Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Formułowanie i charakterystyka systemu nośników dopaminy opartego na egzosomach

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63624

⸱

4 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj naszym celem było uzyskanie preparatu poprzez ładowanie dopaminą izolowanych egzosomów komórek macierzystych z galaretowatych mezenchymalnych komórek macierzystych Whartona. W niniejszym protokole opisano izolację i charakterystykę egzosomów, ładowanie leku do powstałych egzosomów oraz aktywność cytotoksyczną opracowanego preparatu.

Streszczenie

Egzosomy o wielkości od 40 do 200 nm stanowią najmniejszą podgrupę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Te bioaktywne pęcherzyki wydzielane przez komórki odgrywają aktywną rolę w ładunku międzykomórkowym i komunikacji. Egzosomy znajdują się głównie w płynach ustrojowych, takich jak osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz, ślina, płyn owodniowy, siara, mleko matki, płyn stawowy, nasienie i kwas opłucnowy. Biorąc pod uwagę wielkość egzosomów, uważa się, że mogą one odgrywać ważną rolę w chorobach ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ mogą przenikać przez barierę krew-mózg (BBB). W związku z tym badanie to miało na celu opracowanie systemu nanonośników opartego na egzosomach poprzez enkapsulację dopaminy w egzosomach wyizolowanych z galaretowatych mezenchymalnych komórek macierzystych Whartona (WJ-MSC). Egzosomy, które przeszły proces charakteryzacji, inkubowano z dopaminą. Egzosomy naładowane dopaminą zostały ponownie scharakteryzowane pod koniec inkubacji. Egzosomy obciążone dopaminą badano w testach uwalniania leków i cytotoksyczności. Wyniki pokazały, że dopamina może być z powodzeniem zamknięta w egzosomach i że egzosomy obciążone dopaminą nie wpływają na żywotność fibroblastów.

Wprowadzenie

Egzosomy, bioaktywne pęcherzyki o znaczących cechach, o rozmiarach od 40 nm do 200 nm. Egzosomy pochodzą z błony komórkowej i powstają w wyniku uwalniania endosomów1. Struktury te służą jako komunikatory międzykomórkowe i oddziałują z sąsiednimi komórkami, aby ułatwić transfer aktywnych cząsteczek. Egzosomy można izolować z wielu różnych źródeł. Należą do nich płyny ustrojowe, takie jak osocze, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, ślina, a także linie komórkowe hodowane w warunkach in vitro. Egzosomy odgrywają ważną rolę w eliminacji uszkodzeń nerwów, dzięki zawartym w nich biomakrocząsteczkom, takim jak lipidy, białka i kwasy nukleinowe2. Gleja, które są komórkami podporowymi układu nerwowego3, przenoszą białka i mikro RNA do aksonów neuronów za pośrednictwem egzosomów4.

Lipidy tworzące osłonkę mielinową, które są charakterystyczną cechą przewodnictwa nerwowego, są również uwalniane z oligodendrocytów za pośrednictwem egzosomów4,5. Egzosomy są również zaangażowane w procesy takie jak plastyczność synaptyczna, neuronalna reakcja na stres, komunikacja komórka-komórka i neurogeneza w mózgu6,7. Fakt, że egzosomy mają nanowymiary, umożliwia im przejście przez barierę krew-mózg. Istnieje specjalna droga przejścia z płynu śródmiąższowego do płynu mózgowo-rdzeniowego po przeniknięciu przez tę błonę8. Dzięki swoim właściwościom powierzchniowym egzosomy mogą skutecznie oddziaływać z komórkami docelowymi jako system dostarczania leków i aktywnie dostarczać załadowane leki.

