Artykuł metodologiczny

Formułowanie i charakterystyka systemu nośników dopaminy opartego na egzosomach

DOI:

10.3791/63624

⸱

4 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj naszym celem było uzyskanie preparatu poprzez ładowanie dopaminą izolowanych egzosomów komórek macierzystych z galaretowatych mezenchymalnych komórek macierzystych Whartona. W niniejszym protokole opisano izolację i charakterystykę egzosomów, ładowanie leku do powstałych egzosomów oraz aktywność cytotoksyczną opracowanego preparatu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy o wielkości od 40 do 200 nm stanowią najmniejszą podgrupę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Te bioaktywne pęcherzyki wydzielane przez komórki odgrywają aktywną rolę w ładunku międzykomórkowym i komunikacji. Egzosomy znajdują się głównie w płynach ustrojowych, takich jak osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz, ślina, płyn owodniowy, siara, mleko matki, płyn stawowy, nasienie i kwas opłucnowy. Biorąc pod uwagę wielkość egzosomów, uważa się, że mogą one odgrywać ważną rolę w chorobach ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ mogą przenikać przez barierę krew-mózg (BBB). W związku z tym badanie to miało na celu opracowanie systemu nanonośników opartego na egzosomach poprzez enkapsulację dopaminy w egzosomach wyizolowanych z galaretowatych mezenchymalnych komórek macierzystych Whartona (WJ-MSC). Egzosomy, które przeszły proces charakteryzacji, inkubowano z dopaminą. Egzosomy naładowane dopaminą zostały ponownie scharakteryzowane pod koniec inkubacji. Egzosomy obciążone dopaminą badano w testach uwalniania leków i cytotoksyczności. Wyniki pokazały, że dopamina może być z powodzeniem zamknięta w egzosomach i że egzosomy obciążone dopaminą nie wpływają na żywotność fibroblastów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy, bioaktywne pęcherzyki o znaczących cechach, o rozmiarach od 40 nm do 200 nm. Egzosomy pochodzą z błony komórkowej i powstają w wyniku uwalniania endosomów1. Struktury te służą jako komunikatory międzykomórkowe i oddziałują z sąsiednimi komórkami, aby ułatwić transfer aktywnych cząsteczek. Egzosomy można izolować z wielu różnych źródeł. Należą do nich płyny ustrojowe, takie jak osocze, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, ślina, a także linie komórkowe hodowane w warunkach in vitro. Egzosomy odgrywają ważną rolę w eliminacji uszkodzeń nerwów, dzięki zawartym w nich biomakrocząsteczkom, takim jak lipidy, białka i kwasy nukleinowe2. Gleja, które są komórkami podporowymi układu nerwowego3, przenoszą białka i mikro RNA do aksonów neuronów za pośrednictwem egzosomów4.

Lipidy tworzące osłonkę mielinową, które są charakterystyczną cechą przewodnictwa nerwowego, są również uwalniane z oligodendrocytów za pośrednictwem egzosomów4,5. Egzosomy są również zaangażowane w procesy takie jak plastyczność synaptyczna, neuronalna reakcja na stres, komunikacja komórka-komórka i neurogeneza w mózgu6,7. Fakt, że egzosomy mają nanowymiary, umożliwia im przejście przez barierę krew-mózg. Istnieje specjalna droga przejścia z płynu śródmiąższowego do płynu mózgowo-rdzeniowego po przeniknięciu przez tę błonę8. Dzięki swoim właściwościom powierzchniowym egzosomy mogą skutecznie oddziaływać z komórkami docelowymi jako system dostarczania leków i aktywnie dostarczać załadowane leki.

Ze względu na ekspresję różnych białek adhezyjnych (tetraspanin i integryn) na powierzchni egzosomów, te pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą łatwo wchodzić w interakcje i łączyć się z błonami komórkowymi gospodarza9. Uważa się, że egzosomy mogą być stosowane jako system dostarczania leków, zwłaszcza w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego ze względu na ich zdolność do przenikania przez barierę krew-mózg i ich właściwości powierzchniowe. Egzosomy pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) mają mniejsze ryzyko odrzucenia immunologicznego w porównaniu z allogenicznymi terapiami komórkowymi i pod tym względem mogą być ważnym składnikiem aplikacji do leczenia bezkomórkowego10.

