę błony oraz polaryzację komórek3. Dobrze scharakteryzowano dwa różne typy migracji komórek: mezenchymalną i ameboidalną4. Migracja mezenchymów jest stosunkowo powolna (<1 μm/min), opiera się na silnej adhezji między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i zależy od degradacji macierzy indukowanej przez metaloproteazy. Natomiast migracja ameboidalna, charakterystyczna dla komórek odpornościowych szybko reagujących na sygnały zapalne, jest szybsza (>10 μm / min) i wykorzystuje słabe zrosty do poruszania się po ECM. Niezależnie od modalności, migracja komórek wymaga ciągłej przebudowy błony plazmatycznej, co skutkuje generowaniem wystających struktur na krawędzi natarcia komórek, które są ściśle skoordynowane z cofaniem błony na tylnej stronie1.

Aby rozwikłać mechanizmy molekularne leżące u podstaw tych procesów subkomórkowych, niezbędne jest wizualizację dynamiki błon w migrujących komórkach w odpowiedniej rozdzielczości czasowej i przestrzennej. Ponadto, ponieważ na przebudowę błony duży wpływ mają właściwości mikrośrodowiska tkankowego otaczającego migrujące komórki, kluczowe jest zobrazowanie tego procesu bezpośrednio w tkance rodzimej, u żywych zwierząt. Osiąga się to za pomocą mikroskopii przyżyciowej (IVM)5. Pierwsze obrazowanie IVM zostało wykonane ~200 lat temu, kiedy wynaczynienie leukocytów zostało uwidocznione za pomocą prostego mikroskopu trans-illuminacyjnego6, a następnie IVM było używane głównie na półprzezroczystych organizmach modelowych, takich jak Danio pręgowany i Drosophila7,8. W ciągu ostatnich dwóch dekad IVM został z powodzeniem wykorzystany do badania procesów komórkowych u myszy, szczurów i większych ssaków, takich jak świnie5,9. Było to możliwe dzięki 1) znaczącym postępom w mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej (MP) oraz 2) rozwojowi technologii edycji genów, takiej jak CRISPR-Cas9, która umożliwiła szybką inżynierię różnych modeli zwierzęcych w celu ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek i reporterów. Poza tym wizualizacja poszczególnych komórek i ich mikrośrodowiska podczas procesów takich jak inicjacja guza, migracja komórek i odpowiedź immunologiczna była możliwa zarówno dzięki innym formom znakowania egzogennego, takim jak ogólnoustrojowe wprowadzenie barwników do oznaczania układu krwionośnego10,11, jak i wzbudzenie cząsteczek endogennych, takich jak kolagen, poprzez generację drugiej harmonicznej (SHG)10,12 i włókna nerwowe poprzez generowanie trzeciej harmonicznej (THG)11,13. Wreszcie, udoskonalenie technik minimalizowania artefaktów ruchowych spowodowanych biciem serca i oddychaniem doprowadziło do opracowania mikroskopii subkomórkowej (ISMic), która pozwoliła naukowcom obrazować i badać kilka zdarzeń subkomórkowych bezpośrednio u żywych zwierząt na poziomie rozdzielczości podobnym do obserwowanych in vitro14,15,16,17. Przykłady ISMic obejmują badanie dynamiki cytoszkieletu podczas egzocytozy14,15,16,17 i endocytoza15, dynamiczna przebudowa cytoszkieletu podczas migracji komórek17,18, lokalizacja i metabolizm mitochondriów19,20, oraz sygnalizacja wapniowa w mózgu21.

Ten protokół szczegółowo opisuje różne kroki i procedury badania przebudowy błony komórkowej w rozdzielczości subkomórkowej podczas migracji neutrofili w skórze ucha żywej myszy za pomocą ISMic. Podejście to opiera się na wcześniej opisanych protokołach22,23 i jest dostosowane do osiągnięcia wyższej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt National Cancer Institute (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) (protokoły LCMB-031 i LCMB-035) i były zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi. Do eksperymentów wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy w wieku od 2 do 6 miesięcy. Myszy żywicielskie mT/mG i typu dzikiego (WT) znajdują się w tle FVB/NJ, podczas gdy myszy LyzM-Cre x mTmG znajdują się w tle C57BL/6.

1. Materiały oraz przygotowanie odczynników i narzędzi

  1. Rurki, naczynia i igły/strzykawki pokryć PBS + 1% BSA (bez wapnia i magnezu) przez noc pod mieszaniem.
  2. Ostrożnie oczyść powierzchnie i narzędzia/instrumenty przeznaczone do pracy ze zwierzętami przy użyciu 70% etanolu lub w autoklawie.
    1. Do oczyszczania neutrofili należy przygotować: 3 x probówki 15 ml, 1 x miska 60 mm, 1 x probówka 1,5 ml; HBSS zawierający 10 mM HEPES (pH 7,3); roztwór do lizy krwinek czerwonych (ACK); Histopaque 1077; i Histopaque 1119.
  3. Do wstrzykiwań neutrofili należy przygotować: 1 x strzykawkę o małej objętości (10 μl), 1 x 33 g igły skośnej, izofluran i roztwór znieczulający (ketamina, ksylazyna i acepromazyna odpowiednio w dawkach 80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 i 4 mg·kg-1 w roztworze soli fizjologicznej).

