Artykuł metodologiczny

Izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy

DOI:

10.3791/63617

⸱

2 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Kanpur, 2The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine, Indian Institute of Technology-Kanpur, 3Mechanobiology Institute, National University of Singapore

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste poduszeczki tłuszczowej (IFP-MSC) można łatwo wyizolować z podrzepkowej poduszki tłuszczowej stawu kolanowego. Dobrze rozmnażają się in vitro, tworzą kolonie CFU-F i różnicują się w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne. W niniejszym artykule przedstawiono metodologię izolacji, rozszerzania i różnicowania IFP-MSC od stawu kolanowego kóz.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IFP, obecny w stawie kolanowym, służy jako obiecujące źródło MSC. IFP jest łatwo dostępną tkanką, ponieważ jest rutynowo wycinana i odrzucana podczas zabiegów artroskopowych i operacji wymiany stawu kolanowego. Dodatkowo jego usunięcie wiąże się z minimalną chorobowością miejsca dawczego. Ostatnie badania wykazały, że IFP-MSC nie tracą swojej zdolności do proliferacji podczas ekspansji in vitro i mają niezależny od wieku potencjał różnicowania osteogennego. IFP-MSC mają wyższy potencjał różnicowania chondrogennego w porównaniu z MSC pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMSC) i komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ADSC). Chociaż komórki te są łatwo dostępne od starszych i chorych pacjentów, ich skuteczność jest ograniczona. W związku z tym stosowanie IFP-MSC od zdrowych dawców jest ważne dla określenia ich skuteczności w zastosowaniach biomedycznych. Ponieważ dostęp do zdrowego ludzkiego dawcy jest utrudniony, modele zwierzęce mogą być lepszą alternatywą, która umożliwi podstawowe zrozumienie. Duże zwierzęta, takie jak psy, konie, owce i kozy, odgrywają kluczową rolę w badaniach translacyjnych. Wśród nich koza może być preferowanym modelem, ponieważ staw kolanowy kozy ma anatomię najbliższą anatomii ludzkiego stawu kolanowego. Co więcej, kozi IFP może spełniać wyższe liczby MSC potrzebne do zastosowań związanych z regeneracją tkanek. Co więcej, niski koszt, dostępność i zgodność z zasadami 3R w badaniach na zwierzętach sprawiają, że są one atrakcyjnym modelem. W badaniu tym przedstawiono prosty protokół izolacji IFP-MSC ze stawu kolanowego kóz oraz warunki hodowli in vitro dla ich ekspansji i różnicowania. Aseptyczne izolowanie IFP od kozy zostało umyte, zmielone i strawione enzymatycznie. Po filtracji i odwirowaniu pobrane komórki poddano hodowli. Komórki te były przylegające, miały morfologię podobną do MSCs i wykazywały niezwykłą zdolność klonogenną. Co więcej, różnicowały się one w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne, co świadczy o ich wielosilnej mocy. Podsumowując, badanie wykazało izolację i ekspansję MSC, które wykazują potencjał w zastosowaniach inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są atrakcyjnym kandydatem do terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej1,2. Można je pobierać z różnych źródeł tkanek, takich jak szpik kostny, pępowina, łożysko, miazga zębowa i podskórna tkanka tłuszczowa3. Ponieważ jednak dostępność komórek macierzystych u dorosłych jest ograniczona, a procedura ich izolacji jest często inwazyjna (co skutkuje chorobowością w miejscu dawczym), pożądane jest posiadanie alternatywnego źródła komórek macierzystych, które mogłoby obejść te wyzwania.

