Analiza ilościowa właściwości lepkosprężystych krwinek czerwonych przy użyciu pęsety optycznej i mikroskopii defoksyjnej

Podsumowanie

Tutaj opisany jest zintegrowany protokół oparty na pęsetach optycznych i mikroskopii defoksyjnej do pomiaru właściwości reologicznych komórek. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniu właściwości lepkosprężystych erytrocytów w zmiennych warunkach fizjopatologicznych.

Streszczenie

Właściwości lepkosprężyste erytrocytów były badane za pomocą różnych technik. Jednak zgłoszone dane eksperymentalne różnią się. Wynika to nie tylko z normalnej zmienności komórek, ale także z różnic w metodach i modelach odpowiedzi komórek. W tym przypadku zastosowano zintegrowany protokół wykorzystujący pęsetę optyczną i mikroskopię rozogniskowania w celu uzyskania cech reologicznych czerwonych krwinek w zakresie częstotliwości od 1 Hz do 35 Hz. Podczas gdy pęseta optyczna jest wykorzystywana do pomiaru stałej sprężystości kompleksu erytrocytów, mikroskopia rozogniskowania jest w stanie uzyskać profil wysokości komórki, objętość i jej współczynnik kształtu, parametr, który umożliwia konwersję złożonej stałej sprężystości na zespolony moduł ścinania. Ponadto, stosując miękki szklisty model reologiczny, można uzyskać wykładnik skalowania dla obu modułów. Opracowana metodologia pozwala na zbadanie mechanicznego zachowania czerwonych krwinek, charakteryzując ich parametry lepkosprężyste, uzyskane w ściśle określonych warunkach eksperymentalnych, dla kilku stanów fizjologicznych i patologicznych.

Wprowadzenie

Dojrzałe czerwone krwinki (RBC), znane również jako erytrocyty, są w stanie rozciągnąć się ponad dwukrotnie bardziej, gdy przechodzą przez najwęższe naczynia włosowate ludzkiego ciała¹. Taką zdolność przypisuje się ich wyjątkowej zdolności do odkształcania się pod wpływem obciążeń zewnętrznych.

W ostatnich latach różne badania opisywały tę cechę w powierzchniach RBC^2,3. Dziedzina fizyki, która opisuje sprężyste i lepkie reakcje materiałów na obciążenia zewnętrzne, nazywa się reologią. Ogólnie rzecz biorąc, gdy przykładana jest siła zewnętrzna, wynikowe odkształcenie zależy od właściwości materiału i można je podzielić na odkształcenia sprężyste, które magazynują energię, lub odkształcenia lepkie, które rozpraszają energię⁴. Wszystkie komórki, w tym erytrocyty, wykazują zachowanie lepkosprężyste; Innymi słowy, energia jest zarówno magazynowana, jak i rozpraszana. Odpowiedź lepkosprężystą komórki można zatem scharakteryzować za pomocą jej zespolonego modułu ścinania G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), gdzie G' (ω) jest modułem przechowywania, związanym z zachowaniem sprężystym, a G" (ω) jest modułem straty, związanym z jego lepkością⁴. Ponadto do opisu odpowiedzi komórek wykorzystano modele fenomenologiczne, z których jeden z najczęściej używanych nazywa się miękkim szklistym modelem reologii⁵, charakteryzującym się zależnością potęgowo-potęgową zespolonego modułu ścinania od częstotliwości obciążenia.

Metody oparte na pojedynczych komórkach zostały wykorzystane do scharakteryzowania lepkosprężystych właściwości RBC, poprzez przyłożenie siły i pomiar przemieszczenia w funkcji przyłożonego obciążenia^2,3. Jednak w przypadku zespolonego modułu ścinania w literaturze można znaleźć niewiele wyników. Korzystając z dynamicznego rozpraszania światła, podano wartości modułów magazynowania i strat RBC w zakresie 0,01-1 Pa, w zakresie częstotliwości 1-100 Hz⁶. Za pomocą optycznej magnetycznej cytometrii skrętnej uzyskano pozorny zespolony moduł sprężystości⁷, a dla celów porównawczych twierdzono, że współczynnik multiplikatywny może wyjaśnić rozbieżności.

Niedawno ustanowiono nową metodologię opartą na pęsetach optycznych (OT) wraz z mikroskopią defoksyjną (DM), jako zintegrowane narzędzie do ilościowego mapowania przechowywania i utraty modułów ścinania ludzkich erytrocytów przy obciążeniach zależnych od czasu^8,9. Ponadto wykorzystano miękki szklisty model reologiczny w celu dopasowania wyników i uzyskania współczynnika potęgowego, który charakteryzuje RBCs^8,9.

