Artykuł metodologiczny

Budowa homozygotycznych mutantów szarańczy wędrownej z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/63629

⸱

16 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cotton Biology, Key Laboratory of Plant Stress Biology, School of Life Sciences, Henan University, 2Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, 3School of Life Science, Shanxi University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie dostarcza systematycznie optymalizowanej procedury budowy homozygotycznych mutantów szarańczy opartej na rybonukleazie CRISPR/Cas9, jak również szczegółowej metody kriokonserwacji i resuscytacji jaj szarańczy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szarańcza wędrowna, Locusta migratoria, jest nie tylko jedną z najbardziej znanych plag szarańczy, które spowodowały ogromne straty ekonomiczne dla ludzi, ale także ważnym modelem badawczym dla metamorfozy owadów. System CRISPR/Cas9 może dokładnie zlokalizować określone locus DNA i rozszczepić się w miejscu docelowym, skutecznie wprowadzając pęknięcia dwuniciowe w celu wywołania nokautu genu docelowego lub integracji nowych fragmentów genu z określonym locus. Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 jest potężnym narzędziem do rozwiązywania problemów napotkanych w badaniach nad szarańczą, a także obiecującą technologią zwalczania szarańczy. Badanie to zapewnia systematyczny protokół nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 z kompleksem białka Cas9 i pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA) u szarańczy wędrownej. Szczegółowo opisano wybór miejsc docelowych i konstrukcję sgRNA, a następnie syntezę in vitro i weryfikację sgRNA. Kolejne procedury obejmują pobieranie jaj z tratwy i separację jaj garbowanych w celu osiągnięcia udanej mikroiniekcji o niskim wskaźniku śmiertelności, hodowlę jaj, wstępne oszacowanie tempa mutacji, rozmnażanie szarańczy, a także wykrywanie, zachowanie i przejście mutantów w celu zapewnienia stabilności populacji edytowanej szarańczy. Metoda ta może być wykorzystana jako odniesienie dla zastosowań edycji genów opartych na CRISPR/Cas9 u szarańczy wędrownej, a także u innych owadów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie edycji genów mogą być używane do wprowadzania insercji lub delecji do określonego locus genomu, aby sztucznie modyfikować gen docelowy celowo1. W ostatnich latach technologia CRISPR/Cas9 szybko się rozwinęła i ma coraz większy zakres zastosowań w różnych dziedzinach nauk przyrodniczych2,3,4,5,6. System CRISPR/Cas9 został odkryty w 1987 roku7 i powszechnie stosowany w bakteriach i archeonach. Dalsze badania wykazały, że jest to prokariotyczny adaptacyjny układ odpornościowy, który zależy od kierowanej przez RNA nukleazy Cas9 w walce z fagami8. Sztucznie zmodyfikowany system CRISPR/Cas9 składa się głównie z dwóch składników: pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) i białka Cas9. sgRNA składa się z CRISPR RNA (crRNA) komplementarnego do sekwencji docelowej i pomocniczego transaktywującego crRNA (tracrRNA), który jest stosunkowo konserwatywny. Kiedy system CRISPR/Cas9 jest aktywowany, sgRNA tworzy rybonukleoproteinę (RNP) z białkiem Cas9 i kieruje Cas9 do miejsca docelowego poprzez parowanie zasad interakcji RNA-DNA. Następnie dwuniciowe DNA może zostać rozszczepione przez białko Cas9, w wyniku czego pęknięcie dwuniciowe (DSB) pojawia się w pobliżu motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) miejsca docelowego9,10,11,12. Aby złagodzić uszkodzenia spowodowane przez DSB, komórki aktywowałyby kompleksowe odpowiedzi na uszkodzenia DNA, aby skutecznie wykryć uszkodzenia genomowe i zainicjować procedurę naprawy. W komórce istnieją dwa odrębne mechanizmy naprawcze: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawa ukierunkowana na homologię (HDR). NHEJ jest najczęstszą ścieżką naprawczą, która może szybko naprawić pęknięcia dwuniciowe DNA i zapobiega apoptozie komórek. Jest jednak podatny na błędy ze względu na pozostawianie małych fragmentów insercji i delecji (indeli) w pobliżu DSB, co zwykle powoduje otwarte przesunięcie ramki odczytu, a tym samym może prowadzić do nokautu genu. W przeciwieństwie do tego, naprawa homologiczna jest dość rzadkim zdarzeniem. Pod warunkiem, że istnieje matryca naprawcza z sekwencjami homologicznymi do kontekstu DSB, komórki od czasu do czasu naprawiają przerwę genomową zgodnie z pobliską matrycą. Rezultatem HDR jest to, że DSB jest precyzyjnie naprawiany. Zwłaszcza, jeśli istnieje dodatkowa sekwencja między sekwencjami homologicznymi w szablonie, zostaną one zintegrowane z genomem za pomocą HDR i w ten sposób można by zrealizować określone insercje genów13.