2. Oczyszczanie neutrofili od myszy dawcy

  1. Poddaj mysz dawcy eutanazji zgodnie z lokalnymi przepisami instytucjonalnymi.
  2. Zbieraj kości długie od zwierzęcia (kość udowa, piszczelowa i ramienna), zwracając uwagę na zachowanie integralności kości i unikanie obcinania głów kości podczas zbierania24.
  3. W naczyniu o średnicy 60 mm pokrytym BSA usuń mięśnie i tkankę tłuszczową. Przeciąć głowy kości, aby uzyskać dostęp do szpiku, a następnie przepłukać i homogenizować szpik kostny za pomocą strzykawki (igła 27 G) wypełnionej HBSS.
  4. Przefiltrować roztwór do 15 ml probówki pokrytej BSA za pomocą sitka 40 μm i odwirować go przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml ACK na 30 s w celu lizy czerwonych krwinek, a następnie dodać 9 ml HBSS w celu zatrzymania lizy. Odwirować roztwór przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotuj gradient krokowy gęstości w 15 ml probówce pokrytej BSA, delikatnie umieszczając 4 ml 1119 Histopaque na dnie probówki, a następnie delikatnie nakładając 4 ml 1077 Histopaque na wierzch. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć mieszania dwóch warstw.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml HBSS. Delikatnie nałóż roztwór na gradient schodkowy przygotowany powyżej. Wiruj z prędkością 1 000 x g przez 30 minut przy RT z najniższą możliwą prędkością przyspieszania i zwalniania (preferowany jest brak hamulca).
  8. Od góry rurki delikatnie odessać połowę warstwy 1077 Histopaque. Zebrać pozostałą połowę warstwy histopakowej 1077 i górną połowę warstwy histopakowej 1119 do świeżej probówki pokrytej BSA. Mętna zawiesina komórek między dwiema warstwami gęstości zawiera głównie neutrofile.
  9. Dodaj HBSS, aby osiągnąć końcową objętość 15 ml i delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę. Wirować z prędkością 400 x g przez 5 minut przy RT.
  10. Po odwirowaniu ponownie zawiesić i przemyć osad komórkowy 10 ml HBSS i wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz procedurę, a następnie ponownie zawieś osad w 15 ml HBSS, aby określić liczbę komórek za pomocą licznika komórek. Na koniec odwiruj i ponownie zawieś komórki w 1 ml HBSS i przenieś do 1,5 ml probówki pokrytej BSA.
  11. Po oczyszczeniu zawiesinę neutrofili w probówce pokrytej BSA należy delikatnie mieszać przez 30 minut na rotatorze probówki w temperaturze pokojowej do momentu etykietowania i/lub wstrzyknięcia.
    UWAGA: Udane oczyszczanie daje 10-20 x 106 neutrofili na mysz o czystości 95%. Czystość ocenia się za pomocą cytometrii przepływowej, przy użyciu wcześniej opisanych markerów neutrofili (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ i CD11b+)25,26.
    UWAGA: Protokoły oczyszczania neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej i szpiku kostnego myszy są dostępne wcześniej24,27.

3. Znakowanie neutrofili

UWAGA: Aby zobrazować neutrofile, zostały one oczyszczone z myszy LyzM-Cre mT/mG, w których komórki szpikowe wyrażają peptyd ukierunkowany na błonę połączony z GFP. Ponadto oczyszczone neutrofile od myszy typu dzikiego (WT) znakowano in vitro. Poniższe kroki opisują procedurę stosowaną do znakowania oczyszczonych neutrofili za pomocą komercyjnego, przepuszczalnego dla komórek zielonego barwnika fluorescencyjnego i można ją dostosować do dowolnej innej sondy fluorescencyjnej zgodnej z MPM.

  1. Dodać zielony barwnik fluorescencyjny (stężenie zalecane przez producenta; tutaj 1 μM) do zawiesiny neutrofili (oczyszczonej z myszy WT) w probówce pokrytej BSA o pojemności 1,5 ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem w rotatorze probówkowym.
  2. Umyć trzy razy za pomocą HBSS, wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w 1 ml HBSS.
  3. Zawiesinę neutrofili w probówce pokrytej BSA należy delikatnie mieszać w rotatorze probówki w temperaturze pokojowej do czasu zakończenia procedury wstrzykiwania.
    UWAGA: Wysoce preferowane jest wstrzykiwanie znakowanych neutrofili wykonywane zaraz po znakowaniu. Jednakże, jeśli to konieczne, znakowane neutrofile mogą być trzymane w stanie mieszania przez dodatkowe 10-15 minut po znakowaniu bez naruszania integralności odpowiedzi neutrofili in vivo. Długotrwałe pobudzenie (ponad 60 minut po znakowaniu) doprowadzi do zbrylania się, śmierci neutrofili i mylących obserwacji in vivo.
  4. Tuż przed wstrzyknięciem należy ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze soli fizjologicznej, aby osiągnąć gęstość 2-5 x 106 komórek na 20 μL.

4. Wstrzyknięcie neutrofili

UWAGA: Znieczulenie musi być przeprowadzone zgodnie z wytycznymi lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania.