Staw kolanowy to magazyn różnych typów komórek, takich jak MSC pochodzące z poduszek tłuszczowych podrzepkowych, MSC pochodzące z błony maziowej, MSC pochodzące z płynu maziowego, fibroblasty więzadeł, chondrocyty stawowe, itd4,5,6. Komórki te mają potencjał, aby być szeroko badane w badaniach opartych na inżynierii tkanki mięśniowo-szkieletowej. W związku z tym staw kolanowy może być możliwym i wiarygodnym źródłem wielu rodzajów MSC. Magazyn tłuszczu znajdujący się w stawie kolanowym, znany jako poduszeczka tłuszczowa podrzepkowa (IFP) lub poduszeczka tłuszczowa Hoffy, jest obiecującym i alternatywnym wyborem MSC depot. IFP jest stosunkowo łatwo dostępnym i klinicznie dostępnym źródłem MSC, ponieważ jest rutynowo wycinany i wyrzucany jako odpad chirurgiczny podczas artroskopii kolana lub operacji otwartego kolana. Usunięcie IFP wiąże się z minimalną chorobowością w miejscu dawczym, co również czyni go atrakcyjnym źródłem tkanek. Mając podobny profil fenotypowy, MSC z IFP (IFP-MSC) mają zwiększony potencjał klonogenny w porównaniu z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BM-MSCs)6 i lepszą zdolność proliferacyjną w porównaniu z podskórnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ADSC)7. Co ciekawe, w porównaniu z MSC POCHODZĄCYMI Z MAZI STAWOWEJ (SF-MSC), IFP-MSC nie tracą swojej zdolności proliferacyjnej w późnych pasażach, ani nie wydłużają się w późnych pasażach. Sugeruje to, że podczas ekspansji komórek IFP-MSC mogą osiągnąć wystarczająco dużą liczbę komórek do zastosowań w inżynierii tkankowej in vitro bez uszczerbku dla ich szybkości proliferacji8. Ostatnie badania sugerują również, że IFP-MSCs mają lepszy potencjał różnicowania chondrogennego w porównaniu z MSCs pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMSC) i MSCs pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC), prawdopodobnie ze względu na ich anatomiczną bliskość do chrząstki stawowej, co wskazuje na ich przydatność do inżynierii tkanki chrzęstnej6,7,9,10. Co więcej, posiadają również niezależny od wieku potencjał różnicowania osteogennego11. Wykazano, że dostawowe wstrzyknięcie IFP-MSCs zmniejsza ból i poprawia funkcje stawu kolanowego u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA)12,13. Ponadto odnotowano również silne odpowiedzi immunosupresyjne i ulepszone właściwości immunomodulacyjne IFP-MSCs w obecności cytokin zapalnych w stanach patologicznych6.

IFP-MSCs są obiecującym i alternatywnym źródłem MSC; jednak ich korzyści terapeutyczne w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej są stosunkowo mniej zbadane. Istniejące badania nad IFP-MSC wykorzystywały głównie komórki pochodzące od dawców ludzkich. Wśród nich w kilku ostatnich badaniach analizowano IFP-MSC od zdrowych dawców ludzkich (pacjenci bez artretyzmu, w wieku 17-60 lat)6,14, podczas gdy w większości badań stosowano IFP-MSC od starszych pacjentów poddawanych operacji całkowitej wymiany stawu kolanowego (pacjenci chorzy, w wieku 70-80 lat). Ponieważ wiadomo, że zarówno wiek, jak i choroba zmieniają normalne funkcjonowanie komórek macierzystych (zmniejszona liczba i utrata potencjału funkcjonalnego), może to potencjalnie prowadzić do niespójności w wynikach badań opartych na MSC7,15,16,17. Ponadto stosowanie IFP-MSC od pacjentów ze schorzeniami patofizjologicznymi (np. zapalenie stawów i otyłość) również stwarza trudności w zrozumieniu podstawowych cech zdrowych komórek in vitro, działając tym samym jako czynnik ograniczający w rozwoju terapii opartych na MSCs. Aby przezwyciężyć te problemy, niezbędne jest wykorzystanie IFP-MSC od zdrowych dawców. Ponieważ dostęp do zdrowego ludzkiego dawcy jest trudny, lepszą alternatywą mogą być modele zwierzęce. W związku z tym istnieje kilka badań, w których IFP został wyizolowany od myszy18. Jednak ze względu na mały rozmiar poduszeczki tłuszczowej u normalnych myszy, tkanki tłuszczowe pochodzące od wielu zwierząt zostały połączone, aby uzyskać wystarczającą ilość tkanki do przeprowadzenia skomplikowanych procedur eksperymentalnych19. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na duży model zwierzęcy, który mógłby spełnić wymóg większej liczby komórek i jednocześnie spełniać zasady 3R (udoskonalić, zastąpić i zmniejszyć) w badaniach na zwierzętach20. Wykorzystanie dużych zwierząt ma znaczące implikacje w badaniach translacyjnych. W szczególności w inżynierii tkanki mięśniowo-szkieletowej badano szereg dużych zwierząt, takich jak psy, świnie, owce, kozy i konie21. Koza (Capra aegagrus hircus) jest doskonałym wyborem dla dużych zwierząt, ponieważ jej staw kolanowy ma anatomię najbliższą anatomii ludzkiego stawu kolanowego22,23,24. Struktura beleczkowa kości podchrzęstnej i grubość kości podchrzęstnej kóz są podobne do ludzkich, a proporcja chrząstki do kości jest również zbliżona do ludzkiej21. Ponadto kozy zostały szeroko udomowione na całym świecie, dzięki czemu są łatwo dostępne, gdy są dojrzałe kostnie. Co więcej, niskie koszty utrzymania i łatwa obsługa sprawiły, że są one atrakcyjnym modelem zwierzęcym do badań22.

