Protokół tutaj opisuje pomiar organizacji przestrzennej osi wzrokowych oczu muchy domowej, odwzorowany przez automatyczne urządzenie, wykorzystujący zjawisko pseudoźrenicy i mechanizm źrenicy komórek fotoreceptorowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Automatyczne tworzenie wykresów przestrzeni wizualnej złożonych oczu muchy domowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten artykuł opisuje automatyczny pomiar przestrzennej organizacji osi wizualnych oczu złożonych owadów, które składają się z kilku tysięcy jednostek wizualnych zwanych ommatidia. Każde ommatidium próbkuje informację optyczną z małego kąta bryłowego, z przybliżoną czułością o rozkładzie Gaussa (połowa szerokości rzędu 1°) wyśrodkowaną wokół osi widzenia. Razem ommatidia zbierają informacje wizualne z niemal panoramicznego pola widzenia. Rozkład przestrzenny osi widzenia determinuje zatem rozdzielczość przestrzenną oka. Wiedza na temat organizacji optycznej oka złożonego i jego ostrości widzenia jest kluczowa dla ilościowych badań neuronalnego przetwarzania informacji wizualnej. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną procedurę mapowania osi widzenia oka złożonego, wykorzystującą wewnętrzne zjawisko optyczne in vivo, pseudoźrenicę i mechanizm źrenicy komórek fotoreceptorowych. Przedstawiamy konfigurację optomechaniczną do skanowania oczu owadów i wykorzystujemy wyniki eksperymentalne uzyskane od muchy domowej, Musca domestica, aby zilustrować etapy procedury pomiarowej.
Wprowadzenie
Kompaktowość systemów wizualnych owadów i zwinność ich właścicieli, demonstrująca wysoce rozwinięte przetwarzanie informacji wizualnych, zaintrygowały ludzi zarówno ze środowisk naukowych, jak i nienaukowych. Oczy złożone z owadów zostały uznane za potężne urządzenia optyczne zapewniające ostre i wszechstronne zdolności widzenia1,2. Muchy, na przykład, są dobrze znane ze swoich szybkich reakcji na poruszające się obiekty, a pszczoły są znane z posiadania widzenia kolorów i polaryzacji widzenia2.
Złożone oczy stawonogów składają się z wielu anatomicznie podobnych jednostek, ommatidia, z których każda jest zwieńczona soczewką fasetową. U muchówek (muchówek) zespół soczewek fasetowych, znanych zbiorczo jako rogówka, często zbliża się do półkuli. Każda próbka ommatidium pada na światło padające z małego kąta bryłowego o połowie szerokości rzędu 1°. Ommatidia dwojga oczu razem próbkują w przybliżeniu pełny kąt bryłowy, ale osie wzrokowe ommatidii nie są równomiernie rozłożone. Niektóre okolice oczu mają duże zagęszczenie osi widzenia, co tworzy obszar o wysokiej ostrości przestrzennej, potocznie nazywany dołkiem centralnym. Pozostała część oka ma wtedy bardziej zgrubną rozdzielczość przestrzenną3,4,5,6,7,8,9.
Ilościowa analiza organizacji optycznej oczu złożonych jest kluczowa dla szczegółowych badań nad neuronalnym przetwarzaniem informacji wizualnych. Badania sieci neuronowych mózgu owadów10 często wymagają wiedzy na temat przestrzennego rozkładu osi ommatidiału. Co więcej, oczy złożone zainspirowały kilka innowacji technicznych. Wiele inicjatyw mających na celu wytworzenie sztucznych oczu inspirowanych biologicznie powstało w oparciu o istniejące badania ilościowe prawdziwych oczu złożonych11,12,13. Na przykład czujnik oparty na półprzewodnikach o wysokiej rozdzielczości przestrzennej został zaprojektowany w oparciu o model oczu złożonych z owadów11,14,15,16,17. Jednak opracowane do tej pory urządzenia nie realizowały rzeczywistych cech istniejących oczu owadów. Dokładne odwzorowanie złożonych oczu owadów i ich organizacja przestrzenna będą wymagały szczegółowych i wiarygodnych danych z naturalnych oczu, które nie są szeroko dostępne.