  1. Umieść zwierzę w zamkniętej komorze i podaj 3%-5% izofluranu (szybkość przepływu 2 l/min) za pomocą skalibrowanego parownika podłączonego do koncentratora tlenu.
  2. Oceń, czy zwierzę jest nieprzytomne, testując odruch wycofania łapy po uszczypnięciu tylnej opuszki łapy. Następnie przenieś zwierzę na podkładkę rozgrzewającą (37° C), aby utrzymać temperaturę ciała. Kontynuować podawanie izofluranu (1%-2%; szybkość przepływu 0,5 l/min) przez stożek nosowy.
    UWAGA BEZPIECZEŃSTWA: W celu ograniczenia narażenia personelu na toksyczny izofluran zaleca się stosowanie systemu dozowników wyposażonego w jednostkę filtrującą do wychwytywania krążącego izofluranu.
  3. Aby zoptymalizować jakość obrazowania, usuń włoski z ucha za pomocą cienkiego trymera. Procedurę tę można również wykonać dzień lub dwa przed eksperymentem.
    UWAGA: Odradza się stosowanie kremu do depilacji, ponieważ wiadomo, że zaostrza on reakcję zapalną w skórze myszy i wprowadza artefakty obrazowania.
  4. Połóż zwierzę na boku. Za pomocą taśmy chirurgicznej przytrzymaj krawędź ucha i spłaszcz ją wzdłuż podkładki rozgrzewającej. Delikatnie przyklej taśmę, aby zapobiec uszkodzeniu ucha.
  5. Napełnij strzykawkę wyposażoną w igłę 33 G zawiesiną neutrofili (2-5 x 10 6 komórek na 20 μl) i zamontuj ją na mikromanipulatorze.
    UWAGA: Kąt wstrzyknięcia między igłą a uchem w podkładce rozgrzewającej musi wynosić od 10° do 30°, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek i zwiększyć powodzenie wstrzyknięcia komórek.
  6. Delikatnie przesuń igłę (skosem do góry) w kierunku ucha i powoli przekłuj skórę. Gdy igła znajdzie się w skórze, powoli popchnij tłok i dostarcz 2-3 μl zawiesiny komórek.
    UWAGA: Należy unikać obszarów z widocznymi naczyniami krwionośnymi, ponieważ uszkodzenie naczynia krwionośnego powoduje niepożądaną i złożoną odpowiedź immunologiczną na wstrzyknięcie i problemy z obrazowaniem.
  7. Powtórzyć wstrzyknięcie w 2-3 różne miejsca ucha, najlepiej w odległości 2-3 mm od siebie. Nie "przepełniaj" ucha zawiesiną komórek.
    UWAGA: Wstrzyknięcie należy wykonać w środek ucha. Obwód ucha jest cienki i należy się z nim obchodzić ostrożnie, ponieważ można go łatwo uszkodzić, podczas gdy środkowa część jest grubsza, zawiera większe naczynia krwionośne i mniej mieszków włosowych i może wytrzymać większe objętości wstrzyknięć.
  8. Ostrożnie usuń taśmę chirurgiczną i pozwól zwierzęciu odzyskać przytomność pod nadzorem. Pozwól zwierzęciu odpocząć przez 1 godzinę przed obrazowaniem, aby tkanka i komórki mogły się zregenerować po zabiegu wstrzyknięcia.

5. Znieczulenie do IVM

UWAGA: Głębsze znieczulenie znacznie poprawia jakość obrazowania, zmniejszając artefakty ruchu spowodowane biciem serca i oddychaniem. Myszy, którym wstrzyknięto neutrofile, są poddawane znieczuleniu chemicznemu, które zapewnia głębsze uspokojenie niż znieczulenie wywołane gazem. Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z wytycznymi lokalnej instytucjonalnej Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania.

  1. Godzinę po wyzdrowieniu po wstrzyknięciu neutrofili należy znieczulić zwierzęta przez wstrzyknięcie podskórne zawierające mieszaninę ksylazyny/ketaminy/acepromazyny (odpowiednio 80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 i 4 mg·kg-1) w roztworze soli fizjologicznej.
    UWAGA: Aby zapewnić powtarzalność i wiarygodność wyników, zwierzęta muszą być utrzymywane w cieple od momentu znieczulenia do końca eksperymentu za pomocą poduszki grzewczej lub podkładki obiegowej wody podłączonej do pompy grzewczej.
  2. Aby utrzymać znieczulenie dłużej niż 1 godzinę, należy wstrzykiwać mieszaninę ketaminy/acepromazyny (odpowiednio 40 mg·kg-1 i 2 mg·kg-1) podskórnie co 40 minut. Okresowo monitoruj znieczulone myszy pod kątem oznak przytomności, testując odruch wycofania łapy.
  3. Dodatkowo w przypadku zabiegów obrazowania trwających dłużej niż 1 godzinę należy nałożyć na oczy sterylną, niefarmakologiczną maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas znieczulenia i utrzymać nawodnienie organizmu poprzez podskórne wstrzyknięcia roztworu soli fizjologicznej (200 μl co godzinę).
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować cyfrowo sterowany system oparty na perfuzji, aby zapewnić okresowe i płynne wstrzykiwanie roztworu znieczulającego i/lub dostarczanie płynów. Automatyczny sterownik strzykawki można skonfigurować tak, aby dostarczał żądaną objętość środka znieczulającego i zapewniał nawodnienie przez dłuższy czas. W tym celu można wprowadzić skrzydełkową igłę infuzyjną podskórnie do skóry grzbietowej zwierzęcia i zabezpieczyć taśmą chirurgiczną.