Dopamina to cząsteczka, której niedobór w mózgu jest cechą charakterystyczną choroby Parkinsona (PD), pogarszającą się z dnia na dzień11,12,13. Wiadomo, że PD jest związane ze zwyrodnieniem neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej śródmózgowia i utratą funkcji neuronów ruchowych14,15. Śmierć neuronów dopaminergicznych uniemożliwia dopływ neuroprzekaźnika dopaminy do prążkowia mózgu. To z kolei prowadzi do pojawienia się objawów specyficznych dla PD16. Te objawy PD to bradykinezja, niestabilność postawy, sztywność, a zwłaszcza drżenie spoczynkowe12,13. Chociaż PD została po raz pierwszy opisana ponad dwa wieki temu, badania mające na celu zrozumienie patologii i etiologii choroby wciąż trwają i obecnie przyjmuje się, że PD jest złożoną chorobą ogólnoustrojową17. Przewiduje się, że występuje niedobór dopaminy, a kliniczne objawy PD obserwuje się, gdy ponad 80% neuronów ulega degeneracji18. W leczeniu choroby preferowana jest niepełna suplementacja dopaminy w celu zmniejszenia objawów motorycznych. Badania in vivo wykazały, że bezpośredni wlew dopaminy do mózgu znacznie zmniejsza objawy u zwierząt19. Prekursory dopaminy, takie jak L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenyloalanina) i leki z receptorem dopaminy, są stosowane w klinice, ponieważ bezpośredni wlew dopaminy do mózgu nie jest możliwy u ludzi, a dopamina dostająca się do systemu nie może przekroczyć klasy BBB20. Tego typu leki z czasem tracą swoją skuteczność. Jednak nadal nie ma podejścia do leczenia choroby Parkinsona. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba opracowania nowych strategii terapeutycznych i metod leczenia, aby ujawnić patofizjologię choroby i zmniejszyć wpływ choroby Parkinsona na pacjentów.

Badania oparte na egzosomach przyciągnęły ostatnio uwagę ze względu na zbieranie informacji zarówno o podejściach terapeutycznych, jak i patologiach chorób układu nerwowego. Wykazano, że egzosomy pochodzące z MSC zmniejszają stan zapalny w uszkodzeniu nerwów i przyczyniają się do regeneracji neuronów21,22,23. Ponadto doniesiono, że sekretomy egzosomów pochodzące z MSC zmniejszają apoptozę, wykazując działanie neurotroficzne i neuroprotekcyjne, szczególnie na neurony dopaminergiczne24,25. Badania nad platformami, w których egzosomy są wykorzystywane jako systemy dostarczania leków terapeutycznych, w ostatnich latach znacznie przyspieszyły. W licznych badaniach zaobserwowano, że odpowiednie leki można łatwo zamknąć w egzosomach i bezpiecznie dostarczyć do docelowych komórek, tkanek i narządów26,27. Różne metody, takie jak inkubacja, cykle zamrażania/rozmrażania, sonikacja i ekstruzja, mogą być używane do ładowania leków do egzosomów28.

Coincubation z egzosomami lub pęcherzykami podobnymi do egzosomów pozwala na pasywne zamknięcie lipofilowych małych cząsteczek w tych systemach dostarczania28,29,30. W szczególności różne cząsteczki, takie jak curcumin31, catalase30, doxorubicin32 i paclitaxel33 zostały skutecznie załadowane do egzosomów. Zaobserwowano, że egzosomy zawierające katalazę, które mają działanie przeciwutleniające, skutecznie akumulują się w neuronach i komórkach mikrogleju w mózgu i wykazują silne działanie neuroprotekcyjne30. W tym samym badaniu stwierdzono, że saponina, dodana do kompleksu w celu zwiększenia wydajności ładowania, zwiększa procentowy udział leku w ładowaniu podczas inkubacji30,34. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby ustalić standardy ładowania leków do egzosomów.

Ten artykuł opisuje rozwój systemu nanonośników poprzez enkapsulację dopaminy do egzosomów, które zostały wyizolowane z WJ-MSC. Wszystkie etapy, w tym hodowla WJ-MSC, izolacja i charakterystyka egzosomów, eksperymenty z ładowaniem leków, charakterystyka egzosomów obciążonych dopaminą za pomocą różnych technik oraz analiza cytotoksyczności in vitro są szczegółowo wyjaśnione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów i sprzętu użytego w tym protokole.