Ogólnie rzecz biorąc, opracowana metodologia^8,9, której protokół jest szczegółowo opisany poniżej, wyjaśnia poprzednie rozbieżności, używając zmierzonych wartości dla współczynnika kształtu, F_f, który wiąże siły i odkształcenia z naprężeniami i odkształceniami na powierzchni RBC i może być wykorzystany jako nowatorska metoda diagnostyczna zdolna do ilościowego określania parametrów lepkosprężystości i miękkiego szklistego cechy erytrocytów uzyskanych od osób z różnymi patologiami krwi. Taka charakterystyka, przy użyciu opisanego poniżej protokołu, może otworzyć nowe możliwości zrozumienia zachowania erytrocytów z perspektywy mechanobiologicznej.

Protokół

Próbki ludzkiej krwi zostały dostarczone przez dorosłych ochotników mężczyzn i kobiet, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Badań Federalnego Uniwersytetu w Rio de Janeiro (Protokół 2.889.952) i zarejestrowanymi na platformie brazylijskiej pod numerem CAAE 88140418.5.0000.5699. Wszystkim ochotnikom wydano pisemną zgodę i pobrano od niej. Osoby z jakąkolwiek hemoglobinopatią i/lub przyjmujące kontrolowane leki zostały wykluczone. Cały proces przebiegał zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez komisję etyczną instytutu.

1. Przygotowanie uchwytów na próbki

1. Zaopatrzyć się w dwa szkiełka nakrywkowe (24 mm x 60 mm i 24 mm x 32 mm; grubość = 0,13-0,17 mm) i jeden gumowy pierścień (średnica = 10 mm; grubość = 2 mm) dla każdego uchwytu próbki.
2. Wlej smar silikonowy na powierzchnię gumowego pierścienia w taki sposób, aby pokrył cały obwód.
3. Umieść gumowy pierścień na szkiełku nakrywkowym stroną smarowaną w stronę szkiełka nakrywkowego. Odczekaj 5 minut na prawidłowe zamocowanie, uchwyty na próbki są gotowe do przyjęcia kultury komórkowej.
   UWAGA: Ponadto, można również używać komercyjnych lub domowych naczyń ze szklanym dnem, jak opisano wcześniej¹⁰.

2. Hodowla komórkowa

UWAGA: Poniższe kroki opisują, jak uzyskać zdrowe krwinki czerwone z ludzkiej krwi. Ważne jest, aby próbki były świeżo przygotowane przed każdym eksperymentem.

1. Rozcieńczyć 20 μl krwi w 250 μl 1x roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającego 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 10 mM glukozy i uzupełnić 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
2. Po odwirowaniu przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml 1x roztworu PBS/BSA. Umyj komórki 2x w buforze.
3. Obliczyć gęstość komórek za pomocą hemocytometru i zasiać od 50 000 do 100 000 komórek w uchwycie na próbkę przygotowanym w kroku 1. Odczekaj 10-15 minut na niespecyficzne przyłączenie komórek do szkiełka nakrywkowego; Czas oczekiwania nie ma wpływu na komórki.
4. Dodać do próbki 0,2 μl 10% v/v roztworu kuli polistyrenowej (promień = 1,52 ± 0,02 μm) do dalszych eksperymentów OT. Potwierdź prawidłowe wymieszanie, patrząc na próbki pod mikroskopem.
5. Po wysianiu komórek wystarczy umieścić drugie szkiełko nakrywkowe nad gumowym pierścieniem (nie jest konieczne dodawanie smaru do mocowania), zamknąć ustawienie i zakończyć przygotowanie próbki. Próbki są gotowe do analizy mikroskopowej i manipulacji.

3. Ustawienie mikroskopu pęsety optycznej

UWAGA: OT to narzędzia, które wykorzystują wysoce skupioną wiązkę laserową do łapania mikroskopijnych obiektów i mierzenia sił w zakresie piconewton oraz przemieszczeń w skali nanometrowej. Używany laser OT (długość fali 1064 nm) musi być odpowiednio wyrównany, zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰.

1. Krótko, używając co najmniej dwóch luster oddalonych od siebie o kilka centymetrów (co najmniej 10-20 cm), skieruj liniowo spolaryzowaną wiązkę laserową w kierunku tylnego wejścia odwróconego mikroskopu. Precyzyjnie ustaw wiązkę lasera tak, aby weszła do mikroskopu w linii prostej (Rysunek 1).
2. Następnie odbij wiązkę laserową za pomocą zwierciadła dichroicznego, zainstalowanego w mikroskopie, aby przebiegać równolegle do osi soczewki obiektywu i wejść do soczewki w pobliżu środka jej tylnego wejścia. Spowoduje to skupienie lasera w celu utworzenia pułapki optycznej (Rysunek 1).
3. Następnie, aby zmierzyć siły za pomocą OT, skalibruj system, aby uzyskać sztywność pułapki (κ_OT). Zobacz ¹⁰, aby uzyskać bardziej szczegółowy opis procedury kalibracji OT. Po znalezieniu κ_OT system OT jest gotowy do eksperymentów reologicznych.

