Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63647

⸱

30 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, Second Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research, 3Hunan Fangsheng Pharmaceutical Co., Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Streszczenie

Kluczowym celem terapii komórkowej po zawale mięśnia sercowego (MI) jest skuteczne zwiększenie dawki przeszczepionych komórek, a ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) są obiecującym źródłem komórek do naprawy serca po uszkodzeniu niedokrwiennym. Jednak niski wskaźnik przeszczepów jest istotną przeszkodą dla skutecznej regeneracji tkanki serca po przeszczepie. Protokół ten pokazuje, że wielokrotne przezskórne wstrzyknięcia hiPSC-CM pod kontrolą ultrasonograficzną w obszar mięśnia sercowego skutecznie zwiększają wskaźniki przeszczepu komórek. W badaniu opisano również cały proces hodowli hiPSC-CM, leczenie wstępne oraz metody przezskórnego podawania pod kontrolą USG. Ponadto zastosowanie ludzkiego mitochondrialnego DNA pomaga wykryć brak hiPSC-CM w innych narządach myszy. Wreszcie, w artykule opisano zmiany w funkcji serca, angiogenezie, wielkości komórek i apoptozie w strefie granicznej zawału u myszy 4 tygodnie po dostarczeniu komórek. Można stwierdzić, że przezskórne wstrzyknięcie mięśnia sercowego lewej komory pod kontrolą echokardiografii jest wykonalną, stosunkowo inwazyjną, zadowalającą, powtarzalną i skuteczną terapią komórkową.

Wprowadzenie

Gdy dochodzi do ostrego zawału mięśnia sercowego, komórki mięśnia sercowego w obszarze zawału szybko umierają z powodu niedokrwienia i niedotlenienia. Kilka czynników zapalnych jest uwalnianych po śmierci i pęknięciu komórki, podczas gdy komórki zapalne infiltrują miejsce zawału, powodując stan zapalny1. Co istotne, fibroblasty i kolagen, oba bez kurczliwości i przewodnictwa elektrycznego, zastępują komórki mięśnia sercowego w miejscu zawału, tworząc tkankę bliznowatą. Ze względu na ograniczoną zdolność regeneracyjną kardiomiocytów u dorosłych ssaków, żywotna tkanka powstała po dużym obszarze zawału zwykle nie jest wystarczająca do utrzymania wystarczającej pojemności minutowej serca2. Zawał mięśnia sercowego powoduje niewydolność serca, a w ciężkich przypadkach niewydolności serca pacjenci mogą polegać tylko na przeszczepach serca lub urządzeniach wspomagających pracę komór w celu utrzymania prawidłowych funkcji serca3,4.

Po MI, idealną strategią leczenia jest zastąpienie martwych kardiomiocytów nowo powstałymi kardiomiocytami, tworząc elektromechaniczne sprzężenie ze zdrowymi tkankami. Jednak opcje leczenia zazwyczaj przyjmowały ratunek mięśnia sercowego, a nie wymianę. Obecnie terapie oparte na komórkach macierzystych i progenitorowych są jednymi z najbardziej obiecujących strategii wspomagających naprawę mięśnia sercowego po MI5. Jednak przeszczep tych komórek wiąże się z kilkoma problemami, przede wszystkim niezdolnością dorosłych komórek macierzystych do różnicowania się w kardiomiocyty i ich krótką żywotnością6.

Kwestie etyczne związane z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych (ES) mogą być ominięte przez iPSC, które są obiecującym źródłem komórek. Ponadto iPSC mają silne zdolności do samoodnawiania się i mogą różnicować się w kardiomiocyty7. Badania wykazały, że hiPSC-CM przeszczepione do miejsca zawału mięśnia sercowego mogą przetrwać i tworzyć połączenia szczelinowe z komórkami gospodarza8,9. Ponieważ jednak przeszczepione komórki znajdują się w mikrośrodowisku niedokrwienia i stanu zapalnego, ich przeżywalność jest niezwykle niska10,11.

