Artykuł metodologiczny

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

DOI:

10.3791/63630

⸱

29 marca 2022

 ,  ,  , 
1Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Micro y Nanotecnologías, Instituto de Ciencias Aplicadas y Tecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z jadu z ukwiału morskiego i wykrywania jego aktywności hemolitycznej i fosfolipazy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skład jadu ukwiału zawiera cząsteczki polipeptydowe i niebiałkowe. Komponenty cytolityczne mają duży potencjał biotechnologiczny i biomedyczny do projektowania nowych narzędzi molekularnych. Jad ukwiałów lokalizuje się w komórkach gruczołowych z ektodermy i struktur subkomórkowych zwanych nematocystami, które są rozmieszczone w całym ciele ukwiału. Ta cecha wiąże się z wyzwaniami, ponieważ komórki i nematocysty muszą być poddawane lizie, aby uwolnić składniki jadu z innymi nietoksycznymi cząsteczkami. Dlatego po pierwsze, jad pochodzi z surowego ekstraktu (mieszaniny różnych i różnorodnych cząsteczek i szczątków tkankowych). Kolejnym krokiem jest wykrycie polipeptydów o określonej bioaktywności. W tym miejscu opisujemy skuteczną strategię uzyskiwania surowego ekstraktu z ukwiału morskiego i testu biologicznego w celu zidentyfikowania obecności cytolizyn. Pierwszy krok obejmuje niedrogie i proste techniki (mieszanie i cykl zamrażania-rozmrażania) w celu uwolnienia cytolizyny. Uzyskaliśmy najwyższą aktywność cytolityczną i białko (~500 mg białka z 20 g suchej masy). Następnie złożoność polipeptydowa ekstraktu analizowano za pomocą żelu SDS-PAGE, wykrywając białka o masie cząsteczkowej od 10 kDa do 250 kDa. W teście hemolitycznym wykorzystaliśmy czerwone krwinki owcze i oznaczyliśmy HU50 (11,1 ± 0,3 μg/ml). Natomiast obecność fosfolipaz w surowym ekstrakcie oznaczono przy użyciu żółtka jaja jako substratu w stałym podłożu z agarozą. Ogólnie rzecz biorąc, w badaniu tym wykorzystano wydajny i niedrogi protokół do przygotowania surowego ekstraktu i zastosowano powtarzalne testy biologiczne w celu identyfikacji cytolizyny, cząsteczek o znaczeniu biotechnologicznym i biomedycznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta morskie są bogatym źródłem biologicznie aktywnych związków. W ostatnich dziesięcioleciach skład jadu ukwiałów przyciągnął uwagę naukowców, ponieważ obejmuje on różnorodność polipeptydów o działaniu hemolitycznym, cytotoksycznym, enzymatycznym (fosfolipaza, proteaza, chitynaza) i neurotoksycznym oraz hamującym wpływ na aktywność proteolityczną1. Ponadto polipeptydy te są potencjalnymi źródłami rozwoju narzędzi molekularnych w zastosowaniach biotechnologicznych i terapeutycznych2,3.

Istnieje niewiele doniesień na temat jadu ukwiałów i jego składników molekularnych ze względu na złożoność pozyskiwania jadu, nawet izolacji i charakterystyki toksyn. Metody ekstrakcji użyte w raportach obejmowały lizę i opróżnianie zawartości komórek, które są związane i niezwiązane z produkcją jadu1.

Szczególną cechą wszystkich parzydełkowców jest brak systemu produkcji i uwalniania jadu skoncentrowanego w jednym obszarze anatomicznym. Zamiast tego nematocysty są strukturami, które utrzymują klasę Venom4,5. Inne typy komórek, zwane komórkami gruczołów naskórka, również wydzielają toksyny i są również rozmieszczone w całym ciele ukwiałów6.

