Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Podsumowanie

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Streszczenie

Krótkotrwałe lub przejściowe interakcje makromolekuł na błonach lipidowych i z nimi, interfejsie, gdzie zachodzi wiele istotnych reakcji biologicznych, są z natury trudne do oceny za pomocą standardowych metod biofizycznych. Wprowadzenie śledzenia cząstek wrażliwych na masę (MSPT) stanowi ważny krok w kierunku dokładnej ilościowej charakterystyki takich procesów. Z technicznego punktu widzenia było to możliwe dzięki pojawieniu się interferometrycznej mikroskopii rozpraszającej (iSCAT) opartej na fotometrii masowej (MP). Gdy strategia usuwania tła jest zoptymalizowana w celu ujawnienia dwuwymiarowego ruchu cząstek związanych z błoną, technika ta umożliwia analizę w czasie rzeczywistym zarówno dyfuzji, jak i masy cząsteczkowej nieznakowanych makrocząsteczek na błonach biologicznych. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół wykonywania i analizy śledzenia wrażliwych na masę cząstek systemów związanych z membraną. Pomiary wykonywane na komercyjnym fotometrze masowym osiągają rozdzielczość czasową w zakresie milisekund oraz, w zależności od układu MP, granicę detekcji masy do 50 kDa. Aby pokazać potencjał MSPT w zakresie dogłębnej analizy dynamiki makrocząsteczek katalizowanych błonowo w ogóle, przedstawiono wyniki uzyskane dla przykładowych układów białkowych, takich jak natywny interaktor błonowy aneksyna V.

Wprowadzenie

Kiedyś postrzegane jedynie jako bariera przed szerokim zakresem warunków otoczenia, membrany biologiczne są obecnie uważane za jednostki funkcjonalne i platformy katalityczne^1,2. Opierając się na ich zdolności do lokalizacji, wzmacniania i kierowania sygnałami w odpowiedzi na reakcje makrocząsteczkowe związane z błoną, interfejsy lipidowe stanowią kluczowy element dla szerokiej gamy procesów komórkowych, takich jak transport błonowy i kaskady sygnałowe^3,4,5. Służąc jako miejsce zarodkowania do składania stabilnych kompleksów, przyłączanie błony często opiera się na dynamicznej równowadze między formami makrocząsteczek związanymi z błoną i cytozolowymi, a zatem ma charakter przejściowy^6,7.

Pomimo ich wielkiego znaczenia w biologii, do tej pory wyzwaniem było opracowanie metod, które mogą zapewnić dostęp do niejednorodności składu, przestrzeni i czasu reakcji makromolekuł związanych z błoną w czasie rzeczywistym^7,8. Aby rozwiązać podstawowe procesy molekularne, decydujące są dwa aspekty eksperymentalne: wystarczająca rozdzielczość czasowa i czułość pojedynczej cząstki. W związku z tym techniki uśredniania całego obrazu, takie jak odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP), ale także znacznie bardziej czuła spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS), mają ograniczenia, ponieważ w dużej mierze oddzielają informacje przestrzenne od informacji czasowej⁹. Ważnym krokiem w kierunku scharakteryzowania dynamiki poszczególnych cząsteczek było zatem pojawienie się śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) w połączeniu z bardzo czułą mikroskopią. W szczególności skuteczne w tym zakresie okazały się dwa podejścia SPT. Po pierwsze, wykorzystanie fluoroforów jako etykiet i odpowiadających im systemów detekcji fluorescencji utorowało drogę do nanometrowej precyzji i milisekundowej rozdzielczości czasowej^10,11,12. Po drugie, detekcja oparta na rozpraszaniu przy użyciu nanocząstek złota poprawiła zarówno precyzję lokalizacji, jak i rozdzielczość czasową odpowiednio w zakresie subnanometrowym i mikrosekundowym^13,14,15,16. Pomimo wielu zalet obu podejść i ich znaczącego wkładu w mechanistyczne zrozumienie systemów związanych z błonami^17,18, obie techniki były do tej pory ograniczone: wymagają znakowania interesujących nas cząsteczek, co potencjalnie zaburza ich naturalne zachowanie i są niewrażliwe na skład molekularny cząstek związanych z błoną^19,20.

Oba te ograniczenia zostały ostatnio przezwyciężone dzięki wprowadzeniu nowatorskiego podejścia opartego na rozpraszaniu interferometrycznym (iSCAT), zwanego fotometrią masową (MP)^21,22,23. Technika ta pozwala na określenie rozkładu masowego biomolekuł w roztworze zgodnie z ich kontrastem iSCAT po wylądowaniu na szklanym interfejsie. Jednak w celu wykrycia i scharakteryzowania ruchomych cząsteczek dyfundujących na błonach lipidowych konieczne było opracowanie bardziej wyrafinowanego podejścia do analizy obrazu. W międzyczasie zostało to z powodzeniem wdrożone i pozwala wykrywać, śledzić i określać masę cząsteczkową pojedynczych, nieznakowanych biomolekuł dyfundujących na granicy lipidów^24,25. Technika ta, określana jako dynamiczna fotometria masowa lub śledzenie cząstek wrażliwych na masę (MSPT), umożliwia obecnie ocenę złożonych oddziaływań makromolekuł poprzez bezpośrednie rejestrowanie zmian w masie cząsteczkowej śledzonych jednostek, a tym samym otwiera nowe możliwości mechanistycznej analizy dynamiki molekularnej związanej z błoną.

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania próbek, obrazowania i potoku analizy danych wymaganego dla MSPT. W szczególności omówiono wymagania dotyczące próbek i potencjalne problemy, które mogą wystąpić podczas pomiaru i analizy. Co więcej, niezrównany potencjał w zakresie analizy systemów makromolekularnych oddziałujących z błonami jest prezentowany przez różne reprezentatywne wyniki.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Wytwarzanie pęcherzyków wielopłytkowych (MLV)
   1. Obliczyć ilość lipidów rozpuszczonych w chloroformie zgodnie z żądaną mieszaniną lipidów i wymaganą objętością zawiesiny.
      UWAGA: Dla buforu do reprodukcji (reakcji) zaleca się końcowe stężenie pęcherzyków wynoszące 4 mg/ml lipidów.
   2. Odpipetować obliczoną objętość lipidów do szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipet wyporowych wyposażonych w szklane końcówki.
   3. Odparować rozpuszczalnik lipidowy pod słabym strumieniem azotu i stale obracać fiolkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie lipidów na szklanych ściankach.
   4. Zapewnić pełne odparowanie rozpuszczalnika, umieszczając fiolkę pod stałym strumieniem azotu na 15 minut.
   5. Usunąć resztkowe ślady chloroformu poprzez suszenie próżniowe w eksykatorze próżniowym przez dodatkową godzinę.
   6. Ponownie uwodnić mieszaninę lipidów w żądanym buforze do ponownego zawieszania (reakcji) i dokładnie zwirować zawiesinę, aż film lipidowy zostanie rozpuszczony ze ścianek fiolki.
      UWAGA: Bufor reakcyjny powinien zapewniać aktywność i stabilność białka. Bufor reakcyjny zastosowany w tym badaniu zawiera 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 150 mM KCl i 5 mM MgCl₂. Należy pamiętać, że każdy bufor używany do rozcieńczania lipidów lub białek musi zostać przefiltrowany w celu usunięcia zakłócających zanieczyszczeń cząstkami stałymi (patrz krok 5).
2. Wytwarzanie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV)
   1. W kolejnych cyklach zamrażania i rozmrażania zawiesiny lipidów (etap 1.1.6) zagotować 500 ml wody w zlewce na gorącej płycie (między 70 °C a 99 °C) i przygotować pojemnik z ciekłym azotem.
   2. Szokowe zamrożenie rezawiesiny lipidów w ciekłym azocie. Przenieść fiolkę do zlewki z gorącą wodą, aż roztwór całkowicie się rozmrozi. Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania 8-10 razy lub do momentu, gdy wcześniej mętna mieszanina stanie się klarowna.
      UWAGA: Używaj odpowiedniej odzieży i sprzętu ochronnego, takiego jak okulary, rękawice i pęseta, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi z ciekłym azotem, zamrożoną fiolką z lipidami lub wrzącą wodą.
   3. W celu wytworzenia monodyspersyjnego rozkładu pęcherzyków należy zmontować wytłaczarkę lipidową i przetestować jej integralność za pomocą buforu reakcyjnego, aby upewnić się, że nie przecieka.
      UWAGA: Jeśli zaobserwuje się wyciek, ostrożnie ponownie zmontuj wytłaczarkę lipidową, aż nie będzie widoczne rozlanie bufora.
   4. Wytłaczaj zawiesinę lipidową przez 37 przejść przez błonę nukleoporową o wielkości porów 50 nm²⁶. Liczba przejść powinna być nierówna, aby zapewnić, że końcowa mieszanina SUV przekroczyła błonę nukleoporową, a zatem jest wolna od agregatów lipidowych lub pęcherzyków wielopłytkowych. Wytłaczane pęcherzyki zostaną później wykorzystane do utworzenia podpartych dwuwarstw lipidowych (patrz kroki 6 i 7).
      UWAGA: SUV-y mogą również powstawać w wyniku sonikacji uwodnionej mieszaniny lipidów. Jednak przygotowanie przez ekstruzję zapewnia bardziej monodyspersyjny rozkład SUV, co ułatwia pękanie pęcherzyków podczas tworzenia wspieranej dwuwarstwy lipidowej. Wytłaczane pęcherzyki można przechowywać w lodówce maksymalnie 3 dni.