Ustanowiono kilka metod poprawy przeżywalności przeszczepionych komórek, takich jak wstępna obróbka przeszczepionych komórek za pomocą niedotlenienia i szoku cieplnego12,13, modyfikacja genetyczna14,15, oraz jednoczesne przeszczepianie komórek i naczyń włosowatych16. Niestety, większość metod jest ograniczona złożonością i wysokimi kosztami. W związku z tym w niniejszym badaniu zaproponowano powtarzalną, wygodną, stosunkowo inwazyjną i skuteczną metodę dostarczania hiPSC-CM.

Wstrzyknięcie komórek do mięśnia sercowego pod kontrolą USG pod kontrolą USG pod kontrolą USG może być przeprowadzone tylko za pomocą małego ultrasonografu weterynaryjnego o wysokiej rozdzielczości i mikroiniektora, niezależnie od miejsca. Pod kontrolą ultrasonograficzną bezpośrednie dostarczanie komórek w procesie mieczykowatym z osierdzia do mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym protokołem, który pozwala uniknąć uszkodzenia wątroby i płuc. Metoda ta może być łączona jednocześnie z innymi technologiami w celu znacznej poprawy przeżywalności przeszczepionych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w niniejszym badaniu zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez komisję etyczną Drugiego Szpitala Xiangya Uniwersytetu Central South. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów i sprzętu użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów. Harmonogram wstrzykiwania komórek, obrazowania i eutanazji przedstawia się następująco: t0 – indukcja zawału, t1 tydzień – obrazowanie i implantacja komórek, t2 tygodnie – obrazowanie i implantacja komórek, t4 tygodnie – końcowe obrazowanie, eutanazja i pobranie tkanek.