6. Obrazowanie

UWAGA: Konfiguracja zwierząt i opisane tutaj parametry obrazowania są zoptymalizowane dla odwróconego mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w pojedynczą linię laserową do wzbudzania i jednoczesnego zbierania emisji z różnych fluoroforów.

  1. Przed umieszczeniem znieczulonego zwierzęcia na stoliku mikroskopu upewnij się, że mikroskop jest włączony i że zarówno stolik, jak i soczewki są wstępnie podgrzane do 37 °C. Zakryj otwór na stoliku szklanym szkiełkiem nakrywkowym (grubość #1 lub 1.5), które jest wyrównane z podgrzewaną soczewką.
  2. Ostrożnie przenieś zwierzę na scenę. Jeśli obrazowanie jest planowane na dłuższy czas (>1 h), należy nałożyć maść okulistyczną i zabezpieczyć system perfuzyjny oparty na infuzji skrzydełkowej, jak opisano powyżej.
  3. Umieść kroplę soli fizjologicznej na środku szkiełka nakrywkowego i umieść na nim ucho z wstrzykniętymi neutrofilami. Delikatnie spłaszcz ucho za pomocą sterylnego bawełnianego wacika na środku szkiełka nakrywkowego, aby usunąć kieszenie powietrzne.
    UWAGA: Zastosowanie soli fizjologicznej (lub PBS) między uchem a szkiełkiem nakrywkowym zmniejsza załamanie światła spowodowane kieszeniami powietrznymi, zapewniając w ten sposób równomierny współczynnik załamania światła i doskonałą jakość obrazowania.
  4. Zabezpiecz ucho, delikatnie przyciskając drewniany patyczek (wyjęty z bawełnianego wacika) do boku ucha bliżej głowy zwierzęcia i blokując go za pomocą taśmy (Rysunek 1A).
    UWAGA: Zabezpieczony drewniany drążek minimalizuje artefakty ruchu spowodowane biciem serca i oddychaniem oraz znacznie zwiększa jakość obrazowania. Co ważne, drewniany patyczek musi być zapięty na tyle, aby ustabilizować ucho bez upośledzenia przepływu krwi.
  5. Za pomocą okularu mikroskopu znajdź obszar zainteresowania, a następnie przełącz się w tryb akwizycji wielofotonowej.
  6. Ustaw długość fali wzbudzenia laserowego na 900-930 nm, aby umożliwić jednoczesną akwizycję GFP/zielonego barwnika fluorescencyjnego, mTomato, a także kolagenu-I (przez SHG).
  7. Ustaw odpowiedni zestaw luster i kombinacji filtrów na detektorach do zbierania emitowanego światła (filtry pasmowoprzepustowe: Niebieski = 410-460 nm, Zielony = 495-540 nm, Czerwony = 580-640 nm).
    UWAGA: Wstrzyknięte neutrofile, po oznaczeniu barwnikiem zielono-fluorescencyjnym, wykazują silną zieloną fluorescencję, dzięki czemu są widoczne pod okularem mikroskopu, nawet jeśli zostaną wstrzyknięte w głębsze części ucha.
  8. Określ ustawienie najbardziej odpowiednie dla konfiguracji sprzętowej. Nawet jeśli migrujące komórki można śledzić w odstępach od 30 s do 1 minuty, obrazy zdarzeń subkomórkowych z większą prędkością (co najmniej <10 s). W poniższym przykładzie przedstawiono dwie różne konfiguracje obrazowania, aby pokazać różnicę między klasycznym IVM a ISMic.
    1. W klasycznym podejściu IVM do śledzenia migracji komórek i badania tkanki myszy gospodarza (Rysunek 1) użyj 30-krotnego obiektywu i skanera galvo o rozmiarze obrazu 512 x 512 pikseli (rozmiar piksela 0,83 μm) i ustaw przemieszczenie osi z za pomocą zmotoryzowanego stolika o wielkości kroku 2 μm, Umożliwia obrazowanie objętości o głębokości 30 μm co 30 s.
    2. W podejściu ISMic do obrazowania wysoce dynamicznej remodelingu membrany przy większym powiększeniu i rozdzielczości (Rysunek 2) użyj obiektywu 40x i skanera rezonansowego z 3-krotnym uśrednieniem i rozmiarem obrazu 512 x 512 pikseli (rozmiar piksela 0,25 μm) i ustaw przemieszczenie osi z za pomocą piezoelektrycznego o rozmiarze kroku 1 μm, Umożliwia obrazowanie objętości o głębokości 20 μm co 4-5 s.
  9. Wyzwól migrację neutrofili poprzez wywołanie sterylnego uszkodzenia laserem. Ustaw ostrość laser wzbudzający z dużą mocą wystarczającą do osiągnięcia co najmniej 80 mW22, na wąskim obszarze tkanki (20 μm x 20 μm) przez 10 s.
  10. Zidentyfikuj uraz wywołany laserem na podstawie silnych sygnałów autofluorescencyjnych pojawiających się we wszystkich kanałach i wynikającej z tego zmiany układu kolagenu (Rysunek 1D).
    UWAGA: Aby uzyskać wiarygodne wyniki, uraz musi być zawsze wywołany jak najdalej od naczyń krwionośnych; W przypadku pęknięcia komórki krwi uwolnione do tkanki wpłyną na jakość obrazowania, a także spowodują silną ogólną reakcję immunologiczną.
  11. Zapisz dane po zakończeniu eksperymentowania do dalszych analiz.
  12. Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi. W razie potrzeby można pobrać tkankę w celu utrwalenia i dalszej obróbki.