W niniejszym badaniu pokazano prosty protokół izolacji IFP-MSC ze stawu kolanowego Capra aegagrus hircus (kozy) oraz warunki hodowli in vitro dla ich ekspansji i różnicowania. Wyizolowane komórki są przylegające, mają morfologię podobną do MSC, tworzą kolonie CFU-F (fibroblasty tworzące kolonie) i posiadają potencjał różnicowania adipogennego, chondrogenicznego i osteogennego. W związku z tym IFP-MSC wykazują potencjał jako alternatywne źródło MSC do zastosowań biomedycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opiera się na izolacji IFP-MSC od kóz. IFP i krew kozy pobrano z lokalnej rzeźni. Z uwagi na fakt, że takie pobieranie tkanek nie podlega kompetencjom Instytucjonalnej Komisji Etyki Zwierząt, zgoda etyczna nie była wymagana.

1. Izolacja IFP-MSC od stawu udowo-piszczelowego koziego kolana

  1. Pobrać staw udowo-piszczelowy kozy (próbka) obejmujący ~15 cm każdy z obszarów udowych i piszczelowych kończyn tylnych. Natychmiast umieścić próbkę w wysterylizowanym pojemniku do pobierania próbek i przechowywać ją w temperaturze 4 °C w celu transportu do laboratorium w celu dalszego przetwarzania. Przetwarzaj próbki aseptycznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych przez cały czas trwania procedury (Rysunek 1, Krok 1).
  2. Umieścić próbkę na szalce Petriego o średnicy 150 mm i dokładnie przepłukać ją autoklawowanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) uzupełnionym antybiotykami (5 μg/ml amfoterycyny B, 200 μg/ml penicyliny-streptomycyny i 50 μg/ml cyprofloksacyny) w celu uniknięcia zanieczyszczenia. Zawsze upewnij się, że próbka jest uwodniona za pomocą PBS.
  3. Dokładnie zbadaj obszary anatomiczne próbki. Aby ułatwić dostęp do torebki stawowej, upewnij się, że dodatkowe tkanki z obu kości długich zostały całkowicie usunięte (Rysunek 1, Krok 2).
  4. Aby to osiągnąć, najpierw przytrzymaj jedną ręką końcową powierzchnię kości udowej i ostrymi nożyczkami przetnij wzdłużnie w kierunku stawu. Podczas procesu usuń otaczające mięśnie i tkankę tłuszczową z kości. Należy uważać, aby tkanka otaczająca bezpośrednią torebkę stawową pozostała początkowo nienaruszona.
  5. Podobnie wykonaj kolejne nacięcie na piszczelowym końcu próbki i usuń mięśnie i tkankę tłuszczową z kości piszczelowej. Upewnij się, że obie kości długie są całkowicie odsłonięte, a torebka stawowa jest wyraźnie widoczna po tym kroku (Rysunek 1, Krok 3).
  6. Następnie wykonaj nacięcie z obu stron błony maziowej, aby rozciąć staw przegubowy (Rysunek 1, Krok 4). Odetnij rzepkę zarówno z błony maziowej, jak i więzadeł rzepki za pomocą świeżej partii wysterylizowanych nożyczek i kleszczy. Oddzieloną rzepkę należy natychmiast umieścić na szalce Petriego zawierającej PBS (Rysunek 1, Krok 5).
  7. Usuń całą poduszeczkę tłuszczową znajdującą się na wewnętrznej powierzchni rzepki za pomocą nożyczek i kleszczyków i zbierz poduszeczkę tłuszczową na innej świeżej szalce Petriego (Rysunek 1, Krok 6). Zebraną poduszeczkę tłuszczową zmielić za pomocą skalpela. Dołącz inne narzędzia chirurgiczne (np. nożyczki lub ostrza chirurgiczne) zgodnie z wymaganiami, aby uzyskać jak najmniejsze kawałki/segmenty tłuszczu ~2-3 mm.
    UWAGA: Dobre mielenie ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej wydajności komórek. Zawsze utrzymuj tkankę nawilżoną i nie pozwól jej wyschnąć na żadnym etapie procedury izolacji.
  8. Przenieść zmieloną tkankę za pomocą szpatułki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przemyć ją PBS uzupełnionym antybiotykami w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut w mieszalniku do probówek. Powtórz krok prania 3 razy po 15 minut.
  9. Do trawienia enzymatycznego inkubować tkankę mieloną (~ 5 g) w zmodyfikowanym podłożu Eagle's Media firmy Dulbecco (DMEM o niskiej glukozie) zawierającym 1,5 mg/ml kolagenazy typu II (20 ml) i uzupełnionym 2% FBS w temperaturze 37 °C przez 12-16 h.
    UWAGA: Wykonaj trawienie w mieszalniku probówek z prędkością ~15 obrotów na minutę (RPM).
  10. Ostrożnie odessać strawioną tkankę i przefiltrować ją przez sitko do komórek (70 μm) w celu usunięcia niestrawionej tkanki. Odwirować filtrat w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przy sile 150 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i przemyć osad DMEM o niskiej zawartości glukozy co najmniej 2x,
    UWAGA: Strawioną tkankę należy powoli wlać do sitka, aby uniknąć rozlania. Użyj probówki wirówkowej o małej objętości (15 ml), aby uzyskać dobry granulek.
  11. Otrzymany osad komórkowy należy zawiesić w kompletnych pożywkach DMEM (DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełniony 10% FBS i antybiotykami [2,5 μg/ml amfoterycyny, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny i 25 μg/ml cyprofloksacyny]), określanych w protokole w kolejnych krokach jako pożywki ekspandacyjne.
  12. Wysiewać komórki na 150-milimetrowych szalkach Petriego i hodować je w pożywce ekspandującej uzupełnionej 5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i soli trisodowej kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego o stężeniu 50 μg/mL. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić komórkom przyleganie i namnażanie się. Codziennie monitoruj przyczepianie i wzrost komórek.