Ze względu na ekspresję różnych białek adhezyjnych (tetraspanin i integryn) na powierzchni egzosomów, te pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą łatwo wchodzić w interakcje i łączyć się z błonami komórkowymi gospodarza9. Uważa się, że egzosomy mogą być stosowane jako system dostarczania leków, zwłaszcza w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego ze względu na ich zdolność do przenikania przez barierę krew-mózg i ich właściwości powierzchniowe. Egzosomy pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) mają mniejsze ryzyko odrzucenia immunologicznego w porównaniu z allogenicznymi terapiami komórkowymi i pod tym względem mogą być ważnym składnikiem aplikacji do leczenia bezkomórkowego10.

Dopamina to cząsteczka, której niedobór w mózgu jest cechą charakterystyczną choroby Parkinsona (PD), pogarszającą się z dnia na dzień11,12,13. Wiadomo, że PD jest związane ze zwyrodnieniem neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej śródmózgowia i utratą funkcji neuronów ruchowych14,15. Śmierć neuronów dopaminergicznych uniemożliwia dopływ neuroprzekaźnika dopaminy do prążkowia mózgu. To z kolei prowadzi do pojawienia się objawów specyficznych dla PD16. Te objawy PD to bradykinezja, niestabilność postawy, sztywność, a zwłaszcza drżenie spoczynkowe12,13. Chociaż PD została po raz pierwszy opisana ponad dwa wieki temu, badania mające na celu zrozumienie patologii i etiologii choroby wciąż trwają i obecnie przyjmuje się, że PD jest złożoną chorobą ogólnoustrojową17. Przewiduje się, że występuje niedobór dopaminy, a kliniczne objawy PD obserwuje się, gdy ponad 80% neuronów ulega degeneracji18. W leczeniu choroby preferowana jest niepełna suplementacja dopaminy w celu zmniejszenia objawów motorycznych. Badania in vivo wykazały, że bezpośredni wlew dopaminy do mózgu znacznie zmniejsza objawy u zwierząt19. Prekursory dopaminy, takie jak L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenyloalanina) i leki z receptorem dopaminy, są stosowane w klinice, ponieważ bezpośredni wlew dopaminy do mózgu nie jest możliwy u ludzi, a dopamina dostająca się do systemu nie może przekroczyć klasy BBB20. Tego typu leki z czasem tracą swoją skuteczność. Jednak nadal nie ma podejścia do leczenia choroby Parkinsona. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba opracowania nowych strategii terapeutycznych i metod leczenia, aby ujawnić patofizjologię choroby i zmniejszyć wpływ choroby Parkinsona na pacjentów.

Badania oparte na egzosomach przyciągnęły ostatnio uwagę ze względu na zbieranie informacji zarówno o podejściach terapeutycznych, jak i patologiach chorób układu nerwowego. Wykazano, że egzosomy pochodzące z MSC zmniejszają stan zapalny w uszkodzeniu nerwów i przyczyniają się do regeneracji neuronów21,22,23. Ponadto doniesiono, że sekretomy egzosomów pochodzące z MSC zmniejszają apoptozę, wykazując działanie neurotroficzne i neuroprotekcyjne, szczególnie na neurony dopaminergiczne24,25. Badania nad platformami, w których egzosomy są wykorzystywane jako systemy dostarczania leków terapeutycznych, w ostatnich latach znacznie przyspieszyły. W licznych badaniach zaobserwowano, że odpowiednie leki można łatwo zamknąć w egzosomach i bezpiecznie dostarczyć do docelowych komórek, tkanek i narządów26,27. Różne metody, takie jak inkubacja, cykle zamrażania/rozmrażania, sonikacja i ekstruzja, mogą być używane do ładowania leków do egzosomów28.

Coincubation z egzosomami lub pęcherzykami podobnymi do egzosomów pozwala na pasywne zamknięcie lipofilowych małych cząsteczek w tych systemach dostarczania28,29,30. W szczególności różne cząsteczki, takie jak curcumin31, catalase30, doxorubicin32 i paclitaxel33 zostały skutecznie załadowane do egzosomów. Zaobserwowano, że egzosomy zawierające katalazę, które mają działanie przeciwutleniające, skutecznie akumulują się w neuronach i komórkach mikrogleju w mózgu i wykazują silne działanie neuroprotekcyjne30. W tym samym badaniu stwierdzono, że saponina, dodana do kompleksu w celu zwiększenia wydajności ładowania, zwiększa procentowy udział leku w ładowaniu podczas inkubacji30,34. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby ustalić standardy ładowania leków do egzosomów.