Pierwszym i najważniejszym wyzwaniem w uzyskaniu jadu jest wytworzenie ekstraktu z wystarczającą manipulacją w kolejnych procesach, bez inaktywacji lub degradacji labilnych białek. Następnie komórki muszą zostać poddane lizie, a składniki - w tym przypadku polipeptydy muszą być skutecznie i szybko wyekstrahowane, unikając proteolizy i hydrolizy, jednocześnie eliminując inne składniki komórkowe7.

Różne metody są używane do uzyskania surowego ekstraktu z ukwiału; niektóre polegają na poświęceniu organizmu, podczas gdy inne pozwalają na utrzymanie go przy życiu. Metody, które zakładają użycie całego organizmu organizmu, pozwalają na uwolnienie większości toksyn z venom8, w porównaniu z metodami utrzymującymi organizmy przy życiu, które ekstrahują tylko niektóre składniki venom9. Przygotowanie ekstraktu wymaga oceny obecności i siły działania substancji będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą specjalnego testu biologicznego, który obejmuje strategie obserwacji efektów farmakologicznych metodami in vivo lub in vitro10.

Jad ukwiału zawiera cytolityczne polipeptydy, toksyny tworzące pory (PFT)11, oraz fosfolipazy12; te cząsteczki są modelami w badaniach interakcji białko-lipid, narzędziami molekularnymi w terapii nowotworów oraz biosensorami opartymi na nanoporach3. Klasyfikację ukwiałów przeprowadza się według ich wielkości lub masy cząsteczkowej, od 5 kDa do 80 kDa. PFT o masie 20 kDa, najczęściej badane i znane jako aktynoporyny11, jest szczególnie interesujący ze względu na swój potencjał biomedyczny w rozwoju narzędzi molekularnych do możliwych zastosowań jako biosensory przeciwnowotworowe, przeciwdrobnoustrojowe i oparte na nanoporach. Inna cytolizyna, w tym fosfolipazy, a konkretnie fosfolipaza A2 (PLA2)13, uwalnia należny kwas tłuszczowy i hydrolizuje fosfolipidy, destabilizując błonę komórkową. Ze względu na ten mechanizm działania, PLA2 zapowiada się na niezbędny model do badań i zastosowań w chorobach zapalnych. Może służyć jako model do badań zachowania lipidów w błonie komórkowej14.

Tutaj opisujemy skuteczny protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z ukwiału Anthopleura dowii Verrill, 1869, oraz wykrywania hemolizyn i fosfolipaz. Obie są istotnymi toksynami, które można wykorzystać jako szablon do projektowania nowych narzędzi molekularnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukwiały zostały zebrane zgodnie z wytycznymi Narodowej Komisji ds. Akwakultury, Rybołówstwa i Żywności Rządu Federalnego Meksyku (numer zezwolenia PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Komisja Bioetyczna Instytutu Biotechnologii Narodowego Uniwersytetu Autonomicznego Meksyku zatwierdziła wszystkie eksperymenty z ukwiałami. Próbka krwi owcy została zakupiona w Centrum Praktycznego Nauczania i Badań nad Produkcją i Zdrowiem Zwierząt (CEPIPSA, Narodowy Uniwersytet Autonomiczny Meksyku).

1. Kolekcja organizmów

  1. Zbierz ukwiał A. dowii.
    UWAGA: Tutaj organizmy zostały zebrane podczas okresów odpływu w strefie międzypływowej u wybrzeży Ensenada Baja w Kalifornii, Meksyk (Rysunek 1A,B).
  2. Organizmy należy przetransportować do laboratorium w pojemnikach z wodą morską (Rysunek 1C).
  3. W laboratorium należy ręcznie oczyścić organizmy wodą destylowaną, aby usunąć duże cząsteczki substratu przylegające do ciała.
  4. Organizmy należy natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C w ultrazamrażarce przez 72 godziny.
  5. Umieść organizmy w specjalnych szklankach do liofilizacji, w warunkach liofilizacji -20 °C, 0,015 psi, przez 48 godzin.
  6. Organizmy liofilizowane przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

2. Nawodnienie tkanek

  1. Rozpuścić 20 g suchej masy organizmów liofilizowanych w 60 ml (1/3 w/v) 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,5 i 1 tabletce koktajlu inhibitorów (tabela materiałów).
  2. W mieszadle magnetycznym ciągle mieszać próbkę z prędkością ~800 obr./min, 4 °C, przez 12 godzin.

