Artykuł metodologiczny

Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach

DOI:

10.3791/63587

⸱

21 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Department of Biochemistry and Microbiology, Rutgers University, 3Centro de Química Estrutural and Departamento de Química e Bioquímica, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwiększona częstotliwość analiz farmakologicznych i toksykokinetycznych metali i związków na bazie metali u danio pręgowanego może być korzystna dla środowiskowych i klinicznych badań tłumaczeniowych. Ograniczenie związane z nieznaną ekspozycją na wodę zostało przezwyciężone poprzez przeprowadzenie analizy metali śladowych na strawionej tkance danio pręgowanego przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metale i związki na bazie metali obejmują różnorodne farmakologicznie i toksykologiczne ksenobiotyki. Od toksyczności metali ciężkich po chemioterapeutyki, toksykokinetyka tych związków ma znaczenie zarówno historyczne, jak i współczesne. Danio pręgowany stał się atrakcyjnym organizmem modelowym w wyjaśnianiu farmako- i toksykokinetyki w badaniach środowiskowych i klinicznych badaniach translacyjnych. Chociaż badania nad danio pręgowanym mają tę zaletę, że są bardziej przepustowe niż modele gryzoni, istnieje kilka istotnych ograniczeń modelu.

Jedno z takich ograniczeń jest nieodłącznie związane ze schematem dawkowania na bazie wody. Stężenia wody z tych badań nie mogą być ekstrapolowane w celu zapewnienia wiarygodnych dawek wewnętrznych. Bezpośrednie pomiary związków na bazie metali pozwalają na lepszą korelację z odpowiedziami molekularnymi i biologicznymi związanymi ze związkami. Aby przezwyciężyć to ograniczenie w przypadku metali i związków na bazie metali, opracowano technikę trawienia tkanek larwalnych danio pręgowanego po ekspozycji i ilościowego określania stężeń metali w próbkach tkanek za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICPMS).

Metody ICPMS zostały użyte do określenia stężenia metali platyny (Pt) z cisplatyny i rutenu (Ru) z kilku nowych chemioterapeutyków opartych na Ru w tkance danio pręgowanego. Ponadto w protokole tym rozróżniono stężenia Pt, które zostały sekwestrowane w kosmówce larwy w porównaniu z tkanką danio pręgowanego. Wyniki te wskazują, że metoda ta może być stosowana do ilościowego oznaczania dawki metalu obecnego w tkankach larwalnych. Co więcej, metoda ta może być dostosowana w celu identyfikacji określonych metali lub związków na bazie metali w szerokim zakresie badań narażenia i dawkowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metale i związki na bazie metali nadal mają znaczenie farmakologiczne i toksykologiczne. Rozpowszechnienie narażenia na metale ciężkie i jego wpływ na zdrowie wykładniczo zwiększyło badania naukowe od lat 60. XX wieku i osiągnęło rekordowy poziom w 2021 roku. Stężenia metali ciężkich w wodzie pitnej, zanieczyszczenie powietrza i narażenie zawodowe przekraczają limity regulacyjne na całym świecie i pozostają problemem dla arsenu, kadmu, rtęci, chromu, ołowiu i innych metali. Nowatorskie metody ilościowego określania narażenia środowiskowego i analizy rozwoju patologicznego nadal cieszą się dużym zainteresowaniem1,2,3.

Z drugiej strony, medycyna wykorzystała właściwości fizykochemiczne różnych metali do leczenia klinicznego. Leki na bazie metali lub metaloleki mają bogatą historię zastosowań leczniczych i wykazały działanie przeciwko wielu chorobom, odnosząc największe sukcesy jako chemioterapeutyki4. Najsłynniejszy z metaloleków, cisplatyna, jest lekiem przeciwnowotworowym opartym na Pt, uznanym przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) za jeden z podstawowych leków na świecie5. W 2010 roku cisplatyna i jej pochodne Pt miały do 90% skuteczności w kilku nowotworach i były stosowane w około 50% schematów chemioterapii6,7,8. Chociaż chemioterapeutyki oparte na Pt odniosły niepodważalny sukces, toksyczność ograniczająca dawkę uruchomiła badania nad alternatywnymi lekami na bazie metali o wyrafinowanym dostarczaniu i aktywności biologicznej. Spośród tych alternatyw, związki na bazie Ru stały się najbardziej popularne9,10,11,12.

