Terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kwasu 5-aminolulinowego na pierwotnym guzie kości i liniach komórkowych z przerzutami do kości

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia krok po kroku metodologiczne podejście do ekspozycji linii komórek przerzutowych kości i pierwotnych guzów kości na terapię fotodynamiczną za pośrednictwem kwasu 5-aminolewulinowego (PDT). Wpływ na potencjał migracji komórek/inwazyjność, żywotność, apoptozę i potencjał starzenia są również analizowane po ekspozycji na PDT.

Streszczenie

Przerzuty do kości są związane ze złym rokowaniem i niską jakością życia dotkniętych nimi pacjentów. Terapia fotodynamiczna (PDT) jawi się jako nieinwazyjna terapia, która może być ukierunkowana na miejscowe przerzutowe zmiany kostne. W pracy przedstawiono metodę in vitro do badania efektu PDT w adherentnych liniach komórkowych. W tym celu demonstrujemy podejście krok po kroku, aby poddać zarówno pierwotne (guz kości olbrzymiokomórkowej), jak i ludzkie linie komórkowe raka z przerzutami do kości (pochodzące z pierwotnego inwazyjnego przewodowego raka piersi i raka nerki) PDT za pośrednictwem kwasu 5-aminolewulinowego (5-ALA).

Po 24 godzinach od naświetlania 5-ALA-PDT (światło niebieskie o długości fali 436 nm), efekt terapeutyczny został oceniony pod względem potencjału migracji komórek, żywotności, cech apoptozy i zatrzymania wzrostu komórek (starzenia). Po napromieniowaniu 5-ALA-PDT linie komórkowe pochodzenia mięśniowo-szkieletowego reagują inaczej na te same dawki i ekspozycję na PDT. W zależności od stopnia uszkodzenia komórek wywołanego ekspozycją na PDT, odnotowano dwa różne losy komórek - apoptozę i starzenie się. Zmienna czułość na terapię PDT w różnych liniach komórkowych raka kości dostarcza przydatnych informacji do wyboru bardziej odpowiednich ustawień PDT w warunkach klinicznych. Protokół ten ma na celu zilustrowanie zastosowania PDT w kontekście linii komórkowych nowotworów układu mięśniowo-szkieletowego. Można go dostosować w celu zbadania terapeutycznego wpływu PDT na różne linie komórek nowotworowych oraz różne fotouczulacze i źródła światła.

Wprowadzenie

Opcje terapeutyczne dla przerzutów do kości są nadal ograniczone i trudne, pomimo ciągłego rozwoju leczenia onkologicznego. Obecnie standardową metodą jest radioterapia, która wiąże się z powikłaniami, takimi jak miejscowy rumień, toksyczność dla narządów wewnętrznych¹, oraz niewystarczające złamania². Istnieje potrzeba alternatywnych terapii przeciwnowotworowych, ponieważ pacjenci z przerzutami do kości często cierpią z powodu bólu, hiperkalcemii i objawów neurologicznych, które skutkują upośledzeniem mobilności i obniżeniem jakości życia³. Ostatnie odkrycia pokazują, że PDT stanowi obiecującą, alternatywną opcję leczenia przeciwnowotworowego bezpośrednio ukierunkowaną na zmiany kostne, która może być stosowana samodzielnie lub wspomagająco w stosunku do radioterapii⁴.

Mechanizm PDT opiera się zasadniczo na transferze energii z wzbudzonego światłem związku światłoczułego (fotosensybilizatora) do tlenu tkankowego. Ten fotosensybilizator działa podobnie do kondensatora na poziomie nanoskopowym. Może magazynować energię w stanie podstawowym, gdy jest naświetlany światłem o odpowiedniej długości fali i uwalnia zmagazynowaną energię, gdy powraca ze stanu wzbudzonego do pierwotnego stanu podstawowego⁵. Uwolniona energia prowadzi do dwóch reakcji fotochemicznych: jedna to przemiana tlenu w reaktywne rodniki tlenowe poprzez przeniesienie wodoru lub elektronu. Drugi to produkcja singletowych cząstek tlenu poprzez poziome przenoszenie energii z podłoża fotosensybilizatora do lokalnych potrójnych cząstek tlenu⁶. Reaktywne rodniki tlenowe i singletowe cząsteczki tlenu mają wysoce cytotoksyczne działanie na lokalne komórki nowotworowe i indukują niedrożność naczyń krwionośnych i miejscową odpowiedź zapalną poprzez apoptozę komórek śródbłonka naczyń krwionośnych nowotworu⁷.