3. Uwalnianie toksyn

  1. Aby wywołać lizę komórek i wydzielanie nematocyst, należy zamrozić próbkę w temperaturze -20 °C przez 12 godzin, a następnie umieścić pojemnik w wodzie o temperaturze pokojowej (RT), aż rozmrozi się do 90%. Powtórz tę procedurę trzy razy.
    UWAGA: Próbka nie rozmraża się w 100%; bardzo ważne jest utrzymanie próbki w temperaturze ~4 °C, aby zapobiec degradacji białek.
  2. Obserwuj nematocystę wydzieloną pod mikroskopem konfokalnym. Pobrać 10 μl próbki na szkiełko podstawowe i nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe. Obserwuj pod mikroskopem konfokalnym przy powiększeniu 100x i 60x. Tutaj barwnik nie był potrzebny.
  3. Przetwarzaj obrazy zarejestrowane w mikroskopie konfokalnym w oprogramowaniu ImageJ (wersja 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).
  4. Jeśli kanalik wewnątrz nematocysty rozwija się i znajduje się na zewnątrz, nematocysty są rozładowywane; następnie przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie przeprowadź jeszcze tylko jeden cykl zamrażania i rozmrażania.
  5. W celu sklarowania ekstraktu odwirować próbkę o masie 25 400 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C, odzyskać supernatant i ponownie go odwirować. Powtórz ten krok 3-4 razy.
  6. Odzyskać supernatant i wyrzucić osad. Supernatant lub surowy ekstrakt zawiera składniki jadu (toksyny) i inne cząsteczki komórkowe, takie jak lipidy, węglowodany i kwasy nukleinowe.

4. Kwantyfikacja białka ogółem

  1. Określ stężenie białka w surowym ekstrakcie za pomocą komercyjnego testu kolorymetrycznego Bradforda15 zestaw (tabela materiałów).
  2. Rozcieńczyć odczynnik barwnikowy (jedną część barwnika czterema częściami wody destylowanej).
  3. Przygotować roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) frakcji V (tabela materiałów) o stężeniu 1 mg/ml w buforze fosforanowym (50 mM fosforanu sodu, pH 7,5).
  4. Przygotować roztwory wymienione w Tabeli 1 w trzech egzemplarzach.
  5. Energicznie mieszaj każdy roztwór w shakerze przez 4 sekundy.
  6. Próbki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, bez wstrząsania.
  7. Zmierzyć absorbancję (AU) przy 595 nm.
  8. Wykreślić średnie absorbancji BSA próbki (AU w funkcji stężenia białka) i wyznaczyć równanie wykresu (równanie 1).
    figure-protocol-1 Równanie 1
    gdzie y jest absorbancją, m jest nachyleniem linii, x jest stężeniem białka, a b jest punktem przecięcia z osią y. Aby obliczyć stężenie ekstraktu surowego, oblicz x w następujący sposób:
    figure-protocol-2 Równanie 2