Potrzebne są nowatorskie modele i metodologia, aby nadążyć za zapotrzebowaniem na badania farmako- i toksykokinetyczne metali. Model danio pręgowanego leży na przecięciu złożoności i przepustowości, będąc kręgowcem o wysokiej płodności z 70% zachowaną homologią genów13. Model ten okazał się atutem w farmakologii i toksykologii, z obszernymi badaniami przesiewowymi dla różnych związków w celu odkrywania ołowiu, identyfikacji celu i aktywności mechanistycznej14,15,16,17. Jednak wysokoprzepustowe badania przesiewowe chemikaliów zazwyczaj opierają się na narażeniu na działanie wody. Biorąc pod uwagę, że wychwyt może być zmienny w zależności od właściwości fizykochemicznych związku w roztworze (tj. fotodegradacji, rozpuszczalności), może to stanowić główne ograniczenie korelacji w podawaniu dawki i odpowiedzi.

Aby przezwyciężyć to ograniczenie do porównania dawki z wyższymi kręgowcami, zaprojektowano metodologię analizy stężeń metali śladowych w tkance larwalnej danio pręgowanego. W tym przypadku oceniono krzywe dawka-odpowiedź śmiertelnych i subletalnych punktów końcowych dla cisplatyny i nowych związków przeciwnowotworowych na bazie Ru. Śmiertelność i opóźnione wylęganie oceniano dla nominalnych stężeń cisplatyny 0, 3,75, 7,5, 15, 30 i 60 mg/l. Akumulację Pt w tkance organizmu określono za pomocą analizy ICPMS, a wychwyt odpowiednich dawek przez organizm wynosił 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 i 461,9 ng (Pt) na organizm. Dodatkowo larwy danio pręgowanego były narażone na 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/L PMC79. Stężenia te określono analitycznie jako zawierające 0, 0,17, 0,44, 0,66 i 0,76 mg/l Ru. Protokół ten pozwolił również na rozróżnienie stężeń Pt sekwestrowanych w kosmówce larw w porównaniu z tkanką danio pręgowanego. Metodologia ta była w stanie dostarczyć wiarygodnych, solidnych danych do porównań aktywności farmakologicznej i toksykokinetycznej między dobrze znaną chemioterapeutykiem a nowym związkiem. Metoda ta może być stosowana do szerokiej gamy metali i związków na bazie metali.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio rerio szczepu AB (Danio rerio) były używane do wszystkich eksperymentów (zobacz Tabelę Materiałów), a protokół hodowli (#08-025) został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Obiektów Uniwersytetu Rutgers.

1. Hodowla danio pręgowanego

  1. Hoduj i utrzymuj danio pręgowanego w recyrkulacyjnym systemie siedlisk wodnych w cyklu 14 godzin światła: 10 godzin ciemności.
    1. Oczyść miejską wodę z kranu za pomocą filtracji piaskowej i węglowej, aby uzyskać wodę z systemu rybnego. Utrzymuj wodę w systemie wodnym na poziomie 28 °C, <0,05 ppm azotynów, <0,2 ppm amoniaku i pH między 7,2 a 7,7.
    2. Nakarm danio pręgowanego dietą składającą się z wyklutych cyst artemii, krewetek solankowych i pokarmu w postaci płatków dietetycznych dla ryb.

