Artykuł metodologiczny

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

DOI:

10.3791/63614

⸱

13 maja 2022

 ,  , 
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanowymiarowe struktury związane z błoną lipidową, które są uwalniane ze wszystkich komórek, są obecne we wszystkich płynach biologicznych i zawierają białka, kwasy nukleinowe i lipidy, które odzwierciedlają komórkę macierzystą, z której pochodzą. Właściwe oddzielenie EV od innych składników w próbce pozwala na scharakteryzowanie związanego z nimi ładunku i daje wgląd w ich potencjał jako komunikatorów międzykomórkowych i nieinwazyjnych biomarkerów wielu chorób. W obecnym badaniu EV pochodzące z oligodendrocytów wyizolowano z pożywek do hodowli komórkowych przy użyciu kombinacji najnowocześniejszych technik, w tym ultrafiltracji i chromatografii wykluczania wielkości (SEC) w celu oddzielenia EV od innych białek zewnątrzkomórkowych i kompleksów białkowych. Korzystając z dostępnych na rynku kolumn SEC, EV oddzielono od białek zewnątrzkomórkowych uwalnianych z ludzkich komórek skąpodrzewiaka zarówno w warunkach stresu kontrolnego, jak i retikulum endoplazmatycznego (ER). Kanoniczne markery EV CD9, CD63 i CD81 obserwowano we frakcjach 1-4, ale nie we frakcjach 5-8. GM130, białko aparatu Golgiego, i kalneksyna, integralne białko ER, zostały użyte jako ujemne markery EV i nie zaobserwowano ich w żadnej frakcji. Ponadto, podczas łączenia i koncentracji frakcji 1-4 jako frakcji EV i frakcji 5-8 jako frakcji białkowej, zaobserwowano ekspresję CD63, CD81 i CD9 we frakcji EV. Ekspresji GM130 ani kalneksyny nie zaobserwowano w żadnym z typów frakcji. Zebrane frakcje zarówno z warunków stresu kontrolnego, jak i ER uwidoczniono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a pęcherzyki zaobserwowano we frakcjach EV, ale nie we frakcjach białkowych. Cząstki w EV i frakcje białkowe z obu warunków zostały również oznaczone ilościowo za pomocą analizy śledzenia nanocząstek. Łącznie dane te pokazują, że SEC jest skuteczną metodą oddzielania EV od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksplozji zainteresowania badaniem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) towarzyszył znaczny postęp w technologiach i technikach używanych do separacji i badania tych nano-rozmiarowych, heterogenicznych cząstek. W czasie, który upłynął od ich odkrycia prawie cztery dekady temu1,2, odkryto, że te małe błoniaste struktury zawierają bioaktywne lipidy, kwasy nukleinowe i białka i odgrywają główną rolę w komunikacji międzykomórkowej3,4. EV są uwalniane ze wszystkich typów komórek i dlatego są obecne we wszystkich płynach biologicznych, w tym w osoczu krwi i surowicy, ślinie i moczu. EV w tych płynach są bardzo obiecujące, aby służyć jako nieinwazyjne biomarkery różnych chorób, w tym chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych, nowotworów i zaburzeń autoimmunologicznych5,6,7. Co więcej, badania mechanistyczne in vitro można przeprowadzić za pomocą technik hodowli komórkowych poprzez oddzielenie EV uwolnionych do pożywki hodowlanej3,8,9.

Aby zrozumieć rolę EV w patofizjologii choroby, niezbędne jest odpowiednie oddzielenie od płynu, w którym się znajdują. Złotym standardem separacji EV od dawna jest ultrawirowanie różnicowe (dUC)10, jednak pojawiły się bardziej wyrafinowane techniki w celu osiągnięcia lepszej separacji EV od innych składników zewnątrzkomórkowych. Niektóre z tych technik obejmują gradienty gęstości, frakcję przepływu pola asymetrycznego przepływu (A4F), cytometrię przepływu, wychwytywanie immunologiczne, wytrącanie glikolu polietylenowego i chromatografię wykluczania wielkości (SEC)11,12,13. Każda technika ma swój własny zestaw zalet i wad; Wykazano jednak, że SEC dość skutecznie oddziela EV zarówno od płynów biologicznych, jak i supernatantów z hodowli komórkowych8,14,15. SEC ma również dodatkową zaletę polegającą na tym, że jest stosunkowo prosty i przyjazny dla użytkownika.

SEC to metoda, która rozdziela składniki płynu na podstawie rozmiaru. Dzięki tej technice do frakcjonowania próbki używa się kolumny żywicy (wyprodukowanej we własnym zakresie lub zakupionej komercyjnie). Małe cząstki w próbce zostają uwięzione między kulkami w żywicy, podczas gdy większe cząstki są w stanie swobodniej przechodzić przez żywicę, a tym samym eluować się na wcześniejszym etapie procesu. Ponieważ EV są większe niż wiele białek zewnątrzkomórkowych i agregatów białkowych, EV przechodzą przez kolumnę szybciej i eluują we wcześniejszych frakcjach niż białka zewnątrzkomórkowe14.