1. Hodowla i kriokonserwacja mezenchymalnych komórek macierzystych galaretki Whartona

  1. Wyjmij WJ-MSC (z ATCC) z zamrażarki -80 °C. Wysiewać komórki do kolby zawierającej pożywkę DMEM-F12 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Inkubować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze zawierającym 5% CO2 .
  2. Zmieniaj pożywkę co 2 dni. Przejdź przez komórki, gdy osiągną 80% konfluencji. Przepłukać komórki, które mają być przepuszczone, 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    UWAGA: Mycie PBS przed dodaniem trypsyny zapewnia łatwe oddzielenie komórek od powierzchni kolby.
  3. Usunąć PBS i dodać 5 ml roztworu trypsyny-EDTA do kolby. Inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze zawierającym 5% CO2 .
  4. Zebrać sklarowany osad do probówki i odwirować przy sile 1 500 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać 1 ml DMEM-F12 + 10% FBS do probówki przez pipetowanie.
  5. Przenieś komórki do większej kolby i kontynuuj hodowlę, dodając DMEM-F12 + 10% FBS, aż do uzyskania wystarczającej ilości egzosomów35.
    UWAGA: Hodowane komórki zamraża się w gęstości 1 miliona/ml za pomocą 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowuje w temperaturze -80 °C.

2. Produkcja egzosomów z mezenchymalnych komórek macierzystych Wharton's Jelly

UWAGA: Egzosomy są izolowane z hodowanych WJ-MSC. Izolacja egzosomów jest wykonywana, gdy komórki pokrywają powierzchnię kolby i osiągają około 80% gęstości.

  1. Usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem zawierającą 10% FBS z kolby i przemyć komórki 5 ml PBS. Dodaj pożywkę DMEM-F12 bez surowicy do komórek po spłukaniu PBS. Inkubować kolby przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Po inkubacji zebrać pożywkę wolną od surowicy do probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: W kroku 2.1 zbiera się 180 ml pożywki bez surowicy i przechowuje się ją w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu rozpoczyna się proces wirowania wsadowego, jak opisano poniżej.
  2. Izolacja egzosomów
    1. Odwirować zebraną pożywkę pozbawioną surowicy o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C. Ostrożnie pobrać supernatant i przenieść go do innej probówki.
    2. Odwirować zebrany supernatant o stężeniu 2 000 × g przez 10 minut w temperaturze +4 °C. Ostrożnie pobrać supernatant i przenieść go do innej probówki.
    3. Odwirować zebrany supernatant w temperaturze 10 000 × g przez 30 minut w temperaturze +4 °C. Ostrożnie pobrać supernatant i przenieść go do innej probówki.
    4. Przenieść zebrany sklarowany sklarent do probówek ultrawirówek i ultrawirować w stężeniu 110 000 × g przez 130 min. Powoli usunąć sklarowany sklarent i dodać 1 ml PBS do osadu.
    5. Wirować osad i ultrawirować w temperaturze 110 000 × g przez 70 minut w temperaturze +4 °C36 (Rysunek 1). Powoli usunąć sklarowany osad i dodać 1 ml PBS do granulki.
      UWAGA: Po zakończeniu etapów ultrawirowania otrzymane egzosomy można przechowywać w temperaturze -80 °C. Otrzymany granulat jest teraz gotowy do charakteryzacji.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Izolacja egzosomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Charakterystyka egzosomów

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    UWAGA: Analiza śledzenia nanocząstek jest wykonywana w celu określenia wielkości i stężenia izolowanych egzosomów. Tabletki używane do 1x roztworu PBS muszą mieć pH w zakresie 7,3-7,5. 1x Roztwór PBS zawiera 10 mM buforu fosforanowego, 137 mM chlorku sodu i 2,7 mM chlorku potasu. Roztwór przygotowuje się przez dodanie 1 tabletki PBS do 100 ml wody destylowanej. Tak przygotowany roztwór sterylizuje się w autoklawie.
    1. Rozcieńczyć egzosomy 100-krotnie, dodając 990 μl PBS do 10 μl egzosomów. Rozcieńczoną zawiesinę należy pobrać do jednorazowej strzykawki.
    2. Włącz urządzenie NTA i podłącz komputer. Otwórz oprogramowanie.
    3. Wstrzyknąć próbkę w strzykawce do rurki w sekcji kasetowej urządzenia. Zamknij pokrywę kasety urządzenia.
    4. W oprogramowaniu, które się otworzy, kliknij przycisk Rozpocznij analizę. Zapisz wyniki uzyskane przez naciśnięcie przycisku Nagraj.
  2. Dynamiczna analiza rozpraszania światła
    UWAGA: Egzosomy wyizolowane do pomiaru potencjału zeta i wielkości są również rozcieńczane w taki sam sposób, jak do analizy NTA.
    1. Dodaj 980 μl PBS do 20 μl egzosomów.
    2. Otwórz urządzenie do wymiarowania zeta i podłączony komputer. Otwórz oprogramowanie.
    3. Dodać zawiesinę z kroku 3.2.1 do jednorazowej kuwety. Otwórz pokrywę urządzenia, umieść kuwetę w kasecie i zamknij pokrywę.
    4. Wybierz typ kuwety w oprogramowaniu urządzenia. Kliknij przycisk Rozpocznij analizę, aby przeprowadzić analizę potencjału zeta i analizę wymiarową.
      UWAGA: Analizy są wykonywane oddzielnie dla analizy wymiarowej i potencjału zeta.