Konwencjonalne fotosensybilizatory są pochodnymi rodziny porfiryn, takimi jak hematoporfiryny i benzoporfiryny⁸. Stosowanie substancji fotouczulających o wyższym powinowactwie do tkanki nowotworowej może zwiększyć selektywność PDT⁹ y. W szczególności 5-ALA, który jest biosyntetycznym prekursorem protoporfiryny IX, może kumulować się w komórkach nowotworowych, takich jak rogowacenie słoneczne, rak podstawnokomórkowy, guz pęcherza moczowego i rak przewodu pokarmowego⁵. Różne podejścia do dostarczania z wykorzystaniem 5-ALA mogą również zmieniać skuteczność PDT w odniesieniu do lokalizacji guza. W ten sposób miejscowe stosowanie 5-ALA z zastosowaniem PDT stało się pierwszą linią terapii dermatologicznej przeciwko rogowaceniu słonecznemu¹⁰. Ostatnie wyniki badań nad przerzutami do kości inwazyjnych linii komórkowych przewodowego raka piersi wskazują na możliwe hamowanie migracji komórek i indukcję apoptozy po ekspozycji na PDT z 5-ALA¹¹. Jednak stosowanie PDT w podpowięziowych tkankach ludzkich, takich jak tkanka kostna, jest nadal w fazie przedklinicznej do eksperymentalnej, ponieważ skuteczność wymaga poprawy. Zastosowania nanocząsteczek w terapii opartej na świetle już teraz wykazują ogromny wpływ na stomatologię¹². W związku z tym prawdopodobne jest, że połączenie zastosowania nanocząstek z PDT poszerzy zakres jego zastosowania w kierunku onkologii ortopedycznej.

Poniższy protokół opisuje, jak przygotować zarówno komórki pochodzące z pierwotnych guzów kości, jak i linii komórkowych z przerzutami do kości i poddać je działaniu PDT za pośrednictwem 5-ALA przez określony czas ekspozycji. Dołączono również szczegółowy opis sposobu wykonywania i oceny potencjału migracji komórkowej, żywotności i starzenia się po napromieniowaniu 5-ALA-PDT. Instrukcje krok po kroku zapewniają proste i zwięzłe podejście do pozyskiwania wiarygodnych i powtarzalnych danych. Omówiono również zalety, ograniczenia i perspektywy na przyszłość podejścia PDT do zmian nowotworowych kości.

Protokół

Zastosowano trzy różne typy linii komórkowych: "MAM" - linia komórkowa pochodząca z przerzutów raka nerkowokomórkowego do kości, "MAC" - przerzuty do kości inwazyjnego raka przewodowego piersi i "17-1012"- gigantyczny guz kostny. Jako grupę kontrolną wykorzystano mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące ze szpiku. Zgoda instytucjonalna i etyczna została uzyskana przed rozpoczęciem badania (numer projektu: 008/2014BO2 – dla linii komórek nowotworowych oraz numer projektu: 401/2013 BO2 dla MSCs).

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Pożywki hodowlane można przygotować wcześniej. Pożywka hodowlana dla MAM i 17-1012 składa się z RPMI uzupełnionego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 2 mM L-glutaminy. Pożywka hodowlana dla MAC i MSC składa się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z substytutem glutaminy (patrz tabela materiałów), 4,5 g/l D-glukozy uzupełnionej 10% (v/v) FBS.