Dzięki optymalizacji i rozwojowi struktur sgRNA i wariantów białka Cas9, system edycji genetycznej oparty na CRISPR/Cas9 został również z powodzeniem zastosowany w badaniach owadów, w tym między innymi Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella i Locusta migratoria14,15,16,17,18,19. Zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, chociaż RNP składające się z białka Cas9 i transkrybowanego in vitro sgRNA zostały wykorzystane do edycji genomu szarańczy20,21,22, nadal brakuje systematycznego i szczegółowego protokołu dla budowy homozygotycznych mutantów szarańczy za pośrednictwem rybonukleazy CRISPR/Cas9

.

Szarańcza wędrowna jest ważnym szkodnikiem rolniczym, który występuje globalnie i stanowi poważne zagrożenie dla produkcji żywności, będąc szczególnie szkodliwym dla roślin graminowych, takich jak pszenica, kukurydza, ryż i proso23. Analiza funkcji genów w oparciu o technologie edycji genomu może dostarczyć nowych celów i nowych strategii zwalczania szarańczy wędrownej. W badaniu zaproponowano szczegółową metodę eliminowania wędrownych genów szarańczy za pomocą systemu CRISPR/Cas9, w tym wybór miejsc docelowych i projektowanie sgRNA, syntezę in vitro i weryfikację sgRNA, mikroiniekcję i hodowlę jaj, oszacowanie szybkości mutacji w stadium embrionalnym, wykrywanie mutantów, a także pasaż i zachowanie mutantów. Protokół ten może być wykorzystany jako podstawowe odniesienie do manipulacji zdecydowaną większością genów szarańczy i może dostarczyć cennych punktów odniesienia do edycji genomu innych owadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wybór miejsca docelowego i projekt sgRNA

  1. Zbierz jak najwięcej informacji o sekwencji interesującego genu poprzez badania literaturowe i/lub wyszukiwanie mRNA lub kodującej sekwencji DNA (CDS) genu w NCBI i bazie danych szarańczy24.
  2. Porównaj sekwencję zainteresowanego genu z jego genomową sekwencją DNA, aby odróżnić regiony eksonu i intronu.
  3. Wybierz region kandydujący do projektu witryny docelowej w oparciu o cel badawczy. Zaprojektuj pary starterów, aby amplifikować fragment regionu kandydującego i zweryfikować jego sekwencję typu dzikiego poprzez analizę sekwencjonowania produktu PCR.
    UWAGA: Istnieją różne strategie wyboru kandydującego regionu docelowego. Na przykład w większości badań nad funkcją genów/białek należy użyć fragmentu eksonu w pobliżu jego kodonu startowego jako regionu kandydującego, aby zapewnić, że cała funkcja białka/RNA zostanie utracona po edycji genomu (tj. Nokaut genu). Natomiast w przypadku analizy funkcji określonej domeny należy wybrać region kandydujący na początku (lub na obu końcach) domeny.
  4. Skorzystaj z zasobów internetowych, takich jak E-CRISP Design25, aby wyszukać potencjalne lokalizacje docelowe w kandydującym regionie docelowym.
    1. Wybierz "Drosophila melanogaster BDGP6" (lub dowolny inny owad) z rozwijanej listy genomów referencyjnych i wybierz "Wejście to sekwencja FASTA", a następnie wklej sekwencję regionu docelowego do pola tekstowego (w formacie FASTA).
    2. Uruchom aplikację, naciskając "Rozpocznij wyszukiwanie sgRNA" za pomocą "medium" i "pojedynczy projekt", aby uzyskać możliwe miejsca docelowe. Wybierz 1-3 potencjalne cele z wyników na podstawie ich przewidywanych wyników i odpowiednio zaprojektuj odpowiednie sgRNA.
      UWAGA: Istnieje wiele innych platform internetowych do projektowania CRISPR, takich jak CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT i tak dalej (patrz tabela materiałów). Niektóre z nich pełnią funkcję sprawdzania specyficzności dla gatunków, których dane dotyczące sekwencji genomu znajdują się w ich bazach danych. Jednak sekwencja genomowa szarańczy nie została znaleziona na żadnej stronie internetowej. Lepiej jest używać więcej niż jednego narzędzia online do projektowania CRISPR w szarańczy. Kompleksowo, rozważ wyniki z różnych stron internetowych i wybierz sgRNA z wyników na zasadzie najwyższej specyficzności, najwyższej wydajności i najmniejszego wskaźnika niedopasowania (Rysunek 1A,B).