Ten artykuł opisuje rozwój systemu nanonośników poprzez enkapsulację dopaminy do egzosomów, które zostały wyizolowane z WJ-MSC. Wszystkie etapy, w tym hodowla WJ-MSC, izolacja i charakterystyka egzosomów, eksperymenty z ładowaniem leków, charakterystyka egzosomów obciążonych dopaminą za pomocą różnych technik oraz analiza cytotoksyczności in vitro są szczegółowo wyjaśnione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów i sprzętu użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Hodowla i kriokonserwacja mezenchymalnych komórek macierzystych z galaretki Wharton'a

  1. Wyjąć WJ-MSCs (z ATCC) z zamrażarki -80 °C. Wysiać komórki do kolby zawierającej pożywkę DMEM-F12 uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO2.
  2. Wymieniać pożywkę hodowlaną co 2 dni. Pasażować komórki, gdy osiągną 80% konfluencji. Przemyć komórki przeznaczone do pasażowania 5 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
    UWAGA: Przemywanie PBS przed dodaniem trypsyny zapewnia łatwe oddzielenie komórek od powierzchni kolby.
  3. Usunąć PBS i dodać do kolby 5 mL roztworu trypsyny-EDTA. Inkubować kolbę przez 5 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO2.
  4. Przenieść supernatant do probówki i odwirować przy 1,500 x g przez 5 min. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać do probówki 1 mL DMEM-F12 + 10% FBS za pomocą pipety.
  5. Przenieść komórki do większej kolby i kontynuować hodowlę, dodając DMEM-F12 + 10% FBS, aż do uzyskania wystarczającej ilości egzosomów35.
    UWAGA: Hodowane komórki mrozi się w gęstości 1 milion/mL z dodatkiem 10% dimetylosulfoksydu (DMSO) i przechowuje w temperaturze -80 °C.

2. Produkcja egzosomów z mezenchymalnych komórek macierzystych galaretkica Wharton'a

UWAGA: Egzosomy są izolowane z hodowlanych WJ-MSCs. Izolację egzosomów przeprowadza się, gdy komórki pokryją powierzchnię kolby i osiągną gęstość około 80%.

  1. Usunąć z kolby supernatant medium zawierający 10% FBS i przemyć komórki 5 mL PBS. Po płukaniu PBS dodać do komórek medium DMEM-F12 bez surowicy. Inkubować kolby przez 48 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 . Po inkubacji zebrać medium bez surowicy do probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: W kroku 2.1 zbiera się i przechowuje w temperaturze -20 °C 180 mL medium bez surowicy. Po rozmrożeniu rozpoczyna się proces wirowania seryjnego, zgodnie z opisem poniżej.
  2. Izolacja egzosomów
    1. Odwirować zebrane medium bez surowicy przy 300 x g przez 10 min w temperaturze +4 °C. Ostrożnie pobrać supernatant i przenieść go do innej probówki.
    2. Odwirować zebrany supernatant przy 2,000 × g przez 10 min w temperaturze +4 °C. Ostrożnie pobrać supernatant i przenieść go do innej probówki.
    3. Odwirować zebrany supernatant przy 10,000 × g przez 30 min w temperaturze +4 °C. Ostrożnie pobrać supernatant i przenieść go do innej probówki.
    4. Przenieść zebrany supernatant do probówek do ultrawirowania i poddać ultrawirowaniu przy 110,000 × g przez 130 min. Powoli usunąć supernatant i dodać 1 mL PBS do osadu.
    5. Wymieszać osad na wortexie i poddać ultrawirowaniu przy 110,000 × g przez 70 min w temperaturze +4 °C36​ (Rysunek 1). Powoli usunąć supernatant i dodać 1 mL PBS do osadu.
      UWAGA: Po zakończeniu etapów ultrawirowania otrzymane egzosomy można przechowywać w temperaturze -80 °C. Otrzymany osad jest teraz gotowy do charakterystyki.