1. Zbieraj i pasuj komórki, aż do osiągnięcia 80% konfluencji.
2. Przemyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odessać PBS z kolby za pomocą pipety.
   UWAGA: Ten etap zapewnia usunięcie resztkowej kompletnej pożywki zawierającej inhibitory proteazy.
3. Dodać 3 ml 0,05% (v/v) trypsyny-EDTA, aby oddzielić przylegające komórki od dna kolby, w której są hodowane.
4. Inkubować kolby przez 5 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂ .
5. Obserwuj oderwanie komórek pod mikroskopem z kontrastem fazowym.
   UWAGA: Czas inkubacji musi być dostosowany do każdego typu komórki. Zapobiegaj ekspozycji komórek na roztwór trypsyny przez dłuższy czas (>10 min).
6. Zatrzymaj trypsynizację, dodając 3 ml pożywki hodowlanej.
   UWAGA: Upewnij się, że dodałeś odpowiednią pożywkę hodowlaną dla każdego typu komórek zawierającego 10% (v/v) FBS.
7. Przenieść oderwane komórki do probówki wirówkowej i odwirowywać je przez 7 minut w temperaturze 350 × g w temperaturze 7 °C.
8. Odrzucić supernatant.
9. Zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki hodowlanej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru, jak opisano wcześniej¹³.

2. Konfiguracja i ekspozycja PDT

1. Przygotuj urządzenie PDT (patrz tabela materiałów), podłączając wszystkie i akcesoria.
2. Przyciemnij światło w pomieszczeniu, aby uniknąć niepotrzebnego rozpraszania światła.
3. Ustaw i ustabilizuj lekkie włókno za pomocą taśmy klejącej bezpośrednio na płycie studzienki.
   UWAGA: Pożądany jest równomierny rozkład światłowodów na górze studzienek, aby zapewnić, że wszystkie komórki są napromieniowane i otrzymują taką samą ilość energii (Rysunek 1).
4. Upewnij się, że nie zginasz mocno ani nie uszkadzasz światłowodu, ponieważ może to prowadzić do zmniejszenia natężenia światła.
5. Przykryj płytki studzienek folią aluminiową, aby zminimalizować rozpraszanie światła.
6. Włącz urządzenie PDT, naciskając przycisk przełącznika ON/OFF.
7. Włóż kartę z pomiarem do gniazda z przodu urządzenia PDT.
   UWAGA: Do urządzenia dołączona jest jedna karta z pomiarem odpowiadająca czasowi naświetlania 300 s. Dodatkowy program trwający 2 000 s jest automatycznie integrowany z urządzeniem PDT. W obu czasach naświetlania światło jest dostarczane w trybie ciągłego nadawania przez wskazane okresy.
8. Upewnij się, że zegar na wyświetlaczu lightbox PDT zmieni się na zalecany czas wskazany na karcie pomiarowej.
9. Rozpocznij zabieg PDT, naciskając wbudowany pedał nożny.
   UWAGA: W urządzeniu wbudowana jest funkcja automatycznego zatrzymywania, a system działa automatycznie. Nie zatrzymuj procesu świetlnego ani nie usuwaj światłowodu przed zakończeniem cyklu. Po zakończeniu cyklu świetlnego przesłona źródła światła zostaje zamknięta i nie jest dostarczane dalsze światło.