2. Protokół dawka-odpowiedź danio pręgowanego (Rysunek 1)

  1. Przygotuj roztwór wodny z jaj danio pręgowanego, pożywkę E3 lub wodę jajeczną z soli morskiej o stężeniu 60 μg/ml rozpuszczoną w wodzie dejonizowanej18. Unikaj stosowania błękitu metylenowego.
    UWAGA: Dzięki ICPMS zidentyfikowano interferencję izobaryczną wody z jaj danio pręgowanego dla tlenków strontu, które nakładały się na izotop rutenu. Staranne wypłukanie larw przed dalszą analizą rozwiązało ten problem. Pożywka E3 może być dla niektórych łatwiejszym wyborem ze względu na zastrzeżony skład komercyjnych soli morskich.
  2. Rozpuść metal lub związki na bazie metalu w E3 lub wodzie jajecznej. Wirować, aby rozbić materiał kruszywo i homogenizować roztwór.
    UWAGA: W doświadczeniu opisanym poniżej PMC79 i cisplatyna rozpuszczono w maksymalnych stężeniach 12,4 mg/L i 60 mg/L przy maksymalnym stężeniu 0,5% dimetylosulfotlenku (DMSO), aby było odporne na wytrącanie.
    1. Rozcieńczyć metale ciężkie lub związki na bazie metali, takie jak PMC79 i cisplatyna, E3 lub wodą jajeczną, przygotowując co najmniej 5 dawek skoncentrowanych.
      1. Rozpocząć od niskich stężeń roztworów podstawowych w czystym podłożu (tj. DMSO), a następnie rozcieńczyć E3 lub wodą jajeczną. Należy dokładnie rozważyć końcowe stężenia w nośniku.
        UWAGA: Niektóre związki na bazie metali, takie jak cisplatyna, szybko ulegają degradacji, a ich roztwory muszą być codziennie świeże. UWAGA: Z metalami ciężkimi i chemioterapeutykami należy obchodzić się ostrożnie. Zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dla badanego metalu. Cisplatyna może powodować podrażnienie oczu i skóry, być śmiertelna w przypadku połknięcia i może powodować toksyczność w nerkach, krwi, narządach krwiotwórczych i tkankach płodu. Unikaj wdychania oparów i kontaktu z oczami, skórą i ubraniem. Nosić nieprzepuszczalne rękawice i odzież oraz okulary lub gogle ochronne19.
  3. Ustaw zbiorniki hodowlane po południu przed eksperymentem w idealnym stosunku 2 samic do 1 samca z przegrodą między płciami20.
    1. Pociągnij przegrodę, gdy zapalą się światła w cyklu porannym.
    2. Pozwól danio pręgowanemu się rozmnażać.
      UWAGA: Czas hodowli zależy od wymaganego początkowego etapu ekspozycji. Na 3 godziny po zapłodnieniu pozostawić do hodowli przez około 2 godziny. Jaja osiągną 3 hpf po oczyszczeniu i segregacji jaj.
    3. Przenieś ryby hodowlane do czystego zbiornika.
    4. Zbierz jajka, przelewając wodę ze zbiornika przez sitko.
    5. Odwróć sitko na szalce Petriego i użyj butelki ze spryskiwaczem wypełnionej E3 lub wodą jajeczną, aby wypłukać jajka do naczynia.
    6. Oczyść naczynie z jedzenia i odpadów przed eksperymentalnym użyciem.
  4. Losowo umieścić około dwudziestu 3 zarodków hpf w każdej dawce do indywidualnych szklanych fiolek za pomocą pipety transferowej i niewielkiej ilości wody.
  5. Po tym, jak wszystkie zarodki znajdą się w fiolkach, usuń całą wodę z jaj i zastąp ją wystarczającą ilością roztworu dozującego, tak aby około 1 cal roztworu znajdował się powyżej wysokości jaja.
    UWAGA: Konieczność dechorionacji powinna być dokładnie przemyślana. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać więcej informacji.
  6. Codziennie obserwuj zarodki pod kątem zmian chorobowych lub śmiertelności. Ze względu na szybki rozwój embrionalnego danio pręgowanego, uzyskuj codzienne obrazy za pomocą dowolnego mikroskopu jasnego pola/kamery, aby zidentyfikować drobne zmiany między dniami.
  7. Po zakończeniu reakcji na dawkę (4-5 dni po zapłodnieniu [dpf], zgodnie z wytycznymi Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju [OECD]21), przed eutanazją należy połączyć 3-5 larw w celu pobrania próbki złożonej. Eutanazja przez szybkie chłodzenie przez szybkie zamrażanie w ciekłym azocie.
    UWAGA: Eutanazja poprzez przedawkowanie MS-222 lub metanosulfonianu trikainy może potencjalnie zakłócać późniejszą analizę ICPMS. W przypadku tego protokołu zachęca się do stosowania metod eutanazji o szybkim schładzeniu, aby zmniejszyć możliwość ingerencji.
  8. Przeprowadź 3 płukania tkanki wodą o wysokiej czystości (taką jak odwrócona osmoza), aby usunąć nadmiar związku z zewnętrznej strony tkanki.
  9. Przenieś próbki do polipropylenowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, które można używać w kwasach i kuchenkach mikrofalowych. Należy uważać, aby usunąć nadmiar wody, ponieważ pozostały płyn może rozcieńczyć kwas azotowy, a tym samym potencjał utleniający kwasu podczas degradacji tkanek.
    UWAGA: W tym momencie tkanka może być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy. W przypadku metali występujących w naturalnych ilościach czyszczenie rurek w kąpieli z 5% kwasem azotowym przed użyciem poprawi poziom tła otoczenia.

