Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza ilościowa właściwości lepkosprężystych krwinek czerwonych przy użyciu pęsety optycznej i mikroskopii defoksyjnej

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63626

⸱

25 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem - CENABIO, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Instituto de Física, Programa de Pós-graduação Multidisciplinar em Física Aplicada, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Biofísica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 4Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé, 5Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Endocrinologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 6Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Física, Universidade Federal de Minas Gerais, 7Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisany jest zintegrowany protokół oparty na pęsetach optycznych i mikroskopii defoksyjnej do pomiaru właściwości reologicznych komórek. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniu właściwości lepkosprężystych erytrocytów w zmiennych warunkach fizjopatologicznych.

Streszczenie

Właściwości lepkosprężyste erytrocytów były badane za pomocą różnych technik. Jednak zgłoszone dane eksperymentalne różnią się. Wynika to nie tylko z normalnej zmienności komórek, ale także z różnic w metodach i modelach odpowiedzi komórek. W tym przypadku zastosowano zintegrowany protokół wykorzystujący pęsetę optyczną i mikroskopię rozogniskowania w celu uzyskania cech reologicznych czerwonych krwinek w zakresie częstotliwości od 1 Hz do 35 Hz. Podczas gdy pęseta optyczna jest wykorzystywana do pomiaru stałej sprężystości kompleksu erytrocytów, mikroskopia rozogniskowania jest w stanie uzyskać profil wysokości komórki, objętość i jej współczynnik kształtu, parametr, który umożliwia konwersję złożonej stałej sprężystości na zespolony moduł ścinania. Ponadto, stosując miękki szklisty model reologiczny, można uzyskać wykładnik skalowania dla obu modułów. Opracowana metodologia pozwala na zbadanie mechanicznego zachowania czerwonych krwinek, charakteryzując ich parametry lepkosprężyste, uzyskane w ściśle określonych warunkach eksperymentalnych, dla kilku stanów fizjologicznych i patologicznych.

Wprowadzenie

Dojrzałe czerwone krwinki (RBC), znane również jako erytrocyty, są w stanie rozciągnąć się ponad dwukrotnie bardziej, gdy przechodzą przez najwęższe naczynia włosowate ludzkiego ciała1. Taką zdolność przypisuje się ich wyjątkowej zdolności do odkształcania się pod wpływem obciążeń zewnętrznych.

W ostatnich latach różne badania opisywały tę cechę w powierzchniach RBC2,3. Dziedzina fizyki, która opisuje sprężyste i lepkie reakcje materiałów na obciążenia zewnętrzne, nazywa się reologią. Ogólnie rzecz biorąc, gdy przykładana jest siła zewnętrzna, wynikowe odkształcenie zależy od właściwości materiału i można je podzielić na odkształcenia sprężyste, które magazynują energię, lub odkształcenia lepkie, które rozpraszają energię4. Wszystkie komórki, w tym erytrocyty, wykazują zachowanie lepkosprężyste; Innymi słowy, energia jest zarówno magazynowana, jak i rozpraszana. Odpowiedź lepkosprężystą komórki można zatem scharakteryzować za pomocą jej zespolonego modułu ścinania G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), gdzie G' (ω) jest modułem przechowywania, związanym z zachowaniem sprężystym, a G" (ω) jest modułem straty, związanym z jego lepkością4. Ponadto do opisu odpowiedzi komórek wykorzystano modele fenomenologiczne, z których jeden z najczęściej używanych nazywa się miękkim szklistym modelem reologii5, charakteryzującym się zależnością potęgowo-potęgową zespolonego modułu ścinania od częstotliwości obciążenia.

Metody oparte na pojedynczych komórkach zostały wykorzystane do scharakteryzowania lepkosprężystych właściwości RBC, poprzez przyłożenie siły i pomiar przemieszczenia w funkcji przyłożonego obciążenia2,3. Jednak w przypadku zespolonego modułu ścinania w literaturze można znaleźć niewiele wyników. Korzystając z dynamicznego rozpraszania światła, podano wartości modułów magazynowania i strat RBC w zakresie 0,01-1 Pa, w zakresie częstotliwości 1-100 Hz6. Za pomocą optycznej magnetycznej cytometrii skrętnej uzyskano pozorny zespolony moduł sprężystości7, a dla celów porównawczych twierdzono, że współczynnik multiplikatywny może wyjaśnić rozbieżności.

Niedawno ustanowiono nową metodologię opartą na pęsetach optycznych (OT) wraz z mikroskopią defoksyjną (DM), jako zintegrowane narzędzie do ilościowego mapowania przechowywania i utraty modułów ścinania ludzkich erytrocytów przy obciążeniach zależnych od czasu8,9. Ponadto wykorzystano miękki szklisty model reologiczny w celu dopasowania wyników i uzyskania współczynnika potęgowego, który charakteryzuje RBCs8,9.

