Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Gojenie się ran rogówki danio pręgowanego: od ścierania do analizy obrazowej zamknięcia rany

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63605

⸱

1 marca 2022

 ,  , 
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół skupia się na uszkadzaniu powierzchni oka danio pręgowanego poprzez ścieranie, aby ocenić późniejsze zamknięcie rany na poziomie komórkowym. Podejście to wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka rogówki i wykorzystuje skaningową mikroskopię elektronową do śledzenia zmian w morfologii komórek podczas zamykania rany.

Streszczenie

Jako przezroczysta powierzchnia oka, rogówka odgrywa kluczową rolę dla wyraźnego widzenia. Ze względu na swoje położenie tkanka ta jest podatna na zniewagi środowiskowe. Rzeczywiście, najczęściej spotykanymi klinicznie urazami oczu są urazy rogówki. Podczas gdy gojenie się ran rogówki było szeroko badane u małych ssaków (tj. Myszy, szczurów i królików), badania nad fizjologią rogówki zaniedbały inne gatunki, w tym danio pręgowanego, mimo że danio pręgowany jest klasycznym modelem badawczym.

Ten raport opisuje metodę wykonywania pobierania rogówki u danio pręgowanego. Rana jest wykonywana in vivo na znieczulonych rybach za pomocą zadzioru ocznego. Metoda ta pozwala na uzyskanie powtarzalnej rany nabłonkowej, pozostawiając resztę oka w stanie nienaruszonym. Po otarciu przez 3 godziny monitorowane jest zamknięcie rany, po czym rana jest reepitelializowana. Za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, a następnie przetwarzania obrazu, można zbadać kształt komórki nabłonka i wypukłości wierzchołkowe w celu zbadania różnych etapów zamykania rany nabłonka rogówki.

Cechy modelu danio pręgowanego pozwalają na badanie fizjologii tkanki nabłonkowej i zbiorowego zachowania komórek nabłonka, gdy tkanka jest zagrożona. Co więcej, zastosowanie modelu pozbawionego wpływu filmu łzowego może przynieść nowe odpowiedzi na temat reakcji rogówki na stres. Wreszcie, model ten pozwala również na określenie zdarzeń komórkowych i molekularnych zaangażowanych w dowolną tkankę nabłonkową poddaną fizycznej ranie. Metoda ta może być stosowana do oceny skuteczności leku w badaniach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Ponieważ większość nabłonków ma kontakt ze środowiskiem zewnętrznym, są one podatne na uszkodzenia fizyczne, co czyni je odpowiednimi do badania procesów gojenia się ran. Wśród dobrze przebadanych tkanek rogówka jest niezwykle przydatnym modelem w badaniu komórkowych i molekularnych aspektów gojenia się ran. Jako przezroczysta powierzchnia zewnętrzna zapewnia fizyczną ochronę oka i jest pierwszym elementem, który skupia światło na siatkówce. Chociaż struktura i skład komórkowy siatkówki różnią się w zależności od gatunku1, te elementy rogówki są na ogół podobne we wszystkich oczach typu kamerowego, niezależnie od gatunku.

Rogówka składa się z trzech głównych warstw2. Pierwszą i najbardziej zewnętrzną warstwą jest nabłonek, który jest stale odnawiany, aby zapewnić jego przezroczystość. Druga warstwa to zrąb, który zawiera rozproszone komórki, zwane keratocytami, w grubej warstwie ściśle zorganizowanych włókien kolagenowych. Trzecią i najbardziej wewnętrzną warstwą jest śródbłonek, który umożliwia dyfuzję składników odżywczych i płynów z komory przedniej do warstw zewnętrznych. Komórki nabłonkowe i zrębowe oddziałują na siebie poprzez czynniki wzrostu i cytokiny3. Ta interakcja jest podkreślona przez szybką apoptozę i późniejszą proliferację keratocytów po uszkodzeniu nabłonka4,5. W przypadku głębszej rany, takiej jak nakłucie, keratocyty biorą aktywny udział w procesie gojenia6.