W tym artykule o metodach przedstawiono użycie SEC do separacji EV od pożywek do hodowli komórkowych (CCM) od ludzkich oligodendrocytów zarówno w warunkach kontrolnych, jak i stresu retikulum endoplazmatycznego (ER). Korzystając z tego protokołu, wykazano, że EV oddzielone tą techniką znajdują się w określonych frakcjach, które można połączyć i skoncentrować w celu dalszej charakterystyki, oraz że oddzielone EV pochodzą z komórek, a nie z egzogennego źródła, takiego jak płodowa surowica bydlęca (FBS) stosowana do uzupełnienia CCM. Obecność kanonicznych markerów EV, CD63, CD81 i CD916,17,18,19 we frakcjach EV, a ich brak we frakcjach białkowych jest wykazywany za pomocą western blotting. Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) EV są wizualizowane i wyświetlają oczekiwaną morfologię i są obserwowane tylko we frakcji EV. Cząstki są również liczone we frakcjach EV i białkowych zarówno w warunkach stresu kontrolnego, jak i ER, a w próbkach EV obserwuje się dużą liczbę cząstek w oczekiwanym zakresie wielkości 50-200 nm średnicy. Łącznie dane te potwierdzają pogląd, że SEC jest wydajną i skuteczną metodą oddzielania EV od pożywek do hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i odczynników

UWAGA: Zrób odczynniki do hodowli komórkowych w kapturze do hodowli komórkowych, aby zachować sterylność.

  1. Przygotowanie odczynników do hodowli komórkowych
    1. Przygotuj normalny DMEM o wysokim poziomie glukozy, dodając 50 ml FBS i 5 ml penicyliny-paciorkowca (Pen-Strep) do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy i przechowuj w temperaturze 4 °C. Użyj tej pożywki do hodowli i ekspansji komórek.
    2. Przygotuj DMEM o wysokiej zawartości glukozy zubożoną w egzosomy, dodając 50 ml FBS zubożonego w egzosomy i 5 ml Pen-Strep do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy i przechowuj w temperaturze 4 °C. Użyj tej pożywki do leczenia komórek przed izolacją EV.
    3. Przygotować tunikamycynę, dodając 10 mg tunikamycyny do 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Przygotować 50 μl porcji w probówkach o pojemności 0,2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotowanie odczynników do separacji EV
    1. Przygotuj 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodając 9,89 g proszku PBS do 1 l wody dejonizowanej (DI) w cylindrze z podziałką o pojemności 1 l. Mieszać roztwór na płytce mieszającej, aż PBS się rozpuści.
    2. Użyj autoklawu do sterylizacji szkła przed dodaniem PBS. Włóż szkło do pojemnika, zamknij drzwi i sterylizuj przez 30 minut w temperaturze 121 °C.
    3. Wewnątrz komory z przepływem laminarnym podłącz próżnię do filtra 0.22 μm i umieść filtr na butelce z autoklawą. Powoli wlej PBS na filtr i zbierz przefiltrowany PBS do autoklawowanej butelki.
    4. Przygotować 0,5 M wodorotlenku sodu, dodając 9,99 g wodorotlenku sodu do 500 ml 1x PBS w cylindrze miarowym o pojemności 500 ml. Roztwór mieszać na płytce mieszającej, aż wodorotlenek sodu rozpuści się w PBS, a następnie przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm do autoklawowanej butelki o pojemności 500 ml.
    5. Przygotować 0,05% azydku sodu, dodając 0,25 g azydku sodu do 500 ml 1x PBS w cylindrze miarowym o pojemności 500 ml. Roztwór mieszać na płytce mieszającej, aż azydek sodu rozpuści się w PBS, a następnie przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm do autoklawowanej butelki o pojemności 500 ml.
  3. Przygotowanie odczynników do izolacji, oznaczania ilościowego i identyfikacji białek
    1. Przygotuj 100 ml buforu do lizy RIPA, łącząc 1 ml 1 M Tris (pH 7,4), 1 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 1 g deoksycholanu, 1 ml NP-40 i 0,89 g chlorku sodu (NaCl). Doprowadzić objętość do 100 ml za pomocą destylowanegoH2Oi przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby przygotować roztwór RIPA z fosfatazą i inhibitorem proteazy, należy dodać 10 μl fosfatazy i inhibitora proteazy na każdy 1 ml buforu RIPA w probówce o pojemności 15 ml i przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
    2. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować odczynnik roboczy do testu BCA, dodając 10 ml odczynnika A i 200 μl odczynnika B dostarczonego przez zestaw do oznaczania BCA do probówki o pojemności 15 ml. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować odczynnik roboczy do testu mikroBCA, dodając 25 części odczynnika A, 24 części odczynnika B i 1 część odczynnika C do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Przygotuj 10x żelowy bufor do elektroforezy, dodając 30,3 g zasady Tris, 144 g glicyny i 10 g SDS w 1 l wody demineralizowanej. Przechowywać uruchomiony bufor w temperaturze 4 °C. Przygotować 1x bufor transferowy, dodając 3,03 g zasady Tris, 14,4 g glicyny i 200 ml metanolu i dostosować objętość do 1 l wodą DI. Przechowywać bufor transferowy w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotuj buforowaną sól fizjologiczną Tris z Tween-20 (TBS-Tween), dodając 2,4 g zasady Tris, 8 g NaCl i 1 ml Tween-20 do 1 litra wody DI. Przechowuj TBS-Tween w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotuj 5% roztwór blokujący, dodając 5 g beztłuszczowego mleka w proszku do 100 ml TBS-Tween. Przechowywać bufor blokujący w temperaturze 4 °C.
    6. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować podłoże chemiluminescencyjne, dodając 4 ml roztworu nadtlenku i 4 ml roztworu luminolu/wzmacniacza do probówki o pojemności 15 ml i delikatnie odwrócić, aby wymieszać.