Schemat procesu izolacji komórek macierzystych z galaretki Wharton; hodowla komórkowa, wirowanie, inkubacja w CO₂.
Rysunek 1: Izolacja egzosomów. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

3. Charakterystyka egzosomów

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    UWAGA: Analiza śledzenia nanocząstek jest wykonywana w celu określenia rozmiaru i stężenia wyizolowanych egzosomów. Tabletki stosowane do przygotowania roztworu 1x PBS muszą mieścić się w zakresie pH 7,3-7,5. Roztwór 1x PBS zawiera 10 mM buforu fosforanowego, 137 mM chlorku sodu i 2,7 mM chlorku potasu. Roztwór przygotowuje się poprzez dodanie 1 tabletki PBS do 100 mL wody destylowanej. Tak przygotowany roztwór sterylizuje się w autoklawie.
    1. Rozcieńczyć egzosomy 100-krotnie, dodając 990 µL PBS do 10 µL egzosomów. Przenieść rozcieńczoną zawiesinę do jednorazowej strzykawki.
    2. Włączyć urządzenie NTA i podłączyć komputer. Uruchomić oprogramowanie.
    3. Wstrzyknąć próbkę ze strzykawki do przewodu w sekcji kasety urządzenia. Zamknąć pokrywę kasety urządzenia.
    4. W uruchomionym oprogramowaniu kliknąć przycisk Start Analysis. Zapisane wyniki uzyskać poprzez naciśnięcie przycisku Record .
  2. Analiza dynamicznego rozpraszania światła
    UWAGA: Egzosomy wyizolowane do pomiaru potencjału zeta i rozmiaru są rozcieńczane w ten sam sposób, co w przypadku analizy NTA.
    1. Dodać 980 µL PBS do 20 µL egzosomów.
    2. Uruchomić urządzenie do pomiaru potencjału zeta i rozmiaru oraz podłączony komputer. Otworzyć oprogramowanie.
    3. Przenieść zawiesinę z kroku 3.2.1 do jednorazowej kuwety. Otworzyć pokrywę urządzenia, umieścić kuwetę w kasecie i zamknąć pokrywę.
    4. Wybrać typ kuwety w oprogramowaniu urządzenia. Kliknąć przycisk Start Analysis w celu przeprowadzenia analizy potencjału zeta i analizy wymiarowej.
      UWAGA: Analizy wymiarowa oraz potencjału zeta są wykonywane oddzielnie.

4. Ładowanie dopaminy do egzosomów

UWAGA: Po zakończeniu charakterystyki egzosomów WJ-MSC uzyskano egzosomy obciążone dopaminą jako system dostarczania leku. Obciążanie egzosomów lekiem przeprowadza się metodą inkubacji.

  1. Do zawiesiny egzosomów z kroku 2.2.5 dodać 3 mL PBS. Rozcieńczoną zawiesinę wysterylizować poprzez filtrację za pomocą filtrów 0,22 µm. Przenieść 500 µL wysterylizowanej zawiesiny egzosomów do innej probówki.
  2. Przygotować roztwór dopaminy (0,5 mg/mL) w wodzie destylowanej. Dodać 500 µL roztworu dopaminy do probówek zawierających egzosomy.
  3. Do zawiesiny z kroku 4.2 dodać saponinę. Przygotowaną zawiesinę egzosomów z dopaminą inkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Stężenie saponiny nie powinno przekraczać 0,002% całkowitego roztworu.
  4. Zawiesinę poddać ultrawirowaniu przy 90 000 × g przez 70 min w celu usunięcia wolnej dopaminy i saponiny z medium. Wyizolowane egzosomy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz37.
    UWAGA: W celu stabilizacji przygotowanego roztworu dopaminy dodać 0,02% kwasu askorbinowego.