2. Utrzymanie i rozbudowa izolowanych komórek

  1. Zmieniaj pożywkę co 3 dni, aż komórki zaczną się zlewać. Dodawać świeżą sól trisodową kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego o stężeniu 5 ng/ml i 50 μg/ml kwasu triskorbinowego bezpośrednio na szalkę Petriego za każdym razem, gdy zmieniana jest pożywka. Po tym, jak komórki staną się zlewające się w 80%-90%, subkulturuj komórki.
    UWAGA: Usuń nieprzylegające elementy podczas każdej zmiany nośnika. W przypadku, gdy po 3 dniach inkubacji widoczne są kropelki oleju, należy przemyć komórki PBS 1x, a następnie dodać świeżą pożywkę do szalki Petriego. Kontynuuj mycie PBS przed każdą wymianą mediów, aż kropelki oleju zostaną całkowicie usunięte.
  2. Hodowla cząstkowa komórek: Usuń pożywkę ekspandacyjną z szalki Petriego i umyj komórki 1x PBS. Dodać 4 ml 0,25% trypsyny/EDTA do naczynia i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 4 min.
    UWAGA: Konfluencja (80%-90%) jest osiągana w ciągu 7 dni. Podczas trypsynizacji równomiernie rozprowadzić roztwór trypsyny/EDTA na całej powierzchni szalki Petriego.
  3. Usuń komórki, stukając w płytkę z boku i obserwując pod mikroskopem, aby potwierdzić, że wszystkie komórki są odłączone. Zneutralizować trypsynę po dodaniu równej objętości (4 ml) pożywki ekspandatoryjnej.
  4. Zebrać zdysocjowane komórki za pomocą pipety do świeżej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w żądanej objętości pożywki eksplatacyjnej.
  5. Policz komórki przy użyciu standardowej metody liczenia komórek i subkultury na 150 mm szalkach Petriego przy gęstości wysiewu 1 x 104 komórki/cm2 w celu dalszej ekspansji. Do wszystkich testów należy użyć zlewającej się monowarstwy komórek o numerze pasażu P2-P5.
    UWAGA: Kriokonserwuj nadmiar komórek.

3. Ocena zdolności klonogennych IFP-MSC za pomocą testu tworzenia kolonii (CFU-F)

  1. W przypadku testu CFU-F należy zasiać komórki w pożywce ekspandacyjnej na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o gęstości wysiewu 50-100 komórek/cm2. Dodaj pożywkę, aby uzyskać końcową objętość 3 ml.
    UWAGA: Zoptymalizuj stężenie komórek do testów i leczenia.
  2. Hodować komórki przez 12 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w standardowych warunkach hodowli, aby umożliwić komórkom utworzenie kolonii. Zmieniaj nośnik co 3 dni. Zachowaj ostrożność podczas zmiany nośnika.
  3. Po 12 dniach przepłukać kolonie 1x PBS i utrwalić je za pomocą 20% metanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zabarwić kolonie barwnikiem fioletu krystalicznego (0,5% [w/v] w 20% metanolu) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Policz poszczególne kolonie za pomocą odwróconego mikroskopu.
    UWAGA: Kolonia jest definiowana jako klaster składający się z więcej niż 50 komórek.

