Artykuł metodologiczny

Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA

DOI:

10.3791/63623

⸱

2 maja 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia prostą, opłacalną metodę izolacji DNA do analizy zmian mikroflory jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiota jelitowa odgrywa ważną rolę w kształceniu układu odpornościowego. Zależność ta jest niezwykle ważna dla zrozumienia chorób autoimmunologicznych, które są napędzane nie tylko przez czynniki genetyczne, ale także czynniki środowiskowe, które mogą wywołać początek i/lub pogorszyć przebieg choroby. Wcześniej opublikowane badanie dotyczące dynamiki mikrobioty jelitowej u samic myszy MRL/lpr podatnych na toczeń wykazało, w jaki sposób zmiany mikrobioty jelitowej mogą wpływać na postęp choroby. W tym miejscu opisano protokół ekstrakcji reprezentatywnych próbek z mikrobioty jelitowej do badań autoimmunizacji. Próbki mikrobioty są pobierane z odbytu i poddawane obróbce, z której DNA ekstrahuje się metodą fenolowo-chloroformową i oczyszcza przez wytrącanie alkoholu. Po wykonaniu PCR oczyszczone amplikony są sekwencjonowane przy użyciu platformy sekwencjonowania nowej generacji w Argonne National Laboratory. Na koniec analizowane są dane sekwencjonowania genu rybosomalnego RNA 16S. Jako przykład przedstawiono dane uzyskane z porównań mikrobioty jelitowej myszy MRL/lpr z lub bez CX3CR1. Wyniki wykazały znaczące różnice w rodzajach zawierających bakterie chorobotwórcze, takie jak bakterie z gromady Proteobacteria, a także z rodzaju Bifidobacterium, który jest uważany za część zdrowej mikrobioty komensalnej. Podsumowując, ta prosta i opłacalna metoda izolacji DNA jest niezawodna i może pomóc w badaniu zmian mikrobioty jelitowej związanych z chorobami autoimmunologicznymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzie i bakterie współistnieją od dawna. Ustalili współzależny związek z wzajemnymi korzystnymi efektami, który wpływa na odpowiedź immunologiczną gospodarza w sposób ilościowy i jakościowy1. Ostatnie badania sugerują związek między składem mikrobioty jelitowej a patogenezą chorób autoimmunologicznych, do których należą stwardnienie rozsiane2, reumatoidalne zapalenie stawów3, cukrzyca typu 24, Nieswoiste zapalenie jelit5 i toczeń rumieniowaty układowy (SLE)6. Jednak to, czy mikrobiota jelitowa jest główną przyczyną, czy wtórnym skutkiem tych chorób autoimmunologicznych, jest nadal niejasne7. Potencjalnie mikrobiota jelitowa może zaostrzyć chorobę w fazie efektorowej zaburzeń autoimmunologicznych lub odgrywać rolę w regulacji indukcji tych chorób8.

U samic myszy MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) stwierdzono dysbiozę jelitową i zaobserwowano zmiany mikroflory jelitowej ze znacznym niedoborem pałeczek kwasu mlekowego9. Kiedy mieszanina pięciu szczepów Lactobacillus została podana doustnie, objawy podobne do tocznia były znacznie osłabione u tych myszy, co sugeruje istotną rolę mikrobioty w regulacji patogenezy TRU.

Następująca technika ekstrakcji DNA pozwala śledzić fluktuacje mikrobioty i analizować je jakościowo i ilościowo w trakcie mysiej choroby podobnej do SLE u myszy podatnych na toczeń. Niezależnie od tego, czy chodzi o zbadanie zdrowej mikrobioty jelitowej, czy zdefiniowanie dysbiozy, ważne jest, aby krytycznie przeanalizować, w jaki sposób dane są gromadzone oraz czy są one dokładne i powtarzalne10. Każdy krok ma kluczowe znaczenie w tym procesie. Do ekstrakcji DNA drobnoustrojów należy zastosować odpowiednią metodologię, ponieważ wszelkie możliwe problemy wprowadzające błędy systematyczne podczas procesu ekstrakcji DNA mogą skutkować niedokładną reprezentacją drobnoustrojów. Chociaż metoda fenolowo-chloroformowa jest opisana tutaj, istnieją komercyjnie dostępne zestawy do ekstrakcji DNA z bakterii, które sprawdzają się w określonych przypadkach11. Ich użyteczność jest jednak ograniczona kosztem i wymaganą ilością próbki.

Przedstawiony tutaj protokół jest opłacalny i wymaga tylko niewielkiej ilości próbki. Działa dobrze z każdym rodzajem próbki kału i jest przydatny w badaniu dynamiki mikrobioty jelitowej w czasie, a także w porównaniach między grupami. DNA izoluje się metodą oczyszczania alkoholowego, w której wykorzystuje się fenol, chloroform i alkohol izoamylowy. Ekstrakcja na bazie alkoholu pomaga oczyścić i usunąć próbkę białek i lipidów, w której na ostatnim etapie wytrąca się DNA. Proponowana metoda charakteryzuje się znacznie wysoką skutecznością i jakością oraz udowodniono, że jest dokładna w identyfikacji populacji bakterii. Jedną z krytycznych uwag podczas procedury jest to, że może dojść do zanieczyszczenia DNA, a zatem wymagane jest odpowiednie obchodzenie się z próbką12.