7. Reprezentatywna analiza danych

UWAGA: Dane mogą być wizualizowane i analizowane za pomocą oprogramowania do mikroskopu, oprogramowania firm trzecich lub programów dostosowanych do potrzeb klienta. Procedura i wykorzystywane narzędzia zależą od konkretnych potrzeb badaczy. Pokazano tutaj jeden z przykładów przepływu pracy w celu ilościowego określenia krzywizny błony i lokalnych zmian obszaru na krawędzi natarcia i z tyłu migrujących neutrofili.

  1. Otwórz pliki obrazowania za pomocą Imaris lub Fiji, aby zobrazować migrację neutrofili w 4D i określić jakość eksperymentu.
    UWAGA: Imaris i Fiji mogą odczytywać format obrazowania kilku marek mikroskopów.
  2. Przetwarzaj dane, wykonując następujące kroki, uruchamiając niestandardowe skrypty kodu MATLAB. Odczytaj wybrane pliki obrazowania za pomocą pakietu Bio-Formats28 dla MATLAB. Podziel każdą klatkę objętości 3D na segmenty za pomocą algorytmu Otsu29, aby zidentyfikować poszczególne komórki.
  3. Śledź zidentyfikowane obiekty na podstawie kryterium minimalnego przemieszczenia30.
  4. Określ aktywne kontury i granice obiektu.
    1. Wygeneruj maksymalną projekcję dla każdego obiektu zidentyfikowanego w przedziale czasowym.
    2. Zastosuj funkcję bwboundaries w programie MATLAB do maksymalnego rzutowania każdego zidentyfikowanego obiektu z kroku 7.2, aby wygenerować 100 punktów ograniczających.
    3. Zoptymalizuj punkty graniczne zidentyfikowane za pomocą algorytmu dynamicznego konturu, aby osiągnąć precyzję subpikseli31 (Rysunek 3A) za pomocą funkcji w pakiecie MATLAB pobranym za pośrednictwem http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/.
    4. Nałóż granice obiektu i indeks trajektorii obiektu określony przez śledzenie w kroku 7.3 z maksymalnym rzutowaniem oryginalnego obrazu, aby wygenerować wynik filmu z nałożoną warstwą 2D do wizualizacji i ręcznego sprawdzenia
      5. .
  5. W nałożonym filmie ręcznie zaznacz wszystkie obiekty zidentyfikowane jako migrujące komórki, wykluczając obiekty niebędące komórkami, obiekty stykające się i obiekty z niepełnymi obwiedniami. Zapisz indeksy śledzenia, klatki początkowe i końcowe trajektorii każdej komórki w arkuszu kalkulacyjnym, który będzie używany jako dane wejściowe dla kolejnych kroków wdrażanych przez skrypty kodu MATLAB.
  6. Śledź punkty graniczne komórki od każdej klatki do następnej zgodnie z kryterium minimalnego przemieszczenia. Użyj funkcji Polyarea w MATLAB, aby obliczyć obszar podkreślony przez sąsiednie punkty graniczne w dwóch kolejnych przedziałach czasowych (Rysunek 3C). Jeśli lokalna granica komórki przesuwa się na zewnątrz komórki, przypisz znak dodatni do zmiany obszaru. Jeśli lokalna granica komórki przesunie się do wewnątrz komórki, przypisz znak ujemny do zmiany obszaru.
  7. Zmierz lokalną krzywiznę membrany w każdym punkcie granicznym dla każdej ramki, dopasowując sąsiednie punkty graniczne do okręgu (5 na stronę; łącznie 11)32 (Rysunek 3B).
  8. Generuj kimografie za pomocą funkcji imagesc w MATLAB (Rysunki 3D, E), aby pokazać zmiany cech subkomórkowych w czasie i odnieść się do położenia komórki.

Wyniki

W tym miejscu przedstawiono dwa różne zestawy wyników, aby zilustrować klasyczne IVM oraz ISMic, które zapewniają odpowiednio rozdzielczość komórkową i podkomórkową. W pierwszym przykładzie neutrofile wyizolowano z myszy typu dzikiego (WT), oznakowano barwnikiem Cell Tracker Green w celu zabarwienia cytoplazmy, a następnie wstrzyknięto do myszy transgenicznej wykazującej ekspresję białka fluorescencyjnego celowanego w błonę komórkową (mysz mTomato, znana również jako mT/mG)33, Rycina 1 i Film 1 i Film 2). Mysz ta, jako biorca, umożliwiła wizualizację cech strukturalnych w tkance ucha, takich jak naczynia krwionośne, komórki rezydentne oraz mieszki włosowe (Rysunek 1C i Film 1) poprzez Podejście oparte na IVM (krok 6.8.1). Włókna kolagenowe, widoczne poprzez SHG (wykrywane przy połowie długości fali wzbudzenia) układały się w skomplikowaną sieć w skórze właściwej, do której wstrzyknięto neutrofile. Wzdłuż krawędzi mieszków włosowych (HF) zaobserwowano warstwę komórek nabłonkowych (tj. keratynocytów). Sporadycznie widoczne były artefakty z pozostałości włosów, powodujące lokalne wgłębienie skóry (H). Uszkodzenia wywołane laserem były łatwo widoczne ze względu na ich silną autofluorescencję wykrywaną we wszystkich kanałach oraz zmiany w organizacji kolagenu (Rycina 1D). Bardziej kompletny obraz trójwymiarowej architektury skóry oraz lokalizacji wstrzykniętych neutrofili można dostrzec w Film 1, przedstawiające stos Z (Z-stack) skóry od warstw zewnętrznych do wewnętrznych oraz rendering objętościowy 3D. Obrazowanie poklatkowe wykazało, że neutrofile badają skórę ucha i oddziałują z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) oraz tkanką gospodarza (Film 2Obrazowanie w tej rozdzielczości i pozyskiwanie stosu Z co 30 s umożliwia śledzenie komórek oraz pomiar parametrów motywności (tj. prędkości i kierunkowości), jednak precyzyjna i szczegółowa analiza przebudowy błony jest w tej rozdzielczości utrudniona.