5. Charakterystyka egzosomów obciążonych dopaminą

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    UWAGA: Analizę śledzenia nanocząstek wykonuje się w celu określenia wielkości i stężenia wyizolowanych egzosomów.
    1. Należy wykonać kroki 3.1.1-3.1.4, aby rozcieńczyć egzosomy i przeprowadzić analizę NTA.
  2. Analiza dynamicznego rozpraszania światła
    UWAGA: Egzosomy wyizolowane do pomiaru potencjału zeta i wielkości są rozcieńczane w sposób analogiczny do analizy NTA.
    1. Należy wykonać kroki 3.2.1-3.2.4, aby rozcieńczyć egzosomy i przeprowadzić analizę dynamicznego rozpraszania światła.
      UWAGA: Wielkość i potencjały zeta dla każdego roztworu (saponina, dopamina, egzosomy-dopamina) są analizowane osobno.

6. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

UWAGA: Ilości dopaminy załadowane do egzosomów są mierzone metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). W celu wykrycia obecności dopaminy w otrzymanej formulacji, egzosomy są rozrywane za pomocą specjalnego procesu.

  1. Umieścić preparat w ogrzewaczu w temperaturze 75 °C w celu odparowania. Do zawiesiny dodać acetonitryl (w stosunku 50:50) i wymieszać w wortexie. Roztwór sonikować przez 10 min.
  2. Odwirować roztwór przez 10 min przy 10 000 × g. Nadpływ przefiltrować przez filtr 0,22 µm.
  3. Przeanalizować wszystkie anality przy użyciu kolumny C18 w temperaturze 30 °C i przepływie 1 mL/min (faza ruchoma H2O/acetonitryl). Zmierzyć absorbancję przy 230 nm38.

7. Pomiar pojemności załadunku leku (DL) i kinetyka uwalniania leku in vitro

  1. Wydajność ładowania leku (DL)
    UWAGA: Ilość dopaminy załadowanej do egzosomów jest określana ilościowo za pomocą spektroskopii UV-Vis. Absorbancję odczytuje się przy 280 nm. Zebrane podczas syntezy nadsączniki służą do pomiaru ilości niezładowanego leku. Stężenie dopaminy w nadsączniku jest wyznaczane poprzez standardowa krzywa kalibracyjna dla dopaminy.
    1. Przygotuj roztwór stokowy dopaminy o stężeniu 1 mg/ml. Z roztworu stokowego przygotuj roztwory o stężeniach 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 i 0,5 mg/ml, wykorzystując do rozcieńczenia wodę destylowaną.
      UWAGA: W celu zapewnienia stabilności przygotowanego roztworu dopaminy należy dodać 0,02% kwasu askorbinowego.
    2. Wygeneruj standardową krzywą kalibracyjną, mierząc absorbancję każdego rozcieńczenia dopaminy przy 280 nm w spektrofotometrze UV.
    3. Zmierz absorbancję supernatantu przy 280 nm.
    4. Oblicz pojemność załadunku leku dla dopaminy, korzystając z równania (1)39.
      DL (%) = Obliczanie wiązania białek, wzór: (A(całkowite)-A(nadkresowe))/A(całkowite), procentowa wydajność. 100 (1)
      UWAGA: Analizę wykonuje się w trzech powtórzeniach.
  2. In vitro kinetyka uwalniania leku
    UWAGA: Kinetykę uwalniania leku z egzosomów obciążonych dopaminą analizuje się przy użyciu membrany dializacyjnej. Jako medium uwalniające, w celu symulacji fizjologicznego mikrośrodowiska, stosuje się PBS o pH 7,4.
    1. Do membrany dializacyjnej należy dodać 1 ml egzosomów obciążonych dopaminą. Membranę należy umieścić w zlewce. Do zlewki należy dodać 15 ml PBS.
    2. Pobrać próbkę 1 ml medium uwalniającego z zlewki w czasie 0,5, 1, 2, 4, 6 i 8 h. W każdym punkcie czasowym zastąpić pobraną objętość świeżym roztworem PBS. Próbki pobrane w określonych odstępach czasu analizować przy 280 nm przy użyciu spektrometru UV-Vis.
    3. Oblicz wyniki, korzystając z równania (2)40.
      Uwolnienie (%) = Wzór na stosunek uwalniania dopaminy, symbol Σ; równanie chemiczne dla analizy neuroprzekaźników.  100  (2)
      UWAGA: W celu oznaczenia przygotowuje się krzywą kalibracyjną dla in vitro kinetyka uwalniania leku. Roztwór dopaminy przygotowano w stężeniach 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 oraz 5,0 mg/ml. Wartość absorbancji UV dla każdego stężenia wyznaczono przy 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis.

