Artykuł metodologiczny

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

DOI:

10.3791/63614

⸱

13 maja 2022

 ,  , 
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanowymiarowe struktury związane z błoną lipidową, które są uwalniane ze wszystkich komórek, są obecne we wszystkich płynach biologicznych i zawierają białka, kwasy nukleinowe i lipidy, które odzwierciedlają komórkę macierzystą, z której pochodzą. Właściwe oddzielenie EV od innych składników w próbce pozwala na scharakteryzowanie związanego z nimi ładunku i daje wgląd w ich potencjał jako komunikatorów międzykomórkowych i nieinwazyjnych biomarkerów wielu chorób. W obecnym badaniu EV pochodzące z oligodendrocytów wyizolowano z pożywek do hodowli komórkowych przy użyciu kombinacji najnowocześniejszych technik, w tym ultrafiltracji i chromatografii wykluczania wielkości (SEC) w celu oddzielenia EV od innych białek zewnątrzkomórkowych i kompleksów białkowych. Korzystając z dostępnych na rynku kolumn SEC, EV oddzielono od białek zewnątrzkomórkowych uwalnianych z ludzkich komórek skąpodrzewiaka zarówno w warunkach stresu kontrolnego, jak i retikulum endoplazmatycznego (ER). Kanoniczne markery EV CD9, CD63 i CD81 obserwowano we frakcjach 1-4, ale nie we frakcjach 5-8. GM130, białko aparatu Golgiego, i kalneksyna, integralne białko ER, zostały użyte jako ujemne markery EV i nie zaobserwowano ich w żadnej frakcji. Ponadto, podczas łączenia i koncentracji frakcji 1-4 jako frakcji EV i frakcji 5-8 jako frakcji białkowej, zaobserwowano ekspresję CD63, CD81 i CD9 we frakcji EV. Ekspresji GM130 ani kalneksyny nie zaobserwowano w żadnym z typów frakcji. Zebrane frakcje zarówno z warunków stresu kontrolnego, jak i ER uwidoczniono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a pęcherzyki zaobserwowano we frakcjach EV, ale nie we frakcjach białkowych. Cząstki w EV i frakcje białkowe z obu warunków zostały również oznaczone ilościowo za pomocą analizy śledzenia nanocząstek. Łącznie dane te pokazują, że SEC jest skuteczną metodą oddzielania EV od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksplozji zainteresowania badaniem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) towarzyszył znaczny postęp w technologiach i technikach używanych do separacji i badania tych nano-rozmiarowych, heterogenicznych cząstek. W czasie, który upłynął od ich odkrycia prawie cztery dekady temu1,2, odkryto, że te małe błoniaste struktury zawierają bioaktywne lipidy, kwasy nukleinowe i białka i odgrywają główną rolę w komunikacji międzykomórkowej3,4. EV są uwalniane ze wszystkich typów komórek i dlatego są obecne we wszystkich płynach biologicznych, w tym w osoczu krwi i ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i odczynników

UWAGA: Zrób odczynniki do hodowli komórkowych w kapturze do hodowli komórkowych, aby zachować sterylność.