2. Czyszczenie szkiełek mikroskopowych

1. Rozprowadzić równą liczbę szkiełek mikroskopowych (nr #1.5; grubość 0.17 mm) o wymiarach 24 mm x 60 mm i 24 mm x 24 mm w uchwytach mikroskopowych z politetrafluoroetylenu (PTFE).
2. Przenieść uchwyty PTFE do zlewek zawierających ultraczystą wodę i poddać je sonikacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: W zależności od zlewki należy dostosować objętość wody, aby całkowicie zakryć uchwyt PTFE.
3. Użyj pęsety, aby wyjąć uchwyty ze zlewki i zastąp wodę ultraczystym izopropanolem. Włożyć uchwyt do zlewki zawierającej izopropanol i ponownie poddać sonikacji przez 15 min.
   UWAGA: W zależności od zlewki, objętość izopropanolu należy dostosować, aby całkowicie pokryć uchwyt PTFE.
4. Zastąp izopropanol ultraczystą wodą i poddaj sonikacji zlewki zawierającej uchwyty przez 15 minut.
5. Wyjmij uchwyty z PTFE ze zlewek i wysusz szkiełka mikroskopowe w uchwycie pod stałym strumieniem azotu lub sprężonego powietrza.
   UWAGA: Upewnij się, że szkiełka podstawowe są prawidłowo czyszczone, używając rękawiczek, czystych zlewek i folii parafinowej do przykrycia każdej zlewki. W przeciwnym razie pył resztkowy może powodować znaczne wahania tła podczas pomiarów MSPT.

3. Hydrofilizacja preparatów mikroskopowych

UWAGA: Aby uzyskać jednorodną i płynną dwuwarstwę lipidową, hydrofilyzacja szkiełek jest niezbędna i musi być przeprowadzona tuż przed montażem komory przepływowej.

1. Umieść uchwyty z PTFE zawierające tylko szkiełka mikroskopowe o wymiarach 24 mm x 60 mm w czyszczalni plazmowej z tlenem jako gazem procesowym i wyczyść szkiełka mikroskopowe plazmą (parametry używane w tej pracy: 30% mocy, ciśnienie tlenu 0,3 mbar przez 30 s; szczegóły dotyczące zastosowanej myjki plazmowej znajdują się w Tabeli materiałów).
   UWAGA: Aby uzyskać membrany płynów, parametry czyszczenia plazmowego, takie jak moc, ciśnienie tlenu i czas czyszczenia, muszą być dostosowane do każdego instrumentu. W tym celu zaleca się stosowanie fluorescencyjnie znakowanych lipidów, aby zapewnić płynność błony, którą można określić ilościowo za pomocą odzyskiwania fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem (FRAP)²⁷. Jeśli parametry nie są zoptymalizowane dla danej konfiguracji, dyfuzja membranowa może być zakłócona z powodu zmniejszonej płynności membrany.

4. Montaż komór przepływowych

1. Przed montażem komory przepływowej należy przygotować następujące elementy: oczyszczone szkiełka mikroskopowe (24 mm x 24 mm), hydrofilizowane szkiełka mikroskopowe (24 mm x 60 mm), folię aluminiową, tekturę płaską, skalpel i taśmę dwustronną.
2. Owiń płaski karton folią aluminiową.
3. Oczyszczone szkiełka mikroskopowe o wymiarach 24 mm x 24 mm rozłóż na folii aluminiowej w odpowiedniej odległości między sobą.
4. Przymocuj dwustronne paski taśmy do górnej i dolnej krawędzi prowadnic.
5. Każde szkiełko mikroskopowe należy wyciąć skalpelem, tak aby można je było usunąć z folii aluminiowej. W rezultacie, każdy slajd powinien mieć paski dwustronnej taśmy przymocowane do górnej i dolnej krawędzi slajdu (patrz Rysunek 1).
6. Przymocuj szkiełko o wymiarach 24 mm x 24 mm za pomocą dwóch dwustronnych pasków taśmy do hydrofilizowanego szkiełka o wymiarach 24 mm x 60 mm, aby utworzyć ścieżkę przepływu między mniejszymi i większymi szkiełkami mikroskopowymi.
   UWAGA: Aby zapewnić czyste komory przepływowe, należy stale nosić rękawice i upewnić się, że stół warsztatowy jest wolny od kurzu.

5. Filtracja reakcyjnych

1. Sterylne filtrowanie wszystkich reakcyjnych przez membrany z octanu celulozy 0,45 μm, aby zapewnić minimalny sygnał tła podczas pomiarów MSPT.
   UWAGA: Jeśli obecność nukleotydów, takich jak ATP, jest niezbędna do udanego eksperymentu, należy pamiętać o potencjalnym wzroście sygnału tła. Zaleca się stosowanie tylko minimalnych ilości, które nadal zapewniają aktywność białka.

6. Wspomagane tworzenie dwuwarstwy lipidowej (SLB)

UWAGA: Zaleca się wykonanie formowania dwuwarstw lipidowych na fotometrze masy, aby wizualnie zapewnić skuteczne rozprzestrzenianie się pęcherzyków i całkowite usunięcie niezrośniętych pęcherzyków.

1. Rozcieńczyć świeżo wytłaczane SUV (więcej szczegółów w kroku 1) do końcowego stężenia 0,4 mg/ml w wymaganym buforze reakcyjnym. Opcjonalnie, aby przyspieszyć pękanie pęcherzyków, dodać 2 mM CaCl₂ do zawiesiny pęcherzyków.
   UWAGA: Kationy dwuwartościowe mogą powodować agregację niektórych lipidów, takich jak₂. W przypadku mieszanin zawierających takie lipidy należy powstrzymać się od stosowania CaCl₂ w celu ułatwienia pękania pęcherzyków lub innych dwuwartościowych kationów w buforze do resuspensji. Jeśli jest to wymagane w eksperymencie, kationy dwuwartościowe można dodać po pomyślnym utworzeniu podpartej dwuwarstwy lipidowej.
2. Przepłukać 50 μl zawiesiny pęcherzyków do komory przepływowej (krok 4) i inkubować komorę przez 2 min.
   UWAGA:, pęcherzyki lub roztwory białkowe można przepłukać przez komorę przepływową małym kawałkiem chusteczki do namaczania. Możliwe jest jednak również zastosowanie mechanicznego systemu pompowego.
3. Usunąć niestopione pęcherzyki poprzez wielokrotne (co najmniej trzykrotne) przemywanie komory przepływowej za każdym razem 200 μl buforu reakcyjnego.
   UWAGA: Pęcherzyki należy dokładnie wypłukać z komory przepływowej, aby zapewnić stabilny sygnał tła podczas pomiarów MSPT.