Ogólnie rzecz biorąc, opracowana metodologia8,9, której protokół jest szczegółowo opisany poniżej, wyjaśnia poprzednie rozbieżności, używając zmierzonych wartości dla współczynnika kształtu, Ff, który wiąże siły i odkształcenia z naprężeniami i odkształceniami na powierzchni RBC i może być wykorzystany jako nowatorska metoda diagnostyczna zdolna do ilościowego określania parametrów lepkosprężystości i miękkiego szklistego cechy erytrocytów uzyskanych od osób z różnymi patologiami krwi. Taka charakterystyka, przy użyciu opisanego poniżej protokołu, może otworzyć nowe możliwości zrozumienia zachowania erytrocytów z perspektywy mechanobiologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki ludzkiej krwi zostały pobrane od dorosłych ochotników płci męskiej i żeńskiej zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komisję Etyki Badań Uniwersytetu Federalnego w Rio de Janeiro (Protokół 2.889.952) i zarejestrowanymi w Platformie Brazylijskiej pod numerem CAAE 88140418.5.0000.5699. Od wszystkich ochotników uzyskano pisemną zgodę. Z badania wykluczono osoby z jakąkolwiek hemoglobinopatią oraz/lub przyjmujące leki kontrolowane. Cały proces przebiegał zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez komisję etyczną instytutu.

1. Przygotowanie uchwytów na próbki

  1. Przygotować dwa szkiełka podstawowe (24 mm x 60 mm oraz 24 mm x 32 mm; grubość = 0.13-0.17 mm) i jeden pierścień gumowy (średnica = 10 mm; grubość = 2 mm) dla każdego uchwytu do próbek.
  2. Nanieść smar silikonowy na powierzchnię pierścienia gumowego w taki sposób, aby pokryć cały jego obwód.
  3. Umieścić pierścień gumowy na szkiełku podstawowym stroną ze smarem skierowaną w dół. Odczekać 5 min do momentu właściwego przylegnięcia; uchwyty do próbek są wówczas gotowe do przyjęcia hodowli komórkowej.
    UWAGA: Dodatkowo można również zastosować komercyjne lub wykonane samodzielnie szalki z szklanym dnem, zgodnie z wcześniejszym opisem10.

2. Hodowla komórek

UWAGA: Poniższe kroki opisują sposób pozyskiwania zdrowych RBC z ludzkiej krwi. Ważne jest, aby próbki były świeżo przygotowane przed każdym eksperymentem.

  1. Rozcieńczyć 20 µL krwi w 250 µL 1x roztworu buforu fosforanowo-solnego (PBS) zawierającego 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 10 mM glukozy oraz uzupełnionego o 1 mg/mL albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
  2. Po wirowaniu przy 200 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, odessać nadosad za pomocą pipety i resuspender osad komórkowy w 1mL 1x roztworu PBS/BSA. Przemyć komórki 2x w buforze.
  3. Obliczyć gęstość komórek za pomocą hemodycyometru i zasiać od 50 000 do 100 000 komórek w uchwycie do próbek przygotowanym w kroku 1. Odczekać 10-15 min na nieswoiste przyleganie komórek do szkiełka podstawowego; czas oczekiwania nie wpływa na komórki.
  4. Dodać do próbki 0,2 µL 10% v/v roztworu sfer polistyrenowych (promień = 1,52 ± 0,02 µm) na potrzeby dalszych eksperymentów OT. Potwierdzić prawidłowe wymieszanie, obserwując próbki pod mikroskopem.
  5. Po zasianiu komórek umieścić drugie szkiełko podstawowe nad gumowym pierścieniem (dodawanie smaru w celu przytwierdzenia nie jest konieczne), zamknąć układ i zakończyć przygotowanie próbki. Próbki są gotowe do analizy mikroskopowej i manipulacji.

3. Układ mikroskopu z pęsetą optyczną

UWAGA: OT to narzędzia wykorzystujące silnie skupioną wiązkę laserową do chwytania obiektów mikroskopowych oraz pomiaru sił w zakresie pikonewtonów i przemieszczeń w skali nanometrów. Wykorzystywany laser OT (długość fali 1064 nm) musi być odpowiednio skalibrowany, zgodnie z wcześniejszym opisem10.

  1. W skrócie, używając co najmniej dwóch luster oddalonych od siebie o kilka centymetrów (przynajmniej 10-20 cm), skieruj liniowo spolaryzowaną wiązkę lasera w stronę tylnego wlotu mikroskopu odwróconego. Precyzyjnie ustaw wiązkę lasera tak, aby weszła do mikroskopu w linii prostej (Rysunek 1).
  2. Następnie odbij wiązkę lasera za pomocą lustra dichroicznego zainstalowanego w mikroskopie, tak aby biegła ona równolegle do osi obiektywu i weszła do niego w pobliżu centrum tylnego wlotu. Pozwoli to na skupienie lasera w celu utworzenia pułapki optycznej (Rysunek 1).
  3. Następnie, aby mierzyć siły za pomocą OT, skalibruj układ, aby wyznaczyć sztywność pułapki (κOT). Bardziej szczegółowy opis procedury kalibracji OT znajduje się w pozycji10. Po wyznaczeniu κOT układ OT jest gotowy do przeprowadzenia eksperymentów reologicznych.

4. Konfiguracja DM

UWAGA: DM to technika mikroskopii optycznej w polu jasnym, która pozwala na uwidocznienie przezroczystych obiektów po lekkim rozogniskowaniu mikroskopu11,12. Technika ta została zastosowana w celu uzyskania kształtu RBC13. Ten sam mikroskop wykorzystywany w systemie OT może być użyty do DM w celu uzyskania profilu wysokości za pomocą rekonstrukcji 3D.