4. Potencjał różnicowania IFP-MSC

  1. Indukowanie różnicowania adipogennego IFP-MSC
    1. Aby wywołać adipogenezę, należy wysiać komórki o gęstości 25 x 103 komórek/cm2 na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Dodać pożywkę, aby uzyskać końcową objętość 500 μl. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    2. Jednego dnia po konfluencji zastąp pożywkę ekspandacyjną 500 μl adipogennych pożywek różnicujących. Potrzeba około 2 dni, aby komórki osiągnęły zbieżność.
    3. Przygotować adipogenne pożywki różnicujące, uzupełniając pożywki ekspandujące (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/ml amfoterycyny, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny i 25 μg/ml cyprofloksacyny) 25 mM (+)-glukozy, 10 μg/ml insuliny, 1 μM deksametazonu i 100 μM indometacyny.
      UWAGA: Pożywka różnicująca jest niestabilna w temperaturze 4 °C po 1 miesiącu; W związku z tym przygotuj podłoże w razie potrzeby.
    4. Rozważ komórki hodowane w pożywce ekspandowanej uzupełnionej 25 mM D (+) glukozy jako nieindukowane kontrole. Zmieniaj nośnik co 3 dni przez 14 dni. Pod koniec 14 dni umyj komórki 1x PBS. Utrwalić komórki za pomocą obojętnej buforowanej formaliny (NBF; 4 % formaldehydu w PBS) przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Po utrwaleniu przemyć studzienki 1x wodą destylowaną, a następnie inkubować komórki z 60% izopropanolem przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu izopropanolu wybarwić kropelki lipidów, inkubując komórki z 500 μl roztworu roboczego barwnika Oil Red O przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki 1x wodą destylowaną, aby usunąć niezwiązany barwnik i zobrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu.
      UWAGA: Przygotować roztwór podstawowy Oil Red O (ORO), rozpuszczając 300 mg ORO w 100 ml 99% izopropanolu. Aby przygotować roztwór roboczy, należy wymieszać trzy części wywaru ORO i dwie części wody destylowanej i pozostawić do wymieszania w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przefiltrować mieszaninę za pomocą bibuły filtracyjnej 0,2 μm. Roztwór roboczy jest gotowy do użycia. Roztwór podstawowy można przygotować i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc w ciemności, natomiast roztwór roboczy musi być świeżo przygotowany przed każdym użyciem/barwieniem.
  2. Indukowanie chondrogennego różnicowania MSC IFP
    1. Izolacja osocza koziego:
      1. Przygotować 3,4% (w/v) cytrynian sodu w wodzie destylowanej. Dodać 5 ml przygotowanego roztworu cytrynianu sodu do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      2. Zbierz 45 ml świeżo wyizolowanej krwi koziej do tej samej probówki. Natychmiast przechylić probówkę, aby dokładnie wymieszać krew z cytrynianem sodu, aby zapobiec zakrzepom, i przetransportować ją do laboratorium w temperaturze 4 °C.
      3. Odwirować pobraną krew kozią o sile 1000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant (osocze) do świeżej probówki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przefiltrować plazmę przez filtry 0,2 μm, podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.
        UWAGA: Podczas obchodzenia się z próbkami należy utrzymywać temperaturę 2-8 °C. Ważne jest, aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania plazmy.
    2. Hoduj rozprężone komórki do zbiegu 80%-90%, dysocjuj komórki za pomocą roztworu trypsyny/EDTA i osadzaj komórki w 150 x g przez 5 minut w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Zawiesić osad w osoczu kozim o gęstości 2 x 106 komórek na 50 μl roztworu osocza.
    3. Dodać kroplę komórek zawierających osocze (50 μl) na wysterylizowaną szalkę Petriego o średnicy 90 mm, a następnie dodać chlorek wapnia o końcowym stężeniu 0,3% (m/v). Dobrze wymieszaj, aby wytworzyć usieciowany hydrożel plazmowy.