4. Ładowanie dopaminy do egzosomów

UWAGA: Po zakończeniu charakterystyki egzosomów WJ-MSCs, otrzymano egzosomy naładowane dopaminą jako system dostarczania leków. Ładowanie leku do egzosomów odbywa się metodą inkubacji.

  1. Dodać 3 ml PBS do zawiesiny egzosomu z kroku 2.2.5. Wysterylizuj rozcieńczoną zawiesinę przez filtrację za pomocą filtrów 0,22 μm. Przenieś 500 μl wysterylizowanej zawiesiny egzosomu do innej probówki.
  2. Przygotować roztwór dopaminy (0,5 mg/ml) z wodą destylowaną. Dodaj 500 μl roztworu dopaminy do probówek zawierających egzosomy.
  3. Dodaj saponinę do zawiesiny w kroku 4.2. Inkubować przygotowaną zawiesinę egzosomu i dopaminy przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Stężenie saponiny nie powinno przekraczać 0,002% całkowitego roztworu.
  4. Ultraodwirować zawiesinę o stężeniu 90 000 × g przez 70 minut, aby usunąć z pożywki wolną dopaminę i saponinę. Wyizolowane egzosomy należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia do dalszej analizy37.
    UWAGA: Dodać 0,02% kwasu askorbinowego, aby zapewnić stabilność przygotowanego roztworu dopaminy.

5. Charakterystyka egzosomów naładowanych dopaminą

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    UWAGA: Analiza śledzenia nanocząstek jest wykonywana w celu określenia wielkości i stężenia izolowanych egzosomów.
    1. Wykonaj kroki 3.1.1-3.1.4, aby rozcieńczyć egzosomy i wykonać NTA.
  2. Dynamiczna analiza rozpraszania światła
    UWAGA: Egzosomy wyizolowane do pomiaru potencjału zeta i wielkości są również rozcieńczane podobnie jak w analizie NTA.
    1. Wykonaj kroki 3.2.1-3.2.4, aby rozcieńczyć egzosomy i przeprowadzić analizę dynamicznego rozpraszania światła.
      UWAGA: Wielkość i potencjały zeta dla każdego roztworu (saponina, dopamina, egzosom-dopamina) są analizowane osobno.

6. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

UWAGA: Ilości dopaminy załadowanej do egzosomów są mierzone metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Aby wykryć obecność dopaminy w otrzymanym preparacie, egzosomy są detonowane w specjalnym procesie.

  1. Umieścić preparat w grzałce o temperaturze 75 °C do odparowania. Dodaj acetonitryl (w stosunku 50:50) do zawiesiny i wiruj. Sonikować roztwór przez 10 minut.
  2. Odwirować roztwór przez 10 minut w temperaturze 10 000 × g. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm.
  3. Analizować wszystkie anality przy użyciu kolumny C18 w temperaturze 30 °C przy natężeniu przepływu 1 ml/min (faza ruchomaH2O/acetonitryl). Zmierz absorbancję przy 230 nm38.