1. Hodowla hiPSC, różnicowanie w kardiomiocyty i puryfikacja komórek

  1. Wymieszać DMEM/F12 i roztwór zapasowy matrycy błony podstawnej na lodzie w temperaturze 4 °C w stosunku 1,5:1, podzielić na alikwoty i przechowywać otrzymaną mieszaninę (rozcieńczalnik matrycy) w temperaturze -20 °C. Wymieszać dokładnie na lodzie 25 mL pożywki hodowlanej DMEM/F12 w temperaturze 4 °C oraz 1 mL rozcieńczalnika matrycy i rozlać po 1 mL/dołek na płytkę 6-dołkową. Przechowywać płytkę w pozycji pionowej przez 1 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C, a następnie odessać supernatant DMEM/F12 z dołków. Podczas wykonywania tej procedury nie wolno dotykać dna płytki 6-dołkowej.
  2. Wyjąć probówkę do kriokonserwacji zawierającą hiPSC z ciekłego azotu i szybko rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zdezynfekować zewnętrzną powierzchnię probówki do kriokonserwacji 75% alkoholem, wytrzeć alkohol i przenieść probówkę na sterylną stół ultra-czysty.
  3. Za pomocą pipety delikatnie przenieść roztwór do kriokonserwacji zawierający hiPSC do probówki wirówki o pojemności 15 mL, dodać 5 mL pożywki ES bez komórek karmidła (feeder-free) i wirować zawiesinę przy 300 × g przez 3 min w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i delikatnie resuspenderować komórki w 6 mL pożywki ES bez komórek karmidła. Policzyć komórki i dostosować ich stężenie do 5 × 105 komórek/mL za pomocą pożywki hodowlanej.
  4. Dodać inhibitor ROCK (Y27632) do hiPSC do stężenia końcowego 5 µM. Przenieść hiPSC z Y27632 na płytkę 6-dołkową wstępnie potraktowaną matrycą błony podstawowej i delikatnie zakręcić płytką 6-dołkową, kreśląc kształt cyfry „8”, aby równomiernie rozprzestrzenić hiPSC. Umieścić hiPSC w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w pozycji pionowej na 24 h. Zastąpić supernatant pożywką ES bez komórek karmidła i bez Y27632.
  5. Gdy hiPSC osiągną 80% stopnia konfluencji, odessać supernatant hodowlany, przemyć komórki dwukrotnie solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), dodać RPMI1640 + B27 bez insuliny zawierający 10 µM CHIR99021 (inhibitor GSK3-β) i umieścić hiPSC w wilgotnym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 24 h.
  6. Zastąpić połowę supernatantu pożywką RPMI1640 + B27 bez insuliny i inkubować komórki przez kolejne 24 h.
  7. Całkowicie zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką RPMI1640 + B27 (bez insuliny). Umieścić płytki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w pozycji pionowej na 24 h.
  8. Po 3 dniach całkowicie zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką RPMI1640 + B27 bez insuliny + 5 µM IWR1 (inhibitor szlaku sygnałowego Wnt) i umieścić płytki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 48 h.
  9. Po 5 dniach zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką RPMI1640 + B27 bez insuliny i kontynuować inkubację przez 48 h w wilgotnym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  10. Po 7 dniach zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką RPMI + B27 (z insuliną) i umieścić płytki w wilgotnym inkubatorze CO2 na 3 dni w temperaturze 37 °C. Wymieniać pożywkę na RPMI + B27 co 3 dni. Obserwować spontaniczne bicie komórek w 9–12 dniu różnicowania.
  11. Po zaobserwowaniu pulsujących komórek zastąpić pożywkę RPMI + B27 pożywką RPMI 1640 bez glukozy zawierającą kwas mlekowy (1 mL kwasu mlekowego dodany do 500 mL pożywki RPMI 1640 bez glukozy). Inkubować komórki przez 72 h w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
  12. Po 72 h zastąpić supernatant pożywką RPMI + B27 i inkubować przez 48 h w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
  13. Odessać supernatant hodowlany pod podciśnieniem i przemyć komórki 3x PBS, aby usunąć ślady pożywki hodowlanej. Użyć mieszaniny enzymów do odrywania komórek, aby dysocjować hiPSC-CM do pojedynczych komórek w temperaturze 37 °C. Zebrać uzyskane komórki do probówki wirówki 15 mL zawierającej 3 mL roztworu wspomagającego kardiomiocyty, wirować przy 300 × g przez 2 min w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  14. Resuspenderować komórki pożywką RPMI + B27, wysiać je na płytkach 6-dołkowych powlekanych matrycą błony podstawowej i inkubować przez 48 h w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
  15. W celu puryfikacji zastąpić supernatant hodowlany pożywką RPMI 1640 bez glukozy zawierającą kwas mlekowy i inkubować przez 72 h w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
  16. Zastąpić supernatant hodowlany pożywką RPMI + B27 i wymieniać pożywkę co 3 dni.
  17. Kontynuować powyższy proces przez 30 dni, zastępując supernatant hodowlany pożywką bezglukozową zawierającą kwas mlekowy w celu dalszej puryfikacji. Inkubować komórki przez 3 dni z tą pożywką, a następnie zastąpić supernatant pożywką RPMI + B27. Hodować komórki nieprzerwanie przez 30 dni, aż hiPSC-CM będą bić stabilnie, a następnie wykorzystać te komórki do wstrzykiwań domięśniowych u myszy.