    4. Inkubować wytworzony hydrożel w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Po inkubacji przenieść hydrożele na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych zawierające pożywki chondrogenne.
    5. Przygotować pożywkę chondrogenną, uzupełniając DMEM o niskiej zawartości glukozy 10 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES), 1,25 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM proliny, 50 μg/ml soli trisodowej kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego, 100 nM deksametazonu, 1x insulina, transferyna, selenin sodu + linolowo-BSA (ITS+1), antybiotyki (2,5 μg/ml amfoterycyny, 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny i 25 μg/ml cyprofloksacyny), i 10 ng / ml transformujący czynnik wzrostu - β1 (TGF-β1).
    6. Hydrożele hodowane w kompletnych pożywkach DMEM (DMEM niski poziom glukozy z 10% FBS i antybiotykami [2,5 μg / ml amfoterycyny, 100 U / ml penicyliny-streptomycyny i 25 μg / ml cyprofloksacyny]) bez TGF-β1 są uważane za nieindukowane kontrole. Zmieniaj nośnik co 3 dni przez 14 dni.
    7. Po 14 dniach chondrogenicznego różnicowania komórek w hydrożelach osocza, przemyć hydrożele PBS 3x przez 5 min każdy, a następnie utrwalić próbki w NBF przez 3 godziny
      UWAGA: Formaldehyd jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym i może powodować podrażnienie nosa, gardła i płuc po wdychaniu . Wszystkie procedury związane z formaldehydem należy wykonać w dygestorium.
    8. Usunąć NBF, przemyć hydrożele PBS 3x przez 5 minut każdy, a następnie inkubować w 35% (m/v) sacharozie w temperaturze pokojowej przez noc, aby umożliwić całkowite wchłonięcie roztworu do próbek. Hydrożele należy aklimatyzować w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) przez 3 godziny. Osadź próbki w związku OCT za pomocą form silikonowych pod ciekłym azotem.
    9. Próbki o grubości 10-12 μm należy pociąć na szkiełkach pokrytych żelatyną za pomocą kriotomu i przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. Aby zbadać obecność lub odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej po różnicowaniu chondrogennym, wybarwić skrawki barwnikiem Alcian Blue i Safranin-O, które wiążą się z siarczanowymi glikozaminoglikanami.
      UWAGA: Aby przygotować barwnik Alcian Blue, rozpuść 1 g barwnika Alcian Blue w 100 ml 0,1 N HCl i dokładnie wymieszaj w mieszalniku probówkowym przez noc. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc w ciemności. Aby przygotować barwnik Safranin-O, rozpuść 0,1 g barwnika Safranin-O w 100 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszaj w mikserze probówkowym przez noc.
    10. W przypadku barwienia Alcian Blue należy przemyć skrawki hydrożelu 1x wodą destylowaną przez 5 minut. Aby utrwalić sekcje, dodaj 4% NBF do szkiełek i inkubuj przez 30 minut.
    11. Przemyć sekcje 1x wodą destylowaną przez 5 min, a następnie 2x 0,1 N HCl przez 30 s każda. Usuń HCl i delikatnie osusz szkiełka bibułą. Dodać przygotowaną barwie Alcian Blue do skrawków i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
    12. Przemyć niezwiązany barwnik 0,1 N HCl, a następnie wodą destylowaną przez 3 minuty. Odwodnić skrawki w absolutnym etanolu, oczyścić je z ksylenu, a na koniec umieścić poplamione skrawki w żywicznym podłożu w celu obrazowania.
    13. W przypadku barwienia Safranin-O należy umyć skrawki hydrożelu wodą destylowaną 1x przez 5 min. Aby utrwalić sekcje, dodaj 4% NBF do szkiełek i inkubuj przez 30 minut. Umyj skrawki 1x wodą destylowaną przez 5 min, a następnie zanurz szkiełka w 1% kwasie octowym na 10-15 s. Delikatnie osusz szkiełka bibułą.
    14. Dodać przygotowany barwnik Safranin-O do skrawków i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Niezwiązany barwnik przemyć 100% etanolem. Zanurz szkiełka w 100% etanolu na 5 minut. Wysuszyć szkiełka na powietrzu, oczyścić je z ksylenu, a na koniec zamontuj poplamione sekcje w żywicznym podłożu do obrazowania.