7. Generowanie krzywej kalibracyjnej

UWAGA: Aby przekształcić kontrast wykrytych cząstek na masę cząsteczkową, ich sygnał musi być skalibrowany przy użyciu białek o znanych rozmiarach. Zaleca się dostosowanie standardowego reżimu wielkości białka tak, aby obejmował zakres mas cząsteczkowych oczekiwanych dla systemu będącego przedmiotem zainteresowania.

1. Biotynylacja standardowych białek z resztą cysteiny
   1. Obliczyć odpowiednią ilość maleimidu-biotyny dla standardowego białka zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Inkubować białko wzorcowe z oznaczoną objętością biotyny maleimidowej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   3. Aby usunąć niesprzężoną biotynę maleimidową ze sprzężonego kompleksu biotyna-białko, należy przeprowadzić chromatografię wykluczania wielkości na kolumnie odpowiedniej dla białka będącego przedmiotem zainteresowania.
   4. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
      UWAGA: Aby przechowywać białko wzorcowe do dalszych pomiarów, należy zamrozić białko w jednorazowych porcjach w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
2. Pomiar białek wzorcowych dla krzywej kalibracyjnej
   1. W komorze przepływowej przygotować dwuwarstwę lipidową z 0,4 mg/ml wytłaczanymi SUV (więcej szczegółów patrz kroki 1 i 6) zawierającymi 0,01% mol. (v/v) Biotinyl Cap PE (biotynyl 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-kap).
   2. Dodać 50 μl dwuwartościowej streptawidyny o stężeniu 2,5 nM do dwuwarstwy w komorze przepływowej i inkubować przez 10 min.
      UWAGA: Dwuwartościowa streptawidyna została wyrażona i oczyszczona zgodnie z opisem w Howarth et al.²⁸. Można również stosować czterowartościową streptawidynę. Jednak zastosowanie dwuwartościowej streptawidyny może zmniejszyć możliwą stechiometrię reakcji między biotynylowanymi lipidami a standardowymi białkami, które są sprzężone z ugrupowaniem biotyny w celu ułatwienia przypisania gatunków.
   3. Usunąć niezwiązaną dwuwartościową streptawidynę za pomocą 100 μl buforu reakcyjnego.
   4. Dodać 50 μl standardowego białka sprzężonego z biotyną o długości 100 nM do dwuwarstwy w komorze przepływowej i inkubować przez 2 min.
      UWAGA: W zależności od skuteczności biotynylacji i tego, czy stosuje się streptawidynę dwu- czy czterowartościową, optymalne stężenia standardowego białka sprzężonego z biotyną i streptawidyny mogą się różnić.
   5. Wykonaj pomiar MSPT zgodnie ze szczegółami opisanymi w kroku 8.
      UWAGA: Warunki obrazowania muszą być identyczne zarówno dla próbki, jak i wzorców kalibracyjnych.

8. Obrazowanie

1. Tworzenie SLB i przygotowanie próbki
   1. Jak opisano bardziej szczegółowo w kroku 6, wprowadzić SUV-y z pożądaną mieszaniną lipidów (25 μl) do komory przepływu próbki i utworzyć podpartą dwuwarstwę lipidową. Dokładnie umyć komorę (trzykrotnie) 100 μl buforu reakcyjnego w celu usunięcia wszystkich niepołączonych pęcherzyków.
   2. Dodać 50 μl białka będącego przedmiotem zainteresowania do komory na próbkę.
      UWAGA: Ponieważ MSPT jest metodą jednocząsteczkową, stężenie białka musi być utrzymywane w zakresie od pM do nM, aby umożliwić niezakłócone wykrywanie i śledzenie cząstek.
2. Akwizycja wideo
   1. Ustaw żądane warunki obrazowania, takie jak rozmiar pola widzenia (FOV), liczba klatek na sekundę, czas ekspozycji i czas akwizycji w oprogramowaniu do akwizycji.
      UWAGA: Następujące ustawienia okazały się działać dla MSPT na komercyjnym fotometrze masowym (patrz Tabela materiałów): pole widzenia 128 pikseli x 35 pikseli, częstotliwość odświeżania 1 kHz co daje około 200 klatek na sekundę po późniejszym 5-krotnym uśrednieniu klatek i czas ekspozycji 0,95 ms.
   2. Dostosuj ostrość automatycznie lub ręcznie. W razie potrzeby przesuń FOV do pozycji z jednorodną membraną za pomocą bocznego sterowania.
   3. Utwórz folder projektu i rozpocznij nagrywanie filmu. Po zakończeniu nagrywania określ nazwę pliku w oknie dialogowym wyświetlanym przez oprogramowanie do akwizycji. Film jest następnie automatycznie zapisywany w folderze projektu jako plik MP do późniejszej analizy.
      UWAGA: Zapisać co najmniej trzy powtórzenia w różnych komorach przepływowych, aby zapewnić integralność poszczególnych membran i odtwarzalność wyników. Czas trwania filmu można ustawić z góry i zależy to od rodzaju eksperymentu. W większości przypadków zalecany jest czas akwizycji od 5 min do 7 min.
      UWAGA: Domyślnie nagrania filmowe w komercyjnym oprogramowaniu do masowej akwizycji fotometrów są kompresowane przed zapisaniem w celu zmniejszenia miejsca w pamięci. Jednak kompresja plików musi być wyłączona, aby umożliwić niestandardową analizę danych zgodnie z opisem w tym protokole. Szczegółowe informacje na temat wyłączania kompresji plików można znaleźć w instrukcji obsługi producenta.

9. Analiza danych

UWAGA: Potokowi analizy danych towarzyszą dwa interaktywne notatniki Jupyter (MSPT analysis.ipynb, Movie visualization.ipynb). Notesy Jupyter i skojarzone niestandardowe moduły języka Python niezbędne do przeprowadzenia analizy MSPT opisanej poniżej są dostępne w repozytorium publicznym: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit. Aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące poniższej analizy, czytelnicy są odsyłani do MSPT analysis.ipynb, do którego można uzyskać dostęp za pomocą powyższego linku.