2. Przygotowanie hiPSC-CM i ustanowienie modelu ostrego zawału mięśnia sercowego u myszy

  1. Odssać próżniowo supernatant hodowlany z hiPSC-CMs hodowanych przez 60 dni, przemyć komórki 3x PBS i dysocjować hiPSC-CMs do pojedynczych komórek w temperaturze 37 °C przy użyciu mieszaniny enzymów do odrywania komórek (~3-5 min). Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej 5 mL pożywki RPMI + B27 i dokładnie wymieszać przed policzeniem komórek w celu obliczenia ich całkowitej liczby. Odwirować zawiesinę komórkową przy 300 × g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i dodać pożywkę wspierającą dla kardiomiocytów, aby resuspendować komórki do stężenia 0,6 × 105 komórek/µL.
  2. Przygotować probówkę wirówkową z resuspendowanymi hiPSC-CMs w temperaturze 37 °C do wstrzyknięcia14,17,18,19,20.
  3. Umieścić myszy w komorze anestezjologicznej podłączonej do izofluranu w celu indukcji anestezji inhalacyjnej, a następnie zastosować maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas znieczulenia.
    UWAGA: Stężenie izofluranu wynosiło 5%. Należy zwrócić uwagę na wentylację laboratorium podczas eksperymentu.
  4. Sprawdzić zanik odruchów w obrębie łap i ogona po uszczypnięciu, gdy mysz leży płasko na stole operacyjnym, co wskazuje na wystarczające znieczulenie. Podać buprenorfinę (0,1 mg/kg) drogą dosytrawniczą.
  5. Nanieść krem do depilacji na środek szyi i lewą stronę klatki piersiowej myszy, a po 5 min usunąć nałożony krem i włosy za pomocą gazy.
  6. Unieruchomić kończyny i ogon myszy za pomocą taśmy. Unieruchomić siekacze myszy za pomocą nici jedwabnej 2-0 i taśmy. Sterylizować pole operacyjne (środek szyi i lewa strona klatki piersiowej) trzema naprzemiennymi etapami betadyną, a następnie alkoholem.
  7. Założyć sterylny obszar operacyjny. Następnie wykonać cięcie w linii środkowej szyi za pomocą cienkich nożyczek anatomicznych i cienkich pinceciet sekcyjnych, aby w pełni odsłonić tchawicę. W razie potrzeby wyciąć kilka przednich mięśni szyi w celu stabilizacji.
    UWAGA: Operatorzy byli oślepieni na grupy zwierząt.
  8. Wprowadzić rurkę tchawiczą (igła do nakłuć cewnika 20 G) przez pysk.
  9. Podłączyć rurkę tchawiczą do respiratora i sprawdzić ruchy klatki piersiowej, aby upewnić się, że oba płuca są dobrze wentylowane.
  10. Dostosować parametry oddychania (częstość oddechów: 100-150 bpm, objętość tidalna 250-300 µL). Następnie ponownie unieruchomić lewą kończynę tylną po prawej stronie na dole, poluzować taśmę wokół lewej kończyny górnej i wykonać torakotomię w 3-4 przestrzeni międzyżebrowej lewej klatki piersiowej za pomocą cienkich nożyczek sekcyjnych i pinceety w celu maksymalnego odsłonięcia serca.
  11. Za pomocą pinceety, pod mikroskopem, oddzielić osierdzie, aby zwizualizować lewą przednią zstępującą tętnicę wieńcową (LAD) na dolnej krawędzi lewego przedsionka.
  12. Użyć nici jedwabnej 6-0 do podwiązania proksymalnego końca LAD. Po upewnieniu się, że model ostrego zawiału (MI) został odpowiednio ustanowiony (gdy dystalna część LAD w miejscu podwiązania zmieni kolor z czerwonego na biały), zamknąć klatkę piersiową warstwa po warstwie i zszyć skórę przerywanymi szwami 4-0. Wykonać wszystkie wspomniane powyżej procedury chirurgiczne indukcji MI dla grupy kontrolnej (sham), z wyjątkiem podwiązania.
  13. Wyłączyć anestezyjną inhalację, usunąć kaniulę po powrocie myszy do spontanicznego oddychania i umieścić zwierzę w klatce. Monitorować zwierzę, aż odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję na brzuchu. Nie łączyć z innymi zwierzętami do czasu pełnego wyprowadzenia z narkozy. Podać dosytrawniczo buprenorfinę (0,1 mg/kg x 3 dni) i karprofen (5 mg/kg x 1 dzień) co 12 h po operacji.
  14. Wstrzyknąć cyklosporynę A (10 mg·kg-1·day-1) do jamy otrzewnej myszy na 3 dni przed podaniem hiPSC-CMs, aby zapobiec odrzuceniu przeszczepionych komórek. Wstrzykiwać cyklosporynę A w sposób ciągły przez 1 miesiąc po transplantacji.