  3. Indukowanie różnicowania osteogennego MSCs IFP
    1. Aby wywołać różnicowanie osteogenne, należy trypsynizować komórki, jak wspomniano wcześniej (Krok 2.2.). Wysiewać komórki o gęstości 3 x 103 komórki/cm2 na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Dodać pożywkę, aby uzyskać końcową objętość 500 μl. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . 1 dzień po wysiewie zastąp podłoże ekspansywne 500 μl osteogennym podłożem różnicującym.
    2. Przygotuj pożywkę osteogenną, uzupełniając pożywkę ekspandacyjną (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg / ml amfoterycyny, 100 U / ml penicyliny-streptomycyny i 25 μg/ml cyprofloksacyny) 25 mM D (+)-glukozy, 10 nM deksametazonu, 10 mM β-glicerofosforanu, 50 μg / ml soli trisodowej kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego i 10 nM witaminy D3,
      UWAGA: Komórki hodowane w pożywkach ekspandacyjnych uzupełnionych 25 mM D (+) glukozy uważa się za nieindukowane kontrole.
    3. Zmieniaj pożywkę osteogenną co 3 dni przez 14 dni lub 28 dni. Pod koniec 14 dni zmierz stopień osteogenezy za pomocą barwienia fosfatazą alkaliczną (ALP).
      UWAGA: Aby przygotować podłoże do barwienia ALP, rozpuść jedną tabletkę 5-bromo-4-chloro-3-indolylowo-fosforanu (BCIP)/nitroniebieskiego tetrazolu (NBT) w 10 ml wody destylowanej w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Pozwól, aby tabletka całkowicie się rozpuściła. Roztwór podłoża jest gotowy do użycia. Ponieważ roztwór substratu nie może być przechowywany przez dłuższy czas, w zależności od potrzeb, należy przełamać tabletkę na pół i rozpuścić ją w 5 ml wody destylowanej. Aby przygotować bufor permeabilizacyjny, dodać bufor Tris (100 mM) i chlorek magnezu (5 mM) do wody destylowanej. Dodaj Triton X100 (0,1%) do roztworu i pozwól mu się rozpuścić. Dostosuj pH roztworu do 9,25-9,75.
    4. W przypadku barwienia ALP, po 14 dniach od indukcji, usuń pożywkę i umyj komórki PBS. Napraw komórki za pomocą NBF (4%) przez 1 minutę. Przemyć komórki PBS i przetworzyć permeat za pomocą przygotowanego buforu do lizy przez 2-3 minuty.
    5. Dodać 500 μl przygotowanego roztworu substratu do komórek i pozostawić do inkubacji przez 15 minut do 1 godziny, w zależności od poziomu ekspresji. Sprawdź rozwój fioletowo-niebieskiego koloru pomiędzy.
    6. Usunąć roztwór substratu i przemyć wodą destylowaną. Zobrazuj wybarwione komórki za pomocą odwróconego mikroskopu.
    7. Pod koniec 28 dni zmierz stopień zwapnienia po indukcji osteogennej za pomocą barwienia czerwienią Alizaryny.
      UWAGA: Aby przygotować roztwór barwiący Alizarin Red-S (40 mM), rozpuść 2 g Alizarin Red-S w 100 ml wody destylowanej i dostosuj pH do 4,1-4,3 za pomocą HCl lub NH4OH. Przefiltrować roztwór przez membranę 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Ważne jest pH roztworu; Dlatego zaleca się przygotowanie świeżego roztworu lub ponowne zmierzenie pH roztworu, jeśli ma więcej niż 1 miesiąc.
    8. W przypadku barwienia Alizarin Red-S, po 28 dniach od indukcji, usuń pożywkę i umyj komórki 1x zimnym PBS. Utrwalić ogniwa przy użyciu 70% etanolu przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    9. Usuń utrwalacz i umyj komórki 2x wodą destylowaną. Całkowicie usuń wodę i dodaj 1 ml roztworu Alizarin Red-S do każdej studzienki.
    10. Inkubować komórki z roztworem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i obrazować komórki za pomocą mikroskopu odwróconego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja IFP-MSC od stawu udowo-piszczelowego kozy
Etapy związane z izolacją IFP-MSC od stawu kolanowego kozy przedstawiono na Rysunek 1. Poduszka tłuszczowa obecna na wewnętrznej, niestawowej powierzchni rzepki została usunięta, rozdrobniona i trawiona enzymatycznie. IFP-MSC zostały pomyślnie wyizolowane i poddane hodowli in vitro (Rysunek 2A).