2. Synteza i weryfikacja sgRNA in vitro

  1. Zsyntetyzuj sgRNA za pomocą zestawów do syntezy sgRNA zgodnie z instrukcją producenta (Tabela materiałów). Procedura ta zwykle obejmuje trzy etapy: amplifikację matrycy DNA, transkrypcję in vitro i oczyszczanie sgRNA21. Rozcieńczyć zsyntetyzowane sgRNA wodą wolną od nukleaz do stężenia magazynowego 300 ng/μl do dalszego wykorzystania.
  2. Amplifikacja i oczyść docelowy fragment genu, aby służył jako substrat w teście rozszczepienia in vitro systemu CRISPR/Cas9. Wykonaj te czynności zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Zakupione białko Cas9 rozcieńczyć do 300 ng/μL wodą wolną od nukleaz. Inkubować 1 μl sgRNA (300 ng/μl) i 1 μl białka Cas9 (300 ng/μl) z 200 ng oczyszczonego fragmentu docelowego w buforze rozszczepiającym w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (10 μl całkowitej objętości; patrz tabela 1). Oszacuj skuteczność indukowanego sgRNA rozszczepienia Cas9 za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rysunek 1C). Do następującej mikroiniekcji należy wybrać sgRNA o wysokiej aktywności.
    UWAGA: Wyniki elektroforezy w żelu agarozowym można przekształcić w obrazy w skali szarości za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, a wydajność rozszczepienia szacuje się na podstawie skali szarości pasm o spekulowanych rozmiarach.