1. Przetwarzanie wideo
   1. Usuń dominujące statyczne rozpraszanie światła za pomocą algorytmu estymacji tła w pikselach przy użyciu funkcji image_processing.mp_reader.
      1. Aby zastosować usuwanie tła, wybierz opcję continuous_median dla trybu parametrów i ustaw odpowiednią długość przesuwanego okna mediany (window_length) w sekcji B.1 notesu. Opcjonalnie zapisz filmy po usunięciu tła, aby użyć ich do wykrywania cząstek i łączenia trajektorii (ustawiając parametr save_processed_movies na True).
         UWAGA: Dostosuj rozmiar okna (window_length) do wartości od 101 do 2001 w zależności od gęstości cząstek na membranie, oczekiwanego współczynnika dyfuzji, szybkości akwizycji i wymaganej prędkości przetwarzania.
         UWAGA: Strategia usuwania tła działa dobrze, jeśli membrana nie jest zbyt gęsto upakowana i jeśli dyfuzja cząstek jest wystarczająco szybka (tj. każdy piksel przez większość czasu nie jest zajęty przez cząstkę). W przeciwnym razie kontrast cząstek będzie systematycznie niedoceniany, ponieważ nie można ich prawidłowo odróżnić od sygnału tła. Można to skompensować, zwiększając medianę rozmiaru okna kosztem szybkości obliczeń. Należy jednak pamiętać, że ustawienie zbyt dużego rozmiaru okna może negatywnie wpłynąć na wynik z powodu dryfu próbki. Kluczowa jest wizualna inspekcja przetworzonych filmów.
   2. Wykrywaj cząstki i ich położenie w całym filmie za pomocą funkcji particle_fitting.particle_fitter (patrz rozdział B.2 notebooka).
      1. Dostosuj czułość wykrywania cząstek za pomocą parametru progowego (thresh; patrz sekcja B.1 notatnika), który służy do podświetlania potencjalnych miejsc poprzez binaryzację obrazu. Wpływ różnych parametrów progowych na czułość detekcji punktowej można zbadać w osobnym notatniku (Movie visualization.ipynb). Wyniki detekcji cząstek są automatycznie zapisywane w plikach CSV w podkatalogu pliku filmowego.
         UWAGA: Ustawianie parametru progowego na arbitralnie niskim poziomie (na przykład w przypadku filmów wykonanych za pomocą użytego fotometru masowego, parametr progowy poniżej 0,0005) nie jest zalecane, ponieważ miejsca kandydujące będą zdominowane przez fałszywy szum, a tym samym wydłużą czas przetwarzania.
2. Łączenie cząstek w kolejnych klatkach w trajektorie za pomocą pakietu Pythona trackpy (v.0.5.0)²⁹.
   UWAGA: Łączenie trajektorii jest wykonywane w locie po wykryciu punktu. W rezultacie dodatkowy plik CSV zawierający informacje o trajektorii jest przechowywany w podkatalogu pliku CSV z detekcją cząstek.
   1. Usuń trajektorie ze zbyt małą liczbą punktów za pomocą parametru minimum_trajectory_length (patrz rozdział B.1 w notatniku), aby umożliwić solidne określenie współczynników dyfuzji. Szczegółowe wyjaśnienia dotyczące innych parametrów funkcji trackpy można znaleźć w dokumentacji trackpy.
3. Analiza trajektorii
   1. W sekcji C.1 notebooka określ liczbę klatek na sekundę (frame_rate) i rozmiar pikseli w nm (pixel_size), które były używane do pozyskiwania filmów. Utwórz listę plików CSV zawierających informacje o trajektorii zwrócone przez trackpy (patrz krok 9.2) za pomocą funkcji trajectory_analysis.get_csv_files (sekcja C.2 notesu).
   2. Dodatkowo określ nazwę pliku wyjściowego dla kontenera HDF5, który jest używany do przechowywania wyników dopasowania na dysku (sekcja C.3 notebooka). Przeanalizuj wszystkie trajektorie za pomocą funkcji trajectory_analysis.fit_trajectories w sekcji C.4 notesu, która iteruje po liście plików CSV. Ta funkcja wykorzystuje analizę rozkładu odległości skoku (JDD)³⁰ i średniego kwadratu przemieszczenia (MSD)³¹ w celu oszacowania współczynnika dyfuzji każdej trajektorii.
   3. Przeliczyć medianę kontrastu każdej trajektorii na odpowiadającą jej masę, korzystając z zależności kontrast-masa uzyskanej z kalibracji MSPT (patrz sekcja 7). Określić nachylenie (nachylenie) i punkt przecięcia z osią y (odsunięcie) linii kalibracyjnej, która odnosi kontrast iSCAT do masy cząsteczkowej (funkcja trajectory_analysis.apply_calibration; patrz rozdział C.5 notatnika). Ta funkcja dodaje kolumnę z medianą masy trajektorii do każdej ramki danych.
   4. Oceń pozorną gęstość cząstek na membranie za pomocą funkcji trajectory_analysis.gęstość_membrany, która zwraca medianę gęstości wyrażoną w postaci wykrytych cząstek i obecnych trajektorii podczas każdej klatki (patrz sekcja C.6 notatnika) jako dodatkowe kolumny w ramce danych.
      UWAGA: Ponieważ część cząstek zostanie utracona zarówno podczas procesu wykrywania, jak i łączenia trajektorii, rzeczywista gęstość cząstek może być wyższa. Aby uzyskać wiarygodne wyniki dotyczące gęstości cząstek, jak również histogramów masy, należy przeprowadzić oględziny reprezentatywnych zrzutów ekranu w celu sprawdzenia, czy warunki pomiaru są wiarygodne dla śledzenia pojedynczych cząstek (patrz krok 9.1.1).

10. Wizualizacja danych

1. Zilustruj korelację współczynnika masy i dyfuzji z dwuwymiarowym szacowaniem gęstości jądra (KDE), które jest oparte na pakiecie Pythona fastkde (v.1.0.19; https://pypi.org/project/fastkde/).
2. Aby wygenerować wykres, określ plik HDF5 zawierający wyniki MSPT (patrz krok 9.3.2 i sekcja D.1 notatnika) i wybierz pojedynczą (sekcja notesu D.2) lub połączoną ramkę danych (sekcja notesu D.3) jako dane wejściowe dla funkcji plotting.generate_2D_KDE (sekcja notesu D.4).
   UWAGA: Każdy wykreślony zestaw danych powinien zawierać idealnie więcej niż 1,000 trajektorii, aby uzyskać niezawodne 2D-KDE.

Wyniki

Zgodnie ze szczegółowym protokołem przygotowania dwuwarstw lipidowych (SLB) w komorach przepływowych (Rysunek 1), można wyraźnie rozpoznać wzór przypominający plamkę w natywnym widoku wszystkich wyświetlanych warunków (Rysunek 2). Efekt ten jest spowodowany chropowatością powierzchni szkła, która na ogół dominuje w sygnale rozpraszania i prowadzi do wizualnie nierozróżnialnych warunków (szkło, szkło z SLB lub szkło z SLB i przyłączonymi białkami). Obecność pęcherzyków jest jednak wyraźnie wyraźna ze względu na duży przekrój rozpraszania pęcherzyków i umożliwia obserwację pękania pęcherzyków i ich łączenia się w jednorodne błony (Rysunek 2B i film uzupełniający 1). Usuwając statyczny sygnał rozpraszania powierzchni szkła za pomocą podejścia ratiometrycznego, które podkreśla dynamiczne elementy w polu widzenia^24,25, można odkryć nieznakowane białka dyfundujące na błonie (Rysunek 2D), podczas gdy puste SLB (Rysunek 2C) lub samo szkło (Rysunek 2A) pojawia się jako zaszumiony obraz.

Nieodłączne tło pomiarów MSPT można oszacować lokalnie, dzieląc wartość każdego piksela przez medianę n poprzedzających i następnych pikseli filmu w tej samej pozycji obrazu (Rysunek 3). W rezultacie makrocząsteczki pojawiają się jako izotropowe funkcje rozproszenia punktowego (PSF), których ruch na błonie można obserwować, śledzić i określać ilościowo. W rzeczywistości dostępność zarówno kontrastu, jak i zachowania dynamicznego umożliwia bezpośrednie powiązanie wielkości cząsteczki z jej odpowiednim zachowaniem dyfuzyjnym, a wszystko to bez konieczności znakowania cząstki. Niemniej jednak, aby zinterpretować kontrast iSCAT wyznaczony podczas eksperymentów MSPT, konieczne jest przeprowadzenie kalibracji, która przekłada amplitudę sygnału na masę cząsteczkową. Można to osiągnąć poprzez przyłączenie biomolekuł o znanej masie do SLB za pomocą kompleksu biotyna-streptawidyna-biotyna (Figura 4A). Jako przykładową strategię można zastosować biotynylowane warianty albuminy surowicy bydlęcej (BSA), białka A (prA), fosfatazy alkalicznej (AP) i fibronektyny (FN), które wiążą się ze streptawidyną (STP), która z kolei wiąże się z lipidami zawierającymi biotynę (Biotinyl Cap PE) w błonie. Jak pokazano w Rysunek 4A, coraz wyraźniejszy kontrast tych przykładowych makrocząsteczek odzwierciedla rosnącą masę cząsteczkową odpowiednich wzorców biotynylowanych. Poprzez przypisanie każdego piku histogramów kontrastu ( Rysunek 4B) do odpowiedniej masy stanu oligomerowego białka wzorcowego ujawnia się liniowa zależność między kontrastem a masą^21,22 i może być następnie wykorzystana do analizy nieznanych układów makrocząsteczkowych (Rysunek 4C).