Zdolność do ekspansji i klonogenności IFP-MSCs

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole przedstawiono prostą, wiarygodną i powtarzalną metodę izolacji MSCs z koziego IFP. Komórki wyizolowane tą metodą zostały z powodzeniem wykorzystane w naszych dotychczasowych badaniach do regeneracji tkanek in vitro. Zaobserwowano, że izolowane komórki były proliferacyjne, reagowały na różne czynniki wzrostu i zachowywały swoją aktywność biologiczną po wysianiu na elektroprzędzonych włóknach i rusztowaniach25,26. Ponadto zaobserwowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SH dziękuje za wsparcie ze strony Instytutu Stypendium Podoktorskiego IIT Kanpur oraz grantu SYST od DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM dziękuje Indyjskiemu Instytutowi Technologii w Kanpur (IIT-Kanpur) za stypendium Instytutu. DSK dziękuje Gireesh Jankinath Chair Professorship and Department of Biotechnology (Indie) za dofinansowanie (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH i DSK dziękują The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine w IIT-Kanpur za hojne wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
β-glicerofosforanSigma-AldrichG9422-10G10 mM
0,25% Trypsyna- 0,02% EDTAHi-MediaTCL049
15-mL probówka wirówkowaCorning
2-fosfo-L-askorbinowy sól trisodowaSigma49752-10G50 µ g / ml
2-PropanolSigma-AldrichI9516
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)HiMediaTCL021-50ml10 mM
50-mL probówka wirówkowaCorning
Alcian BlueHi-MediaRM471Do barwienia sufowanych gykozaminoglikany
Alizarin Red SS D Fine-Chem Limited26048-25GDo osadzania wapnia
Amfoterycyna BHiMediaA0112,5 &mikro; g / ml
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)Sino Biologicals10014-HNAE5 ng / mL
BCIP / NBT Podłoże ALPSigmaB5655-5TABDo barwienia ALP
bezpieczeństwa biologicznego
BSAHiMediaMB-083Długa nazwa: Albumina surowicy bydlęcej (1,25 mg / ml )
Sitko do komórekHiMediaTCP-18270 &mikro; m
WirówkaREMI
CiprofloksacynaRANBAXY LAB. LimitowanyB17407T12.5 i mikro; g/ml
Crystal VioletS D Fine-Chem Limited42555
D(+)-glukozaMerck1.94925.052125 mM
DeksametazonSigma-AldrichD29151 &mikro; M
DMEM LGSIGMAD5523Długa nazwa: Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Media Etanol o niskiej zawartości glukozy
Merck100983
FBSGibco10270Długa nazwa: Roztwór formaldehydu w surowicy bydlęcej płodu
37%-41%Merck61780805001730
IndometacynaSigma-AldrichI7378100 i mikro; M
Insulina Sigma-AldrichI927810 &mikro; g/mL
Mikroskop odwróconyNikon Eclipse TS 100
ITS + 1Sigma-AldrichI2521-5mLDługa nazwa: insulina, transferyna, selenin sodu + linol-BSA
L-ProlinaHiMediaTO-109-25G1
mM Chlorek magnezuMerck61751605001730Do lizy bufor
MetanolMeck1.07018.2521
Mikropipety i sterylne końcówki (20 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L)Thermoscientific
MUSE Analizator komórekMerck MilliporeDo liczenia komórek
Związek OCTTissue-Tek4583Długa nazwa: Optymalna temperatura skrawania
Olej Red O dyeS D Fine-Chem Limited54304Do barwienia wakuoli lipidowej
Penicylina-StreptomycynaHiMediaA007100 U / ml
Petri szalki (150 mm i 90 mm)NEST
SafraninO S D Fine-Chem Limited50240Do barwienia suflowanych gykozaminoglikany
Cytrynian soduSigma-AldrichC34343,4 % (w/v)
Sterylne nożyczki, kleszcze i skalpeleDo izolacji IFP-MSC
SacharozaMerck1.94953.052135 % (w/v)
TGF- β 1Sino BiologicalsDługa nazwa: Transformujący czynnik wzrostu- β 1 (10 ng/ml)
Inkubator do hodowli tkankowych 37 ° C, 5% CO2Thermoscientific
BuforTris Merck61771405001730Do lizy bufor
Triton X100S D Fine-Chem Limited40632Do buforu do lizy
Kolagenaza typu IIGibco171010151,5 mg / ml
Witamina D3SigmaC9756-1G10 nM
Płytki dołkowe (6 -WP i 24-WP)gniazdo
Szafa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  2. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22(2019).
  3. Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349(2020).
  4. Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
  5. Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
  6. Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864(2019).
  7. Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
  8. Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295(2016).
  9. Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873(2016).
  10. Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
  11. Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
  12. Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
  13. Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
  14. Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44(2021).
  15. Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323(2019).
  16. Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
  17. Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
  18. Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
  19. Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
  20. Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
  21. Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
  22. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19(2016).
  23. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  24. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  25. Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256(2021).
  26. Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
  27. Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
  28. Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
  29. Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
  30. Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
  31. Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
  32. Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
  33. Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
  34. Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
  35. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  36. Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
  37. Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).
  38. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  39. Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
  40. Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
  41. Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek macierzystychekspansja kom rekr nicowanie chondrogenner nicowanie osteogenner nicowanie adipogennemedycyna regeneracyjnain ynieria tkankowa

Powiązane artykuły