3. Mikroiniekcja i hodowla jaj

  1. Przygotować igły do wstrzykiwań, przeciągając szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet (tabela materiałów). Ustaw parametry w następujący sposób: Ciepło na 588, Ciągnięcie na 90, Prędkość na 60 i Czas na 40. Zmielić końcówkę igły iniekcyjnej za pomocą mikro szlifierki (tabela materiałów).
    UWAGA: Idealne końcówki igieł są otwarte i ostrokrawędziowe (Rysunek 2A). Zdecydowanie zaleca się przygotowanie dodatkowych igieł do eksperymentów, ponieważ igły są czasami zablokowane lub przypadkowo złamane podczas wstrzyknięć.
  2. Wymieszaj 1 μl białka Cas9 (300 ng/μL) z 1 μl zweryfikowanego sgRNA (300 ng/μL) razem, aby uzyskać RNP do wstrzykiwań. Dodać 8 μl sterylnej wody wolnej od RNaz, aby uzyskać ostateczną objętość mieszaniny do 10 μl. Dokładnie wymieszać roztwór i trzymać go na lodzie.
    UWAGA: Końcowe stężenia białka Cas9 i sgRNA można zoptymalizować zgodnie z wynikami edycji. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania przygotowanego roztworu RNP i zaleca się natychmiastowe użycie.
  3. Dorosłe samce i samice szarańczy należy hodować razem w temperaturze 30 °C przy fotoperiodzie 16 (światło):8 (ciemne) i dostarczyć im wystarczającą ilość świeżych siewek pszenicy jako pokarm. Obserwuj te szarańcze codziennie i umieść doniczkę do składania jaj (plastikową doniczkę lub kubek wypełniony mokrym, sterylnym piaskiem) w klatce hodowlanej w celu złożenia jaj po połączeniu szarańczy.
    UWAGA: Zwykle 100 par dorosłych szarańczy hodowanych w klatce hodowlanej (40 cm x 40 cm x 40 cm) wystarcza do wytworzenia jaj do wybicia pojedynczego genu. Hoduj dodatkowe pary szarańczy, jeśli potrzeba więcej jaj.
  4. Zbierz świeżo złożone strąki jaj z doniczki do składania jaj i poczekaj około 30 minut na garbowanie jaj. Delikatnie odizoluj jajka od strąków w wodzie za pomocą cienkiej szczoteczki i umyj je trzykrotnie sterylną wodą. Jaja należy przechowywać na szalce Petriego i dodawać sterylną wodę, aby były wilgotne.
    UWAGA: Garbowanie nowo złożonych jaj może znacznie poprawić wydajność mutantów21.
  5. Napełnić igłę iniekcyjną przygotowanym roztworem RNP i załadować ją do mikromanipulatora (Tabela Materiałów).
    1. Ustaw parametry mikroiniekcji w następujący sposób: 300 hPa ciśnienia wtrysku (pi), 0,5 s czasu wtrysku (ti) i 25 hPa ciśnienia kompensacji (pc).
    2. Naciśnij pedał, aby ocenić objętość wstrzykniętego roztworu. Dostosuj ciśnienie wtrysku i czas wtrysku, aby upewnić się, że objętość wtrysku wynosi około 50-100 nL.
      UWAGA: Usunąć powietrze resztkowe z igły, aby roztwór do wstrzykiwań był ciągły i w jak największym stopniu kontrolowany. Połączenie igły i mikromanipulatora musi być szczelne.
  6. Ułóż sterylne jaja regularnie na podkładce iniekcyjnej (Rysunek 2B, C) i umieść podkładkę na stole przedmiotowym mikroskopu (Rycina 3A). Dostosuj powiększenie mikroskopu, aż jaja zostaną zaobserwowane. Wyreguluj igłę do mikroiniekcji pod mikroskopem, aż końcówka iniekcji będzie widoczna, a następnie umieść ją w pobliżu komórki jajowej, która ma zostać wstrzyknięta.
  7. Rozpocząć wstrzykiwanie na odpowiedniej wysokości i pod kątem 30-45 stopni. Ostrożnie włóż końcówkę do jajka w pobliżu mikropyli jajka (Rysunek 3B) i naciśnij pedał, aby zakończyć wstrzykiwanie. Szybko wycofać igłę i przesunąć wkładkę do wstrzykiwania następnego jaja.
    UWAGA: Podczas mikroiniekcji należy zaobserwować niewielkie rozszerzanie się jaja. Dopuszczalna jest niewielka ilość wycieku cytoplazmatycznego w otworze. Wymień igłę do wstrzykiwań na nową lub wyreguluj kąt wtrysku, jeśli odpływ płynu jest zbyt duży.
  8. Przenieść wstrzyknięte jaja do szalki hodowlanej (szalka Petriego z kawałkiem wilgotnej bibuły filtracyjnej) i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
    UWAGA: Potrzeba około 13-14 dni, aby nimfy wykluły się z tych wstrzykniętych jaj (pod warunkiem, że mutacja docelowego genu nie wpłynie na rozwój zarodków) (Ryc. 3C). Wstrzyknij co najmniej 100 jaj, aby zapewnić wystarczającą ilość wylęgu i eklozji do wyeliminowania określonego genu.