  1. Skoryguj system oświetlenia mikroskopu, wykonując oświetlenie Köhlera14, a w celu uzyskania lepszej rozdzielczości całkowicie otwórz przysłonę kondensora przed rozpoczęciem eksperymentów.
  2. Użyj piezoelektrycznego systemu pozycjonowania do przesuwania próbki we wszystkich współrzędnych, z nanometryczną precyzją w osi z. Przeprowadź autokalibrację systemu piezoelektrycznego na wszystkich osiach. Po wykonaniu wszystkich tych procedur system mikroskopowy jest gotowy do eksperymentów DM.

5. Eksperyment reologiczny i analiza w oparciu o OT

UWAGA: Eksperyment reologiczny polega na obserwacji odpowiedzi komórki na małe oscylacje o różnych częstotliwościach.

  1. Eksperyment
    1. Używając systemu OT, uwięź sferę za pomocą lasera OT, a następnie przymocuj ją do erytrocyta (RBC), dociskając sferę do powierzchni komórki w pobliżu górnej powierzchni i blisko krawędzi komórki. Na tym etapie należy korzystać z mikroskopu. Następnie uwięź kolejną sferę i powtórz tę samą procedurę mocowania, ale tym razem przymocuj ją do szkiełka podstawowego, blisko komórki. Sfera przymocowana do szkiełka podstawowego jest kulką referencyjną (Rysunek 2), która jest niezbędna do śledzenia przesunięcia piezoelektrycznego i porównania go ze sferą na RBC.
    2. Przed rozpoczęciem pomiaru upewnij się, że wybrana komórka jest dobrze przymocowana do szkiełka podstawowego, a sfery RBC i referencyjna przylgnęły odpowiednio do powierzchni RBC i szkiełka. Wizualnie zidentyfikuj komórki nieprzylegające, ponieważ będą one przemieszczać się w czasie, mimo wysokiego stopnia adhezji (około 80%-90%).
    3. Do oprogramowania stopnia piezoelektrycznego, korzystając z oprogramowania piezoelektrycznego, dodaj funkcję sinusoidalną o amplitudzie ξ0 = 0.500 ± 0.001 μm i zmiennych częstotliwościach 1 Hz, 7 Hz, 14 Hz, 21 Hz, 28 Hz i 35 Hz, z odpowiednimi częstotliwościami kątowymi ω wynoszącymi 6.3 rad/s, 169 rad/s, 88 rad/s, 132 rad/s, 176 rad/s i 220 rad/s, zgodnie z wcześniejszymi opisami8,9.
    4. Używając stopnia piezoelektrycznego, naciśnij przycisk start, aby uruchomić przesunięcie piezoelektryczne, i utrzymując sferę RBC w pułapce, poddaj próbkę cyklowi ruchów przy użyciu wcześniej ustawionej funkcji sinusoidalnej. Do rejestracji ruchu próbki użyj kamery zdolnej do generowania obrazów z prędkością 790 klatek/s lub wyższą. Schemat eksperymentu przedstawiono na Rysunku 2.
    5. Podczas poddawania próbki ruchom sinusoidalnym aktywuj OT, aby uwięzić sferę przymocowaną do powierzchni RBC. Niezależnie od temperatury wybranej do przeprowadzenia eksperymentów — temperatury pokojowej, 37 °C lub innej — uważnie monitoruj temperaturę, aby uniknąć wahań podczas pomiarów. Laser podczerwony (1064 nm) używany do tworzenia OT prawie nie powoduje uszkodzeń ani nagrzewania komórek.
  2. Analiza
    1. Przeanalizuj obrazy uzyskane podczas ruchów sinusoidalnych za pomocą programu ImageJ, aby wyznaczyć pozycję środka masy każdej z sfer w czasie.
      UWAGA: Dane te pozwalają na generowanie wykresów obrazujących różnice w fazie i amplitudzie między obiema sferami. Takie informacje są kluczowe dla uzyskania odpowiedzi lepkosprężystej erytrocytów.
    2. Aby wyznaczyć środek masy dla każdej z sfer, otwórz oprogramowanie ImageJ. Zaimportuj cały film uzyskany podczas ruchów sinusoidalnych.
    3. W karcie Image kliknij Adjust, a następnie wybierz Threshold. Otworzy się okno progu (threshold). Wybierz B&W. Spowoduje to zmianę tła na białe, a sfer na czarne.
    4. Dostosuj próg za pomocą obu suwaków pod histogramem tak, aby obie sfery pojawiały się z maksymalną liczbą pikseli.
    5. Wybierz sferę referencyjną, klikając File > Rectangle. Narysuj prostokąt, aby zaznaczyć sferę. Po wybraniu sfery referencyjnej na jednym obrazie upewnij się, że prostokąt poprawnie zaznacza tę samą sferę na wszystkich pozostałych obrazach filmu.
    6. Następnie w karcie Analyze kliknij Set Measurements i wybierz opcję Center of Mass.
    7. Ponownie kliknij kartę Analyze i wybierz Analyze Particles. Otworzy się nowe okno. Zdefiniuj rozmiar i kolistość (zależnie od promienia sfery). Zaznacz pola Display Results oraz Clear Results. Na koniec kliknij OK, aby przetworzyć wszystkie obrazy.
    8. Pojawi się nowe okno zawierające tabelę z współrzędnymi xy środka masy. Zapisz te wartości współrzędnych jako plik .txt. Powtórz procedurę dla drugiej sfery, przymocowanej do powierzchni RBC.
    9. Aby uzyskać amplitudę i różnice w fazie dla obu sfer, otwórz oprogramowanie do analizy. Zaimportuj wcześniej uzyskane pliki .txt.
    10. Utwórz nową tabelę z trzema kolumnami. W pierwszej kolumnie (c0) dodaj numer klatki, w drugiej kolumnie (c1) dodaj współrzędne x dla sfery referencyjnej, a w trzeciej kolumnie (c2) współrzędne x dla sfery przymocowanej do powierzchni RBC.