3. Trawienie tkanek i ocena ICPMS (Rysunek 2)

  1. Dodaj około 0,25 ml do 15 ml polipropylenowych probówek wirówkowych na maksymalnie 10 larw (~100 μg) kwasu azotowego o wysokiej czystości (69%). Ultradźwięki przez 1 godzinę w celu wstępnego trawienia próbek przy użyciu następujących ustawień: moc kąpieli ultradźwiękowej: 85 W; 42 kHz ± 6%; zakres temperatur: 19-27 °C.
    UWAGA: Nosić ochronniki słuchu podczas sonikacji. Kwas azotowy powoduje poważne oparzenia dróg oddechowych, oczu i skóry. Nosić pełne wyposażenie ochronne i pracować pod wyciągiem lub w miejscach o odpowiedniej wentylacji. Może być łatwopalny z innymi materiałami. Kwas azotowy należy stosować wyłącznie w dygestorium, aby zapobiec narażeniu na opary powstające podczas trawienia. Nie wdychać ani nie połykać.
    1. Wykonuj krótkie cykle trawienia tkanek (odstępy 5 minut) w bezpiecznym dla kwasów mikrofalowym komorze fermentacyjnej, aż cała tkanka zostanie widocznie utleniona (tj. jednolity, klarowno-żółty roztwór).
      UWAGA: Zaleca się, aby protokół mikrofalowy w Tabeli 1 został wykonany trzy razy i obejmuje 5-minutowy odstęp czasu między każdym etapem podgrzewania.
    2. Uważnie monitorować integralność probówek, aby uniknąć pęknięcia i przeprowadzać krótkie wirowania w wirówce (313 × g przez 1 min) między cyklami, aby przesunąć kondensację kwasu na dno probówki.
      UWAGA: Jeśli tkanka jest trudna do strawienia (zwłaszcza kosmówka), po trawieniu kwasem można użyć 30% nadtlenku wodoru o wysokiej czystości. Użyj nadtlenku wodoru (6,75 ml), aby rozcieńczyć stężenie kwasu do 3,5% i pozostaw próbki na noc w dygestorium. Nadtlenek wodoru rozkłada się doH2Oi nadaje się do analizy ICPMS. Co więcej, metale alternatywne mogą lepiej rozpuszczać się w kwasie solnym lub mieszaninie kwasu solnego i kwasu azotowego (tj. w wodzie królewskiej). Nadtlenek wodoru jest szkodliwy w przypadku połknięcia i powoduje poważne uszkodzenie oczu. Nosić ochronę skóry i oczu22,23.
  2. Gdy tkanka jest widocznie utleniona (tj. jednolity, klarowno-żółty roztwór), rozcieńczyć próbki w dygestorium do 3,5% kwasu azotowego, używając 6,75 ml wody o wysokiej czystości i dokładnie wymieszać.
    UWAGA: W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej. Ten krok nie jest konieczny, jeśli nadtlenek wodoru został dodany w celu wspomagania trawienia w kroku 3.1.
  3. Przeprowadzić dopasowaną do matrycy, 7-punktową krzywą kalibracyjną (zakres stężeń 0,001-10 ppb) przy użyciu certyfikowanego wzorca pierwiastkowego (tj. Pt lub Ru, w zależności od testu) z metalem będącym przedmiotem zainteresowania i optymalnym izotopem (izotopami), aby uwzględnić wszelkie potencjalne zakłócenia izobaryczne.