8. Test cytotoksyczności in vitro

  1. Rewitalizacja i hodowla fibroblastów
    1. Wyjąć fibroblasty z zamrażarki -80 °C. Wysiać komórki do kolby zawierającej DMEM-F12 + 10% FBS.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO2. Wymieniać pożywkę hodowlaną co 2 dni.
    3. Prowadzić pasażowanie komórek aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Postępować zgodnie z krokami 1.3-1.5. Po wirowaniu przy 1,500 × g przez 5 min, usunąć nadsącz, dodać 1 mL DMEM-F12 + 10% FBS i wysiać 10 000 komórek na każdą studzienkę na płytce 96-dołkowej.
      1. Dodać pożywkę DMEM-F12 + 10% FBS i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 18 h w inkubatorze z zawartością 5% CO2. Po zakończeniu inkubacji wymienić pożywkę w studzienkach.
    4. Przygotować roztwór zapasowy zawiesiny egzosomów obciążonych dopaminą. Rozcieńczyć formulację egzosomów obciążonych dopaminą pożywką, aby uzyskać stężenia 100 µL/mL, 250 µL/mL, 500 µL/mL oraz 1,000 µL/mL.
    5. Dodać przygotowane stężenia do komórek w każdej studzience płytki 96-dołkowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 18 h w inkubatorze z zawartością 5% CO241.
  2. Test żywotności komórek MTT
    UWAGA: Po zakończeniu inkubacji wskaźniki żywotności komórek określa się testem MTT.
    1. Przygotować roztwór MTT (5 mg/mL) w PBS. Do każdej studzienki dodać 10 µL roztworu MTT. Inkubować przez 4 h w temperaturze 37 °C.
    2. Po zakończeniu inkubacji dodać 100 µL DMSO do każdej studzienki. Inkubować płytki przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Pomiar absorbancji przeprowadzić w czytniku ELISA przy 570 nm42,43.
      UWAGA: Test żywotności MTT wykonuje się w trzech powtórzeniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja i charakterystyka egzosomów
Komórki macierzyste z galaretki Whartona są hodowane i inkubowane w medium bezsurowiczym przez 48 h po osiągnięciu przez kulturę odpowiedniej gęstości. Po zakończeniu inkubacji supernatant jest przechowywany w temperaturze -20 °C. Zebrane supernatnaty są rozcieńczane w PBS i poddawane ultrawirowaniu (Rycina 1). Otrzymany roztwór jest analizowany za pomocą NTA oraz DLS. Egzosomy są sterylizowane poprzez przepuszczanie przez filtr 0,22 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Egzosomy to małe pęcherzyki błonowe o wymiarach 40-200 nm wydzielane przez większość typów komórek, np. MSCs1. Zdolne do umożliwienia komunikacji między komórkami, egzosomy mogą wnikać do komórek na różne sposoby, takie jak endocytoza, fagocytoza, mikropinocytoza, internalizacja za pośrednictwem lipidów i fuzja33,44. W porównaniu z innymi systemami nanonośników, lipidy i cholesterol znajdujące się na powierzchni egzosomu nadają zdolność do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Praca była przede wszystkim wspierana przez fundusze badawcze zapewnione przez Projekty Naukowo-Badawcze Uniwersytetu Technicznego Yıldız (TSA-2021-4713).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m filtr membranowyAisimoUżywany do procesu sterylizacji