Będąc w kontakcie ze środowiskiem zewnętrznym, fizyczne urazy rogówki są powszechne. Wiele z nich jest spowodowanych przez małe ciała obce7, takie jak piasek lub kurz. Odruch pocierania oczu może prowadzić do rozległych otarć nabłonka i przebudowy rogówki8. W zależności od wielkości i głębokości rany, te fizyczne urazy są bolesne i goją się przez kilka dni9. Optymalna charakterystyka gojenia się ran w modelu ułatwia zrozumienie komórkowych i molekularnych aspektów zamykania ran. Co więcej, takie modele okazały się również przydatne do testowania nowych cząsteczek o potencjale przyspieszającym gojenie rogówki, jak wcześniej wykazano10,11.

Opisany tutaj protokół ma na celu wykorzystanie danio pręgowanego jako odpowiedniego modelu do badania uszkodzeń fizycznych rogówki. Model ten jest bardzo wygodny w farmakologicznych badaniach przesiewowych, ponieważ umożliwia dodawanie cząsteczek bezpośrednio do wody w zbiorniku, a tym samym kontakt z gojącą się rogówką. Przedstawione tutaj szczegóły pomogą naukowcom w przeprowadzeniu badań na modelu danio pręgowanego. Uraz in vivo wykonuje się za pomocą stępionego zadzioru oka. Wpływ na komórki nabłonkowe przylegające do niego lub w pewnej odległości od niego można przeanalizować, usuwając specyficznie centralny nabłonek rogówki. W ostatnich latach liczne raporty koncentrowały się na takiej metodzie na rogówce gryzoni12,13,14,15,16,17; Jednak do tej pory tylko w jednym raporcie zastosowano tę metodę do danio pręgowanego18.

Ze względu na swoją prostotę, fizyczna rana jest przydatna do określenia roli komórek nabłonkowych w zamykaniu ran. Innym dobrze ugruntowanym modelem uszkodzenia rogówki jest oparzenie chemiczne, zwłaszcza oparzenie alkaliczne19,20,21. Jednak takie podejście pośrednio uszkadza całą powierzchnię oka, w tym obwodową rogówkę i zrąb rogówki19. Rzeczywiście, oparzenia alkaliczne potencjalnie wywołują owrzodzenia rogówki, perforacje, zmętnienie nabłonka i szybką neowaskularyzację22, a niekontrolowany wynik oparzeń alkalicznych dyskwalifikuje to podejście do ogólnych badań nad gojeniem się ran. Wiele innych metod jest również stosowanych do badania gojenia się ran rogówki w zależności od konkretnego celu danego badania (np. całkowite oczyszczenie nabłonka23, połączenie chemicznego i mechanicznego uszkodzenia ran o częściowej grubości24, ablacja laserem excimerowym dla ran rozciągających się do zrębu25). Zastosowanie zadzioru ocznego ogranicza punkt ogniskowy do odpowiedzi nabłonka na ranę i zapewnia wysoce powtarzalną ranę.

Jak w przypadku każdej metody zadawania ran, użycie zadzioru do oczu ma swoje wady i zalety. Główną wadą jest to, że odpowiedź jest głównie nabłonkowa, nie odzwierciedla idealnie otarć obserwowanych w warunkach klinicznych. Metoda ta ma jednak wiele zalet, w tym łatwość, z jaką można ją skonfigurować i wykonać, jej precyzję, powtarzalność oraz fakt, że jest nieinwazyjna, co czyni ją metodą dobrze tolerowaną przez zwierzęta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez krajową komisję ds. eksperymentów na zwierzętach.