3. Test migracji

1. Komórki nasienne w następujący sposób: 2 × 10⁴ komórki - MAC, 1 × 10⁴ komórki - MAM, 3 x 10⁴ - 17-1012 i 2,5 × 10⁴ - MSC do każdej 2-komorowej wkładki hodowlanej zintegrowanej z nieprzezroczystymi płytkami 6-dołkowymi z dnem F.
2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny. Następnie usunąć wkładki.
   UWAGA: Aby uzyskać punkt odniesienia dla migracji i początkowy bezstronny rozmiar szczeliny, stosuje się oddzielną płytkę, która nie będzie poddawana dalszej ekspozycji na 5-ALA-PDT (kroki 3.3-3.4), ale zamiast tego zostanie bezpośrednio wybarwiona i określona ilościowo (kroki 3.5-3.12).
3. Zastąp pożywkę świeżą pożywką wolną od FBS, zawierającą 1 mM 5-ALA.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 4 h.
   UWAGA: Jako kontrole, dodatkowe studzienki powinny być jednocześnie pokryte pożywką bez 5-ALA.
5. Poddaj ogniwa działaniu PDT z niebieskim światłem (436 nm, 36 J/cm²) w trybie ciągłego wyjścia przez predefiniowane ramy czasowe 300 s lub 2,000 s, jak wskazano w sekcji 2.
   UWAGA: Płytki, które nie są poddawane ekspozycji PDT, powinny być używane jako kontrole.
6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny
   UWAGA: Okresowo sprawdzaj komórki, aby ocenić stopień migracji dla każdego typu komórek. Musi to być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej.
7. Umyj komórki 1,5 ml PBS, a następnie całkowicie usuń PBS.
8. Utrwal komórki, dodając i inkubując je z 1,5 ml 4% (v/v) paraformaldehydu w PBS przez 10 minut.
9. Dodać 1,5 ml 70% (v/v) etanolu i inkubować przez 10 minut.
10. Wyrzuć etanol i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
11. Inkubować komórki z 1,5 ml 0,2% (v/v) niebieskiego barwnika Coomassie w 90% (v/v) etanolu przez 20 minut.
12. Umyj płytki wodą podwójnie destylowaną.
    UWAGA: Aby dokładnie umyć talerze i usunąć pozostałe zanieczyszczenia, całkowicie zanurz płytki 2-3 razy w czystej, podwójnie destylowanej wodzie.
13. Pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny
    UWAGA: Na tym etapie wysuszone płytki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej kilka tygodni.
14. Wizualizuj i fotografuj migrację komórek do szczelin za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu.
    UWAGA: Obserwuj i fotografuj migrację żywych komórek przez maksymalnie 24 godziny po ekspozycji 5-ALA-PDT. Jednak stałe komórki mogą być przechowywane i fotografowane później.
15. Wyeksportuj obrazy w żądanym formacie i określ ilościowo luki za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów naukowych, jak opisano wcześniej¹⁴.

4. Test żywotności

1. Wysiewać wszystkie komórki o gęstości 1,5 ×^{10 4} na 96-dołkowych płytkach w 50 μl pożywki hodowlanej.
2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.
3. Dodać dodatkowe 50 μl pożywki hodowlanej wolnej od FBS zawierającej 5-ALA o końcowym stężeniu 1 mM.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 4 godziny w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.
   UWAGA: Użyj 2x stężenia, ponieważ komórki są już pokryte 50 μl pożywki hodowlanej. Należy uwzględnić kontrolę z pożywką hodowlaną.
5. Poddaj komórki ekspozycji PDT na niebieskie światło (436 nm, 36 J/cm²) w trybie ciągłego wyjścia przez z góry określone ramy czasowe 300 s lub 2 000 s, jak wskazano w sekcji 2.
   UWAGA: Należy również uwzględnić kontrolę ujemną, która nie jest poddawana ekspozycji PDT.
6. Napromienione komórki inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.
7. Dodać 15 μl odczynnika MTS na komórki i inkubować komórki przez 90 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
8. Zmierzyć absorbancję za pomocą czytnika spektrofotometru przy długości fali 490 nm.

5. Test zatrzymania/starzenia wzrostu komórkowego (aktywność β-galaktozydazy(β-Gal))

UWAGA: Wszystkie użyte tutaj odczynniki i zostały dostarczone w zestawie testowym (zobacz Tabelę Materiałów).