W drugim przykładzie oceniono przebudowę błony poprzez metoda ISMic (krok 6.8.2) z użyciem neutrofili wykazujących ekspresję mGFP, oczyszczonych z LyzM-cre mT/mG myszy i wstrzyknięto je zwierzętom WT (Rycina 2A, schemat doświadczalny). Stosując protokół ISMic (Film 3 oraz nieruchome obrazy w Rycina 2B) i po uszkodzeniu laserem obserwuje się dynamiczne remodelowanie błony plazmatycznej podczas migracji, a także wyraźnie widoczne są formowanie się wypustek błonowych na krawędzi natarcia oraz retrakcja tylnej części komórek (Rysunek 2 i Film 3). Sekwencje time-lapse wyróżnione w Film 3 ujawniają złożoność oddziaływań z ECM. Rzeczywiście, neutrofile migrowały przez przestrzeń śródmiąższową, poruszając się albo wzdłuż włókien, albo w przestrzeniach między nimi. Na koniec, dla każdego punktu czasowego określono aspekty ilościowe, takie jak zmiany krzywizny oraz zmiany powierzchni w przedniej i tylnej części komórek. Wykorzystując komórkę opisaną w Rysunek 2B przykładowo, lokalna dynamika błony plazmatycznej została przeanalizowana przy użyciu potoku algorytmicznego (patrz krok 7) opartego na identyfikacji 100 punktów granicznych leżących u podstawy powierzchni komórki (Rysunek 3A). Zmiany lokalnej krzywizny (Rycina 3B) oraz w obszarze podkreślonym przez wypustki błony komórkowej (Rycina 3C) obliczono dla każdego punktu granicznego i przedstawiono dla każdego przedziału czasowego w formie kymografów (Rycina 3D,E). Zarówno przód, jak i tył komórek wykazują wyższą krzywiznę niż ich boki (Rysunek 3D); ujemne zmiany powierzchni (retrakcje, obszary niebieskie) są bardziej widoczne w tylnej części komórek niż na krawędzi prowadzącej, gdzie bardziej wyraźne są dodatnie zmiany powierzchni (protruzje, obszary czerwone) (Rysunek 3E).