5. Określ złożoność jadu polipeptydowego

  1. Zmontuj szklany pojemnik do pionowej elektroforezy żelowej zgodnie z instrukcją.
  2. Przygotuj mieszaninę akryloamidu (30%): 29,2 g akrylamidu, 0,8 g bis-akrylamidu, końcowa objętość 100 ml. Przefiltrować roztwór za pomocą membrany 0,45 μm. Roztwór należy przechowywać w ciemnej butelce w temperaturze 4 °C. Następnie przygotuj mieszaninę na żel rozdzielczy (Tabela 2).
  3. Żel SDS-PAGE składa się z żelu rozdzielczego i żelu do układania w stosy. Przygotować żele zgodnie z objętościami roztworu określonymi w Tabeli 2. Podczas przygotowywania należy upewnić się, że każda mieszanina jest utrzymywana w temperaturze 4 °C, aby skrócić czas polimeryzacji.
    UWAGA: Objętość każdej mieszanki różni się w zależności od marki używanego sprzętu; dla tego protokołu objętości odpowiadają przygotowaniu 15% żelu akrylowego o grubości 0,75 mm do pionowej komory elektroforetycznej (tabela materiałów).
  4. Po polimeryzacji akrylamidu, ~10 min, dodać mieszaninę żelu do układania.
  5. Przygotuj mieszaninę na żel do układania w stosy, natychmiast dodaj ją do szklanych płytek i umieść grzebień, aby uformować dołki do ładowania próbek.
  6. Po polimeryzacji żelu do układania w stosy (~15 min) wyjmij grzebień i umieść szklany pojemnik w komorze do elektroforezy pionowej.
  7. Umieścić 200 ml buforu elektrod (0,25 M Tris, 0,192 M glicyny, 0,1% SDS) w komorze elektroforezy.
  8. Analiza surowego ekstraktu: Wymieszaj 30 μg surowego ekstraktu z 5 μl buforu ładującego białko (25% glicerolu, 15% dodecylosiarczanu sodu, 25% 2-merkaptoetanolu, 0,125 mM Tris pH 7, błękit bromofenolowy 0,1 mg / ml) w celu denaturacji białek. Ostateczna objętość musi wynosić <50 μl.
  9. Podgrzewać w temperaturze 90 °C przez 5 minut, schłodzić i odwirowywać przez 3 sekundy przy 1 400 x g.
  10. Załadować próbki do dołków żelu do układania w stosy. Załaduj standardową drabinę o masie cząsteczkowej.
  11. Uruchomić elektroforezę przy stałym natężeniu 25 mA przez 1 godzinę 30 min.
  12. Wyjmij szklane pojemniki z komory elektroforetycznej, aby przystąpić do barwienia białek żelu.

6. Barwienie białek

  1. Wypłucz żel w 50 ml wody destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z elektrody buforowej.
  2. Wylej wodę.
  3. Aby uniknąć dyfuzji białek żelu, dodać roztwór utrwalający (60 ml etanolu, 20 ml kwasu octowego i 20 ml wody destylowanej, końcowa objętość 100 ml). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut z wytrząsaniem przy 80 obr./min. Zdekantować roztwór.
  4. Dodać białkowy roztwór sieciujący (15 ml etanolu, 0,25 ml aldehydu glutarowego, 50 ml wody destylowanej, końcowa objętość 65,25 ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 80 obr./min. Usuń roztwór.
  5. Umyj żel 100 ml wody destylowanej przez 5 minut i usuń wodę. Powtórz tę procedurę cztery razy.
  6. Przeprowadzić barwienie białek 50 ml przefiltrowanego roztworu Coomassie blue R-250 (40% metanolu, 10% kwasu octowego, 50% wody destylowanej, 0,1% barwnika, objętość końcowa 100 ml), mieszając z prędkością 60 obr./min w laboratoryjnym oscylatorze obrotowym w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  7. Odzyskaj roztwór, który można użyć do barwienia innych żeli.
  8. Aby usunąć nadmiar barwnika, dodaj roztwór odbarwiający (40 ml metanolu, 10 ml kwasu octowego, 50 ml wody destylowanej). Mieszaj (80 obr./min) przy temperaturze obrotowej, aż prążki (barwione białka) zaczną się uwidaczniać.
  9. Przechowuj żel w 50 ml wody destylowanej i zeskanuj obraz w systemie dokumentacji żelu.