      UWAGA: W tym przykładzie, ponieważ ruchy sinusoidalne były wykonywane tylko wzdłuż osi x, konieczne jest użycie jedynie współrzędnych x dla obu sfer.
    11. Następnie skoreluj klatki z czasem. Kliknij Windows > Formula Entry. Otworzy się nowe okno wprowadzania formuł. W tym oknie można ustawić osiem różnych równań, z których każde jest przypisane do konkretnego klawisza (od F1 do F8).
    12. Wybierz F1 i wpisz następującą formułę:
      c3 = c0 / (camera fps)
      Kliknij Run. Utworzy to w tabeli nową kolumnę dla czasu (kolumna 4).
    13. Odejmij od wartości współrzędnej x każdej klatki jej odpowiednią wartość średnią. Aby to zrobić, przypisz dwa dowolne klawisze w oknie wprowadzania formuł i wpisz dla każdego z nich następujące równania:
      c4 = (c1 - mean(c1)) oraz c5 = (c2 - mean(c2))
      Kliknij przycisk Run. Wyniki pojawią się w kolumnach 5 i 6 odpowiednio dla sfery referencyjnej i sfery RBC.
    14. Przelicz wartości środka masy z pikseli na mikrometry. W tym celu użyj innego klawisza w oknie wprowadzania formuł i wpisz następujące równanie:
      c4 = c 4 / conversion number
      Powtórz ten sam proces dla kolumny 5.
      UWAGA: Współczynnik konwersji uzyskuje się za pomocą skali mikrometrycznej/linijki i wykonania jej zdjęcia przy użyciu tej samej konfiguracji mikroskopu, która była stosowana do pomiarów (w tym tego samego obiektywu). Procedurę tę można przeprowadzić podczas kalibracji mikroskopu. W ten sposób uzyskuje się relację piksel/mikrometr.
    15. Wygeneruj wykres ze środkami masy obu sfer na osi y i czasem na osi x. W tym celu kliknij Gallery > Linear and Scatter. Otworzy się nowe okno. Wybierz kolumnę czasu dla osi x, a na osi y wybierz kolumny środka masy w mikrometrach dla sfery referencyjnej i sfery RBC.
    16. Na wykresie zaznacz tylko dane dotyczące pierwszej częstotliwości kątowej (6.3 rad/s). Użyj narzędzi wskazanych na Rysunku 3.
    17. Zdefiniuj równanie dopasowujące krzywą danych dla sfery referencyjnej. W tym celu kliknij Curve Fit > General and Fit1, zaznacz pole danych związanych z pozycją sfery referencyjnej, a następnie kliknij Define. Otworzy się nowe okno do zdefiniowania równania. Pozycja ξ(t) sfery referencyjnej jest opisana wzorem:
      ξ(t) = ξ0cos(ωt)
      gdzie ξ to ruch sinusoidalny próbki, ω to częstotliwość kątowa, a t to czas w s. Po przeniesieniu tego równania do oprogramowania do analizy będzie ono wyglądać następująco:
      Formuła trygonometryczna, m1*cos(2*π*m2*(m0-m3)); parametry: m1, m2, m3 z przypisanymi wartościami., gdzie m1 to ξ, m2 to f, m0 to czas t, a m3 to faza funkcji cosinus dla t = 0.
    18. Oszacuj wartości m1, m2 i m3 z wykresu. Po zdefiniowaniu równania kliknij OK. Dane zostaną dopasowane na podstawie równania, a na wykresie pojawi się krzywa wraz z małym kwadratem zawierającym wartości m1, m2 i m3.
    19. Zdefiniuj równanie dopasowujące krzywą danych dla sfery RBC. W tym celu kliknij Curve Fit > General i zdefiniuj równanie, które dopasuje krzywą do danych. Pozycja ρ(t) sfery RBC jest dana wzorem:
      Równanie równowagi dynamicznej, ρ(t)=ξ₀cos(ωt)−ξ'cos(ωt−φ), w kontekście formuły fizycznej.
      gdzie ξ' to amplituda pozafazowa, a φ to kąt przesunięcia fazowego. Po przeniesieniu tej formuły do oprogramowania do analizy będzie ona wyglądać następująco:
      Formuły równowagi statycznej, równania trygonometryczne, koncepcja edukacyjna z matematyki, analiza matematyczna., gdzie m1, m2 i m3 to wartości uzyskane przy dopasowywaniu krzywej sfery referencyjnej. m4 to ξ', a m5 to φ.
    20. Oszacuj wartości m4 i m5 z wykresu. Po zdefiniowaniu formuły kliknij OK. Dane zostaną dopasowane na podstawie równania, a na wykresie pojawi się krzywa wraz z małym kwadratem zawierającym wartości m4 i m5.
    21. Następnie utwórz nową tabelę, aby dodać dane uzyskane z dopasowania krzywych w odpowiednich kolumnach. Zdefiniuj pięć różnych kolumn dla następujących parametrów: częstotliwość kątowa, amplituda (sfera referencyjna), czas początkowy, amplituda (sfera RBC) i kąt przesunięcia fazowego. Przeprowadź tę samą procedurę dla wszystkich pozostałych częstotliwości.
    22. Użyj następujących równań, aby wyznaczyć stałe magazynowania (K') i strat (K"):
      Równanie równowagi statycznej, \(K'(\omega)\), diagram formuły, analiza ruchu harmonicznego.
      Równanie lepkosprężystości, K''(ω)=κ_OT(ξ_0/ξ')sin(φ)-ωβ, związane z dynamiczną analizą mechaniczną.
      gdzie κOT to stała sprężystości OT, a β to współczynnik oporu Stokesa. Po przeniesieniu równań do oprogramowania do analizy będą one wyglądać następująco:
      Równanie formuły trygonometrycznej, diagram zawiera funkcję: c6 = (kσT) x (c1/c4) x cos(c5) - (kσT)., oraz