Mikroskopia intravitalna myszy, znakowanie neutrofili, włókna kolagenowe in vivo, schematy doświadczalne.
Rycina 1: IVM neutrofili w skórze ucha myszy. (A) Schematyczna ilustracja przygotowania ucha na stole mikroskopu. (B) Schemat blokowy eksperymentu. (C) Reprezentatywny obraz skóry ucha myszy mTomato po wstrzyknięciu neutrofili znakowanych fluorescencyjnie, z różnymi projekcjami. Mieszek włosowy (HF), Naczynie krwionośne (BV), Naskórek (E), Skóra właściwa (D), Warstwa komórek podstawnych (BCL) oraz artefakt włosa (wynikający z pozostałego włosa na powierzchni skóry, H). (D) Reprezentatywny obraz skóry myszy po sterylnym uszkodzeniu laserowym: kanał niebieski (prawo), kanały zielony i czerwony (środek), obraz scalony (lewo). Uszkodzenie jest widoczne po lewej stronie obrazu poprzez silną emisję autofluorescencji w kanałach zielonym i czerwonym, a także zaburzenie ECM obserwowane jako otwór w włóknach kolagenu typu I. Na obrazach C i D, Zielony: neutrofile; Czerwony: tkanka gospodarza myszy; Cyjan: SHG kolagenu typu I. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces migracji neutrofili; schemat i mikroskopia komórek znakowanych GFP w układzie myszy biorcy.
Rycina 2: Time-lapse migracji neutrofila mGFP w uchu myszy WT. (A) Schemat doświadczenia. (B) Reprezentatywne klatki z Filmu 3. (C) Rendering wolumetryczny tej samej komórki w celu wizualizacji trójwymiarowej organizacji błony. Obszar wysokiej dynamiki błony zaznaczono strzałkami (czerwoną dla retrakcji i niebieską dla protruzji). (D) Powiększona i nachylona wizualizacja wyrenderowanej objętości komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ruchu granicy komórki; wykresy zmian krzywizny i pola powierzchni; mikroskopia i analiza danych.
Rysunek 3: Schemat analityczny do ilościowego określania dynamiki błon pozyskanej za pomocą ISMic. (A) Wyznaczanie konturu komórki i repartycja punktów granicznych (100 punktów granicznych) pomiędzy dwiema kolejnymi klatkami dla neutrofila mGFP opisanego na Rysunku 2B. (B) Kolorowe granice reprezentują lokalną krzywiznę błony wyznaczoną dla każdego punktu granicznego. (C) Lokalne zmiany pola powierzchni pomiędzy dwiema kolejnymi klatkami (obecna: niebieska, następna: czerwona). Zielone obszary reprezentują wyniki śledzenia lokalnego ruchu błony. Żółte strzałki wskazują ogólny kierunek przemieszczania się błony. (D) Kymograf krzywizny granicy komórki w czasie. Oś pionowa reprezentuje indeksy punktów granicznych, gdzie 1 i 100 reprezentują tył komórki zgodnie z kierunkiem jej migracji. (E) Kymograf lokalnej zmiany pola powierzchni odzwierciedlający protruzję błony (czerwony) i retrakcję błony (niebieski) komórki w czasie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Film 1: Neutrofile znakowane na zielono wizualizowane w uchu myszy mTomato za pomocą IVM. Czerwony: tkanka myszy gospodarza mTomato. Cyjan: Collagen-I SHG; Zielony: neutrofil. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: IVM neutrofili migrujących w skórze ucha myszy mTomato. Filmy stanowią projekcje maksymalnej intensywności stosu obrazów zarejestrowanych przez 27 min przy częstotliwości 5 klatek/s. Kolor czerwony: tkanka myszy gospodarza mTomato. Kolor cyjan: SHG kolagenu typu I; kolor zielony: neutrofil. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 3: ISMic przebudowy błony podczas migracji neutrofili w uchu myszy WT. Filmy przedstawiają projekcje maksymalnej intensywności stosu obrazów zarejestrowanego przez ῀8 min przy częstotliwości odświeżania 10 klatek/s. Czerwony: tkanka myszy gospodarza mTomato. Cyjan: SHG kolagenu typu I; Zielony: neutrofil mGFP; Jasnozielony: renderowany neutrofil. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Pomimo dziesięcioleci postępów w dziedzinie migracji komórek i przebudowy błon, w bardzo niewielu badaniach wykorzystano IVM do wizualizacji cech subkomórkowych u żywych zwierząt. Procedury opisane w tym protokole stanowią potężne narzędzie do uzyskania nowego wglądu w migrację neutrofili u żywych zwierząt, a w szczególności w przebudowę błony komórkowej podczas tego procesu. Takie podejście umożliwia badanie migracji neutrofili w warunkach fizjologicznych, biorąc pod uwagę nieodłączną złożoność mikrośrodowiska tkankowego. Rzeczywiście, zastosowanie MPM umożliwia wizualizację wielu cech w tkance gospodarza za pomocą kombinacji szczepów myszy wyrażających wybrane markery fluorescencyjne, znakowania tkanek egzogennych, wzbudzania endogennej fluorescencji oraz sygnałów generowanych przez SHG lub THG12,13.

Jednym z potencjalnych problemów, które należy wziąć pod uwagę w tej procedurze, jest fotouszkodzenie. Mimo że MPM jest ogólnie bezpieczniejszy niż mikroskopia konfokalna pod względem fotowybielania i fototoksyczności, należy zachować ostrożność podczas obrazowania żywych tkanek34. Fototoksyczność może drastycznie utrudnić wyniki, tworząc artefakty obrazowania, od małych jasnych plamek po większe obszary uszkodzonej tkanki, lub hamując/stymulując różne szlaki wewnątrzkomórkowe. Aby zapobiec fototoksyczności, moc lasera powinna być utrzymywana na minimalnym poziomie, a odpowiednie kontrole muszą być zaprojektowane w celu sprawdzenia, czy warunki fizjologiczne są utrzymywane (np. pomiar przepływu krwi, sondy do wykrywania stresu oksydacyjnego)35,36. Co więcej, w tej specyficznej procedurze, która obejmuje skórę, wysoce zalecane są szczepy albinosów, ponieważ melanina obecna u zwierząt o ciemnej sierści jest bardziej wrażliwa na fototoksyczność 36,37,38.

Do głównych ograniczeń procedury należą zastosowany system mikroskopowy i charakter neutrofili. Chociaż zastosowanie MPM znacznie zwiększa głębokość obrazowania tkanek w porównaniu z innymi technikami mikroskopii świetlnej (np. konfokalnym, wirującym dyskiem), możliwość wizualizacji dynamiki subkomórkowej w uchu jest ograniczona do najbardziej zewnętrznych warstw tkanki (80-100 μm). Wynika to z intensywnego rozpraszania światła wytwarzanego przez grubą warstwę ECM, co utrudnia badanie migracji w głębszych warstwach. Kolejnym ograniczeniem jest fakt, że neutrofile są bardzo krótkotrwałe i nie mogą być trzymane w kulturze wystarczająco długo, aby można było zastosować techniki edycji genów. Można temu zaradzić, modyfikując myszy tak, aby wytwarzały neutrofile pozbawione określonych genów lub zawierające wybrane mutacje, co oczywiście zwiększa koszty i czas trwania badań.