4. Ustawienia DM

UWAGA: DM to technika mikroskopii optycznej opartej na jasnym polu, która pozwala na zobaczenie przezroczystych obiektów, jeśli mikroskop jest lekko rozogniskowany^11,12. Taka technika została zastosowana w celu uzyskania RBC shape¹³. Ten sam mikroskop, który jest używany w systemie OT, może być używany do DM, aby uzyskać profil wysokości poprzez rekonstrukcje 3D.

1. Dostosuj system oświetlenia mikroskopu, wykonując Köhler illumination¹⁴ i, aby uzyskać lepszą rozdzielczość, całkowicie otwórz membranę kondensora, aby przeprowadzić eksperymenty.
2. Użyj piezoelektrycznego systemu pozycjonowania, aby przemieścić próbkę we wszystkich współrzędnych, z nanometryczną precyzją w osi z. Wykonaj autokalibrację układu piezoelektrycznego na wszystkich osiach. Po wykonaniu wszystkich procedur system mikroskopowy jest gotowy do eksperymentów z cukrzycą.

5. Eksperyment i analiza reologiczna oparta na OT

UWAGA: Eksperyment reologiczny polega na obserwacji reakcji komórki na małe oscylacje o różnych częstotliwościach.

1. Eksperymentów
   1. Korzystając z systemu OT, uwięzij kulę za pomocą lasera OT, a następnie przymocuj ją do RBC, dociskając kulę do powierzchni komórki w pobliżu górnej powierzchni i blisko krawędzi komórki. Na tym etapie użyj mikroskopu. Następnie złap kolejną kulę i powtórz tę samą procedurę mocowania, ale teraz przymocuj ją do szkiełka nakrywkowego, blisko komórki. Kula przymocowana do szkiełka nakrywkowego to koralik odniesienia (Rysunek 2), który jest niezbędny do śledzenia przemieszczenia piezoelektrycznego i porównania ze sferą RBC.
   2. Przed rozpoczęciem pomiaru upewnij się, że wybrana komórka jest dobrze przymocowana do szkiełka nakrywkowego i że erytrocyty i kulki odniesienia przylegają odpowiednio do powierzchni erytrocytu i szkiełka nakrywkowego. Wizualnie zidentyfikuj nieprzylegające komórki, ponieważ będą się poruszać w czasie, pomimo wysokiego współczynnika adhezji (około 80%-90%).
   3. Dodać sinusoidalną funkcję amplitudy, ξ₀ = 0,500 ± 0,001 μm i zmienne częstotliwości 1 Hz, 7 Hz, 14 Hz, 21 Hz, 28 Hz i 35 Hz, z odpowiednimi częstotliwościami kątowymi, ω, 6,3 rad/s, 169 rad/s, 88 rad/s, 132 rad/s, 176 rad/s, i 220 rad/s, do oprogramowania etapu piezoelektrycznego, przy użyciu oprogramowania piezoelektrycznego, jak wcześniej pokazano^8,9.
   4. Korzystając ze stopnia piezoelektrycznego, naciśnij przycisk start, aby umożliwić przemieszczenie piezoelektryczne i utrzymać sferę RBC w pułapce, poddać próbkę cyklowi ruchów przy użyciu wcześniej ustawionej funkcji sinusoidalnej. Użyj kamery zdolnej do generowania obrazów z prędkością 790 klatek/s lub wyższą, aby zarejestrować ruch próbki. Schemat eksperymentu pokazany jest w Rysunek 2.
   5. Podczas gdy próbka jest poddawana ruchom sinusoidalnym, aktywuj OT, aby uwięzić kulę przyczepioną do powierzchni RBC. Niezależnie od temperatury wybranej do przeprowadzenia eksperymentów, temperatury pokojowej, 37 °C lub innej temperatury, uważnie monitoruj temperaturę, aby uniknąć wahań podczas pomiarów. Laser na podczerwień (1064 nm) używany do tworzenia OT nie powoduje prawie żadnych uszkodzeń ani nagrzewania się komórek.
2. analiza
   1. Przeanalizuj obrazy uzyskane podczas ruchów sinusoidalnych za pomocą ImageJ, aby znaleźć położenie środka masy każdej ze sfer w czasie.
      UWAGA: Dane te pozwalają na wygenerowanie wykresów zdolnych do pokazania różnic faz i amplitud między obiema sferami. Takie informacje mają kluczowe znaczenie dla uzyskania odpowiedzi lepkosprężystej erytrocytów.
   2. Aby uzyskać środek masy dla każdej ze sfer, otwórz oprogramowanie ImageJ. Zaimportuj cały film uzyskany podczas ruchów sinusoidalnych.
   3. Na karcie Obraz kliknij Dostosuj, a następnie wybierz Próg. Otworzy się okno progu. Wybierz opcję B&W. Spowoduje to, że tło stanie się białe, a kule czarne.
   4. Dostosuj próg z obydwoma paskami przewijania pod histogramem, tak aby obie sfery były wyświetlane z maksymalną liczbą pikseli.