      Wyrażenie matematyczne pokazujące równania zmiennych złożonych, zawierające człony trygonometryczne i algebraiczne., gdzie β i κOT należy zastąpić wartościami wyznaczonymi dla systemu.
    23. Przedstaw wyniki na wykresie, używając osi x dla K" i osi y dla K' (Rysunek 4).

6. Eksperyment i analiza DM w celu uzyskania ogólnego czynnika kształtu komórki

  1. Akwizycja wideo
    1. Przesuń stolik piezoelektryczny w kierunku xy za pomocą oprogramowania, aby odnaleźć pojedynczą komórkę przytwierdzoną do szkiełka podstawowego. Uwięź i przytwierdź kulkę polistyrenową o znanej średnicy do powierzchni erytrocyta (RBC). Używając stolika piezoelektrycznego, lekko przesuń uwięzioną kulkę, również przytwierdzoną do powierzchni RBC, aby zdeformować komórkę, a następnie przytwierdź kulkę do szkiełka podstawowego.
      UWAGA: Można również wykorzystać tę samą komórkę z pomiarów OT.
    2. Zmień pozycję w osi z, aby uzyskać ostry obraz, w którym płaszczyzna ostrości znajduje się w środku wybranej komórki. Obraz ten charakteryzuje się mniejszym kontrastem, a poziom szarości w centrum komórki jest równy poziomowi szarości poza komórką (tło).
    3. Po ustaleniu pozycji użyj oprogramowania kamery, aby stworzyć film przedstawiający całą komórkę, składający się z około 5 000 obrazów w formacie 8-bitowym i rozdzielczości 256 pikseli x 256 pikseli, przy częstotliwości klatek 25 fps. Następnie przesuń pozycję w osi z o 2 µm w dół lub w górę, aby uzyskać obraz nieostry dla wybranej komórki. Powtórz te parametry, aby stworzyć film dla tej sytuacji.
    4. Na koniec, bez zmiany pozycji w osi z, wyszukaj obszar bez komórek, aby powtórzyć tę samą procedurę i stworzyć film tła obrazu.
  2. Akwizycja obrazu kontrastowego
    1. Konwertuj każdy z trzech filmów na trzy obrazy uśrednione. W programie ImageJ wybierz jeden z filmów, kliknij Image > Stacks > Z Project i wybierz opcję Average Intensity. Powtórz tę procedurę dla pozostałych filmów, aby uzyskać odpowiednie obrazy.
    2. Zmień wszystkie uzyskane obrazy z 8-bitowych na 32-bitowe zmiennoprzecinkowe. W programie ImageJ kliknij Image > Type > 32-bits. Następnie kliknij Analyze > Set Measurements i wybierz opcję Mean Gray Value. Na koniec ponownie kliknij Analyze > Measure.
    3. Następnie kliknij Process > Image Calculator i podziel obraz ostry przez obraz tła. Do otrzymanego wyniku pomnóż średnią wartość poziomu szarości obrazu ostrego. Wartość średnią uzyskaj, klikając Process > Math > Multiply.
    4. Aby uzyskać wartość średnią, wybierz obraz ostry, a następnie kliknij Analyze > Measure. Dla obrazu reprezentatywnego średnia wartość poziomu szarości wynosi 69,199. Powtórz powyższe procedury dla obrazu nieostrego. W tym przypadku średnia wartość poziomu szarości wynosi 69,231. Rysunek 5 przedstawia obrazy ostre i nieostre przed i po przeprowadzeniu procedury.
    5. Obrazy mogą stracić kontrast wizualny podczas operacji. Aby lepiej zwizualizować obrazy, kliknij Image > Adjust > Brightness/Contrast i wybierz opcję Auto.
    6. Następnie, aby wyznaczyć kontrast obrazu, użyj następnego zależności:
      Równanie ilustrujące obliczanie stężenia w formule, istotne dla badań analizy chemicznej., gdzie NImg to poziom szarości komórki, N0 to poziom szarości poza komórką, a B jest parametrem stałym odpowiadającym poziomowi szarości dla zerowej intensywności światła, który zależy od kamery.
    7. Aby wyznaczyć wartość B, użyj miernika mocy do pomiaru intensywności światła. Dla każdej wartości intensywności światła należy zarejestrować wideo; w ten sposób różne wartości intensywności można powiązać z różnymi poziomami szarości. Na koniec uzyskaj dopasowanie liniowe i powiąż B z zerową intensywnością światła15.
    8. Aby wyznaczyć wartość N0, kliknij ikonę Polygon Selection i narysuj wielokąt taki jak na Rysunku 6. Następnie kliknij zakładkę Analyze i wybierz Measure, aby wyznaczyć średni poziom szarości dla zaznaczonego obszaru. Każdy obraz składa się ze zbioru pikseli, a każdy piksel ma określony poziom szarości. Zbiór wszystkich poziomów szarości wszystkich pikseli tworzących obraz odpowiada NImg.