    1. Stosując stężenie podstawowe wodnego, certyfikowanego wzorca pierwiastkowego (Ru, Pt = 1000 ppb), pobrać 0,1 ml porcji i pipetować do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Rozcieńczyć 3,5% kwasem azotowym do końcowej objętości 10 ml w celu uzyskania roztworu wzorcowego o stężeniu 10 ppb.
    2. Używając zapasu 10 ppb, wykonaj następujące seryjne rozcieńczenia: 0,1, 1,0 i 5,0 ppb roztwory wzorcowe w 3,5% kwasie azotowym.
    3. Używając 0,1 podstawy, wykonaj następujące seryjne rozcieńczenia: 0,001, 0,005 i 0,01 ppb roztwory wzorcowe w 3,5% kwasie azotowym.
  4. Przygotuj przyrząd ICPMS (patrz Tabela materiałów) do analizy próbki w następujący sposób:
    1. Przed uruchomieniem przyrządu upewnij się, że zawór gazu argonowego jest otwarty, wszystkie rurki są dobrze podłączone, a czysty 5% kwas azotowy jest otwarty do płukania rurek i naczyń szklanych między analizami próbek.
    2. Sprawdź stan palnika i stożków oraz upewnij się, że skrzynka palnika jest dobrze zatrzaśnięta, a rurka drenażowa komory natryskowej jest prawidłowo podłączona do perypompy.
    3. Otwórz oprogramowanie (patrz tabela materiałów).
    4. Sprawdź odczyty podciśnienia i upewnij się, że wszystkie pompy turbo pracują na 100%.
    5. Kliknij START w oknie Stan systemu sterowania plazmą, aby zainicjować sekwencję startową, włączyć pompę plazmową, schładzacz plazmowy, oczyścić nebulizator i zapalić plazmę. Poczekaj, aż plazma zaświeci się i ustabilizuje, gdy okno stanu wskaże, że sekwencja startowa została zakończona. W tym momencie zwróć uwagę na zielone kropki w oknie Stan systemu, które wskazują, że wszystkie zasilacze są włączone.
    6. Na pasku menu kliknij Control | autosampler w menu rozwijanym. Wprowadź pozycję stojaka automatycznego podajnika próbek dla probówki zawierającej 5% kwasu azotowego. Pozwól, aby kwas dostał się do osocza.
    7. Na pasku menu kliknij Skany | Magnes w menu rozwijanym. W oknie MagnetScan wpisz 115 w polu Pozycja masy znacznika i kliknij Enter. Pozwól magnesowi skanować w całym zakresie mas w poszukiwaniu 115cali (114.6083 do 115.3749) przez 30 minut, podczas gdy instrument się nagrzewa.
    8. Po 30 minutach użyj kontrolki automatycznego podajnika próbek, aby przejść do pozycji wieloelementowego roztworu strojenia 1 ppb. Zassać roztwór strojeniowy i dostroić instrument, aby zoptymalizować odczyt sygnału. Wyreguluj pozycję palnika (X, Y, Z) tak, aby palnik był wyrównany ze środkiem stożków i natężeniem przepływu nebulizatora (~ 30 psi) w oknie sterowania plazmą. Dokonaj niezbędnych zmian w oknie dostrajania optyki jonowej dla źródła, detektora i analizatora.
    9. Po zoptymalizowaniu odczytu sygnału (~1,2 × 106 zliczeń/s dla 1 ppb na 115In), kliknij Stop w oknie Magnet Scan.