7. Przygotuj roztwór czerwonych krwinek

  1. Wyciągnij 1 ml krwi z żyły szyjnej owcy.
  2. Wyjąć igłę ze strzykawki i natychmiast odcedzić krew do probówki z 50 ml roztworu Alsever (0,002 M kwas cytrynowy, 0,07 M NaCl, 0,1 M dekstroza i 0,027 M cytrynian sodu jako antykoagulant, pH 7,4).
  3. Powoli odwróć roztwór trzy razy.
  4. Przechowywać w temperaturze 4 °C do przeniesienia do laboratorium.
  5. Wirować przy 804 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  6. Zawiesić osad w 30 ml roztworu Alsever. Dodaj roztwór, przesuwając go wzdłuż wewnętrznych ścianek probówki i za pomocą plastikowej pipety Pasteura powoli ponownie zawiesić komórki. Ponownie odwirować przy 804 x g przez 5 minut, 4 °C. Powtarzać tę procedurę aż do sklarowania sklarowanego sklarowania.
  7. Dodać 15 ml roztworu Alsever; zawiesić osad powoli za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
  8. Utrzymać końcową objętość roztworu Alsever, aby osiągnąć stężenie około 2 x 106 komórek/ml. Następnie użyj komory Neubauera lub hemocytometru, aby policzyć komórki.
    UWAGA: Policz erytrocyty na szkiełku hemacytometrycznym (Ulepszony Neubauer). Prowadnica jest prowadnicą o wymiarach 30 mm x 70 mm x 4 mm. W środku znajdują się dwa srebrne podnóżki (Rysunek 2A) (jedna górna i jedna dolna siatka), każda o wymiarach 3 mm x 3 mm, oraz dwa kanały po bokach siatki. Liczenie komórek znajduje się w rogach i środkowych kwadratach (czerwone kwadraty w Rysunek 2B). Optymalna koncentracja komórek do liczenia powinna być rzędu 106 komórek. Centralne pudełko ma powierzchnię 0,1cm2, co odpowiada 0,0001 ml.
  9. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku.
  10. Umieścić 10 μl próbki między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym i poczekać, aż próbka zostanie rozsączona.
  11. W mikroskopie optycznym (powiększenie 60x) wykonaj liczenie w pierwszym kwadratowym polu. Policz tylko komórki w środkowej siatce oraz te, które dotykają górnego lub lewego marginesu pola.
  12. Określ stężenie komórek za pomocą następującego równania:
    figure-protocol-3 Równanie 3
    Jeżeli próbka jest bardzo skoncentrowana i wymagane jest rozcieńczenie, należy zastosować następujące równanie:
    figure-protocol-4 Równanie 4
    UWAGA: Przyjmując roztwór erytrocytów do testu hemolizy, powoli homogenizuj roztwór za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
  13. Wykonaj kroki w trzech egzemplarzach, aby zmniejszyć liczbę błędów.

8. Test hemolizy

  1. Przygotować mieszaniny roztworów (w trzech powtórzeniach) wskazane w tabeli 3 na stożkowych płytkach 96-dołkowych.
    UWAGA: Mieszaj erytrocyty powoli, aby utrzymać jednorodną zawiesinę.
  2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, bez wstrząsania.
  3. Odwirować płytkę o sile 804 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odzyskać supernatant na innej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
  5. Jeśli surowy ekstrakt zawiera cytolizyny, erytrocyty ulegną lizie i uwolnią hemoglobinę. Odczytać absorbancję przy 415 nm.
  6. Oblicz procent hemolizy, używając następującego równania:
    % hemolizy = ((Ekstrakt surowy-bufor AAlsever) / (AH2O-AAlsever)) x 100
    UWAGA: Ekstrakt surowy, bufor AAlsever i AH2O odpowiadają odpowiednio absorbancji erytrocytów z ekstraktem surowym, absorbancji roztworu Alsever i absorbancji wody destylowanej.
  7. Przeprowadzić test hemolizy przed i po każdym cyklu zamrażania i rozmrażania z 50 μg białka całkowitego z surowego ekstraktu.
  8. Określ liczbę cykli zamrażania i rozmrażania wymaganych do osiągnięcia 100% aktywności hemolitycznej.
  9. Oblicz ilość ekstraktu, która powoduje hemolizę w 50% erytrocytów (HU50); postępuj zgodnie z tym samym protokołem opisanym w Tabeli 3, zwiększ ilość surowego ekstraktu z ukwiałów morskich i zaprojektuj wykres z korektami sigmoidalnymi za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. Pochodzenie, Tabela materiałów).