    9. Użyj równania kontrastu, aby wyznaczyć NImg - No, wykonując to poprzez wybranie Process > Math > Subtract. Podziel wynik przez N0 - B. Na koniec wyznacz kontrast dla obrazu ostrego (C0) i nieostrego (C1).
  3. Uzyskiwanie profilu wysokości
    1. W celu uzyskania profilu wysokości zastosuj wcześniej opisaną metodę13. W skrócie, użyj transformaty Hartleya (FHT), aby wyznaczyć grubość RBC. W programie ImageJ kliknij Process > FFT > FFT Options, a następnie wybierz FHT.
    2. Odejmij obrazy C0 i C1 w ImageJ, korzystając z Process > Math > Subtract, aby uzyskać obraz do następnego etapu procedury, C= C0 - C1.
    3. Dla obrazu C kliknij Process > FFT > FFT Options, a następnie wybierz FHT, aby wykonać transformatę Hartleya obrazu. Następnie podziel przez częstotliwość przestrzenną q2 za pomocą specjalistycznej wtyczki DivideQ2. Kliknij Plugin > DivideQ2.
      UWAGA: Plik DivideQ2.class musi zostać skopiowany do katalogu z wtyczkami, w którym zainstalowano ImageJ. Wtyczka jest dostarczana jako plik .class (Plik uzupełniający 1), który należy umieścić w folderze wtyczek ImageJ.
    4. Następnie wykonaj odwrotną transformatę FHT, korzystając z Process > FFT > FFT , aby uzyskać obraz z poziomem szarości proporcjonalnym do wysokości komórki.
    5. Na koniec kliknij Process > Math > Multiply, aby pomnożyć wynikowy obraz przez następującą stałą:
      Schemat równania parametrów optycznych zawierający obliczenia współczynnika załamania i grubości.
      która jest zdefiniowana na podstawie charakterystyki obrazów, próbki i układu eksperymentalnego13. Tutaj n = 1,51 to współczynnik załamania oleju, p = 0,0721 μm to przelicznik między mikrometrami a pikselami obrazów, Δn = 0,058 to różnica między współczynnikami załamania RBC a ośrodka wodnego, odległość między obrazami ostrym a nieostrym (Zf1 - Zf2) = 2μm, a rozmiar obrazów to N2 = 256 pxl2.
    6. Użyj wynikowego obrazu do uzyskania profilu wysokości (Rysunek 7). Wynikowy obraz jest wykorzystywany w ImageJ do obserwacji różnych profili wysokości. Zależy to od miejsca w komórce, w którym umieszczona jest żółta linia pionowa; na przykład na Rysunku 7 uzyskano profil wysokości ograniczony linią pionową, co można zaobserwować naciskając Ctrl + K.
  4. Współczynnik kształtu (Form Factor)
    1. Po znalezieniu obrazu zawierającego profil wysokości RBC, użyj kontrastu z obrazu nieostrego 2 µm, aby stworzyć zestaw dwóch obrazów w ImageJ. Kliknij Image > Stacks, a następnie wybierz opcję Images to Stack. Aby wyznaczyć współczynnik kształtu, użyj spersonalizowanego makra ImageJ do analizy stosu. Spersonalizowane makro ImageJ jest dostępne do pobrania jako Plik uzupełniający 2.
      UWAGA: Program wykorzystuje obraz nieostry do wyznaczenia krawędzi komórki. Następnie wyznacza obwód dla każdej pozycji poziomej, korzystając z obrazu zawierającego profil wysokości. Oprócz krawędzi program wyznacza obwód oraz odwrotność obwodu. Suma wartości odwrotności obwodu pomnożona przez grubość piksela odpowiada odwrotności współczynnika kształtu.
    2. Wprowadź do programu relację piksel/mikrometr. Wartość tę uzyskaj z eksperymentu kalibracji obiektywu mikroskopu. W użytym przykładzie wartość ta wynosi 13,87 piksel/μm.
    3. Wybierz początkową pozycję poziomą, aby umieścić żółtą linię na pierwszym obrazie stosu. Rozpocznij linię przed początkiem komórki i narysuj ją poza pionowymi granicami komórki. W przykładzie żółta linia ma długość 153 pikseli, a pozycja początkowa znajduje się między i = 70, y1 = 80 a i = 70 i y2 = 195. Następnie przesuwaj żółtą linię poziomo, aż pozycja końcowa wyniesie f = 245, y1 = 80 i f = 245, y2 = 195.
    4. Na koniec, aby wyznaczyć krawędzie komórki, obwód i odwrotność obwodu, wybierz zakładkę Macro i kliknij Run Macro. Makro wygeneruje tabelę z pozycjami krawędzi, obwodem i odwrotnością obwodu oraz obraz analizowanej komórki. Sprawdź, czy krawędzie tego obrazu są podobne do krawędzi na Rysunku 7; w przeciwnym razie powtórz procedurę.
    5. Użyj sumy odwrotności obwodu, aby wyznaczyć współczynnik kształtu8.