0,45 i mikro; m filtr strzykawkowyAisimoUżywany w procesie sterylizacji
15 ml probówka FalconNest Stosowanyw etapie hodowli komórkowej
25 cm2 kolby do hodowli komórkowych (Falcon, TPP Kolby do hodowli tkankowychGniazdoUżywane w etapie hodowli komórkowej
50 ml Falcon probówkaNest Używanew etapie
hodowli komórkowej75 cm2 kolby do hodowli komórkowych (Falcon, kolby do hodowli tkankowych TPPGniazdoUżywane w etapie hodowli komórkowej
Płytki 96-dołkowe (Falcon, mikropłytki TPP)Merck MilliporeStosowany w etapie hodowli komórkowej
AcetonitrylSigma271004-1LUżywany do analizy HPLC
AutoklawNUVE-OT 90LUżywany w procesie sterylizacji
Komórka Kabinahodowlana Hera Safe KSUżywany w procesie hodowli komórkowej
OdśrodkowyHitachiCF16RNStosowany w
inkubatorze CO2 z Safe Cell UVPanasonicUżywany w procesie hodowli komórkowej
Chlorowodorek dopaminy H8502-10GSigmaH8502-10GStosowany w obciążeniu
egzosomem dopaminąZmodyfikowana mieszanka pożywki / składników odżywczych Dulbecco's Eagle's Substrate-F12Sigma RNBJ7249Używany jako pożywka do hodowli komórkowych
Płodowa surowica bydlęca-FBSKoziorożecFBS-16AZastosowano go przez dodanie do pożywki do hodowli komórkowej.
Zamrażarka -80 ° CPanasonicMDF-U5386S-PEDo przechowywania komórek i powstałych egzosomów
LodówkaPanasonicMPR-215-PESłuży do przechowywania kultur komórkowych i innych materiałów
Wysokosprawna chromatografia cieczowa - HPLCAgilent TechnologiesZbadano obecność dopaminy w zawartości otrzymanego preparatu.
Mikroskop - PrimovertZeissSłuży do obserwacji komórek w hodowli
Test MTTBiomatikSłuży do pomiaru żywotności komórek
NanoSight NS300Malvernpanalytical Malvern panalyticalSłuży do charakteryzacji egzosomów
Optima XPN-100 UltrawirówkaBeckman CoulterStosowany w etapie izolacji egzosomów
Tabletka PBSBiomatik43602W przygotowaniu roztworu PBS
Penicilin/ Roztwór streptomycynyKoziorożecPB-SDodano go do pożywki, aby zapobiec zanieczyszczeniu w hodowli komórkowej.
PipetaIsolab
Precision Balance-KernKern-ABJ220-4NMUżywany do przygotowywania roztworów
Q500 SonicatorQsonica, LLCUżywany do trawienia egzosomów w analizie HPLC
SaponinaSigma47036-50G-FZastosowano go poprzez dodanie go do całkowitego roztworu w procesie ładowania egzosomem dopaminy.
Spectrostar-Nano-SpectrophotometryBMG LABTECHSłuży do analizy MTT i uwalniania leków
SPSS 22pakiet statystyczny program
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexSłuży do jednorodnego mieszania roztworów
Łaźnia wodna 37 ° C-SenovaSenovaStosowany w etapie hodowli komórkowej
Wharton' s galaretka mezenchymalne komórki macierzysteATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSSłuży do charakteryzacji egzosomów
komórkowej.

Bibliografia

  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System no nik w egzosomalnychenkapsulacja dopaminyp cherzyki zewn trzkom rkowebariera krew m zgegzosomy z galaretki Whartonaledzenie nanocz stekwirowanie seryjnetest uwalniania lekutest cytotoksyczno citest MTT
Formułowanie i charakterystyka systemu nośników dopaminy opartego na egzosomach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.