Dobrym przykładem demonstrującym stosowalność i możliwości MSPT do analizy mas cząsteczkowych, a tym samym badania stanów oligomerów i zdarzeń oligomeryzacji, jest rozważenie biotynylowanej aldolazy i biotynylowanej IgG (Rysunek 5). Powszechnie uważa się, że aldolaza jest homotetramerem³². Jednak rozkład masy rozwiązany przez MSPT charakteryzuje się czterema wyraźnymi pikami, co podkreśla obecność wielu populacji (Rysunek 5A). Podczas gdy pierwszy mniejszy pik odpowiada niezajętej streptawidynie i można się go spodziewać ze względu na konfigurację w tego rodzaju eksperymencie, można również wykryć kompleksy aldolazy z tylko dwiema podjednostkami (2SU) lub sześcioma podjednostkami (6SU) (Figura 5B). Co ciekawe, tetra- i heksameryczne kompleksy aldolazy-streptawidyny wykazują obniżony współczynnik dyfuzji w porównaniu z dimeryczną aldolazą i samą streptawidyną, co wskazuje na zwiększony opór lepkości, np. poprzez przyłączenie drugiego biotynylowanego lipidu do streptawidyny. Podobnie, biotynylowana IgG wykazuje trzy piki w rozkładzie masy, przy czym pierwszy pik ponownie odpowiada masie pojedynczej streptawidyny. Masa najliczniejszego piku odpowiada masie jednego łańcucha lekkiego i jednego ciężkiego łańcucha (1SU), tj. połowy przeciwciała IgG. Pełne przeciwciało z dwiema identycznymi połówkami (2SU) wykrywa się w około 11% przypadków. Spadek współczynnika dyfuzji wraz ze wzrostem rozmiarów kompleksu wskazuje na interakcje streptawidyny z więcej niż jednym biotynylowanym lipidem lub dodatkowy opór spowodowany przyłączoną IgG, lub jedno i drugie.

Oprócz samej analizy stanów oligomerów zależnych od błony, MSPT daje również szczególną zaletę korelacji dyfuzyjnego zachowania interesującej makrocząsteczki z jej stanem oligomerowym. Reprezentatywne wyniki dla tego typu analizy przedstawiono dla aneksyny V (AnV) i podjednostki B toksyny (CTxB), które wiążą się odpowiednio z dioleoilofosfatydyloseryną (DOPS) lub glikosfingolipidami (GM1), wbudowanymi w błonę (Figura 6A). Oba estymacje gęstości jądra (KDE) charakteryzują się jednomodalnym rozkładem masy i dyfuzji, co wskazuje na pojedynczy liczny gatunek o podobnym zachowaniu dyfuzyjnym. Stwierdzono, że szczytowe położenie masy cząsteczkowej i współczynnik dyfuzji wynoszą odpowiednio 49,8 ± 2,2 kDa i 1,4 ± 0,1 μm²/s dla AnV oraz 62,7 ± 3,1 kDa i 0,4 ± 0,1 μm²/s dla CTxB. Zmierzone współczynniki dyfuzji są porównywalne z poprzednio podawanymi wartościami uzyskanymi z szybkoobrotowych AFM i FRAP^33,34. Nieznacznie zmniejszona masa w porównaniu z masą oczekiwanej makrocząsteczki (52 kDa dla trimera AnV, 65 kDa dla pentameru CTxB) może wskazywać na obecność mniejszych kompleksów z mniejszą liczbą podjednostek w zespole. Chociaż różnica masy między białkami jest niewielka i bliska określonej granicy wykrywalności mikroskopu (≈50 kDa), ich współczynniki dyfuzji znacznie się różnią. W mieszaninie równomolowej, na przykład, porównując dyfuzję mieszaniny z rozkładem samych AnV i CTxB, można wywnioskować, że AnV występuje bardziej obficie na membranie niż CTxB (Rysunek 6B). Jeśli jednak stężenie CTxB zostanie podwojone w porównaniu ze stężeniem AnV, równowaga zostanie przesunięta w kierunku CTxB jako dominującego białka na błonie. Jak pokazano w przypadku mieszanin AnV i CTxB, MSPT nie tylko pozwala na rozróżnianie makrocząsteczek związanych z błoną na podstawie ich masy cząsteczkowej, ale także umożliwia rozróżnianie różnych populacji makrocząsteczek zgodnie z ich dyfuzyjnym zachowaniem.

Podobnie jak w przypadku wszystkich technik mikroskopowych, pewne wymagania eksperymentalne są niezbędne do osiągnięcia pożądanej jakości danych. Ważnym przykładem w tym kontekście są dokładnie oczyszczone szkiełka nakrywkowe. Ogólnie rzecz biorąc, jest to uważane za warunek wstępny dla eksperymentów jednocząsteczkowych związanych z mikroskopią, ale MSPT jest szczególnie wrażliwy na zanieczyszczenia próbki. Zwiększone rozpraszanie pochodzące od szklanej powierzchni nieoczyszczonych szkiełek nakrywkowych uniemożliwia jakiekolwiek ilościowe pomiary iSCAT. Warto zauważyć, że nawet resztki brudu lub kurzu na niedostatecznie oczyszczonym szkle mogą powodować znaczące zniekształcenia obrazu, rozpoznawalne jako jasne punkty w natywnym trybie obrazowania (Rysunek 7A). Chociaż defekty te są usuwane przez estymację tła ze względu na ich statyczny charakter, dokładne określenie kontrastu cząstki może być osłabione, a tym samym negatywnie wpływać na jej analizę ilościową. Innym częstym problemem napotykanym w eksperymentach MSPT są pozostałe pęcherzyki, które albo unoszą się (owinięte na pomarańczowo) w polu widzenia, albo niestopione pęcherzyki, które utknęły (zakreślone na niebiesko) w określonej pozycji na membranie i wyglądają jak duże pulsujące rozpraszacze (Rysunek 7B). Aby zminimalizować ich występowanie i zakłócenia w akwizycji filmu, zaleca się dokładne umycie SLB przed dodaniem białka oraz stosowanie świeżo przygotowanych mieszanin małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV) i kationów dwuwartościowych.

Jednym z czynników, który musi być brany pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów śledzenia cząstek wrażliwych na masę, jest gęstość makrocząsteczek związanych z interfejsem membranowym. Wysokie zagęszczenie cząstek na membranie może w rzeczywistości powodować problemy z dwóch powodów: i) Powiązanie detekcji cząstek z kolejnych ramek w trajektorie staje się niejednoznaczne, a tym samym zwiększa prawdopodobieństwo błędów i błędnie oszacowanych współczynników dyfuzji. ii) Masa cząstek, która jest wyodrębniana z amplitudy odpowiadającego im pasowania PSF, staje się systematycznie niedoszacowana, a piki masy poszerzają się, ponieważ oddzielenie statycznego sygnału tła od dynamicznego sygnału cząstek jest coraz trudniejsze (Rysunek 7C). Obecnie wizualna ocena jakości danych w procesie pozyskiwania filmów MSPT jest trudna na dostępnych mikroskopach komercyjnych, ponieważ zaimplementowany widok ratiometryczny w oprogramowaniu do akwizycji wykorzystuje usuwanie tła ustanowione dla fotometrii masowej²¹ zamiast algorytmu opartego na medianie opisanego tutaj i w odniesieniach^24,25 (Rysunek 7D). Ciągłe usuwanie tła w oparciu o średnie, stosowane do wizualizacji lądujących cząsteczek w fotometrii masowej, powoduje, że cząstki dyfundujące pojawiają się jako ciemne fronty z jasnymi ogonami, co sprawia, że plamy wydają się wysoce anizotropowe i zakłócają dopasowanie PSF podczas procedury wykrywania. W związku z tym zastosowanie zaimplementowanego w oprogramowaniu do akwizycji przetwarzania obrazu opartego na średnich nie nadaje się do analizy dyfuzyjnych biomolekuł na błonach.