1. Przygotowania

  1. Przygotuj wcześniej roztwór podstawowy tricainy używany do znieczulenia26 (0,4% roztwór podstawowy używany w tym protokole). Używaj rękawiczek i przechowuj materiały w dygestorium, gdy tylko jest to możliwe.
    1. Na 50 ml 0,4% roztworu odważyć 200 mg proszku tricainy do probówki o pojemności 50 ml. Rozpuścić proszek w około 45 ml podwójnie destylowanej wody.
    2. Dostosuj pH roztworu podstawowego tricainy do 7 za pomocą 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 ml). Dodać roztwór Tris do wywaru z tricainą w porcjach, dokładnie wymieszać bulion po każdej podwielokrotności i sprawdzić pH po każdym dodaniu Tris.
  2. Przed eksperymentem przygotuj 0,02% roztwór roboczy tricainy.
    1. Rozmrozić 2 ml 0,4% roztworu podstawowego i dodać do 40 ml wody systemowej (stężenie końcowe 0,02%). Umieść roztwór w małym pojemniku.
  3. Przed eksperymentem należy przygotować wodę regeneracyjną zawierającą środek przeciwbólowy. Używaj rękawiczek i trzymaj materiały w dygestorium, gdy tylko jest to możliwe.
    1. Na jeden litr wody regeneracyjnej odważ 2,5 mg chlorowodorku lidokainy w proszku i rozpuść go w świeżej wodzie systemowej. Sprawdź pH i w razie potrzeby dostosuj do 7
      2. .
  4. Przed eksperymentem należy przygotować roztwór utrwalający (2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M roztworze fosforanu sodu (Na-PO4) o pH 7,4). Używaj rękawiczek i przechowuj materiały w dygestorium.
    1. Na 10 ml roztworu utrwalającego odpipetować pipetą 5 ml 0,2 M Na-PO4 do probówki. Dodaj 0,5 ml 50% aldehydu glutarowego i dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby uzyskać końcową objętość 10 ml. Chronić roztwór przed światłem i przechowywać go na lodzie lub w lodówce przed użyciem.
      UWAGA: Jeśli próbki muszą być pobierane przez kilka godzin po zranieniu, należy przygotować roztwór utrwalający tuż przed użyciem.
  5. Przygotuj sprzęt do zranienia (Rysunek 1).
    1. Napełnij zbiorniki odzysku lub mniejsze pojemniki wodą systemową.
    2. Przygotuj zadzior okulistyczny. Sprawdź, czy końcówka zadziorów jest czysta. W razie potrzeby usuń resztki komórek wilgotnym wacikiem.
    3. Wykonaj nacięcie z boku miękkiej gąbki i zwilż gąbkę wodą systemową. Umieść gąbkę na podstawie/stoliku mikroskopu preparacyjnego. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo miejsca roboczego do korzystania z zadziorów i wystarczające oświetlenie z boków i/lub z góry, aby prawidłowo widzieć powierzchnię oka.

2. Znieczulenie

  1. Przenieś rybę ze zbiornika do 0,02% roztworu tricainy za pomocą siatki tak delikatnie, jak to możliwe.
  2. Monitoruj znieczulenie, sprawdzając, czy nie ma reakcji na lekki bodziec mechaniczny.
    UWAGA: W celu uzyskania spójnego znieczulenia, przed ścieraniem dorosłych ryb AB typu dzikiego stosuje się 2-minutową ekspozycję na tricainę. W przypadku ryb o innym pochodzeniu genetycznym może być potrzebny inny czas trwania.

3. Ścieranie

  1. Delikatnie umieść znieczuloną rybę łyżką w nacięciu na gąbce, głową wystającą z powierzchni gąbki.
  2. Włącz zadzior i ustaw ostrość widok mikroskopu na powierzchni oka.
  3. Ostrożnie zbliż się do powierzchni oka końcówką zadziorów. Dotykając powierzchni oka, zacznij przesuwać końcówkę zadziorów po powierzchni oka okrężnymi ruchami. Unikaj gwałtownych ruchów, ponieważ może to prowadzić do przechylenia oka w oczodole i ześlizgnięcia się końcówki zadziorów.
  4. Po zakończeniu ścierania ostrożnie umieść rybę w wodzie systemowej zawierającej środek przeciwbólowy w celu odzyskania sprawności.
  5. Wyczyść zadziory zaraz po użyciu wilgotnym wacikiem.