3. wstrzykiwanie hiPSC-CM pod kontrolą ultrasonograficzną

  1. Po stworzeniu modelu MI, w pierwszym dniu po MI przypisz myszy z modelem MI (myszy C57BL/6 w wieku 12 tygodni; masa od 22 g do 24 g, 50% samców i 50% samic) do grup z pojedynczą dawką (SD, n = 8 w niniejszym badaniu) i wielokrotnymi dawkami (MD, n = 8 w niniejszym badaniu), a następnie w pierwszym i drugim tygodniu po MI umieść je w komorze do znieczulenia podłączonej do 5% izofluranu w celu indukcji znieczulenia wziewnego, a następnie wykonaj intubację tchawicy.
  2. Sierść na klatce piersiowej i górnej części brzucha myszy pokryj kremem do depilacji, a po 5 min usuń krem gazikiem. Monitoruj częstotliwość akcji serca myszy na stole operacyjnym i podawaj izofluran wziewnie, aż częstotliwość akcji serca utrzyma się na poziomie 400-500 bpm.
  3. Umożliw kończyny i ogon myszy taśmą na konsoli detekcyjnej i ustaw temperaturę platformy na 37 °C.
  4. Nałóż specjalny żel ultradźwiękowy na górną część brzucha i użyj małej weterynaryjnej głowicy ultradźwiękowej o wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać obrazy wątroby myszy.
  5. Zmniejsz częstotliwość pracy respiratora do 50 bpm. Użyj mikrosstrzykawki o pojemności 5 µL, aby pobrać ~3 × 105 komórek (z kroku 2.1). Trzymając strzykawkę za pomocą mikromanipulatora, wprowadź 3 mm igłę w lewym obszarze przywyrostka miecza (Rycina 1A). Pod kontrolą ultradźwięków podążaj wzdłuż górnej krawędzi przepony (Rycina 1B), obserwuj rytm i zakres oddychania (Rycina 1C,D) i wprowadź igłę do osierdzia na końcu cyklu wydechowego, unikając uszkodzenia wątroby i płuc (Rycina 1D).
  6. Po wprowadzeniu igły mikroinjektora do jamy osierdziowej dostosuj częstotliwość oddychania do parametrów pierwotnych (150 bpm). Uzyskaj obraz w osi długiej w przekroju parasternalnym serca myszy za pomocą echokardiografii w trybie M zgodnie z instrukcjami producenta17 (Rycina 1E). Pod kontrolą ultradźwięków wstrzyknij 3 × 105 komórek (Rycina 1F) w trzy obszary brzeżne miejsca zawału (1 × 105 komórek na miejsce wstrzyknięcia).
  7. Usuń specjalną głowicę ultradźwiękową i spłucz żel. Odstaw mysz od znieczulenia wziewnego i po odzyskaniu pełnej przytomności przenieś ją z powrotem do klatki.
  8. Powtórz powyższe procedury wstrzykiwania komórek pod kontrolą ultradźwięków 1 i 2 tygodnie po wywołaniu MI w przypadku myszy z grupy MD.

4. Ocena funkcji serca, znakowanie fluorescencyjne, zliczanie przeszczepionych komórek, obszaru zawału mięśnia sercowego oraz detekcja ludzkich mitochondriów w organach u myszy 30 dni po podwiązaniu przedniej gałęzi tętnicy zstępującej