2. Hodowla i leczenie komórek

  1. Zasiać dwie kolby hodowlane komórek T175 z 2,3 x 106 ludzkimi komórkami skąpodendroglioma (HOG) każda. Doprowadzić końcową objętość normalnego DMEM o wysokiej zawartości glukozy do 25 ml i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 48 godzin.
  2. Pod koniec 48 godzin, ciepły DMEM o wysokiej zawartości glukozy zubożony w egzosomy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do leczenia dodać 25 μl 10 mg/ml tunikamycyny do 25 ml pożywki zubożonej w egzosomy, końcowe stężenie 10 μg/ml tunikamycyny w celu wywołania stresu ER. Do kontroli dodaj 25 μl DMSO do 25 ml pożywki zubożonej w egzosomy.
  3. Usuń i wyrzuć normalny DMEM o wysokim poziomie glukozy z komórek i delikatnie przepłucz komórki i kolbę 10 ml 1x PBS. Odessać i wyrzucić PBS.
  4. Dodać 25 ml pożywki kontrolnej do kolby znakowanej kontrolnie, a 25 ml 10 μg/ml tunikamycyny w pożywce do roztworu znakowanego kolbą. Kolby należy umieścić z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.

3. Zbieranie i koncentracja kondycjonowanego CCM (Rysunek 1)

  1. Umieścić PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Obserwuj kolby pod mikroskopem złożonym z soczewką obiektywową 10x i 100x. Zanotuj wszelkie różnice między kolbami. Wykonaj następujące czynności zarówno dla kolb kontrolnych, jak i poddanych działaniu substancji.
  2. Wyjąć pożywkę z kolby i umieścić w probówce o pojemności 50 ml. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  3. Odwirować probówkę o masie 2 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml i umieścić na lodzie.
  4. Uzyskać cztery jednostki ultrafiltracji o pojemności 15 ml i stężeniu 3 kDa i dodać 5 ml PBS do każdej probówki. Zalać filtr przez odwirowanie jednostek ultrafiltracji przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W obecnym protokole zastosowano jednostki ultrafiltracji o masie cząsteczkowej 3 kDa, aby zatrzymać wszystkie białka zewnątrzkomórkowe uwolnione z komórek. Jednostki ultrafiltracji o większej masie cząsteczkowej (np. 30 kDa) również będą działać z tym protokołem, jednak białka zewnątrzkomórkowe mniejsze niż 30 kDa zostaną odfiltrowane i usunięte z próbek20,21.
  5. Usuń PBS z jednostek ultrafiltracji. Podzielić supernatant z każdego stanu (kontrolny i traktowany tunikamycyną) na dwie jednostki ultrafiltracji każda, po około 12,5 ml pożywki w każdej.
  6. Odwirować probówki o masie 4 000 x g przez 1 h 45 min w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy skoncentrowane podłoże (określane jako retentat) w każdej jednostce ultrafiltracji zostanie zagęszczone do 250 μl lub mniej.
  7. Przenieść retentat z obu kontrolnych jednostek ultrafiltracji do jednej oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przenieść retentat z obu poddanych działaniu ultrafiltracji jednostek do innej oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  8. Zmierzyć całkowitą objętość retentatu w każdej probówce do mikrowirówek na 500 μl. Jeśli próbka jest mniejsza niż 500 μl, dodaj 0,22 μm przefiltrowany 1x PBS, aż końcowa objętość wyniesie 500 μL. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