4. Pobieranie próbek

  1. W wybranym momencie podnieś rybę siatką i umieść ją w 0,02% roztworze tricainy. Trzymaj zwierzę w roztworze, aż ruch wieczkowy całkowicie ustanie, a ryba nie zareaguje na dotyk.
  2. Umieść rybę na szalce Petriego łyżką i przytrzymaj ją pęsetą. Odetnij głowę rybie nożyczkami do preparowania. Unikaj zadrapań na powierzchni oka podczas obchodzenia się z próbką.
  3. Umieścić tkankę w probówce zawierającej 0,1 M Na-PO4.
    1. Przepłukać tkankę, zastępując 0,1 M Na-PO4 czystym buforem, tak aby w roztworze nie pozostała krew.

5. Przetwarzanie próbek do mikroskopii elektronowej

  1. Utrwalić tkankę w 2,5% aldehydzie glutarowym/0,1 M Na-PO4 (pH 7,4) przez ~24 h w temperaturze +4 °C. Trzymaj próbkę na obracającym się/wstrząsającym uchwycie na próbkę, aby zapewnić prawidłowe utrwalenie.
  2. Usunąć roztwór utrwalający i kilkakrotnie przepłukać próbkę 0,1 M Na-PO4.
  3. W tym momencie należy przeanalizować próbkę.
    1. Umieścić próbkę na kropli 0,1 M Na-PO4 na płytce rozwarstwiającej. Jeśli konieczne jest zobrazowanie obu oczu tej samej ryby, przeciąć próbkę głowy na dwie części za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych.
    2. Alternatywnie, zbieraj oczy tylko poprzez ostrożne umieszczanie końcówek cienkiej pęsety w oczodole od strony oka, zwracając szczególną uwagę, aby nie zarysować powierzchni oka. Następnie wyciągnij oko z oczodołu.
    3. Wypreparowaną próbkę przenieść do probówki zawierającej 0,1 M Na-PO4. Upewnij się, że w probówce z próbką nie ma dodatkowej tkanki, ponieważ może ona przylegać do górnej części oka podczas przetwarzania próbki.
  4. Przechowywać próbkę w 0,1 M Na-PO4 (maksymalnie jeden tydzień) w temperaturze +4 °C.
  5. Przetwarzaj próbki do obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.
    1. Umieścić próbki w 2% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze Na-PO4 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Umyć próbki 3 razy przez 5 minut, każde przemycie w 0,1 M Na-PO4 w temperaturze pokojowej.
    3. Próbki należy odwadniać kolejno w 30%, 50% i 70% etanolu przez 1 godzinę w każdym roztworze w temperaturze pokojowej.
    4. Zanurz próbki w 96% etanolu na 2-3 godziny w temperaturze pokojowej.
    5. Następnie należy inkubować próbki dwukrotnie w 100% etanolu, najpierw przez 1 godzinę, a następnie w świeżym 100% etanolu przez noc w temperaturze +4 °C.
    6. Próbki należy poddać 30 cyklom w zautomatyzowanej suszarce do punktów krytycznych.
  6. Osadź próbki i pokryj je platyną.
    1. Umieść samoprzylepną zakładkę na uchwycie. Jeśli próbka musi być oznaczona na górze uchwytu, pozostaw kawałek papieru okładki zakładki na wypustce i napisz identyfikator próbki na papierze.
    2. Umieść montaż z wypustką na podstawie mikroskopu preparacyjnego.
    3. Delikatnie umieść próbkę tkanki na uchwycie za pomocą cienkiej pęsety, rogówką skierowaną do góry.
    4. Pokryj próbkę platyną za pomocą odpowiedniego urządzenia. Po pokryciu należy przechowywać próbki w temperaturze pokojowej do czasu obrazowania.