  1. Ocena funkcji serca
    1. Umieść mysz w komorze anestezjologicznej podłączonej do izofluranu w celu indukcji znieczulenia inhalacyjnego, a następnie zastosuj maść weterynaryjną do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia. Usuń włosy z lewej strony klatki piersiowej myszy za pomocą kremu do depilacji. Połóż mysz na panelu operacyjnym w celu monitorowania częstości akcji serca i regulacji inhalacji izofluranu. Utrzymuj częstotliwość pracy serca myszy na poziomie 400-500 bpm. Punkt końcowy eksperymentu przypada na 30. dzień (po indukcji MI). 
    2. Ustabilizuj kończyny i ogon myszy taśmą na konsoli detekcyjnej i ustaw temperaturę platformy na 37 °C.
    3. Po nałożeniu specjalnego żelu ultradźwiękowego na obszar przedni serca, użyj (weterynaryjnej) wysokorozdzielczej sondy ultradźwiękowej do serca, aby uzyskać obrazy w osi długiej przymostkowej oraz dwuwymiarowe obrazy w osi krótkiej w trybach echokardiografii M-mode i B-mode zgodnie z instrukcjami producenta17.
    4. Po zakończeniu badania ultradźwiękowego zmyj specjalny żel ultradźwiękowy, wyłącz znieczulenie inhalacyjne i zwróć mysz do klatki osobno po odzyskaniu pełnej świadomości.
    5. Przeanalizuj uzyskane dane i oblicz frakcję wyrzutową (EF) oraz skracanie frakcyjne (FS) lewej komory za pomocą oprogramowania analitycznego. Upewnij się, że operator nie zna przynależności zwierząt do grup doświadczalnych17.
  2. Markowanie fluorescencyjne przekrojów
    1. Przemyj wyizolowane serce PBS, zanurz je w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C na 12 h. Wyjmij serce i zanurz je w 30% sacharozie na 24 h w celu odwodnienia.
    2. Zatop odwodnione serce w związku OCT (optimal cutting temperature) na suchem lodzie. Przekrój serce od podstawy do wierzchołka przy użyciu kriostatu z grubością 10 µm, umieść przekroje na szkiełkach i przechowuj je w temperaturze -20 °C.
    3. Przemyj szkiełka z tkanką serca PBS przez 3 min.
    4. Przeprowadź permeabilizację tkanki na szkiełkach za pomocą 0,5% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 8 min, a następnie przemyj je 3x PBS przez 5 min na każde płukanie.
    5. Po pokryciu tkanki 10% surowicą osła i 90% PBS (roztwór blokujący), blokuj przekroje przez 1 h w temperaturze pokojowej.
    6. Po usunięciu roztworu blokującego inkubuj przekroje z przeciwciałem pierwotnym (rozcieńczonym 1:100 w roztworze blokującym) przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyj je 3x PBS przez 5 min na każde płukanie.
    7. Inkubuj tkankę na szkiełkach z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluoroforem (rozcieńczonym 1:100 w roztworze blokującym) przez 1 h w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Od tego momentu unikaj wystawiania tkanek z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluoroforem na światło.
    8. Przemyj szkiełka 3x PBS przez 5 min na każde płukanie.
    9. Zamontuj preparaty na szkiełkach, używając medium montażowego zawierającego 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), i wykonaj zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym17.
  3. Liczba przeszczepionych hiPSC-CMs17
    1. Wykonaj immunofluorescencyjne barwienie tkanek na zamrożonych przekrojach serca dla troponiny T specyficznej dla ludzi (hcTnT), ludzkiego antygenu jądrowego (HNA) oraz nieswoistej alfa-aktyniny sarkomerycznej.
    2. Po seryjnym cięciu całego serca, pobierz jeden przekrój z każdych 50 przekrojów do markowania fluorescencyjnego.
    3. Losowo wykonaj pięć zdjęć przy dużym powiększeniu na każdy przekrój. Policz liczbę pól widzenia z graftami, oblicz średnią liczbę przeszczepionych komórek na jednostkę powierzchni i przyjmij ją jako A1/µm2. Oblicz całkowitą powierzchnię graftu w przekroju za pomocą ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) i przyjmij ją jako B1μm2, tak aby liczba przeszczepionych komórek w tym przekroju = A1 × B121,22.
    4. Oblicz całkowitą liczbę przeszczepionych komórek na serce myszy, korzystając z równania (1), oraz procentowy wskaźnik przeżycia/przyjęcia (engraftment rate) za pomocą równania (2), przyjmując, że wybrano jeden przekrój z każdych 50 przekrojów21,22.
    5. Całkowita liczba przeszczepionych komórek na serce myszy = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ An × Bn) × 50 (1)
      wskaźnik przyjęcia = Wzór na wydajność przyjęcia, procent hiPSC-CMs, równanie dla analizy komórkowej i badań. (2)
      UWAGA: Liczba podanych komórek wynosiła 3 × 105 dla grupy SD i 3 × 3 × 105 dla grupy MD.
  4. Ocena obszaru zawału mięśnia sercowego
    1. Wykonaj poprzeczne zamrożone przekroje (oś krótka) wyizolowanego serca, od wierzchołka do podstawy serca, o grubości 10 µm.
    2. Po seryjnym cięciu całego serca, pobierz jedno szkiełko z każdych 30 przekrojów i utrwal je w podgrzanym do 58 °C roztworze Bouina. Wybarw przekrój za pomocą barwników do kolagenu: 0,04% Direct Red i 0,1% Fast Green (rozcieńczonych w PBS) zgodnie z instrukcją producenta17.
    3. Użyj oprogramowania (np. ImageJ) do analizy obrazów po wykonaniu mikroskopowych fotografii poprzecznych całego serca, stosując równanie (3):14,17
      % obszaru zawału = Równanie analizy serca, stosunek objętości blizny do lewej komory, schemat, badania układu sercowo-naczyniowego. × 100%  (3)
  5. Wykrywanie ludzkiego mtDNA w różnych organach
    1. Znieczul myszy 5% izofluranem i utnij je poprzez tylną dyslokację szyjną. Przeprowadź sekcję myszy 4 tygodnie po transplantacji komórek. Pobierz organy (wątroba, płuca, mózg, nerki, śledziona) oraz część mięśnia sercowego (n = 3 w tej sekcji).
    2. Rozetrzyj każdą tkankę organu w ciekłym azocie i wyekstrahuj DNA z tkanki za pomocą referencyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta.
    3. Zgodnie z instrukcjami producenta użyj referencyjnego zestawu i starterów (patrz Tabela materiałów), aby wykryć ludzkie mtDNA w wyżej wymienionych tkankach (z kroku 4.5.1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Echokardiografia służąca do oceny funkcji lewej komory u myszy w każdej z grup wykazała, że uszkodzenia po MI zostały skutecznie cofnięte w grupie MD (Ryc. 2A). W porównaniu z grupą MI, grupa SD po MI wykazała zwiększoną frakcję wyrzutową (EF) (z 30% do 35%; Ryc. 2B) oraz skrócenie frakcyjne (FS) (z 18% do 22%; Ryc. 2C). Jednak jeszcze ważniejsze jest to, że wielokrotne przezskórne iniekcje hiPSC-CMs u myszy w grupie MD zwiększyły E...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe etapy tego badania obejmują hodowlę hiPSC, różnicowanie kardiomiocytów, oczyszczanie hiPSC-CM i przeszczepienie hiPSC-CM do miejsca zawału mięśnia sercowego myszy. Kluczem jest zastosowanie ultrasonografii serca do przezskórnego kierowania leczenia w kierunku miejsca zawału na krawędzi zawału, w które wstrzyknięto hiPSC-CM.