4. Kolekcja komórek

  1. Umieść trypsynę, PBS i DMEM zubożony w egzosomy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 7 ml trypsyny zarówno do kolb kontrolnych, jak i poddanych działaniu substancji i umieścić w inkubatorze na 5 minut.
  2. Obejrzyj pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy komórki są podniesione. Jeśli komórki nie zostaną podniesione, mocno postukaj kolbą o dłoń, aby usunąć komórki.
  3. Przemyć kolbę 7 ml DMEM zubożonego w egzosomy. Pobrać zawiesinę komórek z kolby i umieścić w probówkach o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować probówki przez 10 minut przy 500 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 5 ml 1x PBS do osadu komórkowego. Delikatnie wymieszać pipetą, aby rozbić osad.
  5. Odwirować probówki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 200 μl roztworu RIPA z fosfatazą i inhibitorem proteazy do osadu komórkowego, pipetą do wymieszania.
  6. Przenieść komórki w roztworze RIPA do probówek o pojemności 1,5 ml. Pozostaw probówki na lodzie na 5 minut. Odwirować probówki o stężeniu 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Przenieść supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Oznacz probówki warunkami leczenia i datą. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

5. Separacja EV za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar (Rysunek 2)

UWAGA: Wykonaj następujące kroki dwa razy, raz dla retentatu kontrolnego i raz dla retentatu traktowanego tunikamycyną.
UWAGA: PBS używany w tej sekcji to filtr 0,22 μm 1x PBS.

  1. Włącz automatyczny kolektor frakcji (AFC) i dostosuj ustawienia, aby zbierać osiem frakcji, 0,5 ml na frakcję i objętość bufora (pustkę) do domyślnych.
    UWAGA: Warunki pracy AFC są następujące: objętość kolumny/łoża = 10 ml; objętość pustek = 2,70 ml; objętość spłukiwania = 15 ml; optymalna wielkość frakcji = 500 μL; bufor wymagany na przebieg = 65 ml; natężenie przepływu przy 20 °C = 1,0 ml/min; Możliwość ponownego użycia kolumny = pięć zastosowań.
  2. Wyjmij kolumnę (patrz Tabela materiałów) z 4 °C i pozwól kolumnie rozgrzać się do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem (zwykle ~30 min).
  3. Wyjmij próbki retentatu z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść na lodzie do rozmrożenia. Czekając, ustaw osiem oznaczonych probówek o pojemności 1,5 ml w karuzeli AFC z pokrywkami skierowanymi do wewnątrz.
  4. Włóż kolumnę do AFC z kodem kreskowym skierowanym w stronę czytnika. Rozpocznij zbiórkę, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby sprawdzić, czy w karuzeli znajdują się rurki i czy pojemnik na odpady działa prawidłowo.
  5. Rozpocząć płukanie kolumny, dodając 15 ml 1x PBS do kolumny po całkowitym wchłonięciu bufora magazynującego do górnej części matrycy kolumny. Nie należy dodawać PBS zbyt wcześnie, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie bufora pamięci masowej i uniemożliwi odpowiednie spłukiwanie.
  6. Tuż przed wchłonięciem przez matrycę całego 15 ml PBS kliknij przycisk OK, aby zatrzymać płukanie i usunąć resztki PBS z górnej części matrycy kolumny za pomocą mikropipety. Nie dotykaj matrycy.
  7. Dodać 500 μl próbki do środka kolumny. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć uruchamianie. Obserwuj, jak próbka wchłania się do matrycy i szybko dodaj 8 ml PBS do kolumny natychmiast po całkowitym wchłonięciu próbki.
  8. AFC automatycznie rozproszy pustą objętość do środka karuzeli, a następnie zbierze wszystkie osiem frakcji po 500 μl każda. Po zakończeniu biegu usuń frakcje z karuzeli i umieść na lodzie. Frakcje 1-4 zawierają EV, podczas gdy frakcje 5-8 zawierają białka zewnątrzkomórkowe. Usuń pustą objętość ze środka karuzeli.
  9. Dodać 10 ml PBS do kolumny po zebraniu ośmiu frakcji, aby zmyć pozostałą próbkę z kolumny. Po całkowitym przepłukaniu próbki retentatu przez kolumnę, dodać 15 ml 1x PBS do kolumny.
  10. Ponieważ końcowy PBS jest wchłaniany przez matrycę, dodać 500 μl 0,5 M wodorotlenku sodu do środka matrycy kolumny. Gdy wodorotlenek sodu zostanie wchłonięty, dodaj 30 ml 1x PBS do kolumny i pozwól mu przepłukać.
  11. Jeśli przeprowadzasz kolejną próbkę, dodaj osiem oznakowanych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml do karuzeli i powtórz kroki 5.7-5.10.
  12. Po zakończeniu ze wszystkimi próbkami wykonaj następujące kroki, aby zachować kolumnę do późniejszego użycia. Po przepłukaniu 30 ml PBS przez kolumnę, jak opisano w kroku 5.10, dodać 15 ml 0,05% azydku sodu do kolumny.
  13. Pozostawić około 5 ml azydku sodu na wierzchu matrycy kolumny. Zdejmij kolumnę z AFC i przymocuj górną i dolną zaślepkę. Umieść kolumnę z powrotem w temperaturze 4 °C w celu przechowywania (kolumna może być używana do pięciu razy).