Głównym powodem niedostatku danych jest ekstremalna uciążliwość dostępnych procedur do tworzenia wykresów cech przestrzennych oczu. Zmotywowało to do podjęcia prób ustanowienia bardziej zautomatyzowanej procedury mapowania oczu. W pierwszej próbie zautomatyzowanych analiz oczu złożonych owadów, Douglass i Wehling18 opracowali procedurę skanowania do mapowania rozmiarów fasetek w rogówce i zademonstrowali jej wykonalność dla kilku gatunków much. Tutaj rozszerzamy ich podejście, opracowując metody nie tylko skanowania fasetek rogówki, ale także oceny osi wzrokowych ommatidia, do których należą fasetki. Przedstawiamy przypadek oczu muchy domowej, aby zilustrować zastosowane procedury.
Eksperymentalna konfiguracja do skanowania oczu owadów to: częściowo optyczna, tj. mikroskop z kamerą i optyką oświetleniową; częściowo mechaniczna, tj. system goniometryczny do obracania badanego owada; i częściowo obliczeniowa, tj. wykorzystanie sterowników oprogramowania dla przyrządów i programów do wykonywania pomiarów i analiz. Opracowane metody obejmują szereg procedur obliczeniowych, od przechwytywania obrazów, wyboru kanałów kamery i ustawiania progów przetwarzania obrazu, po rozpoznawanie poszczególnych lokalizacji fasetek na podstawie jasnych punktów światła odbitego od ich wypukłych powierzchni. Metody transformaty Fouriera były kluczowe w analizie obrazu, zarówno do wykrywania pojedynczych faset, jak i do analizy wzorców fasetowych.
Struktura artykułu jest następująca. Najpierw wprowadzamy konfigurację eksperymentalną i zjawisko pseudoźrenicy - marker optyczny używany do identyfikacji osi wzrokowych fotoreceptorów w żywych oczach19,20,21. Następnie przedstawiono algorytmy wykorzystywane w procedurze skanowania i analizie obrazu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół jest zgodny z wytycznymi Uniwersytetu dotyczącymi pielęgnacji owadów.
1. Przygotowanie muchy domowej, Musca domestica
- Zbierz muchę z populacji hodowanej w laboratorium. Umieść muchę w mosiężnym uchwycie (Rysunek 1).
- Wyciąć 6 mm od górnej części rurki mocującej (patrz tabela materiałów). Nowa górna część rurki ma średnicę zewnętrzną 4 mm i średnicę wewnętrzną 2,5 mm (Rysunek 1A). Umieść żywą muchę w tubie, uszczelnij rurkę bawełnianą powłoką, aby zapobiec uszkodzeniu muchy, i popchnij muchę tak, aby głowa wystawała z tuby, a jej ciało było skrępowane (Rysunek 1B). Unieruchomić głowę woskiem pszczelim tak, aby oczy pozostały odsłonięte (Rysunek 1C-E).
- Ponownie przeciąć rurkę tak, aby długość rurki wynosiła 10 mm (Rysunek 1C). Umieść plastikową rurkę z muchą w mosiężnym uchwycie tak, aby jedno oko muchy było skierowane do góry, gdy uchwyt spoczywa na blacie stołu (Rysunek 1D, E).
- Dostosuj orientację rurki w taki sposób, aby przy wzniesieniu goniometru pod kątem 0° (tj. stopień azymutalny znajdował się w pozycji poziomej), pionowa wiązka oświetlenia mikroskopu była prostopadła do powierzchni oka w obszarze centralnym, między brzuszną a grzbietową oraz między przednią i tylną krawędzią oka, tak aby całe oko mogło być skanowane w zakresie azymutu i wysokości dozwolonym przez ustawienie.
2. Wyrównanie osi azymutu obrotu goniometru z osią optyczną mikroskopu
- Zamontuj kołek wyrównujący na stoliku obrotu azymutu, aby można było wyregulować położenie x-y końcówki tak, aby pokrywało się z osią azymutu na zmotoryzowanym stopniu. Podczas oglądania za pomocą mikroskopu, wyposażonego w obiektyw 5x, ustaw ostrość na końcówce za pomocą joysticka osi z (Rysunek 2).