Opisane tutaj procedury, chociaż zaprojektowane do badania dynamiki błony, mogą być dostosowane do rozwiązania każdego problemu biologicznego komórki nie tylko w neutrofilach, ale także w innych typach komórek odpornościowych i komórkach migrujących. Informacje zebrane za pomocą IVM w małym powiększeniu dotyczące zachowań komórkowych (np. fenotypu migracyjnego, szybkości komórki i kierunkowości22) można uzupełnić i skorelować z informacjami mechanistycznymi uzyskanymi za pomocą ISMic na temat repozycji organelli, wydzielania białek, endocytozy, dynamiki jądrowej, dynamiki wapnia, organizacji cytoszkieletu i netozy. Zastosowanie manipulacji farmakologicznych i/lub genetycznych może uwypuklić rolę określonych szlaków molekularnych w procesie będącym przedmiotem zainteresowania, co czyni to podejście unikalnym i bardzo skutecznym.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez wewnętrzny program badawczy National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,5 mlUSA Scientific4036-3204
Probówki 15 mlCorning430766
Strzykawka 1 mlIgła Covidien8881501400
27 GTerumoSV*27EL
30x obiektywOlympusUPLSAPO30XS1,05 NA, Zanurzenie w oleju silikonowym
40xobiektyw OlympusUPLSAPO40XS1.23 NA, zanurzenie w oleju silikonowym
Naczynia 60 mmFalcon353002
6 ml strzykawkaKendall8881516937
Acepromazyna (10 mg / ml)Vet one13985-587-50
Bufor do lizy ACKJakość Biologiczna118-156-101
BalanceANDEK-1200A
BSASigma AldrichA9647
Sitko do komórek 40 i mikro; mSigma AldrichCLS431750
FijiImageJN/AOprogramowanie do wizualizacji/analizy obrazu
Oprogramowanie FluoviewOlympusN/AOprogramowanie do akwizycji
FVB szczep myszy JacksonNie dotyczyFVB
System znieczulenia gazowegoPatterson weterynaryjny07-8915712Link 7 model
Green Cell trackerThermoC2925Solubilizowany w kulturze komórkowej klasy DMSO, aby osiągnąć stężenie 1 mM (1000x)
Krem do depilacjiNairN/A
HBSS (bez Ca2+, Mg2+)Gibco14175-095
HEPES 1 M pH 7,3Jakość Biologiczna118-089-721
Histopaque 1077Sigma Aldrich10771-100ML
Histopaque 1991Sigma Aldrich11191-100ML
ImarisBitplaneN/AOprogramowanie do wizualizacji/analizy obrazu
IsofluraneVet one13985-528-40
Ketamina (100 mg / ml)Vet one13985-584-10
LyzM-cre x mT/mGwygenerowane w laboratoriumN/AC57BL/6J tło
Ręczny mikromanipulatorWPIM3301R
MATLABMatWorksN/AOprogramowanie do analizy
mtomato myszszczep generowany w laboratoriumN/AmT/mG, tło FVB Laser
wielofotonowySpectra PhysicsInsight DS+
Mikroskop wielofotonowyOlympusMPE-RS
Nanofil 10 i mikro; Strzykawka LWPINANOFIL
Nanofil 33 G igłaWPINF33BV-2
Podgrzewacz obiektywuBioptechsN/A
Sterownik grzałki obiektywuBioptechs150803
Maść okulistycznaMajorNDC 0904-6488-38
Koncentrator tlenuCaireVisionAire 5
PBS (bez Ca2+, Mg2+)Jakość Biologiczna114-058-131
Sól fizjologicznaJakość Biologiczna114-055-101
Grzałka scenicznaOkolabN/A
Sterownik grzałki scenicznejOkolabH401-T
Taśma chirurgiczna3M1538-1Hipoalergiczny
sterownik strzykawkiHarvard ApparatusPHD Ultra
Podkładki rozgrzewająceParkland ScientificA2789B
Pompa grzewczaParkland ScientificTP-700
Ksylazyna (100 mg / ml)Vet one13985-704-10
27 G Zestaw do infuzji skrzydełkowej Kendall 827112 tła

Bibliografia

  1. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  2. Oudin, M. J., Weaver, V. M. Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).
  3. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959(2015).
  4. Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells. International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).
  5. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  6. Wagner, R. Explanatory panels on physiology and development history 1839. , Leopold Voss. Leipzig, Germany. (1839).
  7. Yaniv, K., et al. Live imaging of lymphatic development in the zebrafish. Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).
  8. Vinegoni, C., et al. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (30), e1510(2009).
  9. Sack, F. -U. Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs. Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).
  10. Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy. PloS One. 6 (11), 28237(2011).
  11. Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1, 32-43 (2012).
  12. Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review. Cells. 10 (7), 1760(2021).
  13. Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization. Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).
  14. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  15. Shitara, A., et al. Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals. Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).
  16. Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  17. Subramanian, B. C., et al. The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation. The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).
  18. Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy. iScience. 16, 283-297 (2019).
  19. Porat-Shliom, N., et al. In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations. Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).
  20. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  21. Calvo-Rodriguez, M., et al. Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 11, 2146(2020).
  22. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  23. Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
  24. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586(2013).
  25. Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
  26. Lakschevitz, F. S. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  27. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745(2008).
  28. MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html (2022).
  29. Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  30. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  31. Xu, C., Prince, J. L. Snakes, shapes, and gradient vector flow. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).
  32. Driscoll, M. K., et al. Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell. Aging. 4 (2), 119-132 (2012).
  33. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  34. Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
  35. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), 104250(2014).
  36. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  37. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  38. Wu, X. S., et al. Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikroskopia intravitalnaobrazowanie subkomórkoweobrazowanie skóry myszymikroskopia wielofotonowadynamika błony plazmatycznejmodel uszkodzenia laserowegoobrazowanie time-lapseoddziaływanie z macierzą zewnątrzkomórkową
Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.