6. Ultrafiltracja frakcji EV i białek

  1. Uzyskać dwie jednostki ultrafiltracji o pojemności 2 ml i 3 kDa na próbkę. Użyj jednej jednostki do zagęszczenia frakcji EV (frakcje 1-4), a drugiej do zagęszczenia frakcji białkowych (frakcje 5-8). Każda jednostka składa się z trzech części: stożka, filtra i cylindra przepływowego; Odpowiednio oznacz każdą część.
  2. Skonstruuj jednostkę do ultrafiltracji i dodaj 1 ml 0,22 μm przefiltrowanego 1x PBS do części filtracyjnej i nakryj stożkiem. Odwirować jednostkę do ultrafiltracji stożkiem do góry o masie 3 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Wyjąć przefiltrowany PBS z cylindra przepływowego. Odwróć jednostkę ultrafiltracyjną do góry nogami (stożkiem do dołu) i odwiruj przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Usuń pozostały PBS ze stożka.
  4. Dodaj odpowiednie frakcje (całą objętość 500 μL) do każdej jednostki ultrafiltracji (całkowita objętość wyniesie 2 ml). Kolumny wirówkowe stożkiem do góry przez 1 h 45 min przy 3 500 x g w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy poziom retentatu osiągnie 100 μl.
  5. Wyjmij cylinder przepływowy i wylej przepływ. Odwróć jednostkę ultrafiltracji do góry nogami (stożkiem do dołu) i wiruj przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieś retentat w stożku do znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i doprowadź objętość każdej próbki do 150 μl za pomocą 0,22 μm przefiltrowanego 1x PBS. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

7. Sterowanie multimediami

  1. Zaopatrzyć się w dwie kolby do hodowli komórkowych T175. Oznaczyć jedną kontrolkę kolby i drugą obróbkę. Ciepły DMEM o wysokiej zawartości glukozy zubożony w egzosomy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Dodać 25 μl roztworu podstawowego tunikamycyny (10 mg/ml) do 25 ml pożywki i umieścić w kolbie oznaczonej jako traktowanie. Dodać 25 μl DMSO do 25 ml pożywki i umieścić w kolbie oznaczonej jako kontrola. Kolby należy przechowywać w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny.
  3. Zbierz nośniki i przetwórz je w celu oddzielenia pojazdów elektrycznych zgodnie z opisem w krokach 3.2-3.8. Następnie wykonaj wszystkie czynności opisane w sekcjach 5 i 6.