      1. Kliknij Kalibruj magnes i wybierz Niska rozdzielczość w wyskakującym okienku.
      2. Kliknij przycisk OK i otwórz plik "Mass Calibration (Low Resolution).smc", aby skalibrować Magnet.
        UWAGA: Kalibracja magnesu zmierzy liczby/s i dopasuje krzywą w następującym zakresie masy: od 7Li do 238U.
      3. Kliknij Zapisz | Służy do stosowania bieżącej kalibracji magnesu do analiz. W przypadku pomiaru nieznanych próbek o szerokim zakresie stężeń należy wykonać kalibrację detektora, aby porównać sygnały liczby impulsów jonów przy niskich stężeniach z osłabionymi sygnałami jonowymi wytwarzanymi przy wyższych stężeniach. Przeanalizuj próbki po zakończeniu strojenia i kalibracji.
    10. Na pasku menu kliknij Pozyskiwanie danych.
      1. Kliknij Konfiguracja metody w menu rozwijanym. Użyj istniejącej metody dostarczonej przez producenta lub utwórz metodę na podstawie interesujących Cię elementów. W razie potrzeby dostosuj tryb analizy, czas zatrzymania, opóźnienie przełączenia, liczbę przeciągnięć/cykli, rozdzielczość, tryb wykrywania i masę parkowania dla ustawień deflektora.
      2. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać ustawienia metody. Zoptymalizuj parametry dla każdego metalu i izotopu. W tabeli 2 przedstawiono konkretne parametry operacyjne zastosowane w tym badaniu.
    11. Na pasku menu kliknij Pozyskiwanie danych.
      1. Kliknij Uruchamianie wsadowe w menu rozwijanym. Alternatywnie kliknij ikonę BATCH pod paskiem menu. Zaimportuj parametry wsadowe z arkusza kalkulacyjnego lub utwórz sekwencję w oknie Uruchamianie wsadowe. Wprowadź typ próbki, pozycję stojaka automatycznego podajnika próbek, czas transferu, czas mycia, powtórzenia, identyfikator próbki i plik metody.
    12. Ułóż serię partii w następującej kolejności: roztwory wzorcowe dla krzywej kalibracyjnej (0,001-10 ppb Pt lub Ru), następnie wzorzec kontroli jakości, a następnie nieznane próbki.
      UWAGA: Roztwory wzorcowe są mierzone w liczbach/s w ICPMS, a regresja liniowa jest dopasowana do wzorców ze względnym odchyleniem standardowym (RSD) > 0,999. Niewiadome są również mierzone jako liczby/s i rozwiązywane dla stężenia w ppb przy użyciu regresji liniowej krzywej kalibracyjnej, y = mx + b. Przetwarzanie danych można również zakończyć za pomocą oprogramowania, do którego się odwołuje.
    13. Monitoruj dryft przyrządu i odtwarzalność próbki, uwzględniając standard kontroli jakości 0,5 ppb co 5-10 próbek.
      UWAGA: Odpowiednie normy kontroli jakości powinny być certyfikowanym standardowym materiałem odniesienia, innym niż wzorzec stosowany w krzywej kalibracyjnej.
szt. szt. szt. szt.
Watówmocprotokół
30050%5
30075%5
3000%5
30075%5