4. Szacowanie szybkości mutacji i badania przesiewowe mutantów

  1. Codziennie po wstrzyknięciu należy sprawdzać rozwój wstrzykniętych komórek jajowych. Przenieś wstrzyknięte jaja do nowej płytki hodowlanej co 24 godziny w ciągu pierwszych 5 dni.
  2. 6 dnia (lub później) po wstrzyknięciu należy losowo pobrać i przenieść 10 jaj do probówki i odpowiednio zmielić jaja dwiema stalowymi kulkami o częstotliwości 60 Hz przez 6 minut za pomocą młynka (patrz Tabela materiałów). Ponownie zawiesić zanieczyszczenia za pomocą 1 ml PBS. Przenieść 5 μl mieszaniny do 45 μl 50 mM NaOH i poddać lizie w temperaturze 95 °C przez 5 min. Dodać 5 μl 1 M Tris-HCl (pH = 8,0) do systemu lizy, aby zakończyć alkaliczną reakcję lizy.
    UWAGA: Jaja można pobrać do lizy alkalicznej w dowolnym dniu po ostatnim przeniesieniu, a wiele jaj można wykorzystać jako jedną próbkę w zależności od ich sytuacji rozwojowej (np. pięć 6-dniowych zarodków można użyć jako jednej próbki, a dwa 10-dniowe zarodki mogą być użyte jako jedna próbka). Czasami nie jest możliwe uzyskanie genomowego DNA jaj metodą lizy alkalicznej. Komercyjne zestawy do ekstrakcji genomowego DNA mogą być stosowane jako alternatywna metoda izolowania genomowego DNA z komórek jajowych.
  3. Pobrać 1 μl produktu do lizy jako matrycę PCR w celu amplifikacji docelowego fragmentu genu (Tabela 2 i Tabela 3) i wysłać produkty PCR do sekwencjonowania. Porównaj wyniki sekwencjonowania z sekwencją typu dzikiego, aby wstępnie ocenić, czy system CRISPR/Cas9 rozszczepił gen docelowy in vivo (Figura 4A). Pozostawić resztę jaj do dalszego rozwoju, pod warunkiem że indele zostaną wykryte w stadium embrionalnym.
    UWAGA: W ten sposób można wstępnie oszacować tempo mutacji na etapie zarodka. Jeśli na tym etapie nie zostaną znalezione żadne indele, przygotuj kilka nowych sgRNA dla genu docelowego i powtórz protokół knock-out z kroku 2.1.
  4. Przenieść wyklute nimfy do klatki hodowlanej i hodować je zgodnie z opisem w kroku 3.3. Kiedy nimfy rozwiną się do piątego stadium rozwojowego, oddziel je plastikowymi kubkami hodowlanymi (1 nimfa/kubek).
    UWAGA: Zwykle potrzeba około 25-35 dni, aby nimfy rozwinęły się do piątego stadium rozwojowego, a najbardziej oczywistym fenotypem jest to, że pąki skrzydeł rozciągają się do czwartego lub piątego segmentu brzucha. Ponadto zaleca się rejestrowanie fenotypów martwych nimf w celu przewidzenia związku między genem docelowym a fenotypami w dalszych badaniach.
  5. Odetnij około 2 mm długości czułków nożyczkami preparacyjnymi i poddaj je lizie metodą lizy alkalicznej (krok 4.2). Przeanalizuj sekwencję docelowego fragmentu genu tych nimf, jak opisano powyżej (krok 4.3), aby zidentyfikować mutanty G0 (Rysunek 4B).
    UWAGA: Anteny przycięte do lizy mogą być nieco dłuższe, a mielenie lub mielenie anten jest pomocne w lizie, chociaż anteny mogą być bezpośrednio trawione. Osobniki z wieloma pikami w pobliżu miejsca docelowego w wyniku sekwencjonowania są identyfikowane jako pozytywne mutanty i dopuszcza się je do późniejszego rozwoju i krycia.

5. Ustanawianie i przechodzenie linii mutantów

  1. Przeprowadź krzyżowanie przy użyciu mutantów G0 i szarańczy typu dzikiego (Rysunek 4B). Zebrać oocysty i inkubować je oddzielnie w temperaturze 30 °C. Użyć 3-6 rozwiniętych komórek jajowych w każdej oocyście w celu wykrycia mutacji zgodnie z opisem w krokach 4.2 i 4.3. Zachowaj oocysty z dodatnim wynikiem mutacji do późniejszego rozwoju i porzuć oocysty z ujemnymi mutacjami.
    UWAGA: Oszacowanie częstości mutacji w stadium embrionalnym może znacznie przyspieszyć badania przesiewowe mutantów G1. Zwykle 3-6 rozwiniętych jaj można zmieszać jako jedną próbkę do genotypowania za pośrednictwem PCR, jak opisano powyżej.
  2. Schowaj nimfy G1 zgodnie z opisem w kroku 4.4. Odciąć czułki o długości około 2 mm, aby przeprowadzić genotypowanie oparte na PCR, jak opisano w kroku 4.5 w celu wykrycia heterozygot G1. Wykonaj klonowanie TA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Spis materiałów) w celu zidentyfikowania ich mutacji. Wykonaj krzyżówkę przy użyciu heterozygot G1 z tymi samymi mutacjami, aby uzyskać nimfyG2.
    UWAGA: Sekwencjonowanie produktów PCR metodą Sangera może dostarczyć jedynie informacji potrzebnych do znalezienia heterozygot, ale nie jest wystarczające do identyfikacji dokładnych mutacji. W związku z tym klonowanie TA przy użyciu produktów PCR jest wymagane do jednoznacznej identyfikacji mutacji i może sprzyjać tworzeniu stabilnych linii zmutowanych.
  3. Wychowuj nimfy G2 do ich piątego stadium rozwojowego. Użyj genotypowania opartego na PCR opisanego w kroku 5.2, aby zidentyfikować homozygoty i/lub heterozygoty, które są odpowiednie do dalszych badań i stabilnego pasażu (Rysunek 4B).
    UWAGA: Zwróć uwagę, aby uniknąć mieszania homozygot i heterozygot. Zaleca się wykonywanie genotypowania opartego na PCR w każdym pokoleniu w celu potwierdzenia homozygotyczności i/lub heterozygotyczności każdej populacji. Liczba szarańczy użytych do tej kontroli zależy od wielkości populacji. Co więcej, populacja szarańczy może zostać zwiększona dzięki strategii krzyżowej.