DNA jest następnie analizowane przez platformy sekwencjonowania nowej generacji dla genu 16S rRNA, takie jak Illumina MiSeq. W szczególności analizowany jest region hiperzmienny V4 w celu zapewnienia lepszej kwantyfikacji taksonów o wysokiej randze13. Późniejsza analiza bioinformatyczna jest zlecana na zewnątrz, a następnie przeprowadzana jest analiza wewnętrzna przy użyciu standardowych metod statystycznych. Dostępnych jest wiele programów bioinformatycznych typu open source do sekwencjonowania na dalszych etapach, a rodzaj wykonywanych analiz zależy w dużej mierze od konkretnego pytania biologicznego będącego przedmiotem zainteresowania14. Protokół ten koncentruje się w szczególności na etapach eksperymentalnych poprzedzających sekwencjonowanie i zapewnia bardziej wszechstronną, opłacalną, porównywalną i wydajną metodę uzyskiwania DNA z próbek kału.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Locus Cx3cr1gfp/gfp myszy B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J był krzyżowany wstecznie z MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) przez 10 pokoleń, aby wygenerować myszy MRL/lpr-CX3CR1 gfp/gfp. Badania przesiewowe genomu przy użyciu paneli polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) potwierdziły, że tło genetyczne nowo wygenerowanych myszy było w ponad 97% identyczne z tłem MRL/lpr. Następnie myszy były hodowane i utrzymywane w określonym środowisku wolnym od patogenów, zgodnie ze specyficznymi wymaganiami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech. Próbki pobrano, gdy myszy miały 13, 14 i 15 tygodni.

1. Pobieranie próbek mikrobioty od myszy

  1. Wyjmij każdą mysz z klatki z osobna. Zebrać granulki kału bezpośrednio z odbytu i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia. Próbki należy przetwarzać za pomocą sterylnych i czystych kleszczy, probówek i rękawiczek.
    UWAGA: Pojemnik (np. zlewka) może być użyty do umieszczenia myszy w oczekiwaniu na próbkę kału. Wyczyść pojemnik etanolem przed i po każdej myszy.
  2. Dodaj zamrożony granulat do wstępnie zważonej probówki z nakrętką o pojemności 2 ml. Zapisz masę kału w gramach, która powinna wynosić od 0,02 do 0,05 g na granulkę kału.
  3. Dodaj do granulatu cienką warstwę kulek szklanych o średnicy 0,1 mm, 500 μl buforu do lizy (50 mM NaCl, 5 mM Tris i 50 mM EDTA) i 200 μl 20% SDS.
  4. Ubijaj rurkę przez 4 minuty w homogenizatorze (przy maksymalnej mocy), a następnie 3-5 minut wirowania.
  5. Wirować przez krótki czas, aby usunąć pęcherzyki i pianę (naciśnij przycisk na wirówce, aż osiągnie 1,000-1,200 x g, a następnie zwolnij).

2. Ekstrakcja DNA

  1. Przenieść 350 μl supernatantu otrzymanego w kroku 1.5 (uważając, aby nie przenosić żadnych zanieczyszczeń) do nowej probówki z zatrzaskiem o pojemności 1,5 ml. Dodać 500 μl mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (PCI; 25:24:1, v/v) i wirować przez 1 min.
    UWAGA: Od teraz próbki muszą być przenoszone wewnątrz okapu chemicznego. PCI jest toksyczny.
  2. Wirować w temperaturze 6 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Przenieść 180 μl fazy wodnej (górna warstwa) do nowej probówki z zatrzaskiem o pojemności 1,5 ml. Dodać 180 μl (1:1) chloroformu, odwrócić i wymieszać.
    UWAGA: Zminimalizuj zanieczyszczenie z dolnej warstwy podczas przenoszenia górnej warstwy.
  3. Wirować w temperaturze 18 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Przenieść 180 μl fazy wodnej do nowej probówki z zatrzaskiem.
    UWAGA: Po odrzuceniu PCI i chloroformu, w komorze bezpieczeństwa biologicznego można wykonać następujące czynności.
  4. Dodaj 180 μl zimnego izopropanolu i 36 μl 5M NH4Ac. Odwróć kilka razy do wymieszania i umieść probówkę na lodzie na 20 minut.
  5. Wirować w temperaturze 18 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wlać do odrzucenia supernatantu. Umyj granulat kilkakrotnie 500 μl zimnego 70% etanolu podczas odwracania.
    UWAGA: Etanol należy rozcieńczyć podwójnie dejonizowaną sterylną wodą.
  6. Wirować w temperaturze 18 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant w celu usunięcia pozostałości etanolu.
  7. Wysuszyć probówkę do góry nogami na bibułce przez 20 minut, aż granulka stanie się przezroczysta. Zawiesić osad w 50 μl wody molekularnej. Podgrzewać ciecz w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić duże granulki DNA.
  8. Po podgrzaniu zakręć rurkami, aby odzyskać kropelki kondensatu na pokrywie (3 400 x g przez 1 min).
  9. Zmierzyć stężenie i uzyskać stosunek 260/280 za pomocą spektrofotometru. Użyj wody molekularnej jako ślepego miejsca. Dobrej jakości DNA powinno mieć proporcje 260/280 w zakresie od 1,8 do 2,
    UWAGA: Oczekiwany plon DNA wynosi co najmniej 0,03 g na osad kału.