Rysunek 1: Diagram przepływu poszczególnych kroków wymaganych do analizy interakcji białko-błona ze śledzeniem cząstek wrażliwych na masę (MSPT). Aby przygotować próbki do pomiarów MSPT, szkiełka szklane muszą być dokładnie oczyszczone i aktywowane plazmą tlenową. Po złożeniu w komorach przepływu próbek, małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV) są przygotowywane do tworzenia wspieranej dwuwarstwy lipidowej (SLB), a wszystkie reakcyjne są filtrowane w celu zmniejszenia rozpraszania tła. SUV-y są dodawane w celu utworzenia dwuwarstw lipidowych w komorach przepływowych. Opcjonalnie kationy dwuwartościowe, takie jak jony Ca²⁺, mogą być dodawane do SUV-ów, aby przyspieszyć pękanie pęcherzyków. Na koniec niskie stężenia białka będącego przedmiotem zainteresowania są wypłukiwane do komory reakcyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Natywny i ratiometryczny widok przykładowych powierzchni istotnych dla pomiarów MSPT. Reprezentatywne obrazy chropowatości powierzchni szkiełka podstawowego (A) podczas tworzenia podpartej dwuwarstwy lipidowej (B) z nienaruszoną podpartą dwuwarstwą lipidową (C) oraz przykładowych białek odtworzonych na SLB (D). Wszystkie cztery przykłady są wyświetlane w trybie natywnym, do którego można uzyskać dostęp podczas samego pomiaru, oraz jako przetworzone obrazy ratiometryczne po usunięciu tła na podstawie mediany. Podziałka skali wynosi 1 μm. Do analizy danych (patrz dołączony notatnik Jupyter; krok 9) użyto następujących parametrów: mediana rozmiaru okna (window_length) = 1001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Diagram krok po kroku etapów wymaganych do zbierania i analizy danych MSPT. Po zebraniu danych dla próbki będącej przedmiotem zainteresowania na fotometrze masowym, filmy są przetwarzane w celu usunięcia statycznego tła za pomocą przesuwającego się mediany w kierunku pikseli. Następnie cząstki kandydujące są identyfikowane i dopasowywane przez funkcję rozrzutu punktowego (PSF) przed ich połączeniem w trajektorie cząstek. Aby umożliwić wyznaczenie współczynnika dyfuzji dla każdej cząstki, stosuje się analizę przemieszczenia średniokwadratowego (MSD) lub rozkładu odległości skoku (JDD). Na tym etapie wartości kontrastu mogą zostać przekształcone w masy cząsteczkowe zgodnie z relacją kontrast-masa wyznaczoną za pomocą strategii kalibracji. Ostatnim krokiem jest filtrowanie trajektorii na podstawie ich długości lub gęstości cząstek membrany i wizualizacja za pomocą dwuwymiarowego szacowania gęstości jądra (2D-KDE). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Kalibracja relacji masa do kontrastu dla pomiarów MSPT. (A) Reprezentatywne ramki ratiometryczne uzyskane dla przykładowych kompleksów białkowych typu streptawidyna ze standardem dyfundujących na podpartej dwuwarstwie lipidowej zawierającej niewielki procent biotynylowanych lipidów (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE ratio of 70:29.99:0.01 mol%). Jako modelowe wzorce masy cząsteczkowej pokazano monowalentną streptawidynę²⁸ (tylko STP) lub dwuwartościową streptawidynę²⁸ w kompleksie z biotynylowaną albuminą surowicy bydlęcej (BSA), biotynylowanym białkiem A (prA), biotynylowaną fosfatazą alkaliczną (AP) lub biotynylowaną fibronektyną (FN). Miejsca kandydujące są podświetlone na pomarańczowo (przerywane okręgi), a udane detekcje cząstek są wyróżnione na czerwono (pełne kółka). Podziałki skali reprezentują 1 μm. (B) Rozkłady gęstości prawdopodobieństwa wartości kontrastu uzyskanych dla pięciu modelowych białek wzorcowych. Wszystkie wyświetlane dane reprezentują zbiorcze rozkłady trzech niezależnych eksperymentów na warunek: tylko STP n = 82 719; BSA n = 9,034; prA n = 22,204; AP n = 69 065 i FN n = 71 759 trajektorii. W porównaniu z liczbą cząstek wyznaczoną dla błon z białkami, liczba cząstek wykrytych na pustej dwuwarstwie jest znikoma przy umiarkowanych gęstościach błony (rysunek uzupełniający 1). Piki kontrastu brane pod uwagę przy kalibracji masy są oznaczone liniami ciągłymi, podczas gdy piki przerywane reprezentują stany oligomerowe, które nie są brane pod uwagę. (C) Krzywa kalibracyjna kontrastu do masy wyprowadzona na podstawie kontrastów pików w panelu D i odpowiednich mas sekwencyjnych kompleksów. Słupki błędów wyświetlają błąd standardowy lokalizacji pików oszacowanych za pomocą bootstrappingu (100 ponownych prób z 1 000 trajektorii każda). Do analizy danych (patrz Jupyter notebook; krok 9) użyto następujących parametrów: mediana rozmiaru okna (window_length) = 1 001 klatek, próg wykrywania (thresh) = 0,00055, zakres wyszukiwania (dmax) = 4 piksele, pamięć (max_frames_to_vanish) = 0 klatek, minimalna długość trajektorii (minimum_trajectory_length) = 7 ramek (tylko STP), 9 ramek (BSA/FN), 15 ramek (prA), 10 ramek (AP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Rozszyfrowywanie stanów oligomerowych białek związanych z błoną. (A) Oszacowanie gęstości ziarna 2D zarówno masy, jak i współczynnika dyfuzji czterowartościowej streptawidyny w kompleksie z biotynylowaną aldolazą (lewy panel) lub z modyfikowanym biotyną kozim przeciwciałem anty-IgG Rabbit (prawy panel). Rekonstytucję obu kompleksów przeprowadzono na podpartej dwuwarstwie lipidowej zawierającej DOPC, DOPG i Biotinyl Cap PE w stosunku odpowiednio 70:29,99:0,01 mol%. W sumie uwzględniono 116 787 trajektorii trzech niezależnych kontrprób dla kompleksu streptawidyna-aldolaza (gęstość cząstek 0,1 ^μm-2) i 348 405 dla kompozytu streptawidyna-IgG (gęstość cząstek 0,1 ^μm-2). Uwzględniono tylko cząstki o długości ścieżki wynoszącej co najmniej pięć klatek. Przedstawiono krańcowe rozkłady prawdopodobieństwa zarówno masy cząsteczkowej (na górze), jak i współczynnika dyfuzji (po prawej). x w obu panelach oznacza odpowiednie lokalne maksima KDE. (B) Porównanie oznaczonych mas oligomerów dla kompleksu czterowartościowej streptawidyny z aldolazą modyfikowaną biotyną (lewy panel) lub biotynylowaną IgG (prawy panel) z, zgodnie z masami sekwencji, oczekiwanymi masami cząsteczkowymi. Skrót SU wprowadza się w odniesieniu do podjednostki białka będącego przedmiotem zainteresowania. Słupki błędów wyświetlają błąd standardowy lokalizacji pików oszacowanych za pomocą bootstrappingu (100 ponownych prób z 1 000 trajektorii każda). Do analizy danych (patrz dołączony notatnik Jupyter; krok 9) użyto następujących parametrów: mediana rozmiaru okna (window_length) = 1 001 klatek, próg wykrywania (thresh) = 0,00055, zakres wyszukiwania (dmax) = 4 piksele, pamięć (max_frames_to_vanish) = 0 klatek, minimalna długość trajektorii (minimum_trajectory_length) = 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Rozpuszczanie dyfuzyjnego zachowania natywnych białek oddziałujących z błoną aneksyny V (AnV) i podjednostki B toksyny (CTxB). (A) Oszacowanie gęstości ziarna 2D zarówno masy, jak i współczynnika dyfuzji aneksyny V (lewy panel) i podjednostki B toksyny (prawy panel). Do rekonstytucji błony AnV i CTxB zastosowano kompozycje lipidowe odpowiednio 80:20 mol% DOPC do DOPS i 99,99:0,01 mol% DOPC do GM1. W sumie uwzględniono 206 819 trajektorii trzech niezależnych kontrprób dla AnV (gęstość cząstek 0,1 ^μm-2) i 142 895 trajektorii dla CTxB (gęstość cząstek 0,2 ^μm-2). (B) Oszacowania gęstości ziarna 2D mieszanin CTxB i AnV w stosunku odpowiednio 1:1 (lewy panel) lub 2:1 (prawy panel). Rekonstytucję mieszanin białkowych przeprowadzono na podpartej dwuwarstwie lipidowej zawierającej lipidy DOPC, DOPS i GM1 w stosunku 80:19,99:0,01 mol%. W sumie uwzględniono 42 696 trajektorii trzech niezależnych kontrprób dla mieszaniny 1:1 (gęstość cząstek 0,1 ^μm-2) i 264 561 trajektorii dla stosunku 2:1 (gęstość cząstek 0,3 ^μm-2). Zarówno dla (A), jak i (B) uwzględniono tylko cząstki o długości ścieżki wynoszącej co najmniej pięć ramek. Przedstawiono krańcowe rozkłady prawdopodobieństwa zarówno masy cząsteczkowej (na górze), jak i współczynnika dyfuzji (po prawej). Biały znak x w każdym panelu oznacza odpowiednie globalne maksimum KDE. Do analizy danych (patrz dołączony notatnik Jupyter; krok 9) użyto następujących parametrów: mediana rozmiaru okna (window_length) = 1 001 klatek, próg wykrywania (thresh) = 0,00055, zakres wyszukiwania (dmax) = 4 piksele, pamięć (max_frames_to_vanish) = 0 klatek, minimalna długość trajektorii (minimum_trajectory_length) = 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Potencjalne komplikacje w trakcie pomiarów MSPT lub podczas analizy danych. (A) Reprezentatywne obrazy chropowatości powierzchni wyświetlane zarówno w natywnym, jak i przetworzonym (usuwanie tła na podstawie mediany) widoku ratiometrycznym nieoczyszczonego szkiełka nakrywkowego. W obu przypadkach jasne punkty stanowią szczątkowe zanieczyszczenia powierzchniowe, które utrudniają pomiary bez artefaktów. (B) Przykładowe obrazy pozostałości pęcherzyków w polu widzenia po niedostatecznym myciu membrany. Zarówno pęcherzyki statyczne (zaznaczone na niebiesko), jak i dyfuzyjne (zaznaczone na pomarańczowo) będą pogarszać jakość pomiaru odpowiednio z powodu pulsacji i drgań lub z powodu ich ruchu kierunkowego. (C) Jako technika jednocząsteczkowa, MSPT wymaga niskich gęstości cząstek (reprezentatywny obraz, górny panel), aby umożliwić prawidłowe połączenie i określenie masy każdej cząstki. W przypadku dużych gęstości cząstek membranowych (panel środkowy) dopasowanie cząstek jest utrudnione, co wpływa na określenie masy (patrz dolny panel). (D) Reprezentatywne obrazy ratiometryczne cząstek dyfundujących na granicy faz membrany po usunięciu tła na podstawie średniej (górny panel) lub mediany. W przypadku cząstek dyfuzyjnych strategia usuwania tła oparta na średniej tworzy zniekształcone obrazy PSF cząstki, co można zobaczyć w małych wstawkach między górnym a środkowym panelem. W przeciwieństwie do tego, niezniekształcone cząstki PSF można uzyskać za pomocą podejścia opartego na medianie. Dolny panel: Porównanie profili linii przechodzących przez środek PSF uzyskanych po usunięciu tła na podstawie średniej lub mediany. W przypadku wszystkich obrazów natywnych i ratiometrycznych wyświetlanych na tym rysunku paski skali reprezentują 1 μm. Do analizy danych (patrz dołączony notatnik Jupyter; krok 9) użyto następujących parametrów: mediana rozmiaru okna (window_length) = 1 001 klatek, próg wykrywania (thresh) = 0,00055, zakres wyszukiwania (dmax) = 4 piksele, pamięć (max_frames_to_vanish) = 0 klatek, minimalna długość trajektorii (minimum_trajectory_length) = 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Porównanie błon bezbiałkowych i zajętych. Reprezentatywne obrazy nienaruszonej podpartej dwuwarstwy lipidowej przed (A) i po (B) dodaniu oczyszczonej streptawidyny (STP). Miejsca kandydujące, które zostały pomyślnie dopasowane do modelu PSF, są oznaczone kolorem czerwonym. (C) Rozkład prawdopodobieństwa kontrastu cząstek wykrytych na pustej membranie (tło błony, kolor szary) i na dwuwarstwie z dyfuzyjnymi cząstkami streptawidyny (kolor niebieski). Oba rozkłady prawdopodobieństwa reprezentują zbiorcze dane z trzech niezależnych eksperymentów o identycznych parametrach akwizycji i analizy filmu. Do analizy danych (patrz dołączony notatnik Jupyter; krok 9) użyto następujących parametrów: mediana rozmiaru okna (window_length) = 1 001 klatek, próg wykrywania (thresh) = 0,00055, zakres wyszukiwania (dmax) = 4 piksele, pamięć (max_frames_to_vanish) = 0 klatek, minimalna długość trajektorii (minimum_trajectory_length) = 7 klatek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy film 1: Przykładowy film pokazujący pękanie i stapianie pęcherzyków w jednorodną membranę zarejestrowany za pomocą masowego fotometru. Mediana rozmiaru okna przetwarzania obrazu (window_length) = 1 001 klatek. Podziałka: 1 μm. Zakres liczby kamer: = 16 892; biały = 65 408. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowy film 2: Przykładowe filmy pokazujące dyfuzję kompleksów aneksyny V (na górze) i biotynylowanej aldolazy (na dole) na dwuwarstwie, jak uzyskano z pomiarów MSPT. Mediana rozmiaru okna przetwarzania obrazu (window_length) = 1 001 klatek. Podziałka: 1 μm. Zakres kontrastu rozpraszania interferometrycznego: = -0,0075; biały = 0,0075. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Prezentowany protokół rozszerza fotometrię masową²¹, technikę analizującą masę pojedynczych biomolekuł adsorbujących na szkle, do jeszcze bardziej wszechstronnego narzędzia zdolnego do jednoczesnego pomiaru masy i dyfuzji nieznakowanych biomolekuł oddziałujących z błoną. Rozszerzenie tej analizy osiągnięto poprzez zastosowanie zmodyfikowanej strategii usuwania tła dostosowanej do ruchu bocznego cząsteczek^24,25. Ogólnie rzecz biorąc, usuwanie tła ma ogromne znaczenie dla podejść opartych na iSCAT, ponieważ silne rozproszenie chropowatości powierzchni szkła stanowi główną przeszkodę w analizie, a dokładne określenie lokalnego tła każdego piksela jest niezbędne do ilościowego określenia masy i lokalizacji cząstek. Oprócz analizy obrazu dostosowanej do ruchu cząstek, późniejsza detekcja cząstek, łączenie trajektorii i analiza danych uzupełniają nowatorską ekspansję MP w kierunku śledzenia cząstek czułych na masę (MSPT).