6. Kriokonserwacja i reanimacja jaj

  1. Jaja przeznaczone do kriokonserwacji należy umyć sterylną wodą i inkubować w naczyniu hodowlanym, jak opisano powyżej (krok 3.8) przez 5-6 dni. Zbierz te jaja razem w naczyniu hodowlanym i przykryj je fragmentami bibuły filtracyjnej. Owiń całe naczynie hodowlane folią parafinową.
  2. Przechowywać naczynie w temperaturze 25 °C przez 2 dni, a następnie kolejne 2 dni w stosunkowo niższej temperaturze (13-16 °C). Następnie przełóż naczynie do lodówki o temperaturze 6 °C. Dodawaj do niego wodę co 2 tygodnie, aby zapewnić wilgotne środowisko dla jaj (Rysunek 5A).
    UWAGA: Spekuluje się, że zarodki znajdują się w stadium katatrepsis po rozwoju przez 5-6 dni w temperaturze 30 °C26. Chłodzenie gradientowe jest pomocne w kriokonserwacji jaj (Tabela 5).
  3. W celu reanimacji kriokonserwowanych jaj należy wyjąć szalkę Petriego z lodówki i przechowywać w temperaturze 25 °C przez 2 dni. Umieść te jaja w inkubatorze w temperaturze 30 °C, aż wyklują się nimfy (Rysunek 5B).
    UWAGA: Konieczne jest umieszczenie kriokonserwowanych jaj w temperaturze 25 °C przed przeniesieniem ich do inkubatora w temperaturze 30 °C. Zarodki mogą być kriokonserwowane przez co najmniej pięć miesięcy, chociaż wskaźnik wylęgu i wskaźnik eklozji mogą się zmniejszyć z powodu kriokonserwacji (Tabela 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zawiera szczegółowe kroki generowania homozygotycznych mutantów migrującej szarańczy z RNP składającym się z białka Cas9 i syntetyzowanego in vitro sgRNA. Poniżej przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników nokautu genu docelowego za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u szarańczy, w tym selekcji celu, syntezy i weryfikacji sgRNA (Figura 1A), pobierania i wstrzykiwania jaj, badań przesiewowych i pasażowania mutantów, krioprezerwacji i resuscytacji homozygotycznych jaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szarańcza jest jednym z najbardziej niszczycielskich szkodników rolnictwa od czasów cywilizacji ludzkiej23. Technologia edycji genomu oparta na CRISPR/Cas9 jest potężnym narzędziem zapewniającym lepszą wiedzę na temat mechanizmów biologicznych szarańczy, a także obiecującą strategią zwalczania szkodników. W związku z tym bardzo korzystne jest opracowanie wydajnej i łatwej w użyciu metody budowy homozygotycznych mutantów szarańczy za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Chociaż opisano kilka świetnych prac, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32070502, 31601697, 32072419 oraz Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (2020M672205).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 i razy; NEBuffer r3.1New England BiolabsB7030SBufor   in vitro Testy rozszczepienia Cas9
2xEs Taq MasterMix (Dye)CwbioCW0690Do amplifikacji genów
2xPfu MasterMix (Dye)CwbioCW0686Do amplifikacji genów
CHOPCHOPStrona internetowa do projektowania sgRNA, http://chopchop.cbu.uib.no/.
Strona internetowa CRISPOROnline do projektowania sgRNA, http://crispor.org.
Strona internetowa CRISPRdirectOnline do projektowania sgRNA, http://crispr.dbcls.jp/.
Zasilacz do elektroforezyLIUYI BIOLOGYDYY-6DSeparacja cząsteczek kwasu nukleinowego o różnych rozmiarach
Rurka EppendorfaEppendorf30125177Do pobierania próbek itp.
Cienkie szczotkiAnnigoni1235Do czyszczenia i izolowania jaj. Zakupione online.
Płonący/brązowy ściągacz do mikropipetSutter InstrumentP97Do wykonywania igieł do mikroiniekcji
Zestaw do ekstrakcji żeluCwbioCW2302Odzyskiwanie i oczyszczanie DNA
System analizy obrazowania żeluOLYMPUSGel Doc XRObserwuj wyniki elektroforezy
GeneTouch PlusBioerB-48DADo amplifikacji genów
Szkło elektroda kapilarnaGairdnerGD-102Do wykonania  igły iniekcyjne z  a  Ściągacz do mikropipet
InkubatorMEMMERTINplus55Do hodowli zarodków szarańczy wędrownej
Wanna metalowaTIANGENAJ-800Do podgrzewania próbki
Mikro autowtryskiwaczEppendorf5253000068Mikroiniekcja zarodków we wczesnym etapie rozwoju
MikrowirówkaAllshengMTV-1Służy do mieszania odczynników
MikromłynekNARISHIGEEG-401Do uziemienia końcówki igły iniekcyjnej