   5. Wybierz sferę odniesienia, klikając Plik > Prostokąt. Narysuj prostokąt, aby zaznaczyć sferę. Po zaznaczeniu sfery odniesienia na jednym obrazie upewnij się, że prostokąt poprawnie zaznacza również tę samą sferę na wszystkich innych obrazach filmu.
   6. Następnie w zakładce Analiza kliknij Ustaw pomiary i wybierz opcję Środek masy.
   7. Kliknij ponownie kartę Analizuj i wybierz opcję Analizuj cząstki. Otworzy się nowe okno. Umożliwia zdefiniowanie rozmiaru i kołowości (w zależności od promienia kuli). Zaznacz następujące pola: Wyświetl wyniki i Wyczyść wyniki. Na koniec kliknij OK, aby przetworzyć wszystkie obrazy.
   8. Pojawi się nowe okno zawierające tabelę ze współrzędnymi xy dla środka bryły. Zapisz te wartości współrzędnych jako plik .txt. Powtórz procedurę dla drugiej kuli, przymocowanej do powierzchni RBC.
   9. Aby uzyskać amplitudę i różnice faz dla obu sfer, otwórz oprogramowanie analityczne. Zaimportuj .txt wcześniej uzyskane pliki.
   10. Utwórz nową tabelę z trzema kolumnami. W pierwszej kolumnie (c0) dodaj liczbę ramek, w drugiej kolumnie (c1) dodaj współrzędne x dla sfery odniesienia, a w trzeciej kolumnie (c2) współrzędne x dla sfery dołączonej do powierzchni RBC.
       UWAGA: W tym przykładzie, ponieważ ruchy sinusoidalne zostały wykonane tylko w osi x, konieczne jest użycie współrzędnych x tylko dla obu sfer.
   11. Następnie skoreluj klatki z czasem. Kliknij Windows > Wpis formuły. Otworzy się nowe okno o nazwie wprowadzanie formuły. W tym oknie możliwe jest ustawienie ośmiu różnych równań, każde z nich w określonej tonacji (od F1 do F8).
   12. Wybierz F1, wpisz następującą formułę:
       C3 = C0 / (Szybkość na sekundę kamery)
       Kliknij Uruchom. Spowoduje to utworzenie nowej kolumny dla czasu w tabeli (kolumna 4).
   13. Odejmij wartość współrzędnej x każdej klatki przez odpowiednią wartość średnią. Aby to zrobić, wyznacz dowolne dwa we wpisie formuły i wpisz następujące równania dla każdego:
       C4 = (C1 - Średnia(C1)) i C5 = (C2 - Średnia(C2))
       Kliknij przycisk Uruchom. Wyniki pojawią się w kolumnach 5 i 6 odpowiednio dla sfer referencyjnych i RBC.
   14. Przelicz wartości środka masy z pikseli na mikrometry. W tym celu użyj innego we wpisie formuły i wpisz następujące równanie:
       C4 = C 4 / Liczba konwersji
       Powtórz ten sam proces dla kolumny 5.
       UWAGA: Konwersja odbywa się za pomocą skali mikrometrycznej/linijki i uzyskuje się jej obraz za pomocą tej samej konfiguracji mikroskopu, która jest używana do pomiarów (w tym tej samej soczewki obiektywu). Procedurę tę można wykonać podczas kalibracji mikroskopu. W ten sposób uzyskuje się zależność piksel/mikrometr.
   15. Wygeneruj wykres ze środkami masy obu sfer na osi y i czasem na osi x. W tym celu kliknij Galeria > liniowe i punktowe. Otworzy się nowe okno. Wybierz kolumnę czasu dla osi x, a na osi y wybierz kolumny środka masy w mikrometrach zarówno dla sfer odniesienia, jak i RBC.
   16. Na wykresie wybierz tylko dane związane z pierwszą częstotliwością kątową (6,3 rad/s). Użyj narzędzi wskazanych w Rysunek 3.
   17. Zdefiniuj równanie, które dostosowuje krzywą danych dla sfery odniesienia. W tym celu kliknij Dopasowanie krzywej > Ogólne i Dopasowanie1, zaznacz pole danych związanych z położeniem sfery odniesienia, a następnie kliknij Definiuj. Otworzy się nowe okno do zdefiniowania równania. Położenie ξ(t) sfery odniesienia jest opisane przez:
       ξ(t) = ξ₀cos(ωt)
       gdzie ξ jest sinusoidalnym ruchem próbki, ω jest częstotliwością kątową, a t jest czasem w s. Przenosząc to równanie do oprogramowania analitycznego, będzie ono wyglądać następująco:
       , gdzie m1 to ξ, m2 to f, m0 to czas t, a m3 to faza funkcji cosinus dla t = 0.
   18. Oszacuj wartości dla m1, m2 i m3 z działki. Po zdefiniowaniu równania kliknij OK. Dane zostaną dopasowane na podstawie równania, a na wykresie pojawi się krzywa wraz z małym kwadratem z wartościami m1, m2 i m3.
   19. Zdefiniuj równanie, które dostosowuje krzywą danych dla sfery RBC. W tym celu kliknij Dopasowanie krzywej > Ogólne i zdefiniuj równanie, które dostosuje krzywą dla danych. Położenie ρ(t) sfery RBC jest określone wzorem:
       