3. Przygotowanie próbki do sekwencjonowania genu 16S rRNA

  1. Wyślij próbki DNA do Argonne National Laboratory, gdzie są one poddawane przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowane na Illumina Miseq.
    1. Próbki należy wysyłać w 96-dołkowych płytkach z pełną listwą dolną, z próbkami ułożonymi w rzędach (A1-A12, B1-B12 itd.) i uszczelnionymi uszczelkami z płytek foliowych.
    2. Wyślij końcową objętość 20 μl na próbkę na studzienkę, w stężeniu od 1-50 ng / μL.
      UWAGA: Rozcieńczenia należy wykonywać wodą molekularną.
    3. Po przygotowaniu próbek wirować w temperaturze 600 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie zamrażać próbki w temperaturze -80 °C przez 24 godziny.
    4. Wyślij w nocy na suchym lodzie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki z Argonne National Laboratory są analizowane przez wykwalifikowanego bioinformatyka, a następnie przeprowadzana jest wewnętrzna analiza danych przy użyciu standardowych metod statystycznych. Typowe analizy mikrobiomu obejmują grupowanie podobnych sekwencji w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) lub warianty sekwencji amplikonów (ASV) jako wskaźnik zastępczy dla różnych mikroorganizmów w próbce. Liczby OTU lub ASV w próbkach można następnie wykorzystać do zbadania zmian w różnorodności wewnątrz próbki (alfa) i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrównoważona mikrobiota jelitowa może chronić organizm ludzki przed chorobami. Gdy ta równowaga zostanie zakłócona przez zewnętrzne lub wewnętrzne wyzwalacze, konsekwencje mogą być katastrofalne. Metoda ta przedstawia sposób analizy dynamiki mikrobioty jelitowej w modelach mysich. Metoda ta nadaje się nie tylko do porównań między grupami, ale także do śledzenia mikrobioty jelitowej w czasie, aby lepiej identyfikować czynniki zależne od czasu, które zaburzają mikrobiotę jelitową.

Wszystkie mysz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy pomoc ze strony Argonne National Laboratory i współpracujących z nami bioinformatyków. Praca ta jest wspierana przez różne granty NIH i wewnętrzne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koraliki szklane 0,1 mmProdukty BioSpec11079101
Rurki z nakrętką 2 mlThermo Fisher Scientific3488
20% SDSFisherScientificBP1311-1SDS 20%
96% Etanol, klasa biologii molekularnejThermo Fisher ScientificT032021000CS
Octan amonu (5 m)Thermo Fisher ScientificAM9071NH4AC 5M
B6.129P2(CG)-Cx3cr1tm1Litt/JJackson Laboratory005582
Bullet Blender burza 24Next Advance4116-BBY24MHomogenizator
chloroformFisherScientificC298-500
Woda uzdatniona DEPCThermo Fisher ScientificAM9916
Kwastetraoctowy etylenodiaminyFisherScientificBP118-500EDTA
Uszczelka foliowaFisherScientificNC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256FisherScientific06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) myszyJackson Laboratory000485
Spektrofotomer Nanodrop 2000Thermo Fisher ScientificND2000CLAPTOP
Fenol: chloroform: izoamylalchohol (25:24:1)FisherScientificBP1752I-400Skala PCI
z 4 miejscami po przecinkuMettler ToledoMS205DU
96-dołkowe płytki z osłonąThermo Fisher ScientificAB-0800
Chlorek soduFisherScientific15528154NaCl
Tris ChlorowodorekFisherScientificBP1757-100
VortexScientific IndustriesSI-0236

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
  2. Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
  3. Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).
  4. Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085(2010).
  5. Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
  6. Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
  7. Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).
  8. Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
  9. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73(2017).
  10. Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).
  11. Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).
  12. Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365(2016).
  13. Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).
  14. Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
  15. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamika mikrobioty jelitowejekstrakcja fenolo chloroformowamodele chor b autoimmunologicznychsekwencjonowanie 16S rRNAbakterie patogenneamplifikacja PCRwykrywanie Proteobacteria

Powiązane artykuły