7. Pomiar zdolności ładowania leku (DL) i kinetyka uwalniania leku in vitro

  1. Pojemność ładowania leku (DL)
    UWAGA: Ilość dopaminy załadowanej do egzosomów jest określana ilościowo za pomocą spektroskopii UV-Vis. Absorbancję odczytuje się przy długości fali 280 nm. Pobrane supernatanty podczas syntezy służą do pomiaru ilości nieobciążonego leku. Stężenie dopaminy w supernatancie określa się za pomocą standardowej krzywej kalibracyjnej dla dopaminy.
    1. Przygotować roztwór podstawowy zawierający 1 mg/ml dopaminy. Przygotować stężenia 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 i 0,5 mg/ml z roztworu podstawowego, używając wody destylowanej.
      UWAGA: Dodać 0,02% kwasu askorbinowego, aby zapewnić stabilność przygotowanego roztworu dopaminy.
    2. Wygeneruj wzorcową krzywą kalibracyjną, mierząc absorbancję każdego rozcieńczenia dopaminy przy 280 nm w spektrofotometrze UV.
    3. Zmierzyć absorbancję supernatantu przy długości fali 280 nm.
    4. Oblicz zdolność ładowania dopaminy przez lek za pomocą Eq (1)39.
      DL (%) = figure-protocol-2 100 (1)
      UWAGA: Analizę przeprowadza się w trzech egzemplarzach.
  2. Kinetyka uwalniania leku in vitro
    UWAGA: Kinetyka uwalniania leków w egzosomach obciążonych dopaminą jest wykonywana przy użyciu membrany dializacyjnej. PBS, pH 7,4, jest używany jako pożywka antyadhezyjna do symulacji fizjologicznego mikrośrodowiska.
    1. Dodaj 1 ml egzosomów obciążonych dopaminą do błony dializy. Umieść membranę w zlewce. Dodać 15 ml PBS do zlewki.
    2. Pobrać próbkę 1 ml pożywki antyadhezyjnej w zlewce po 0,5, 1, 2, 4, 6 i 8 godzinach. W każdym punkcie czasowym zastąp objętość próbki świeżym PBS. Analizować próbki pobrane w określonych odstępach czasu przy długości fali 280 nm przy użyciu spektrometru UV-Vis.
    3. Oblicz wyniki za pomocą równania (2)40.
      Wydanie (%) = figure-protocol-3 100 (2)
      UWAGA: Przygotowuje się krzywą kalibracyjną do oznaczania kinetyki uwalniania leku in vitro. Roztwór dopaminy przygotowuje się w stężeniach 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 i 5,0 mg/ml. Wartość absorbancji promieniowania UV dla każdego stężenia określa się przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis.