       gdzie ξ' jest amplitudą poza fazą, a φ jest kątem poza fazą. Przenosząc tę formułę do oprogramowania analitycznego, będzie ona wyglądać następująco:
       , gdzie m1, m2 i m3 to wartości uzyskane w dopasowaniu krzywej sfery odniesienia. m4 to ξ', a m5 to φ.
   20. Oszacuj wartości dla m4 i m5 z powierzchni. Po zdefiniowaniu formuły kliknij OK. Dane zostaną dopasowane na podstawie równania, a na wykresie pojawi się krzywa wraz z małym kwadratem z wartościami m4 i m5.
   21. Następnie utwórz nową tabelę, aby dodać dane uzyskane z dopasowania krzywej w odpowiednich kolumnach. Zdefiniuj pięć różnych kolumn dla następujących parametrów: częstotliwość kątowa, amplituda (sfera odniesienia), czas początkowy, amplituda (sfera RBC) i kąt przesunięcia fazowego. Wykonaj tę samą procedurę dla wszystkich innych częstotliwości.
   22. Użyj poniższych równań, aby znaleźć stałe przechowywania (K') i strat (K"):
       
       
       gdzie κ_OT jest stałą sprężystości OT, a β jest współczynnikiem oporu Stokesa. Przenosząc równania do oprogramowania analitycznego, będzie to wyglądać następująco:
       , and
       
       , gdzie β i κ_OT muszą zostać zastąpione wartościami znalezionymi w systemie.
   23. Wykreśl wyniki na wykresie, używając osi x dla K" i osi y dla K' (Rysunek 4).

