Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z jadu z ukwiału morskiego i wykrywania jego aktywności hemolitycznej i fosfolipazy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skład jadu ukwiału zawiera cząsteczki polipeptydowe i niebiałkowe. Komponenty cytolityczne mają duży potencjał biotechnologiczny i biomedyczny do projektowania nowych narzędzi molekularnych. Jad ukwiałów lokalizuje się w komórkach gruczołowych z ektodermy i struktur subkomórkowych zwanych nematocystami, które są rozmieszczone w całym ciele ukwiału. Ta cecha wiąże się z wyzwaniami, ponieważ komórki i nematocysty muszą być poddawane lizie, aby uwolnić składniki jadu z innymi nietoksycznymi cząsteczkami. Dlatego po pierwsze, jad pochodzi z surowego ekstraktu (mieszaniny różnych i różnorodnych cząsteczek i szczątków tkankowych). Kolejnym krokiem jest wykrycie polipeptydów o określonej bioaktywności. W tym miejscu opisujemy skuteczną strategię uzyskiwania surowego ekstraktu z ukwiału morskiego i testu biologicznego w celu zidentyfikowania obecności cytolizyn. Pierwszy krok obejmuje niedrogie i proste techniki (mieszanie i cykl zamrażania-rozmrażania) w celu uwolnienia cytolizyny. Uzyskaliśmy najwyższą aktywność cytolityczną i białko (~500 mg białka z 20 g suchej masy). Następnie złożoność polipeptydowa ekstraktu analizowano za pomocą żelu SDS-PAGE, wykrywając białka o masie cząsteczkowej od 10 kDa do 250 kDa. W teście hemolitycznym wykorzystaliśmy czerwone krwinki owcze i oznaczyliśmy HU50 (11,1 ± 0,3 μg/ml). Natomiast obecność fosfolipaz w surowym ekstrakcie oznaczono przy użyciu żółtka jaja jako substratu w stałym podłożu z agarozą. Ogólnie rzecz biorąc, w badaniu tym wykorzystano wydajny i niedrogi protokół do przygotowania surowego ekstraktu i zastosowano powtarzalne testy biologiczne w celu identyfikacji cytolizyny, cząsteczek o znaczeniu biotechnologicznym i biomedycznym.
Wprowadzenie
Zwierzęta morskie są bogatym źródłem biologicznie aktywnych związków. W ostatnich dziesięcioleciach skład jadu ukwiałów przyciągnął uwagę naukowców, ponieważ obejmuje on różnorodność polipeptydów o działaniu hemolitycznym, cytotoksycznym, enzymatycznym (fosfolipaza, proteaza, chitynaza) i neurotoksycznym oraz hamującym wpływ na aktywność proteolityczną1. Ponadto polipeptydy te są potencjalnymi źródłami rozwoju narzędzi molekularnych w zastosowaniach biotechnologicznych i terapeutycznych2,3.
Istnieje niewiele doniesień na temat jadu ukwiałów i jego składników ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Aktinie zebrano zgodnie z wytycznymi Narodowej Komisji ds. Akwakultury, Rybołówstwa i Żywności Rządu Federalnego Meksyku (numer pozwolenia PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Komitet Bioetyki Instytutu Biotechnologii Narodowego Autonomicznego Uniwersytetu Meksyku zatwierdził wszystkie eksperymenty z udziałem aktinii. Próbka krwi owczej została zakupiona w Centrum Praktycznej Nauki i Badań nad Produkcją i Zdrowiem Zwierząt (CEPIPSA, Narodowy Autonomiczny Uniwersytet Meksyku).
1. Zbiór organizmów
- Zebrać ukwiały morskie A. dowii.
UWAGA: W tym przypadku organizmy zostały zebrane podczas odpływów w strefie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki protokołu zastosowanego do otrzymania surowego ekstraktu z ukwiału morskiego wykazały, że połączenie dwóch technik (mieszania oraz cykli zamrażania i rozmrażania) doprowadziło do wydajnego opróżnienia nematocyst, a całkowita ilość białka wyniosła 500 mg (8 mg/mL) (Rycina 3).
Złożoność białkową ekstraktu surowego można było zaobserwować w zakresie od 10 kDa do ponad 250 kDa za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Ponadto wykryto cytolizyny w strefa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Duże zapotrzebowanie na nowe związki mające zastosowanie w różnych dziedzinach nauki i przemysłu doprowadziło do badań nad jadem. Jad stanowi bogate źródło cząsteczek, które służy jako matryca do generowania nowych narzędzi molekularnych. Jednak złożoność tych jadów wymaga wdrożenia i połączenia różnych metod ich pozyskiwania i badania.
Tutaj pokazujemy metodę pozyskiwania i analizy jadu ukwiałów Anthopleura dowii, Verrill 1869, którą można wykorzystać do zbadania jadu innych gatunków.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu w związku z publikacją niniejszego artykułu.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), z numerem grantu IT200819. Autorzy dziękują Tomowi Musselmanowi, Rock Paper Editing, LLC, za sprawdzenie angielskiej gramatyki tego manuskryptu; oraz pomoc techniczna ze strony Samanty Jiménez (CICESE, Ensenada) i Juana Manuela Barbosy Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Dziękujemy również dr Augusto Césarowi Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) za pozyskanie krwi owczej. Szczególne podziękowania kierujemy do dr José Sanigera Blesa z ICAT-UNAM za udostępnienie w jego laboratorium materiałów do nagrania wideo.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stożkowa probówka wirówkowa 15 ml | Corning | 430766 | |
| 2-bromofenol niebieski | Sigma | B75808 | |
| 2-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 ml stożkowe probówki wirówkowe | Corning | 430828 | |
| Kwas octowy Lacjatowy | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Akrylamid | Promega | V3115 | |
| Agaroza | Promega | V3125 | |
| Bizakryloamid | Promega | V3143 | |
| Frakcja albuminy w surowicy bydlęcej V | Sigma | A3059-100G | |
| Testy białek Bradford | Bio-Rad | 5000006 | |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Płytki do hodowli komórkowych 96 dołków, V-dolna | Corning | 3894 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5804R | |
| Probówki wirówkowe | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Kwas cytrynowy | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Przezroczyste płaskie płytki 96-dołkowe z płaskim dnem | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Obudowa bezkanałowa | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | System dokumentacji żelu | |
| Hemocytometr Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Marienfeld | 650030 | ||
| ImageJ (oprogramowanie) | NIH, USA | Wersja 1.53c | |
| Inkubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Metanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Komórka tetra | Mini-PROTEANBio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4. H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Oprogramowanie | w wersji 9 | Do projektowania działki z korektami sigmoidalnymi | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman | Gilson | F167380 | |
| Prefabrykowany mini żel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Roche | 11836153001 | |
| Test białka Koncentrat odczynnika barwnika | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rodamina 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Cytrynian sodu dwuwodny | JT Baker | 3646-01 | |
| Spektrofotometr | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Zasilacz | Hoefer | PS300B |
Bibliografia
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic u....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