1. Zasiać komórki o gęstości 1,5 ×^{10 4} w 96-dołkowych płytkach w 100 μl pożywki hodowlanej. Inkubować komórki przez 24 godziny, w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.
2. Dodać 100 μl świeżej pożywki wolnej od FBS z 5-ALA o końcowym stężeniu 1 mM i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
   UWAGA: Jako kontrole, oddzielne studzienki powinny być jednocześnie pokryte świeżą pożywką bez fotouczulacza 5-ALA.
3. Poddaj komórki ekspozycji PDT na niebieskie światło (436 nm, 36 J/cm²) w trybie ciągłego wyjścia przez z góry określone ramy czasowe 300 s lub 2 000 s, jak wskazano w sekcji 2.
   UWAGA: Należy również dołączyć płytkę kontroli ujemnej, która nie jest narażona na PDT.
4. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.
5. Wyrzuć pożywkę i umyj komórki dwa razy PBS.
6. Przykryj komórki 100 μl 1x buforu do lizy komórek i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. Odwirować lizat w temperaturze 350 × g1 przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.
8. Pobrać pipetą 50 μl supernatantu na nową 96-dołkową płytkę i dodać kolejne 50 μl 2x buforu do oznaczania.
9. Umieścić nową 96-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1,5 godziny
   UWAGA: Pasztety należy chronić przed światłem, aby uniknąć fotowybielania.
10. Przenieść 50 μl mieszaniny na nieprzezroczystą płytkę 96-dołkową o nieprzezroczystych ściankach i dodać 200 μl roztworu zatrzymującego.
11. Zmierzyć absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych przy wzbudzeniu 360 nm/emisji 465 nm.

Wyniki

Po ekspozycji na PDT z użyciem 5-ALA, w grupie kontrolnej MSC nie zaobserwowano istotnego wpływu na migrację po napromieniowaniu 5-ALA PDT (Rycina 2A, i, v, ix). W przeciwieństwie do niej, komórki MAC (Rycina 1B oraz Rycina 2A, iii, vii, xi) i 17-1012 (Rycina 1B oraz Rycina 2A, ii, vi, x) wykazały spadek potencjału migracyj...

Dyskusja

Pomimo obecnych opcji leczenia, odpowiedź terapeutyczna raka jest zmienna, co przemawia za nowatorskimi podejściami, a nawet terapiami skojarzonymi w leczeniu przerzutów do kości przy jednoczesnym zachowaniu początkowej struktury tkanki. W tym kontekście PDT jest obiecującą alternatywą. Z uproszczonego punktu widzenia PDT składa się z dwóch podstawowych składników: (1) nietoksycznego, wrażliwego na światło barwnika zwanego fotouczulaczem (PS) oraz (2) zewnętrznego źródła światła o odpowiedniej długości fali, które odpowi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Karta z pomiarem 300 s dla PDT	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	nie dotyczy	http://www.illuminoss.com
Fotouczulacz kwasu 5-aminolewulinowego (5-ALA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7793	10 mg
Płytki 6-dołkowe	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy	657160
Szkiełka komorowe 8-dołkowe	SARSTEDT AG & Co. KG, Monachium, Niemcy	94.6140.802
96 Płytki dołkowe (F-buttom)	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy	655180
CellTiter 96 Roztwór wodny Proliferacja komórek Test (MTS)	Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA	G3580
Test starzenia komórkowego	Biotrend Chemikalien GmbH, Kö ln, Niemcy	CBA-231	Ilościowy test ß-galaktozydazy związany ze starzeniem
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	35055	0,5% (w/v)
Culture-Inserts 2Well	ibidi GmbH, Grä felfing, Niemcy	80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I	Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA	31966-021
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	F7524
Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych	Promega, Madison, Wisconsin, USA	GlowMAx®, GM3510
Hemocytometr	Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland	4042
ImageJ	National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA	ImageJ (wersja: 1.53a)	Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów naukowych; https://imagej.net/
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym	Leica, Wetzlar, Niemcy	DM IMBRE 100
Metanol AnulaR Normapur	VWR, Fontenay-Sous-Bois, Francja	20847.307
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	158127	Proszek, urządzenie PDT o czystości 95%
(kaseta świetlna i akcesoria)	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	nie dotyczy	Niebieskie światło 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicylina-Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15140-122	10 000 U/ml Penicylina 10 000 μ g/ml Streptomycyny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	10010-015
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	21875034
Czytnik spektrofotometu/mikropłytek	BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Niemcy	EL800
Trypan Blue barwnik 0,4%	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	T8154
Trypsyna-EDTA 10x	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	T4174