6. Eksperyment i analiza DM w celu uzyskania ogólnego współczynnika kształtu komórki

1. Akwizycja wideo
   1. Przesuń stolik piezoelektryczny w kierunku xy za pomocą oprogramowania, aby wyszukać izolowaną komórkę przymocowaną do szkiełka nakrywkowego. Złap i przymocuj kulę polistyrenową o znanej średnicy do powierzchni RBC. Za pomocą stolika piezoelektrycznego lekko przesuń uwięziony koralik, również przymocowany do powierzchni RBC, w celu odkształcenia komórki, a następnie przymocuj koralik do szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Możliwe jest również użycie tej samej komórki z pomiarów OT.
   2. Zmień położenie osi z, aby znaleźć skoncentrowany obraz, w którym płaszczyzna ostrości znajduje się w środku wybranej komórki. Na tym obrazie kontrast jest mniejszy z poziomem szarości w środku komórki równym poziomowi szarości na zewnątrz komórki (tło).
   3. Po ustaleniu pozycji użyj oprogramowania aparatu, aby utworzyć film z całej komórki z około 5,000 obrazów w rozdzielczości 8-bitowej i 256 pikseli x 256 pikseli, z szybkością 25 kl./s. Następnie przesuń pozycję osi z o 2 μm w dół lub w górę, aby uzyskać rozmyty obraz dla wybranej komórki. Powtórz parametry, aby utworzyć film dla tej sytuacji.
   4. Na koniec, bez zmiany położenia osi z, wyszukaj region bez komórek, aby powtórzyć tę samą procedurę i utworzyć film z tła obrazu.
2. Akwizycja obrazu kontrastowego
   1. Przekonwertuj każdy z trzech filmów na trzy średnie obrazy. Za pomocą ImageJ wybierz jeden z filmów, kliknij Image > Stacks > Z Project i wybierz opcję Average Intensity (Średnia intensywność). Powtórz tę procedurę dla innych filmów, aby uzyskać odpowiednie obrazy.
   2. Zmień wszystkie uzyskane obrazy z 8-bitowych na 32-bitowe zmiennoprzecinkowe. Korzystając z ImageJ, kliknij Obraz > Wpisz > 32-bitowe. Następnie kliknij Analizuj > ustaw pomiary i wybierz opcję Średnia wartość szarości. Na koniec kliknij ponownie Analizuj > mierz.
   3. Następnie kliknij Process > Image Calculator i podziel skoncentrowany obraz przez obraz tła. Aby uzyskać ten wynik, pomnóż średnią wartość poziomu szarości wyostrzonego obrazu. Uzyskaj średnią wartość, klikając Process > Math > Multiply.
   4. Aby uzyskać wartość średnią, wybierz skoncentrowany obraz, a następnie kliknij pozycję Analizuj > mierz. Dla obrazu reprezentatywnego średnia wartość poziomu szarości wynosi 69 199. Powtórz powyższe procedury dla rozmytego obrazu. W tym przypadku średnia wartość poziomu szarości wynosi 69 231. Rysunek 5 pokazuje obrazy skoncentrowane i rozmyte przed i po zabiegu.
   5. Obrazy mogą utracić kontrast wizualny podczas operacji. Aby lepiej zobrazować obrazy, kliknij Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast i wybierz opcję Auto.
   6. Następnie, aby znaleźć kontrast obrazu, użyj następującej relacji:
      , gdzie N_Img to poziom szarości komórki, N₀ to poziom szarości na zewnątrz komórki i jest stałym parametrem odpowiadającym poziomowi szarości dla zerowego natężenia światła, które zależy od kamery.
   7. Aby znaleźć wartość B, użyj miernika mocy, aby zmierzyć natężenie światła. Dla każdej wartości natężenia światła musi zostać nagrany film; W związku z tym różne wartości intensywności mogą być powiązane z różnymi poziomami szarości. Na koniec uzyskaj dopasowanie liniowe i powiąż B z zerowym natężeniem światła¹⁵.
   8. Znajdź wartość N₀, kliknij ikonę Wybór wielokąta i narysuj wielokąt, taki jak ten w Rysunek 6. Następnie kliknij kartę Analizuj i wybierz Zmierz, aby znaleźć średni poziom szarości dla wybranego obszaru. Każdy obraz jest tworzony przez zestaw pikseli, a każdy piksel ma określony poziom szarości. Zbiór wszystkich poziomów szarości ze względu na wszystkie piksele składające się na obraz odpowiada N_Img.
   9. Użyj równania kontrastu, aby określić N_Img - N_o i wykonaj to, wybierając opcję Process > Math > Subtract. Podziel wynik przez N₀ - B. Na koniec znajdź kontrast dla wyostrzonego (C0) i rozmytego obrazu (C1).
3. Uzyskanie profilu wysokości
   1. W celu uzyskania profilu wysokości należy skorzystać z opisanej już metody¹³. Krótko mówiąc, użyj transformaty Hartleya (FHT), aby uzyskać grubość RBC. W ImageJ kliknij Process > FFT > FFT Options, a następnie wybierz FHT.
   2. Odejmij obrazy C0 i C1 w obrazie J za pomocą funkcji Process > Math > Odejmij, aby uzyskać obraz dla następującej procedury, C= C0 - C1.
   3. W przypadku obrazu C kliknij Process > FFT > FFT Options, a następnie wybierz FHT, aby wykonać transformację Hartleya obrazu. Następnie podziel według częstotliwości przestrzennej q² za pomocą niestandardowej wtyczki DivideQ2. Kliknij wtyczkę > DivideQ2.
      UWAGA: Plik DivideQ2.class musi zostać skopiowany do katalogu wtyczek, w którym zainstalowany jest ImageJ. Wtyczka jest dostarczana jako plik .class (>plik uzupełniający 1), który należy dołączyć do folderu wtyczki ImageJ.
   4. Następnie wykonaj odwrotną transformację FHT za pomocą Process > FFT > FFT, aby uzyskać obraz o poziomie szarości proporcjonalnym do wysokości komórki.
   5. Na koniec kliknij Process > Math > Multiply, aby pomnożyć wynikowy obraz przy użyciu następującej stałej:
      
      , który jest definiowany na podstawie charakterystyki obrazów, próbki i konfiguracji eksperymentalnej¹³. Tutaj n = 1,51 to współczynnik załamania światła oleju, p = 0,0721 μm to zależność między mikrometrami a pikselami obrazów, Δn = 0,058 to różnica między krwinkami czerwonymi a wodnymi współczynnikami załamania światła, odległość między obrazami ogniskowania i rozogniskowania (Z_f1 - Z_f2) = 2μm oraz rozmiar obrazów, N² = 256 pxl².
   6. Użyj wynikowego obrazu, aby uzyskać profil wysokości (Rysunek 7). Uzyskany obraz jest używany w ImageJ do obserwacji różnych profili wysokości. Zależy to od tego, w którym miejscu komórki znajduje się żółta pionowa linia, na przykład w Rysunek 7 uzyskuje się profil wysokości ograniczony linią pionową, obserwuj to, naciskając Ctrl + K.
4. Faktor
   1. Po znalezieniu obrazu, który zawiera profil wysokości RBC, użyj rozmytego kontrastu 2 μm, aby utworzyć zestaw dwóch obrazów w obrazie ImageJ. Kliknij Obrazy > stosy, a następnie wybierz opcję Obrazy do ułożenia w stos. Aby znaleźć współczynnik kształtu, użyj makra dostosowanego do ImageJ do przeanalizowania stosu. Dostosowane makro ImageJ jest dostępne do pobrania jako plik uzupełniający 2.
      UWAGA: Program wykorzystuje obraz z defoksem do określenia krawędzi komórek. Następnie określa obwód, korzystając z obrazu zawierającego profil wysokości, dla każdej pozycji poziomej. Oprócz krawędzi określa obwód, a także odwrotność obwodu. Suma odwrotnych wartości obwodu pomnożona przez grubość piksela odpowiada odwrotności współczynnika kształtu.
   2. Wstaw relację piksel/mikrometr w programie. Uzyskaj tę wartość z eksperymentu kalibracji obiektywu mikroskopu. W użytym przykładzie wartość wynosi 13,87 piksela/μm.
   3. Wybierz poziomą pozycję początkową, aby umieścić żółtą linię na pierwszym obrazie stosu. Rozpocznij linię przed początkiem komórki i narysuj ją poza pionowymi granicami komórki. W tym przykładzie żółta linia ma długość 153 pikseli, a pozycja początkowa mieści się między i = 70, y1 = 80 i i = 70 oraz y2 = 195. Następnie przesuń żółtą linię poziomo, aż końcowa pozycja to f = 245, y1 = 80 i f = 245, a y2 = 195.
   4. Na koniec, aby znaleźć krawędzie komórek, obwód i odwrotność obwodu, wybierz kartę Makro i kliknij Uruchom makro. Makro dostarczy tabelę z położeniem krawędzi, obwodem i odwrotnością obwodu oraz obrazem analizowanej komórki. Sprawdź, czy krawędzie tego obrazu są podobne do krawędzi Rysunek 7, w przeciwnym razie powtórz procedurę.
   5. Użyj sumy odwrotności obwodu, aby znaleźć współczynnik kształtu⁸.