7. Model reologii miękkich ciał szklistych i analiza eksperymentalna

  1. Organizacja danych eksperymentalnych w tabeli
    1. Utwórz nową tabelę w oprogramowaniu analitycznym, klikając kartę File. Wyznacz 10 różnych kolumn (od c0 do c9) dla następujących parametrów: częstotliwości kątowe (rad/s): c0; wartości K' (pN/µm) uzyskane dla każdej częstotliwości kątowej: c1; ErrK': c2; wartości K" (pN/µm) uzyskane dla każdej częstotliwości kątowej: c3; ErrK": c4; wartości G'(Pa) uzyskane dla każdej częstotliwości kątowej: c5; ErrG': c6; wartości G" (Pa) uzyskane dla każdej częstotliwości kątowej: c7; ErrG": c8 oraz Ff wraz z odpowiadającym mu błędem: c9 (Rycina 8). Użyj następujących wzorów do wypełnienia poniższych kolumn:
      c5 = (3 x c1) / (8 x 1.28 x 0.087)
      c6 = (3 / (8 x 0.087 x 1.28)) x sqrt (c2^2 + (c1 x 0.01 / 1.28)^2 + (c1 x 0.008 / 0.087) ^ 2)
      c7 = (3 x c3) / (8 x 1.28 x 0.087)
      c8 = (3 / (8 x 0.087 x c4)) x sqrt (c4^2 + (c3 x 0.01 / 1.28)^2 + (c3 x 0.008 / 0.087)^2)
  2. Wykreślanie krzywej G' (ω) w funkcji G" (ω)
    1. Aby wygenerować krzywą G' (ω) w funkcji G" (ω) w oprogramowaniu analitycznym, użyj danych z poprzedniej tabeli. Kliknij Gallery > Linear i wybierz format Scatter Plot.
    2. Otworzy się nowe okno. Wybierz kolumnę G" jako oś x i kolumnę G' jako oś y. Na koniec kliknij przycisk Plot, aby uzyskać wykres.
    3. Aby dodać słupki błędów na wykresie, kliknij okno Plot, a następnie wybierz Plot > Error Bars. Otworzy się nowe okno. Najpierw zaznacz opcję Y Err. Otworzy się kolejne okno o nazwie Error Bar Settings.
    4. Kliknij % of Value, wybierz Data Column, a następnie kliknij kolumnę ErrG'. Na koniec kliknij OK > Plot, co spowoduje pojawienie się słupków błędów dla wartości y. Powtórz tę samą procedurę dla wartości osi x, zaznaczając tym razem pole X Err i odpowiednią kolumnę dla ErrG". Końcowy wykres będzie podobny do przedstawionego na Rycini 9.
  3. Dopasowanie parametrów do modelu reologii szklistej cieczy (soft glassy rheology model)
    UWAGA: Analiza danych jest podzielona na dwie części: 1) dopasowanie krzywej na wykresie G' (ω) w funkcji G" (ω) w celu uzyskania parametrów Γ i Gm; 2) dopasowanie krzywych G' (ω) i G" (ω) jako funkcji częstotliwości ω w celu uzyskania wykładnika prawa potęgowego α.
    1. Dopasowanie krzywej na wykresie G' (ω) w funkcji G" (ω) w celu uzyskania parametrów Γ i Gm.
      1. Kliknij kartę Curve Fit, wybierz Fit1. Otworzy się nowe okno. Zaznacz Square i kliknij przycisk Define. Pojawi się okno definicji ogólnego dopasowania krzywej (general curve fit definition). Wpisz następujące równanie:
        m1 + m0/m2
        gdzie m1 = 61.576; m2 = 1, z dopuszczalnym błędem 1 x 10-5. Tutaj m0 reprezentuje G", m1 reprezentuje Gm, a m2 reprezentuje Γ.
        UWAGA: Dla m1 i m2 konieczne jest oszacowanie ich wartości podczas definicji dopasowania krzywej. Powyższe szacunki oparto na pokazanym przykładzie eksperymentu. W rzeczywistych eksperymentach oszacuj wartości na podstawie danych zaobserwowanych na wykresie.
      2. Kliknij przycisk OK w obu oknach, a dopasowanie pojawi się w postaci czarnej krzywej, jak pokazano na Rycini 10. Sprawdź poprawne wartości m1 i m2 w tabeli dopasowania krzywej, która pojawiła się wraz z wykresem.
    2. Dopasowanie krzywych G' i G" jako funkcji częstotliwości kątowej ω
      1. Następnie utwórz dwa inne wykresy: G' jako funkcję ω oraz G' jako funkcję ω. Umieść słupki błędów tylko na osi y, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.
      2. Powtórz procedurę dopasowania krzywej, ale tym razem w Curve Fit Selections wybierz opcję G", a następnie w General Fit > Curve Definition wpisz następujące równanie:
        Równanie dla równowagi statycznej; ΣFx=0; m1=23.683, m2=0.5; obliczenia matematyczne.
        W tym przypadku m1 oszacowano jako wartość G" (ω) = 23.683 Pa dla ω = 6.3 rad/s; m2 oszacowano na 0.5 (pamiętaj, że m2 to wykładnik α, który przyjmuje wartości od 0 do 1). Wprowadź wartość Γ = 2.0293 zgodnie z wynikiem m2 z Ryciny 10.
      3. Zaznacz opcję Weight Data. Po wykonaniu tych czynności kliknij OK, a pojawi się dopasowanie krzywej podobne do tego na Rycini 11 – niebieska krzywa. Pojawią się wartości dla α, α = 0.63 ± 0.02 oraz G0, G0 = (3.7 ± 0.3) Pa. Użyj tych wartości do dopasowania kolejnej krzywej, G' (ω).
      4. Kliknij następną krzywą, powtórz procedurę dopasowania, ale tym razem w General Fit Curve Definition wpisz następujące równanie:
        Równania do obliczania masy cząsteczkowej w analizie chemicznej; wzór: 55.075 + 3.703 × m0^m3.
        W tym przypadku m3 jest jedynie wartością szacunkową α w celu potwierdzenia wcześniej uzyskanej wartości. Użyj wartości dla G0 = 3.703 oraz G' (ω) = 23.683 Pa dla ω = 6.3 rad/s.
      5. Ponownie dodaj 1 x 10-5 jako dopuszczalny błąd i zaznacz opcję Weight Data. Po wykonaniu tych czynności kliknij OK, a pojawi się dopasowanie krzywej podobne do tego na Rycini 11 – zielona krzywa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia schematy systemu OT wykorzystanego do pomiarów reologicznych. Rycina 2 pokazuje schematy eksperymentu z mikrorheologii z obiema sferami, a także przedstawiony jest reprezentatywny RBC. Rycina 3 pokazuje typową krzywą amplitud obu sfer w funkcji czasu, gdy ruchy sinusoidalne są generowane przez platformę piezoelektryczną. Podczas gdy sfera referencyjna (Rycina 3 – krzywa czerwona) os...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole przedstawiono zintegrowaną metodę opartą na pęsetie optycznej i mikroskopii rozogniskowującej w celu ilościowego mapowania lepkosprężystych właściwości RBC. Określono wyniki modułów ścinania magazynowania i straty, wraz z wykładnikiem skalowania, który charakteryzuje miękką szklistą reologię RBC. Zastosowanie tego protokołu w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak sytuacjafizjologiczna8 lub wzdłuż każdego etapu cyklu wewnątrzerytrocytarnego P. falciparum