Tabela 1: Protokół mikrofalowego trawienia masy tkanki larwalnej. Próbki larw danio pręgowanego trawiono w 0,25 ml kwasu azotowego. Ta tabela została zmodyfikowana z 24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te wyniki zostały już wcześniej opublikowane24. Badania wychwytu tkankowego przeprowadzono z ekspozycją na cisplatynę i nowy związek przeciwnowotworowy na bazie Ru, PMC79. Śmiertelność i opóźnione wylęganie oceniano dla nominalnych stężeń cisplatyny 0, 3,75, 7,5, 15, 30 i 60 mg/l cisplatyny. Akumulację Pt w tkance organizmu określono za pomocą analizy ICPMS, a tkanka organizmu zawierała odpowiednie dawki 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 i 461,9 ng (Pt) na organizm (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół został wdrożony w celu określenia dostarczania i wchłaniania leków przeciwnowotworowych na bazie metali zawierających Pt lub Ru. Chociaż metody te zostały już opublikowane, w niniejszym protokole omówiono ważne kwestie i szczegóły dotyczące dostosowania tej metodologii do szeregu związków. Protokół OECD w połączeniu z trawieniem tkanek i analizą ICPMS pozwolił nam ustalić, że PMC79 był silniejszy niż cisplatyna i powodował rozproszoną akumulację w tkankach, co sugeruje odrębne mechanizmy. Ponadto, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które mogłyby zostać ujawnione przez któregokolwiek z autorów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Dodatkowo Brittany Karas jest wspierana przez T32NS115700 grantów szkoleniowych od NINDS, NIH. Autorzy uznają Andreię Valente i Portugalską Fundację na rzecz Nauki i Technologii (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) na dostawę PMC79.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczep AB Danio pręgowany (Danio reri)Daniopręgowany Międzynarodowe Centrum Zasobów Danio pręgowanyDziki typ ABDziki typ AB Danio pręgowany
klasy ACS Kwas azotowyVWR BDH ChemicalsBDH3130-2,5LPKwas azotowy (68-70%); służy do wytwarzania 10% roztworu do kąpieli kwasowej HNO3 do namaczania/wstępnego celanowania probówek wirówkowych
Aquatox Dieta rybna (płatek)Zeigler Bros, Inc.Pokarm w płatkach należy mieszać w proporcji 1:4 diety Aquatox Fish do płatków tropikalnych TetraMin i stosować jako
paszę Cysty artemii, krewetki solankowePentairAESBS90Jaja krewetek solankowych sprzedawane w 15-uncjowych, pakowanych próżniowo puszkach do wyklucia i wykorzystania jako pasza
ASX-510 Autosampler dla ICPMSTeledyne CETACAutomatyczny próbnik z regulowanym ruchem XYZ, przepływową stacją płukania i sondą o wymiarach wewnętrznych 0,3 mm. Kompatybilny z oprogramowaniem Nu AttoLab do programowalnych analiz wsadowych.   
WirówkaThermo ScientificCL 2Thermo Scientific CL 2 kompaktowa wirówka stołowa o zmiennym zakresie prędkości do 5200 obr./min; służy do doprowadzania próbki i kondensatu kwaśnego na dno probówki wirówkowej między odstępami między mikrofalowymi roztwarzaczami; pomaga w zatrzymywaniu próbek
Probówki wirówkoweVWR21008-105Ultra wysokowydajne polipropylenowe probówki wirówkowe z płaską nakrętką; objętość 15 ml; szczelne ze stożkowym dnem
Fiolki z gwintem z przezroczystego szkła klasy AFisherbrand03-339-25BPojedyncze szklane fiolki do ograniczania narażenia
DimetylosulfotlenekMillipore SigmaD8418Rozpuszczalnik lub nośnik do związków hydrofobowych
Mieszalnik wirowy o stałej prędkościVWR10153-834Mieszalnik wirowy; służy do homogenizacji próbki po roztwarzaniu i rozcieńczaniu w kwasie
Nadtlenek wodoru o wysokiej czystościMerk KGaA, EDM Millipore1.07298.0250Suprapur Nadtlenek wodoru (30%); używany do mineralizacji
próbek Kwas azotowy EDM o wysokiej czystościKwas azotowy MilliporeNX0408-2Omni Trace Ultra Kwas azotowy (69%); używany do trawienia próbki
Instant Ocean Sea SaltSpectrum Brands, Inc.Natychmiastowy ocean® Sól morskaRoztwór wodny jaj zawiera sól morską oceaniczną o końcowym stężeniu 60 &mikro; g/ml