8. Test cytotoksyczności in vitro

  1. Rewitalizacja i hodowla fibroblastów
    1. Usuń fibroblasty z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Wysiewać komórki do kolby zawierającej DMEM-F12 + 10% FBS.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze zawierającym 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co 2 dni.
    3. Przejdź komórki, aż osiągną 80% konfluencji. Wykonaj kroki 1.3-1.5. Po odwirowaniu w ilości 1 500 × g przez 5 minut usunąć supernatant, dodać 1 ml DMEM-F12 + 10% FBS i wysiać 10 000 komórek na studzienkę na płytce 96-dołkowej.
      1. Dodać pożywkę DMEM-F12 + 10% FBS i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 18 godzin w inkubatorze zawierającym 5% CO2 . Zmień pożywkę studzienek pod koniec inkubacji.
    4. Przygotuj zapas zawiesiny egzosomu obciążonej dopaminą. Rozcieńczyć preparat egzosomu naładowany dopaminą pożywką, aby uzyskać stężenia 100 μL/ml, 250 μL/mL, 500 μL/ml i 1,000 μL/ml.
    5. Dodaj przygotowane stężenia do komórek w każdym dołku 96-dołkowej płytki. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 18 godzin w inkubatorze zawierającym 5% CO241.
  2. Test żywotności komórek MTT
    UWAGA: Pod koniec inkubacji współczynniki żywotności komórek określa się za pomocą testu MTT.
    1. Przygotować roztwór MTT (5 mg/ml) z PBS. Dodać 10 μl roztworu MTT do każdego dołka. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Pod koniec inkubacji dodać 100 μl DMSO do każdej studzienki. Inkubować płytki przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Zmierz wartości absorbancji w czytniku ELISA przy 570 nm42,43.
      UWAGA: Test żywotności MTT przeprowadza się w trzech egzemplarzach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i charakterystyka egzosomu
Komórki macierzyste w galarecie Whartona są hodowane i inkubowane w podłożu bez surowicy przez 48 godzin, gdy hodowla osiągnie wystarczającą gęstość. Po zakończeniu inkubacji supernatant jest przechowywany w temperaturze -20 °C. Zebrane supernatanty rozcieńcza się PBS i poddaje ultrawirowaniu (Rysunek 1). Otrzymane rozwiązanie jest analizowane za pomocą analiz NTA i DLS. Egzosomy są sterylizowane przez przejście przez filtr 0,22 μm. Średnią wiel...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy to małe pęcherzyki błonowe o wymiarach 40-200 nm wydzielane przez większość typów komórek, np. MSCs1. Zdolne do umożliwienia komunikacji między komórkami, egzosomy mogą wnikać do komórek na różne sposoby, takie jak endocytoza, fagocytoza, mikropinocytoza, internalizacja za pośrednictwem lipidów i fuzja33,44. W porównaniu z innymi systemami nanonośników, lipidy i cholesterol znajdujące się na powierzchni egzosomu nadają zdolność do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była przede wszystkim wspierana przez fundusze badawcze zapewnione przez Projekty Naukowo-Badawcze Uniwersytetu Technicznego Yıldız (TSA-2021-4713).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m filtr membranowyAisimoUżywany do procesu sterylizacji
0,45 i mikro; m filtr strzykawkowyAisimoUżywany w procesie sterylizacji
15 ml probówka FalconNest Stosowanyw etapie hodowli komórkowej
25 cm2 kolby do hodowli komórkowych (Falcon, TPP Kolby do hodowli tkankowychGniazdoUżywane w etapie hodowli komórkowej
50 ml Falcon probówkaNest Używanew etapie
hodowli komórkowej75 cm2 kolby do hodowli komórkowych (Falcon, kolby do hodowli tkankowych TPPGniazdoUżywane w etapie hodowli komórkowej
Płytki 96-dołkowe (Falcon, mikropłytki TPP)Merck MilliporeStosowany w etapie hodowli komórkowej
AcetonitrylSigma271004-1LUżywany do analizy HPLC
AutoklawNUVE-OT 90LUżywany w procesie sterylizacji
Komórka Kabinahodowlana Hera Safe KSUżywany w procesie hodowli komórkowej
OdśrodkowyHitachiCF16RNStosowany w
inkubatorze CO2 z Safe Cell UVPanasonicUżywany w procesie hodowli komórkowej
Chlorowodorek dopaminy H8502-10GSigmaH8502-10GStosowany w obciążeniu
egzosomem dopaminąZmodyfikowana mieszanka pożywki / składników odżywczych Dulbecco's Eagle's Substrate-F12Sigma RNBJ7249Używany jako pożywka do hodowli komórkowych
Płodowa surowica bydlęca-FBSKoziorożecFBS-16AZastosowano go przez dodanie do pożywki do hodowli komórkowej.
Zamrażarka -80 ° CPanasonicMDF-U5386S-PEDo przechowywania komórek i powstałych egzosomów
LodówkaPanasonicMPR-215-PESłuży do przechowywania kultur komórkowych i innych materiałów
Wysokosprawna chromatografia cieczowa - HPLCAgilent TechnologiesZbadano obecność dopaminy w zawartości otrzymanego preparatu.
Mikroskop - PrimovertZeissSłuży do obserwacji komórek w hodowli
Test MTTBiomatikSłuży do pomiaru żywotności komórek
NanoSight NS300Malvernpanalytical Malvern panalyticalSłuży do charakteryzacji egzosomów
Optima XPN-100 UltrawirówkaBeckman CoulterStosowany w etapie izolacji egzosomów
Tabletka PBSBiomatik43602W przygotowaniu roztworu PBS
Penicilin/ Roztwór streptomycynyKoziorożecPB-SDodano go do pożywki, aby zapobiec zanieczyszczeniu w hodowli komórkowej.
PipetaIsolab
Precision Balance-KernKern-ABJ220-4NMUżywany do przygotowywania roztworów
Q500 SonicatorQsonica, LLCUżywany do trawienia egzosomów w analizie HPLC
SaponinaSigma47036-50G-FZastosowano go poprzez dodanie go do całkowitego roztworu w procesie ładowania egzosomem dopaminy.
Spectrostar-Nano-SpectrophotometryBMG LABTECHSłuży do analizy MTT i uwalniania leków
SPSS 22pakiet statystyczny program
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexSłuży do jednorodnego mieszania roztworów
Łaźnia wodna 37 ° C-SenovaSenovaStosowany w etapie hodowli komórkowej
Wharton' s galaretka mezenchymalne komórki macierzysteATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSSłuży do charakteryzacji egzosomów
komórkowej.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Exosome Carrier SystemDopamine EncapsulationExtracellular VesiclesBlood Brain BarrierWharton s Jelly ExosomesNanoparticle TrackingSerial CentrifugationDrug Release AssayCytotoxicity AssayMTT Assay

Powiązane artykuły