7. Model reologii miękkiego szklistego i analiza eksperymentalna

1. Organizowanie danych eksperymentalnych w tabeli
   1. Utwórz nową tabelę w oprogramowaniu analitycznym, klikając zakładkę Plik. Wyznacz 10 różnych kolumn (od c0 do c9) dla następujących parametrów: używane częstotliwości kątowe (rad/s): c0; Wartości K' (pN/μm) uzyskane dla każdej częstotliwości kątowej: c1; Błądzić': c2; Wartości K" (pN/μm) uzyskane dla każdej częstotliwości kątowej: c3; ErrK": c4; Wartości G'(Pa) uzyskane dla każdej częstotliwości kątowej: c5; ErrG': c6; Wartości G" (Pa) uzyskane dla każdej częstotliwości kątowej: c7; ErrG": c8 i F_f z odpowiednim błędem: c9 (Rysunek 8). Użyj następującej formuły, aby wypełnić następujące kolumny:
      C5 = (3 x C1) / (8 x 1,28 x 0,087)
      C6 = (3 / (8 x 0,087 x 1,28)) x sqrt (C2^2 + (C1 x 0,01 / 1,28)^2 + (C1 x 0,008 / 0,087) ^ 2)
      C7 = (3 x C3) / (8 x 1,28 x 0,087)
      C8 = (3 / (8 x 0,087 x C4)) x sqrt (C4^2 + (C3 x 0,01 / 1,28)^2 + (C3 x 0,008 / 0,087)^2)
2. Krzywa kreślenia G' (ω) w funkcji G" (ω)
   1. Aby wygenerować krzywą G' (ω) w stosunku do G" (ω) w oprogramowaniu analitycznym, należy skorzystać z danych z poprzedniej tabeli. Kliknij Galeria > Liniowy i wybierz format wykresu punktowego.
   2. Otworzy się nowe okno. Wybierz kolumnę G" jako oś x, a kolumnę G' jako oś y. Na koniec kliknij przycisk Wykres, aby uzyskać wykres.
   3. Aby dodać słupki błędów do wykresu, kliknij okno Wykres, a następnie kliknij pozycję Wykres > słupki błędów. Otworzy się nowe okno. Najpierw zaznacz opcję Y Err. Otworzy się kolejne okno o nazwie Ustawienia paska błędów.
   4. Kliknij pozycję % wartości, wybierz pozycję Kolumna danych, a następnie kliknij kolumnę ErrG'. Na koniec kliknij OK > Wykres, pojawią się paski błędów dla wartości y. Powtórz tę samą procedurę dla wartości osi x, wybierając teraz kwadrat X Err i odpowiednią kolumnę dla ErrG". Końcowy wykres będzie podobny do tego pokazanego na Rysunek 9.
3. Dopasowanie parametrów do modelu reologii miękkiego szklistego
   UWAGA: Analiza danych jest podzielona na dwie części: 1) krzywą pasującą wykres G' (ω) versus G" (ω) w celu uzyskania parametrów Γ i G_m; 2) dopasowanie krzywej G' (ω) i G" (ω) w funkcji częstotliwości ω, w celu uzyskania wykładnika prawa potęgowego α.
   1. Krzywa pasująca do wykresu G' (ω) w stosunku do G" (ω) w celu uzyskania parametrów Γ i G_m.
      1. Kliknij kartę Dopasowanie krzywej i wybierz opcję Dopasuj 1. Otworzy się nowe okno. Wybierz kwadrat i kliknij przycisk Definiuj. Pojawi się okno o nazwie ogólna definicja dopasowania krzywej. Wpisz następujące równanie:
         m1 + m0/m2
         gdzie m1 = 61,576; m2 = 1, z dopuszczalnym błędem 1 x ^10-5. Tutaj m0 oznacza G", m1 oznacza G_m, a m2 oznacza Γ.
         UWAGA: Dla m1 i m2 konieczne jest oszacowanie ich odpowiednich wartości podczas definiowania dopasowania krzywej. Powyższe szacunki zostały oparte na pokazanym przykładzie eksperymentu. W eksperymentach oszacuj liczby zgodnie z wartościami zaobserwowanymi na wykresie.
      2. Kliknij przycisk OK w obu oknach, a pojawi się złączka, jak pokazano na Rysunek 10 - krzywa. Sprawdź poprawne wartości dla m1 i m2 wymienione w tabeli dopasowania krzywej, która pojawiła się wraz z wykresem.
   2. Dopasowanie krzywej G' i G" w funkcji częstotliwości kątowej ω
      1. Następnie utwórz dwa inne wykresy, a mianowicie G' jako funkcję ω i G' jako funkcję ω. Słupki błędów należy umieszczać tylko na osi y, jak pokazano wcześniej.
      2. Powtórz procedurę dopasowania krzywej, ale teraz w opcjach dopasowania krzywej wybierz opcję G", a następnie w polu Ogólne dopasowanie > definicji krzywej wpisz następujące równanie:
         