MicroloaderEppendorf5242956003Do ładowania roztworów do igieł iniekcyjnych.
System do mikromanipulacjiEppendorfTransferMan 4rAlternatywny system manipulacyjny do mikroiniekcji
MikroskopcnoptecSZ780Do mikroiniekcji
Manipulator z napędem silnikowymNARISHIGEMM-94Do kontrolowania pozycji mikropipety podczas poprzedzającego mikroiniekcję
Młynek do tkanek z wieloma próbkamijingxinTissuelyser-64Zmiel i homogenizuj jaja
w garnku do składaniaChangShengYuanYiCS-11Wypełniony mokrym sterylnym piaskiem do składania w nim jaj szarańczy. Oocysty są pobierane z tego pojemnika. Zakupione online.
ParafilmParafilmMPM996Do owijania szalek Petriego.
pEASY-T3 Zestaw do klonowaniaTransGen BiotechCT301-01Do klonowania TA
szalka PetriegoNEST752001Do hodowli i konserwacji  jaj.
PipetorEppendorfResearch plusDo ładowania próbki
plastikowy kubekhodowlany Do hodowli szarańczy osobno i każdy plastikowy kubek wystarczająco duży (o objętości nie mniejszej niż 1000 ml) wystarczy. Zakupiony online.
Precyzyjny zestaw do syntezy gRNAThermoA29377Do syntezy sgRNA
Primer PremierPREMIER BiosoftPrimer Premier 5.00Do projektowania podkładów
SnapGeneInsightful ScienceSnapGene® 4.2.4Do analizy  sekwencji
Kulki staloweHuaXinGangQiuHXGQ60Do mielenia próbek. Zakupione online.
KońcówkibioleafD781349Do ładowania próbki
Trans DNA Marker IITransGen BiotechBM411-01Służy do określania wielkości genu
TrueCut Cas9 Protein v2ThermoA36496Cas9 protein
UniversalGen DNA KitCwbioCWY004Do ekstrakcji genomowego DNA
VANNAS NożyczkiMikroskopia elektronowa Nauki72932-01Do odcinania czułków
PszenicaDo generowania sadzonek pszenicy jako pokarmu dla szarańczy. Kupione od lokalnych rolników.
Strona internetowa ZiFiTOnline do projektowania sgRNA, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.
jaj

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
  2. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
  3. McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281(2020).
  4. Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312(2020).
  5. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
  6. Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
  7. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
  8. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  9. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  10. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471(2013).
  11. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  14. Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068(2021).
  15. Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
  16. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  17. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  18. Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
  19. Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
  20. Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60(2018).
  21. Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
  22. Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
  23. Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D. Locust and grasshopper management. Annual Review of Entomology. 64, 15-34 (2019).
  24. Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: http://www.locustmine.org:8080/locustmine (2019).
  25. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (2014).
  26. Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
  27. Barry, S. K., et al. Injecting Gryllus bimaculatus eggs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59726(2019).
  28. Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
  29. Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171(2017).
  30. Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
  31. Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
  32. Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
  33. Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wyciszenie genuedycja genomutechnika mikrowstrzykiwaniapobieranie kom rek jajowychprojektowanie sgRNAprzesiewanie mutacjikriokonserwacja kom rek jajowych

Powiązane artykuły