6. Obrazowanie (Rysunek 2)

  1. Używaj urządzeń zgodnie z zaleceniami zawartymi w instrukcji obsługi oraz przez ekspertów w dziedzinie obrazowania.
  2. Uzyskuj obrazy o pożądanym powiększeniu i używaj obrazów 2,000-2,500x do analizy.
  3. Dostosuj jasność i kontrast tak, aby na obrazie nie było prześwietlonych obszarów, a granice komórek i mikrogrzbiety były widoczne tak wyraźnie, jak to możliwe.
    UWAGA: Położenie i kąt tkanki wpływają na ustawienia jasności i kontrastu. Może być konieczne dostosowanie ich w zależności od próbki i między różnymi obszarami tkanki.

7. Pomiar kształtu, rozmiaru i wzoru mikrogrzbietu

  1. Otwórz obraz TIFF w Fiji ImageJ 1.5327. Ustaw skalę za pomocą paska skali obrazu: utwórz linię o rozmiarze równym paskowi skali za pomocą narzędzia Linia. Wybierz pozycję Analizuj | Ustaw skalę i wpisz znaną odległość. Otwórz menedżera ROI z punktu menu Analizuj | Menu Narzędzia.
  2. W polu Rozmiar i zaokrąglenie komórki wybierz pozycję Analizuj | Ustawianie pomiarów | Deskryptory kształtów. Użyj narzędzia Lupa, aby zobaczyć powiększone komórki. Zaznacz komórki za pomocą narzędzia Wielokąt i dodaj każde zaznaczenie do menedżera ROI. Na koniec zmierz wybrane komórki i zapisz pomiar.
  3. Analiza mikrogrzbietów (Rysunek 3 i Rysunek 4)
    1. Upewnij się, że obraz jest w formacie 8-bitowym z menu Obraz | Wpisz menu.
    2. Zaznacz komórkę za pomocą narzędzia Wielokąt i wyczyść tło z punktu menu Edycja | Czysty na zewnątrz.
    3. Wygładź obraz od jednego do trzech razy, wybierając opcję Proces | Wygładź i dostosuj jasność i kontrast z poziomu Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast, aby mikrogrzbiety wyróżniały się tak wyraźnie, jak to tylko możliwe.
    4. Obracanie obrazu z procesu | Filtry | Convolve, zamień na binarny z Process | Binarny | Utwórz binarny i zszkieletuj czarno-biały obraz, wybierając pozycję Proces | Binarny | Szkieletowanie.
    5. Używanie funkcji szkieletu Analizuj w oknie Analizuj | Menu szkieletu do pomiaru parametrów mikrogrzbietu i zapisania wartości.
      UWAGA: W SEM poszczególne obrazy mogą różnić się jasnością i kontrastem. W związku z tym etapy analizy mogą wymagać dostosowania z obrazu na obraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsze badanie opisuje metodę wykorzystania wiertła okulistycznego w eksperymentach dotyczących gojenia ran rogówki u rybek zebrafish. Metoda ta została zmodyfikowana na podstawie wcześniejszych badań przeprowadzonych na myszach, w których wykazano, że wiertło skutecznie usuwa warstwy komórek nabłonkowych13. Wyzwaniem w przypadku tworzenia ran rogówki u rybek zebrafish jest stosunkowo niewielki rozmiar oka, a w przypadku czasochłonnych eksperymentów — konieczność utrzymania stałego przepływu wo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Urazy fizyczne rogówki są najczęstszą przyczyną wizyt pacjentów okulistycznych w szpitalu. Dlatego ważne jest, aby ustanowić odpowiednie modele do badania różnych aspektów patofizjologii rogówki. Jak dotąd mysz jest najczęściej używanym modelem do badania gojenia się ran rogówki. Jednak dodawanie kropli do oczu na mysie zranione oczy w celu sprawdzenia wpływu określonych leków na gojenie się ran rogówki może być trudne. Pod tym względem model danio pręgowanego jest szczególnie przydatny do farmakologicznych badań przesie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Pertti Panula za dostęp do jednostki Danio pręgowanego oraz Henriemu Koivuli za wskazówki i pomoc w eksperymentach z danio pręgowanym. Badania były wspierane przez Akademię Fińską, Fundację Jane i Aatos Erkko, Fińską Fundację Kultury oraz Program ATIP-Avenir. Obrazowanie wykonano w Zakładzie Mikroskopii Elektronowej i Zakładzie Mikroskopii Świetlnej Instytutu Biotechnologii, przy wsparciu HiLIFE i Biocenter Finland.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 M Na-PO4 (bufor fosforanu sodu), pH 7,4we własnymroztworze przygotowuje się z 1M buforu fosforanu sodu (1M Na2 HPO4 dostosowanego do pH 7,4 za pomocą 1M NaH2 PO4 ).