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych w produktach opisanych w tym manuskrypcie i nie mają nic więcej do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować wszystkim członkom zaawansowanego zakładu mikroskopowego CENABIO za niezwykle ważną pomoc. Prace te były wspierane przez brazylijskie agencje Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) oraz Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) wraz z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Projekt B.P. otrzymał wsparcie w ramach grantu JCNE od FAPERJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia hodowlane 35 mmCorning430165
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9418
Szkiełka nakrywkoweKnittel GlassVD12460Y1A.01 i VD12432Y1A.01
Naczynia ze szklanym dnemMatTek Life SciencesP35G-0-10-C
GlukozaSigma-AldrichG7021
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
Olejek immersyjnyNikonMXA22165
Mikroskop odwróconyNikonEclipse TE300
KaleidaGraphSynergy Softwarehttps://www.synergy.com/
KClSigma-AldrichP5405
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Kamera mikroskopowaHamamatsuC11440-10C
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136
NaClSigma-AldrichS5886
Komora NeubaueraSigma-AldrichBR717805-1EA
ObiektywNikonPLAN APO 100X 1,4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1,4 NA DIC H i Plan APO 10x XXNA PH2
Stół optycznyThorlabsT1020CK
OT laserIPG PhotonicsYLR-5-1064-LP
Mikrosfery polistyrenowePolysciences17134-15
pierścień gumowyForever SealsNBR O-ring
Smar silikonowyDow CorningZ273554
Pozycjonowanie stolikaPIP-545.3R8S
PipetaGilsonP1000

Bibliografia

  1. Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
  2. Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501(2014).
  3. Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613(2019).
  4. Boal, D. Mechanics of the Cell. 2 edn. , Cambridge University Press. (2012).
  5. Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911(2006).
  6. Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
  7. Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
  8. Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403(2020).
  9. Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370(2020).
  10. Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283(2021).
  11. Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
  12. Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904(2003).
  13. Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107(2014).
  14. Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
  15. Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
  16. Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5(2016).
  17. Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mechanika erytrocytówmiękka reologia szklistaprofil wysokości komórkimoduł ścinaniastół piezoelektrycznykulki polistyrenowe
Analiza ilościowa właściwości lepkosprężystych krwinek czerwonych przy użyciu pęsety optycznej i mikroskopii defoksyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.