8. Western blotting

  1. Kwantyfikacja białek z lizatów komórkowych i frakcji białkowych za pomocą testu BCA
    UWAGA: Kwantyfikacja białka zarówno z próbek kontrolnych, jak i próbek traktowanych tunikamycyną przeprowadza się w następujących krokach.
    1. Rozmrozić zlizowane komórki i frakcje białkowe na lodzie. Przygotować trzy probówki rozcieńczające dla każdej próbki; 1:2, 1:10 i 1:100.
    2. Na 96-dołkowej płytce do oznaczania z przezroczystym dnem naładować trzy egzemplarze 25 μl wzorców białkowych albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 25 μl rozcieńczenia każdej próbki. Dodać 200 μl odczynnika roboczego do każdej studzienki zawierającej wzorzec lub próbkę, używając pipety wielokanałowej.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie czytać na płytce za pomocą czytnika płytek przy absorbancji 562 nm. Obliczyć stężenie białka w każdej próbce i określić objętość próbki potrzebną do otrzymania 20 μg białka dla lizatów komórkowych i 15 μg białka dla frakcji białkowych.
  2. Kwantyfikacja białek z frakcji EV za pomocą testu mikroBCA
    1. Próbki EV rozmrozić na lodzie. Wykonać dwa rozcieńczenia dla każdej próbki: 1:50 i 1:100.
    2. Na 96-dołkowej płytce do oznaczania z przezroczystym dnem naładować trzy egzemplarze 100 μl wzorców białkowych BSA i 100 μl każdej próbki rozcieńczonej. Dodać 100 μl odczynnika roboczego microBCA do każdej studzienki zawierającej wzorzec lub próbkę, używając pipety wielokanałowej.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, a następnie czytać płytkę za pomocą czytnika płytek przy absorbancji 562 nm. Obliczyć stężenie białka w każdej próbce i określić objętość próbki potrzebną do uzyskania 15 μg białka dla frakcji EV.
  3. Western blotting
    UWAGA: Protokół Western blotting został przeprowadzony podobnie do opisanego w 22 i zmodyfikowany zgodnie z opisem poniżej.
    1. Przygotuj 10% żele poliakrylamidowe za pomocą zestawu do robienia żelu, korzystając z instrukcji producenta.
    2. Do elektroforezy żelowej należy przygotować próbki lizatu komórkowego, łącząc w probówce o pojemności 1,5 ml objętość lizatu komórkowego niezbędną dla 20 μg białka, 5 μl 4x buforu Laemmli oraz objętość buforu RIPA niezbędną do uzyskania całkowitej objętości do 20 μl.
    3. Przygotować próbki EV i frakcji białkowej, łącząc w probówce o pojemności 1,5 ml objętość próbki niezbędną dla 15 μg białka, 5 μl 4x buforu Laemmli i buforu RIPA do objętości 20 μl.
    4. Przygotować próbki kontrolne pożywki, łącząc w probówce o pojemności 1,5 ml 15 μl próbki i 5 μl 4 Laemmli.
      UWAGA: W zależności od przeciwciał, które mają być użyte, bufor Laemmli może, ale nie musi, zawierać środek redukujący, taki jak 50 mM ditiotreitol (DTT).
    5. Gotować wszystkie próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut, przenieść próbki do lodu w celu ostygnięcia i krótko odwirować przez 30 s przy 10 000 x g, a następnie umieścić próbki z powrotem w lodzie.
    6. Dodaj żele do zbiornika do elektroforezy i dodaj 1x żelowy bufor do elektroforezy. Załadować 15 μl drabinki białkowej i 20 μl próbki. Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 30-50 minut lub do momentu, gdy próbki dotrą do dna żelu, tuż przed spływającym.
    7. Przenieść białko do membrany PVDF z 1x buforem transferowym w temperaturze 4 °C przez 30 minut przy napięciu 100 V lub do momentu zakończenia przenoszenia. Rysunek uzupełniający 1, rysunek uzupełniający 2 i rysunek uzupełniający 3 pokazują obrazy bez plam każdej plamy po zakończeniu transferu.
    8. Zablokuj membranę w 5% mleku/TBS-Tween na 1 godzinę w temperaturze pokojowej na shakerze. Inkubować błonę w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc na wytrząsarce w temperaturze 4 °C. Informacje na temat rozcieńczenia przeciwciał znajdują się w Tabeli 1.
    9. Następnego dnia usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj membranę 3x TBS-Tween przez 5 minut w temperaturze pokojowej na shakerze.
    10. Przygotować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w 5% mleku/TBS-Tween. Informacje na temat rozcieńczenia znajdują się w Tabeli 1. Dodać przeciwciało wtórne do błony i inkubować na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przemyć 3x TBS-Tween przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej na shakerze.
    11. Dodać substrat chemiluminescencyjny do membrany i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Plama obrazu za pomocą analizy kolorymetrycznej i chemiluminescencyjnej. Rysunek uzupełniający 4, rysunek uzupełniający 5 i rysunek uzupełniający 6 pokazują nieprzycięte obrazy każdej plamy.

9. Obrazowanie TEM

  1. Wyładowanie jarzeniowe23 Siatki pokryte węglem/formvarem o siatce 400 do usuwania węglowodorów i nadawania siatek hydrofilowości.
  2. Dodać 5 μl próbki EV lub frakcji białkowej do siatek. Inkubuj kratki w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut.
  3. Usuń nadmiar roztworu, odprowadzając go bibułą filtracyjną. Umyj kratki 5 μl nanoczystej wody i usuń nadmiar poprzez odprowadzanie wilgoci.
  4. Nałożyć 5 μl 1% wodnego octanu uranylu i natychmiast odsiąć. Pozostaw kratki do wyschnięcia. Zobrazuj siatki pod napięciem 120 kV na transmisyjnym mikroskopie elektronowym i rejestruj obrazy za pomocą kamery urządzenia z naładowaną parą.

10. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)

  1. Pobrać próbki EV i frakcji białkowej w temperaturze od -80 °C i rozmrozić na lodzie.
  2. Włącz komputer i urządzenie NTA. Otwórz oprogramowanie NTA, a rozpocznie się jego automatyczne inicjowanie.
  3. Wybierz odpowiednią pompę, która zawiera wodę wolną od cząstek stałych i kliknij przycisk Wypłucz instrument, aby przepłukać ogniwo. Podczas płukania wstrzyknij 10-20 ml wody wolnej od cząstek stałych do portu iniekcyjnego z przodu instrumentu za pomocą strzykawki i unikaj pęcherzyków powietrza.
  4. Pojawi się ekran sprawdzania jakości komórki; kliknij OK i rozpocznie się sprawdzanie jakości komórki. Po pomyślnym przejściu kontroli pojawi się wyskakujący ekran automatycznego wyrównywania z informacją: Proszę wypełnić komórkę zawiesiną wyrównania 100 nm (rozcieńczenie 1:250 000).
    1. Przygotować rozcieńczenie 1 zawiesiny wyrównującej przez dodanie 10 ml wody wolnej od cząstek stałych i 10 μl kulek polistyrenowych o długości 100 nm do probówki (rozcieńczenie 1:1 000). Delikatnie odwróć do mieszania. Rozcieńczenie 1 ma okres trwałości 2-3 dni w temperaturze 4 °C.
    2. Utworzyć rozcieńczenie 2 zawiesiny wyrównującej przez dodanie 20 ml wody wolnej od cząstek stałych i 80 μl rozcieńczenia 1 (1:1,000) do probówki, aby uzyskać rozcieńczenie 1:250,000. Delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać. Rozcieńczenie 2 ma okres trwałości 30-60 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Wypełnić kukrę 2 ml rozcieńczenia 2 (1:250 000). Kliknij OK, a program zakończy automatyczne wyrównywanie (ostrość) i optymalizację ostrości. Otworzy się zakładka analiza, w której można utworzyć profil, który dostarcza wyników czystości i symetrii celi pomiarowej w paraboli. Pojawi się wyskakujący ekran z informacją: View Video Mikroskop jest teraz gotowy do eksperymentów; kliknij OK, a program powróci do zakładki sprawdzania komórek.
  6. Wypłucz kulki polistyrenu z komórki, wstrzykując wodę wolną od cząstek stałych do portu iniekcyjnego w celu umycia ogniwa. Kontynuuj mycie, aż liczba wykrytych cząstek będzie mieścić się w przedziale 0-10 (zwykle między 5-10 ml). Dodaj 1 ml przefiltrowanego PBS o wielkości 0,22 μm, aby przygotować komórkę do pierwszej próbki.
  7. Rozcieńczyć pierwszą próbkę PBS z filtrem 0,22 μm (rozpocząć od rozcieńczenia 1:1000) i wprowadzić współczynnik rozcieńczenia do programu. Włóż 1 ml próbki do celi i odczekaj 5 minut, aż ruch cząstek zwolni, ponieważ początkowo będą one poruszać się bardzo szybko po ekranie. Ustaw czułość i migawkę odpowiednio na 75,0 i 100.
  8. Liczba wykrytych cząstek do idealnego rozcieńczenia próbki wynosi 50-200 cząstek. W przypadku stwierdzenia obecności cząstek poniżej 50 lub powyżej 200 należy dostosować rozcieńczenie próbki. Jeśli wymagane jest nowe rozcieńczenie, przemyj ogniwo wodą wolną od cząstek, aż do wykrycia 0-10 cząstek. Powtarzać dodawanie rozcieńczonej próbki i przemywanie aż do uzyskania idealnego rozcieńczenia.
  9. Sprawdź wszystkie 11 pozycji kamery, aby zwizualizować, że ruch cząstek uległ spowolnieniu i upewnij się, że liczba wykrytych cząstek jest podobna we wszystkich pozycjach kamery. Jeśli liczba cząstek różni się znacznie w zależności od pozycji kamery, dodaj więcej próbki.
  10. Kliknij kartę Pomiar i uruchom pobieranie wideo. Na karcie akwizycji wideo wprowadź niestandardową nazwę próbki i zidentyfikuj bezpieczną lokalizację. Zaznacz pola autosave.txt i autosave.pdf, aby zapisać dane.
  11. Ustaw temperaturę na 25 °C, kliknij 488 nm, aby ustawić laser i kliknij 11, aby ustawić pozycje kamery. Kliknij przycisk OK, aby uruchomić zbieranie danych. Program rozpocznie analizę liczby cząstek i ich wielkości we wszystkich 11 pozycjach. Na karcie analizy pojawi się wykres słupkowy ze średnicą/nm na osi x i cząstkami/ml na osi y.
  12. Po zebraniu danych pojawi się wyskakujący ekran zatytułowany Przegląd pozycji, zawierający dane dla każdej z 11 pozycji. Jeżeli z analizy usunięto więcej niż dwie pozycje, należy powtórzyć procedurę z większą ilością próbki. Jeśli nie, kliknij przycisk Kontynuuj. Otworzy się plik PDF i txt zawierający wyniki. Zapisz pliki w bezpiecznym miejscu.
  13. Aby uruchomić kolejny przykład, przejdź do karty Sprawdzanie komórek i powtórz kroki od 10.6 do 10.12. Jeśli to zrobisz, umyj komórkę wodą bez cząstek, aż liczba wykrytych cząstek wyniesie 0-10 (około 5-10 ml). Przepłucz komórkę 1 ml PBS z filtrem 0,22 μm, zamknij program i wyłącz komputer.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot ujawnia odpowiednie oddzielenie EV od CCM