Mars X Mikrofalowy system mineralizacjiCEM, Matthews, NCMikrofalowy system trawienia kwasem stosowany do trawienia i homogenizacji próbek w jednolitych warunkach. W przypadku tej metodologii metodę trawienia w otwartym naczyniu przeprowadzono przy użyciu jednorazowych probówek wirówkowych z polipropylenu o małej mocy (300 W). 
Roztwór wielopierwiastkowy 3SPEX CertiPREPCLMS-3Zawiera 10 mg/l Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn w 10% HCl/1% HNO3; stosowany jako standard kontroli jakości dla analiz Pt i Ru
Nu Instruments AttoM Spektrometr masowy z plazmą sprzężoną indukcyjnie o wysokiej rozdzielczości (HR-ICP-MS)nu Instruments/AmatekSpektrometr masowy z podwójnie ogniskowanym sektorem magnetycznym sprzężonym indukcyjnie z sektorem magnetycznym z elastycznym systemem szczelinowym o niskiej i wysokiej rozdzielczości oraz systemem detektora zakresu dynamicznego. Przetwarzanie danych i kwantyfikacja odbywa się za pomocą oprogramowania towarzyszącego NuQuant.
Roztwór wzorcowy platyny (Pt), NIST 3140Narodowy Instytut Standaryzacji i Technologii3140Przygotowany z ampułki zawierającej 9,996 mg/g Pt w 10% HCl; ; stosowany jako wzorzec kontroli jakości do analiz Pt
Roztwór wzorcowy platyny (Pt), jednopierwiastkowyWysokie standardy czystości100040-2Zawiera 1000 mg/l Pt w 5% roztworze
wzorcowym HCl Ruten (Ru), jednopierwiastkowyWysokie standardyczystości100046-2Zawiera 1000 mg/L Ru w 2% HCl
TetraMin Tropical FlakesTetra77101Płatki do zmieszania w stosunku 1:4 Aquatox Fish Diet do TetraMin Tropical Flakes i stosowania jako pasza
Kwas azotowy klasy metali śladowych VWRBDH Chemicals87003-261Aristar Plus Kwas azotowy (67-70%); stosowany do roztworu do płukania w ASX-510 Autosampler
Ultradźwiękowa łaźnia wodnaVWRB2500A-DTHUltradźwiękowa kąpiel wodna stosowana w celu wspomagania trawienia kwasami przed mineralizacją mikrofalową

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
  2. Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65(2018).
  3. Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821(2021).
  4. Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
  5. Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
  6. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  7. Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin-based chemotherapy of human cancers. Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97(2019).
  8. Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925(2019).
  9. Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
  10. Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995(2019).
  11. Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. Ruthenium antimetastatic agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).
  12. Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323(2018).
  13. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  14. Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
  15. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  16. Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
  17. Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
  20. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  21. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
  22. EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
  23. Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
  24. Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
  25. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
  26. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  27. Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Toksykokinetyka u ryb zebrafishkwantyfikacja dawki metalipobieranie platynypobieranie rutenuekspozycja przez wodtrawienie tkanekanaliza ICP MSpobieranie przez tkanki larwalnemetale chemioterapeutyczne

Powiązane artykuły