  1. Przygotowanie odczynników do hodowli komórkowych
    1. Przygotuj normalny DMEM o wysokim poziomie glukozy, dodając 50 ml FBS i 5 ml penicyliny-paciorkowca (Pen-Strep) do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy i przechowuj w temperaturze 4 °C. Użyj tej pożywki do hodowli i ekspansji komórek.
    2. Przygotuj DMEM o wysokiej zawartości glukozy zubożoną w egzosomy, dodając 50 ml FBS zubożonego w egzosomy i 5 ml Pen-Strep do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy i ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot ujawnia odpowiednie oddzielenie EV od CCM
Aby ocenić skuteczność SEC w oddzielaniu EV od pożywek do hodowli komórkowych, przeprowadzono western blot przy użyciu każdej pojedynczej frakcji z próbek kontrolnych w celu zbadania ekspresji trzech kanonicznych markerów EV, CD9, CD63 i CD81, a także GM130 i calnexin18, które zostały użyte jako kontrole ujemne (Rysunek 3). Albumina expression18 został również zbadany, aby upewni.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEC to przyjazna dla użytkownika metoda odpowiedniego oddzielania pojazdów elektrycznych od kondycjonowanego CCM. W celu specyficznego wyizolowania EV pochodzących z komórek należy wziąć pod uwagę staranne rozważenie rodzaju CCM i jego dodatków. Wiele pożywek do hodowli komórkowych musi być uzupełnionych FBS, który zawiera EV pochodzące od zwierzęcia, u którego zebrano surowicę. Te EV w surowicy mogą nasycać i maskować każdy sygnał wytwarzany przez EV pochodzące z komórek w hodowli26. W związku z .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Penn State Behrend i Hamot Health Foundation za finansowanie, a także Penn State Microscopy Facility w University Park, PA.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolVWR97064-588
4X Laemmli Bufor do próbekBioRad1610747
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC900308odcięcie 3 kDa
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 z membraną Ultracel-3Sigma-AldrichUFC2003243 kDa odcięcie
Amon NadsiarczanSigma-AldrichA3678-100G
Anty królik IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężona z HRP7074V1:1000 Rozcieńczenie
Przeciwciało anty-kalnexinoweAbcam  ab225951:500 Rozcieńczenie
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD9BioLegend3121021:500 Rozcieńczenie
przeciwciała anty-GM130 [EP892Y] - Marker cis-GolgiegoAbcamab526491:500 Rozcieńczenie
Anty-mysie IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRP7076V1:1000 Rozcieńczony
automatyczny kolektor frakcjiIzon Science
Zestaw do testów BCABio-Rad
Kamera CCDGatan Orius SC200
Cd63 Mysz anty ludzka556019 BD:1000 Rozcieńczenie
CD81 PrzeciwciałoSanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Rozcieńczanie
Cellstar Filter Cap Kolby do hodowli komórkowychGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoksycholanSigma-AldrichD6750-10G
ditiotreitolSigma3483-12-3
DMEM/Wysoka glukoza z L-glutaminą; bez soduCytivaSH300022.
Płodowa surowica bydlęca Klasa premiumVWR97068-085
Płodowa surowica bydlęca, zubożona w egzosomyThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Świetna wartość Beztłuszczowe mleko w proszkuAmazonB076NRD2TZ
HOG Ludzka linia komórkowa oligodendrogliomaSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Rozmiar Kolumny wykluczające 5pkIzon Science
Metanol >99,8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Płytki szklaneBioRad1653310z przekładkami 0,75 mm
Mini-PROTEAN Krótkie płytkiBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicylina-Streptomycyna, roztwórSigma-AldrichP4458-100 ml
soli fizjologicznej buforowanej fosforanami PBSFisher Scientific BP66150
Pierce Zestawy do oznaczania białek BCA i odczynnikiThermo Fisher Scientific23227
Membrany transferowe Pierce PVDFThermo Scientific88518
Bibuła filtracyjna Pierce Western BlottingThermo Scientific84783
Polioksyetylen-20 (TWEEN 20), 500 mlBio BasicTB0560
Koktajl inhibitorów proteazy/fosfatazy (100X)Technologia sygnalizacji komórkowej5872S
Rekombinowane przeciwciało anty-TSG101 [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 rozcieńczenie
Wodorotlenek slodiumSigma-AldrichSX0603
Azydek soduFisher ScientificBP922I-500
Chlorek soduSigma-AldrichS9888-500G
Dodecylosiarczan sodu,≥ 99,0% (GC), bezpyłowe granulkiSigma-Aldrich75746-1KG
TetrametyloetylenodiaminaSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Zestaw do usuwania plam z akrylamidu FastCast, 10%BioRad1610183
Transmisyjny mikroskop elektronowyFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsyna 0,25% proteaza z trypiną wieprzową, HBSS, EDTA; bez wapnia, magnezuCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View oprogramowanieAnalytikNTA
1FS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ultrafiltrowanieseparacja EVp cherzyki zewn trzkom rkowe oligodendrocyt wWestern blotledzenie nanocz stektransmisyjna mikroskopia elektronowamarkery EV

Powiązane artykuły