Aby ocenić skuteczność SEC w oddzielaniu EV od pożywek do hodowli komórkowych, przeprowadzono western blot przy użyciu każdej pojedynczej frakcji z próbek kontrolnych w celu zbadania ekspresji trzech kanonicznych markerów EV, CD9, CD63 i CD81, a także GM130 i calnexin18, które zostały użyte jako kontrole ujemne (Rysunek 3). Albumina expression18 został również zbadany, aby upewni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEC to przyjazna dla użytkownika metoda odpowiedniego oddzielania pojazdów elektrycznych od kondycjonowanego CCM. W celu specyficznego wyizolowania EV pochodzących z komórek należy wziąć pod uwagę staranne rozważenie rodzaju CCM i jego dodatków. Wiele pożywek do hodowli komórkowych musi być uzupełnionych FBS, który zawiera EV pochodzące od zwierzęcia, u którego zebrano surowicę. Te EV w surowicy mogą nasycać i maskować każdy sygnał wytwarzany przez EV pochodzące z komórek w hodowli26. W związku z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Penn State Behrend i Hamot Health Foundation za finansowanie, a także Penn State Microscopy Facility w University Park, PA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolVWR97064-588
4X Laemmli Bufor do próbekBioRad1610747
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC900308odcięcie 3 kDa
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 z membraną Ultracel-3Sigma-AldrichUFC2003243 kDa odcięcie
Amon NadsiarczanSigma-AldrichA3678-100G
Anty królik IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężona z HRP7074V1:1000 Rozcieńczenie
Przeciwciało anty-kalnexinoweAbcam  ab225951:500 Rozcieńczenie
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD9BioLegend3121021:500 Rozcieńczenie
przeciwciała anty-GM130 [EP892Y] - Marker cis-GolgiegoAbcamab526491:500 Rozcieńczenie
Anty-mysie IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRP7076V1:1000 Rozcieńczony
automatyczny kolektor frakcjiIzon Science
Zestaw do testów BCABio-Rad
Kamera CCDGatan Orius SC200
Cd63 Mysz anty ludzka556019 BD:1000 Rozcieńczenie
CD81 PrzeciwciałoSanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Rozcieńczanie
Cellstar Filter Cap Kolby do hodowli komórkowychGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoksycholanSigma-AldrichD6750-10G
ditiotreitolSigma3483-12-3
DMEM/Wysoka glukoza z L-glutaminą; bez soduCytivaSH300022.
Płodowa surowica bydlęca Klasa premiumVWR97068-085
Płodowa surowica bydlęca, zubożona w egzosomyThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Świetna wartość Beztłuszczowe mleko w proszkuAmazonB076NRD2TZ
HOG Ludzka linia komórkowa oligodendrogliomaSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Rozmiar Kolumny wykluczające 5pkIzon Science
Metanol >99,8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Płytki szklaneBioRad1653310z przekładkami 0,75 mm
Mini-PROTEAN Krótkie płytkiBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicylina-Streptomycyna, roztwórSigma-AldrichP4458-100 ml
soli fizjologicznej buforowanej fosforanami PBSFisher Scientific BP66150
Pierce Zestawy do oznaczania białek BCA i odczynnikiThermo Fisher Scientific23227
Membrany transferowe Pierce PVDFThermo Scientific88518
Bibuła filtracyjna Pierce Western BlottingThermo Scientific84783
Polioksyetylen-20 (TWEEN 20), 500 mlBio BasicTB0560
Koktajl inhibitorów proteazy/fosfatazy (100X)Technologia sygnalizacji komórkowej5872S
Rekombinowane przeciwciało anty-TSG101 [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 rozcieńczenie
Wodorotlenek slodiumSigma-AldrichSX0603
Azydek soduFisher ScientificBP922I-500
Chlorek soduSigma-AldrichS9888-500G
Dodecylosiarczan sodu,≥ 99,0% (GC), bezpyłowe granulkiSigma-Aldrich75746-1KG
TetrametyloetylenodiaminaSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Zestaw do usuwania plam z akrylamidu FastCast, 10%BioRad1610183
Transmisyjny mikroskop elektronowyFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsyna 0,25% proteaza z trypiną wieprzową, HBSS, EDTA; bez wapnia, magnezuCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View oprogramowanieAnalytikNTA
1FS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ultrafiltrowanieseparacja EVp cherzyki zewn trzkom rkowe oligodendrocyt wWestern blotledzenie nanocz stektransmisyjna mikroskopia elektronowamarkery EV

Powiązane artykuły