Ogólnie rzecz biorąc, dokładnie oczyszczone szkiełka podstawowe i czyste środowisko pracy są kluczowymi wymaganiami dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów MSPT. Ze względu na brak znakowania makrocząsteczek uzyskany sygnał jest z natury nieselektywny. Czyste próbki, a także właściwe obchodzenie się z próbkami mają zatem kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że obserwacje nie zostaną błędnie zinterpretowane. W szczególności, gdy badane są cząsteczki o niskiej masie cząsteczkowej, zatwierdza się pomiary kontrolne błon bezbiałkowych w celu oceny wkładu tła (rysunek uzupełniający 1). Oprócz włączenia pomiarów kontrolnych, zaleca się zatem postępowanie zgodnie z krokami przygotowania przedstawionymi na rysunku 2 dla każdej studzienki przepływowej. W połączeniu te środki bezpieczeństwa zapewnią, że wykryty sygnał pochodzi z biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania, a nie na przykład z zanieczyszczonej komory przepływowej, bufora lub membrany.

Oprócz środków ostrożności dotyczących projektu eksperymentalnego, należy również zachować ostrożność podczas przetwarzania obrazu MSPT. Podczas przetwarzania wideo należy starannie dobrać wartość trzech parametrów, aby zapewnić prawidłowe wyniki: i) długość mediany okna do usunięcia tła, ii) próg wykrywania cząstek oraz iii) maksymalny promień wyszukiwania podczas przypisywania linków. Większe okno środkowe (i) na ogół ułatwia oddzielanie dyfuzyjnych cząstek od nałożonego quasi-stałego tła. Jednak w przypadku zbyt dużych rozmiarów okien dryft próbki w końcu stanie się zauważalny i zmniejszy dokładność oszacowania tła. Optymalne ustawienia w dużym stopniu zależą od właściwości próbki i warunków pomiaru. Niemniej jednak wartość 1 001 może być używana jako solidny punkt wyjścia. Parametr progowy (ii) musi być dostrojony w zależności od najmniejszej masy cząsteczkowej oczekiwanej w próbce. Wartość poniżej 0,0005 nie jest zalecana dla pomiarów wykonanych za pomocą fotometru masowego użytego w tym badaniu. Aby przyspieszyć czas analizy, można wybrać wyższe wartości, jeśli spodziewana jest próbka o dużej masie cząsteczkowej. Promień wyszukiwania w łączeniu trajektorii (iii) określa maksymalną odległość radialną w pikselach, w której przesunięte położenie cząstki będzie wyszukiwane w kolejnych klatkach. Powinien być dostosowany do najszybszej cząstki w próbce, a jeśli jest to preferowane, można zamiast tego użyć adaptacyjnego zakresu wyszukiwania (zobacz dokumentację trackpy) w celu skrócenia czasu obliczeń. Szczególnie w początkowej fazie projektu zalecana jest ponowna analiza filmów o różnych parametrach w celu walidacji uzyskanych wyników.

Ze względu na jednocząsteczkowy charakter MSPT należy unikać pomiaru przy dużej gęstości cząstek membrany, ponieważ mogą one zakłócać dokładny kontrast i określenie masy. Wykazano, że gęstości poniżej jednej cząstki na mikrometr kwadratowy są korzystne dla pomiarów MSPT²⁴. Dodatkową kwestią są oczekiwane współczynniki dyfuzji w próbce. Chociaż ma zastosowanie do szerokiego zakresu współczynników dyfuzji, MSPT ma dolną granicę dostępnych współczynników dyfuzji. Lokalne ograniczenie do obszaru kilku pikseli przez znaczną część okresu mediany okna łączy cząstkę ze statycznym tłem. Dla warunków obrazowania stosowanych w tym protokole nie zaleca się pomiaru współczynników dyfuzji poniżej 0,01^μm2/s. Na przykład przy tej prędkości dyfuzji średnie kwadratowe przemieszczenie cząstki w połowie rozmiaru okna mediany wynosi około 4 pikseli, a zatem ma podobny rozmiar jak rozmiar PSF. W związku z tym oszacowanie statycznego tła prawdopodobnie będzie zawierało wkłady sygnału od samej cząstki, co skutkuje pozornie zmniejszonym kontrastem cząstki, aż w końcu zbliży się do poziomu szumu. Jednak współczynniki dyfuzji makrocząsteczek w zakresie od 0,05 do 10 μm²/s mogą być wyraźnie określone.

Aby jeszcze bardziej rozszerzyć zakres zastosowań MSPT, można przewidzieć postęp algorytmu tła opartego na medianie poprzez eliminację pikseli, które są tymczasowo zajęte przez cząstkę, lub poprzez korekcję dryfu próbki, co umożliwia większe rozmiary mediany okien. Oba podejścia złagodziłyby problemy związane z pomiarami przy dużej gęstości cząstek i powolnej dyfuzji. Na horyzoncie pojawiają się ulepszenia w zakresie czułości na mniejszą masę dzięki nowej generacji fotometrów masowych, które mogą zapewnić dostęp do biomolekuł mniejszych niż 50 kDa. W związku z tym przyszłe eksperymenty MSPT będą w stanie badać dynamikę pojedynczych cząsteczek i interakcje związane z błonami dla jeszcze szerszego zakresu mimikry błonowej, takiej jak amortyzowane dwuwarstwy i układy makromolekularne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aneksyna V	Sigma Aldrich	#SRP8026	przykładowe białko oddziałujące z błoną
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad Laboratories Inc.	#5000006	zestaw testowy Bradforda do oznaczania stężeń białka
albumina bydlęca znakowana biotyną	Sigma Aldrich	#A8549	przykładowe białko, które może być stosowane jako białko standardowe dla
podjednostki B toksyny	Sigma Aldrich	#SAE0069	oddziałujące z błoną
, #1.5, 24 x 24 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	#0102062
szkła nakrywkowe, #1,5, 24 x 60 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	#0102242
dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	#850375	lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków jednowarstwowych niezbędnych do wspomaganego tworzenia dwuwarstwy lipidowej
dioleoilo-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotynyl (18:1 Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	#870273	lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków unilamelarnych niezbędnych do wspomaganego tworzenia dwuwarstw lipidowych
dioleoilo-sn-glycero-3-fosfogliccerol (DOPG)	Avanti Polar Lipids	#840475	lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków jednowarstwowych niezbędnych do wspomaganego tworzenia dwuwarstwy lipidowej
dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-L-seryna (DOPS)	Avanti Polar Lipids	#840035	lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków jednowarstwowych niezbędnych do podparcia tworzenia dwuwarstwowych warstw lipidowych
	taśma dwustronna tesa	#57912-00000-02	potrzebna do montażu szklanych komór na próbki
Extruder	Avanti Polar Lipids	#610023	Wytłaczarka do lipidów umożliwiająca monodyspersyjną dystrybucję pęcherzyków
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#A39261	Biotyna ze stopioną maileimidem, która może być stosowana do biotynylacji standardowych białek dla MSPT
Fibronectin (Biotinylated)	Cytoskeleton Inc.	#FNR03-Przykładowe białko,	które może być używane jako standardowe białko do MSPT
Gel Filtration HMW Calibration Kit	Cytiva	#28403842	standardowych białek, np. aldolazy, która może być biotynylowana i stosowana jako wzorce masy cząsteczkowej dla MSPT
GM1 Gangliozyd (mózg, sól sodowa owczy)	Avanti Polar Lipids	#860065	lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków jednowarstwowych niezbędnych do wspomaganego tworzenia dwuwarstwowych lipidów
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H+L), Biotyna	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)	#31820	Przykładowe białko podkreślające istnienie różnych stanów białkowych
Izopropanol, 99,5%, do spektroskopii	Thermo Fisher Scientific	#10003643
Olejek	immersyjny o niskiej autofluorescencjiOlympus K.K.	#IMMOIL-F30CC
pET21a-Streptavidin-Alive	Addgene	#20860	wymagany do ekspresji i oczyszczania dwuwartościowej streptawidyny w połączeniu ze sobą
pET21a-Streptawidyna-Dead	Addgene	#20859	wymagany do ekspresji i oczyszczania dwuwartościowej streptawidyny w połączeniu ze sobą
Pierce Alkaline Phosphatase, biotynylowany	Thermo Fisher Scientific	#29339	przykładowe białko, które może być stosowane jako białko standardowe dla MSPT
Pierce Protein A, Biotinylated	Thermo Fisher Scientific	#29989	przykładowe białko, które może być stosowane jako białko standardowe dla MSPT
Refeyn Acquire	Refeyn Ltd.		oprogramowanie sterujące dla Refeyn OneMP
Refeyn One	Refeyn Ltd.	-	Fotometr masowy
sterylne filtry strzykawkowe 0,45 i mikro; m membrana octanu celulozy	VWR International	#514-0063	potrzebna do filtrowania cząstek z buforu będącego przedmiotem zainteresowania
czterowartościowa streptawidyna	Thermo Fisher Scientific	#SNN1001	czterowartościowa streptawidyna umożliwiająca obecność kilku miejsc wiązania biotyny
Hydrofilowa membrana Whatman Nuclepore, 0,05 i mikro; m Wielkość porów, 25 mm Okrąg	Cytiva	#110603	wielkość porów 50 nm jest zalecana do wspomaganego tworzenia dwuwarstw lipidowych w kontekście
myjki plazmowej MSPT Zepto model 2	Diener electronic GmbH	-