9. Test fosfolipazy

  1. Umyj jedno jajo kurze z 1% SDS w wodzie destylowanej.
  2. Oddziel żółtko od białka w sterylnych warunkach.
  3. Przygotuj 50 ml 0,86% roztworu NaCl i przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Następnie przygotuj roztwór A: Dodaj 12 ml żółtka jaja i 36 ml 0,86% roztworu NaCl.
  4. Przygotuj roztwór B: Wymieszaj 300 mg agarozy w 50 ml buforu (50 mM Tris, pH 7,5), przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej do wrzenia. Schłodzić w ciepłej wodzie do temperatury 43-45°C.
  5. Przygotuj roztwór C: Przygotuj 10 mM CaCl2 i przefiltruj go filtrem 0,22 μm.
  6. Przygotuj roztwór D: 10 mg rodaminy 6G w 1 ml wody destylowanej.
  7. W sterylnych warunkach (okap z przepływem laminarnym) dodać 500 μl roztworów A i C do roztworu B i 100 μl roztworu D, wymieszać i wlać 25 ml do każdej szalki Petriego (90 x 15 mm).
  8. Poczekaj, aż roztwór stężeje w sterylnych warunkach (30 min).
  9. Wykonaj studzienki (o średnicy ~2-3 mm) za pomocą cienkiej rurki.
  10. Dodać łącznie 20 μl buforu fosforanowego (kontrola ujemna) do jednego dołka i 20 μl oznaczonej fosfolipazy (kontrola dodatnia) do drugiego studzienki.
  11. Umieścić różne ilości surowego białka ekstraktu, 5, 15, 25, 35, 45 μg, w pozostałych studzienkach, każdy w końcowej objętości 20 μl.
  12. Poczekaj, aż agar zaadsorbuje wszystkie próbki (30 min).
  13. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 godzin.
  14. Jeśli wokół studni tworzy się halo, oznacza to aktywność fosfolipazy. Zmierz aureolę utworzoną suwmiarką z noniuszem.
    UWAGA: Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach (kroki od 9.1 do 9.14).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki protokołu użytego do uzyskania surowego ekstraktu z ukwiału pokazały, że połączenie dwóch technik (mieszanie oraz cykle zamrażania i rozmrażania) spowodowało skuteczne uwalnianie nematocyst, a całkowita ilość białka wynosiła 500 mg (8 mg/mL) (Rysunek 3).

Złożoność białka surowego ekstraktu można było zaobserwować od 10 kDa do ponad 250 kDa za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Ponadto cytolizyny wykryto w strefie masy cząsteczkowej 15 kDa i 20 kDa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duże zapotrzebowanie na nowe związki mające zastosowanie w różnych dziedzinach nauki i przemysłu doprowadziło do badań nad jadem. Jad stanowi bogate źródło cząsteczek, które służy jako matryca do generowania nowych narzędzi molekularnych. Jednak złożoność tych jadów wymaga wdrożenia i połączenia różnych metod ich pozyskiwania i badania.