         W tym przypadku oszacowano, że m1 to wartość G" (ω) = 23,683 Pa, gdy ω = 6,3 rad/s; M2 oszacowano na 0,5 (pamiętaj, że M2 jest wykładnikiem α i waha się od 0 do 1). Wstaw wartość dla Γ = 2,0293, zgodnie z wynikiem m2 w Rysunek 10.
      3. Zaznacz opcję Dane dotyczące masy. Po tych wszystkich procedurach kliknij na OK, a pojawi się krzywa pasująca do tej w Rysunek 11 - pojawi się niebieska krzywa. Pojawią się wartości dla α, α = 0,63 ± 0,02 i G₀, G₀ = (3,7 ± 0,3)Pa. Użyj tych wartości, aby dopasować następną krzywą, G' (ω).
      4. Kliknij następną krzywą, powtórz procedurę dopasowania krzywej, ale teraz w definicji krzywej dopasowania ogólnego wpisz następujące równanie:
         
         W tym przypadku m3 to tylko szacunkowa wartość α aby potwierdzić wcześniej uzyskaną wartość. Użyj wartości dla G₀ = 3,703 i G' (ω) = 23,683 Pa, gdy ω = 6,3 rad/s.
      5. Ponownie dodaj 1 x ^10-5 jako dopuszczalny błąd i zaznacz opcję Dane dotyczące wagi. Po tych wszystkich procedurach kliknij na OK, a pojawi się krzywa pasująca do tej w Rysunek 11 - pojawi się zielona krzywa.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schematy systemu OT używanego do pomiarów reologicznych. Rysunek 2 pokazuje schematy eksperymentu mikroreologicznego z obiema sferami, a także pokazany jest reprezentatywny RBC. Rysunek 3 pokazuje typową krzywą dla amplitud obu sfer w funkcji czasu, kiedy ruchy sinusoidalne są wytwarzane przez stopień piezoelektryczny. Podczas gdy sfera referencyjna (Rysunek 3 - czerwona krzywa) oscyluje zgodnie...

Dyskusja

W tym protokole przedstawiono zintegrowaną metodę opartą na pęsetie optycznej i mikroskopii rozogniskowującej w celu ilościowego mapowania lepkosprężystych właściwości RBC. Określono wyniki modułów ścinania magazynowania i straty, wraz z wykładnikiem skalowania, który charakteryzuje miękką szklistą reologię RBC. Zastosowanie tego protokołu w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak sytuacja^{fizjologiczna8} lub wzdłuż każdego etapu cyklu wewnątrzerytrocytarnego P. falciparum

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynia hodowlane 35 mm	Corning	430165
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A9418
Szkiełka nakrywkowe	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 i VD12432Y1A.01
Naczynia ze szklanym dnem	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Olejek immersyjny	Nikon	MXA22165
Mikroskop odwrócony	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Kamera mikroskopowa	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Komora Neubauera	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Obiektyw	Nikon	PLAN APO 100X 1,4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1,4 NA DIC H i Plan APO 10x XXNA PH2
Stół optyczny	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Mikrosfery polistyrenowe	Polysciences	17134-15
pierścień gumowy	Forever Seals	NBR O-ring
Smar silikonowy	Dow Corning	Z273554
Pozycjonowanie stolika	PI	P-545.3R8S
Pipeta	Gilson	P1000