0,2 M Na-PO4 (bufor fosforanu sodu), pH 7,4we własnymroztworze przygotowuje się z 1M buforu fosforanu sodu (1M Na2 HPO4 dostosowany do pH 7,4 za pomocą 1M NaH2 PO4 ).
Końcówki do zadziorów 0,5 mmAlger Equipment CompanyBU-5S
1M Tris, pH 8,8Wewnętrzne
zakładki samoprzylepneAgar ScientificG3347N
Frez Algerbrush, Kompletny instrumentAlger Equipment CompanyBR2-5
Swapy bawełnianeHeinz Herenz Hamburg1030128
Płytkasekcyjnawłasne
narzędzia preparacyjneFine Science Tools
podwójnie destylowana wodawe własnym zakresie
probówki Eppedorf, 2 mldowolny dostawca
Sól metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanuSigmaA5040Uwaga: powoduje podrażnienie.
Aldehyd glutarowy, 50% roztwór wodny, klasa ISigmaG7651Uwaga: toksyczny.
Chlorowodorek lidokainySigmaL5647Uwaga: toksyczny.
mocowaniaAgar ScientificG301P
szalka PetriegoPaski101VR20
Macherey-Nagel92110
Łyżki plastikowedowolny dostawca
Probówki plastikowe, 15 mlGreiner Bio-One188271
Probówki plastikowe, 50 mlGreiner Bio-One227261
Skaningowy mikroskop elektronowyFEIQuanta 250 FEG
Miękka gąbkadowolny dostawca
Powlekarka do napylaniaQuorum TechnologiesGQ150TS
Mikroskop stereoskopowyLeica
wskaźnikowe pH Thermo Scientific

Bibliografia

  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, M. J., Holland, E. J. , Elsevier. 1-22 (2017).
  3. Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
  4. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  5. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  6. West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
  7. Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
  8. Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
  9. Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
  10. Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776(2015).
  11. Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
  12. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
  13. Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071(2018).
  14. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  15. Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
  16. Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
  17. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  18. Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
  19. Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  20. Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159(2014).
  21. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  22. Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
  23. Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  24. Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
  25. Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
  26. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio. , Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  29. Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
  30. Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998(2020).
  31. Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
  32. Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
  33. van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  34. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
  35. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  36. Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
  37. Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
  38. Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
  39. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

róg rogówki danio pręgowanegoabrazyjna rana rogówkiskaningowa mikroskopia elektronowakształt komórek nabłonkowychanaliza mikrowypustekanaliza w programie ImageJfizjologia tkanki nabłonkowejbadania farmakologiczne
Gojenie się ran rogówki danio pręgowanego: od ścierania do analizy obrazowej zamknięcia rany
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.