Tutaj pokazujemy metodę pozyskiwania i analizy jadu ukwiałów Anthopleura dowii, Verrill 1869, którą można wykorzystać do zbadania jadu innych gatunków...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu w związku z publikacją niniejszego artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), z numerem grantu IT200819. Autorzy dziękują Tomowi Musselmanowi, Rock Paper Editing, LLC, za sprawdzenie angielskiej gramatyki tego manuskryptu; oraz pomoc techniczna ze strony Samanty Jiménez (CICESE, Ensenada) i Juana Manuela Barbosy Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Dziękujemy również dr Augusto Césarowi Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) za pozyskanie krwi owczej. Szczególne podziękowania kierujemy do dr José Sanigera Blesa z ICAT-UNAM za udostępnienie w jego laboratorium materiałów do nagrania wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowa probówka wirówkowa 15 mlCorning430766
2-bromofenol niebieskiSigmaB75808
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250-100ML
50 ml stożkowe probówki wirówkoweCorning430828
Kwas octowy LacjatowyJ.T. Baker9515-03
AkrylamidPromegaV3115
AgarozaPromegaV3125
BizakryloamidPromegaV3143
Frakcja albuminy w surowicy bydlęcej VSigmaA3059-100G
Testy białek BradfordBio-Rad5000006
Chlorek wapniaSigma-AldrichC3306
Płytki do hodowli komórkowych 96 dołków, V-dolnaCorning3894
WirówkaEppendorf5804R
Probówki wirówkoweCorningCLS430829
ChemiDoc MP systemBio-Rad1708280
Kwas cytrynowySigma-Aldrich251275
Przezroczyste płaskie płytki 96-dołkowe z płaskim dnemThermo Scientific3855
Coomassie Brilliant Blue G-250Bio-Rad#1610406
Coomassie brilliant blue R-250Bio-Rad1610400
DextroseJ.T. Baker1916-01
Obudowa bezkanałowaLabconcoVerticalhttps://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZBio Rad.System dokumentacji żelu
Hemocytometr GlycerolSigma-AldrichG5516-4L
Marienfeld650030
ImageJ (oprogramowanie)NIH, USAWersja 1.53c
Inkubator 211LabnetI5211 DS
MetanolJ.T. Baker9049-03
Komórka tetraMini-PROTEANBio-Rad1658000EDU
Na2HPO4J.T. Baker3824-01
NaClJ.T. Baker3624-01
NaH2PO4. H2OJ.T. Baker3818-05
Oprogramowaniew wersji 9Do projektowania działki z korektami sigmoidalnymi
PetridishFalcon351007
PipetmanGilsonF167380
Prefabrykowany mini żelBioRad1658004
Prestained Protein LadderThermo Scientific26620
Koktajl inhibitorów proteazyRoche11836153001
Test białka Koncentrat odczynnika barwnikaBio-Rad5000006
Rodamina 6GSigma-Aldrich252433
SDSSigma-AldrichL4509
Cytrynian sodu dwuwodnyJT Baker3646-01
SpektrofotometrTHERMO SCIENTIFICG10S UV-VIS
Tris BaseSigma-Aldrich77-86-1
Volt ZasilaczHoeferPS300B
Origin Zestaw

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
  2. Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
  3. Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539(2020).
  4. Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
  5. Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), New York, N.Y. 329-339 (2013).
  6. Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
  7. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
  8. Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897(2016).
  9. Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
  10. Hader, D., Erzinger, G. Bioassays: Advanced Methods and Applications. , Elsevier Science. (2017).
  11. Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
  12. Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
  13. Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
  14. Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663(2015).
  17. Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
  18. Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
  19. Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
  20. de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
  21. Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
  22. Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
  23. Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
  24. Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418(2019).
  25. Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
  26. Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Jad ukwia uaktywno hemolitycznaprzygotowanie ekstraktu surowegodetekcja cytolizynelektroforeza SDS PAGEwyrzut nematocystkwantyfikacja bia ektest hemolizybioanaliza na po ywce agarowej

Powiązane artykuły