- Za pomocą joysticków osi x i y wyrównaj regulację x-y osi azymutu z osią optyczną mikroskopu i upewnij się, że osie obrotowe elewacji i azymutu są wstępnie wyrównane z wyśrodkowanym kołkiem.
- Manipuluj joystickami azymutu i elewacji, aby sprawdzić, czy sworzeń jest wyśrodkowany względem obu stopni swobody. Gdy jest dobrze wyśrodkowana, końcówka sworznia pozostaje w przybliżeniu w tej samej pozycji podczas rotacji azymutu i elewacji.
3. Wyrównanie oka muchy z stopniami zmotoryzowanymi
- Przy stopniu elewacji ustawionym pod kątem 0° zamontuj muchę i jej uchwyt na stopniu azymutalnym. Obserwuj oko muchy pod mikroskopem.
- Przy włączonej diodzie LED oświetlenia wyreguluj poziome położenie muchy tak, aby środek pseudoźrenicy był wyrównany z mikroskopem. Dostosuj pionową pozycję muchy za pomocą obracającej się uchwytu (Rysunek 1D), tak aby głęboka pseudoźrenica (DPP; Rysunek 3)19,20,21 jest ustawiany na poziomie osi wysokości.
- Wyrównaj DPP względem osi azymutu i elewacji, wyśrodkowując go w polu widzenia (patrz Rysunek 2). Użyj magnesów przyklejonych do dolnej części uchwytu na muchy, aby mocno przymocować go do żelaznej płyty zamontowanej na stoliku azymutalnym, umożliwiając jednocześnie ręczną regulację przesuwu.
- Przełącz view na kamerę cyfrową zamontowaną przy mikroskopie. Uruchom inicjalizację oprogramowania systemu GRACE, która obejmuje inicjalizację sterowników silników i kontrolera LED Arduino (Rysunek 4). Dlatego otwórz MATLAB R2020a lub nowszą wersję. Uruchom skrypt MATLAB Initialize_All_Systems (Plik uzupełniający 1).
- Sprawdź, czy pseudoźrenica muchy (Rysunek 3B,C) znajduje się w centrum obrazu wyświetlanego na ekranie komputera.
4. Automatyczne ustawianie ostrości i automatyczne centrowanie
- Skieruj ostrość na poziom pseudoźrenicy rogówki (CPP; Rysunek 3B)19,20,21 ręcznie za pomocą joysticka osi z.
- Uruchom algorytm automatycznego ustawiania ostrości (plik uzupełniający 1, skryptowy AF), aby uzyskać ostry obraz na poziomie rogówki. Sprawdź, przywracając ostrość do poziomu DPP, dostosowując zmotoryzowany stolik osi z. Przechowuj odległość między DPP a CPP (w krokach silnika).
- Dostosuj wyśrodkowanie pseudoźrenicy, uruchamiając algorytm automatycznego centrowania (plik uzupełniający 1, skrypt AC). Przenieś fokus z powrotem na poziom CPP.
- Uruchom ponownie algorytm autofokusa. Wyzeruj stopnie zmotoryzowane w ich bieżących pozycjach (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), gdzie E to wysokość, a A to azymut.
- Uruchom algorytm skanowania (plik uzupełniający 1, skrypt Scan_Begin), który próbkuje obrazy oczu wzdłuż trajektorii w krokach co 5°, wykonując jednocześnie algorytmy automatycznego centrowania i automatycznego ustawiania ostrości.
- Po zakończeniu pobierania próbek wyłącz sterownik LED i sterowniki silników.
- Przetwarzaj obrazy, stosując algorytmy przetwarzania obrazu (plik uzupełniający 1, skrypt ImProcFacets).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zwierzęta i stymulacja optyczna
Eksperymenty przeprowadzono na muszkach domowych (Musca domestica) pochodzących z hodowli utrzymywanej przez Katedrę Genetyki Ewolucyjnej na Uniwersytecie w Groningen. Przed pomiarami muchę unieruchamia się, przyklejając ją woskiem o niskiej temperaturze topnienia w dopasowanej probówce. Następnie muchę montuje się na stole zmotoryzowanego goniometru. Środki dwóch stołów obrotowych pokrywają się z punktem ogniskowym układu mikroskopowego24<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rozkład przestrzenny osi wzrokowych oczu muchy domowej można narysować za pomocą zjawiska pseudoźrenicy oczu złożonych i zmian odbicia spowodowanych mechanizmem źrenicy zależnej od światła. W związku z tym badana mucha jest montowana w systemie goniometrycznym, który umożliwia inspekcję lokalnego wzoru fasetowego za pomocą zestawu mikroskopowego wyposażonego w kamerę cyfrową, a wszystko to pod kontrolą komputera. Analiza obrazu daje mapy oczu. Istotną trudnością, jaką napotykamy, jest to, że bez starannego ustawienia oka...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane finansowo przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych/Europejskie Biuro Badań i Rozwoju Lotnictwa i Kosmonautyki AFOSR/EOARD (grant FA9550-15-1-0068, dla D.G.S.). Dziękujemy dr Primožowi Pirihowi za wiele pomocnych rozmów oraz Kehanowi Satu, Heinowi Leertouwerowi i Oscarowi Rincónowi Cardeño za pomoc.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aparat cyfrowy | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Pozyskiwanie wzmocnionych obrazów i cyfrowa komunikacja z komputerem PC |
| Gwiazda dużej mocy LED | Velleman | LH3WW | Źródło światła do obserwacji i obrazowania oka złożonego |
| Uchwyt do badanej muchy | Uniwersytet w Groningen | Różne konstrukcje zostały wyprodukowane przez warsztat uniwersytecki | |
| Silnik | liniowyELERO | ELERO Junior 1, wersja C | Uruchamia górny mikroskop w górę i w dół. (Obciążenie 300N, Prędkość skoku 15mm/s, prąd znamionowy 1.2A) |
| Wosk topliwy w niskiej temperaturze | różne | Wosk o niskiej temperaturze topnienia służy do unieruchomienia muchy i przymocowania jej do uchwytu | |
| Mikroskop | Zeiss | Każda alternatywna marka mikroskopów będzie odpowiednia; preferowanym celem jest 5x | |
| Kontroler silnika i diod LED | Uniwersytet w Groningen | Z-o1 | Zaprojektowany i zbudowany przez Uniwersytet w Groningen i oparty na technologiach Arduino i Adafruit. |
| Zmotoryzowana scena | Standa (Wilno, Litwa) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | 6-osiowy zmotoryzowany stolik zmodyfikowany tak, aby miał 5 stopni swobody. |
| Elementy optyczne | LINUS | Kilka schematów i soczewek tworzących system epi-illuminacji (patrz Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| Komputer z systemem MATLAB | University of Groningen | Komputer jest w stanie przetwarzać obrazy z kamery PointGrey, kontrolować intensywność diody LED i wysyłać komunikaty sterujące do sterowników silnikowych systemu | |
| Zasilanie (36V, 3.34A) | Standa (Wilno, Litwa) | PUP120-17 | Dedykowany zasilacz do sterowników silników STANDA |
| Lutownica | różne | Służy do topienia wosku | |
| Sterownik silnika krokowego i stałego | Standa (Wilno, Litwa) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedykowane sterowniki do stopnia zmotoryzowanego STANDA zdolne do komunikacji z MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μ L | KOŃCÓWKI DO PIPET FINNPIPETTE, 400/PUDEŁKO. Służy do powstrzymywania muchy |
| Narzędzie do kształtowania / wypalania gwintów | pióra | rzeźbienia Max Wax Końcówka pióra do rzeźbienia jest przeznaczona do przenoszenia wosku do głowy muchy | |
| Język programowania wykorzystywany do implementacji algorytmów |
Bibliografia
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M. Topography of vision and behaviour. The Journal of Experimental Biology. 212, Pt 21 3522-3532 (2009).
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002(2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168(2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782(2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613(2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