Wraz z wydłużeniem czasu hodowli fenotyp hiPSC-CM zmienia morfologię (większy rozmiar komórek), strukturę (mięśnie, gęstość włókienek, rozmieszczenie, mikroskopijn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Główny Plan Badawczy Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 91539111 do JY), Kluczowy Projekt Nauki i Technologii Prowincji Hunan (nr 2020SK53420 do JY) oraz Program Innowacji Naukowych i Technologicznych Prowincji Hunan (2021RC2106 do CF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało< / silna>
troponina sercowa TAbcamab8295
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150105
Osioł IgG przeciw myszom H& L (Alexa Fluor 555)Abcamab150110
Osioł IgG przeciw królikom H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150073
Osioł IgG przeciw królikom H& L (Alexa Fluor 555)Abcamab150062
Ludzka troponina sercowa TAbcamab91605
Izolektyna B4WektorFL-1201
Sarkomeryczna alfa aktyninaAbcamab9465
Aglutynina z kiełków pszenicyThermo Fisher ScientificW11261
Odczynnik
AccutaseThermo Fisher Scientific00-4555-56
Suplement B27 (bez insuliny)Suplement Thermo Fisher ScientificA1895601
B27 (bez surowicy)Thermo Fisher Scientific17– 504-044
Roztwór BouinaThermo Fisher ScientificSDHT10132
CHIR99021SelleckCT99021
cyklosporyna AMedchemexpressHY-B0579
DIRECT REDSigma-Aldrich365548-25G
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320033
DNeasy Blood & Zestaw chusteczekhigienicznych Qiagen69504
FAST GREEN FCFSigma-Aldrich  F7252-5G
Bez glukozy RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11879020
IWR1SelleckS7086
Kwas mlekowySigma-AldrichL6661
MatrigelBD BiosciencesBD356234
mTeSR1Technologie komórek macierzystych72562
Związek OCTSAKURA4583
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Zestaw PowerUP SYBR Green MasterMixThermo Fisher ScientificA25742
RPMI1640Thermo Fisher Scientific11875119
STEMdif Kardiomiocyty do zamrażania/STEMdiffStem Cell Technologies5030
STEMdiff Podłoże wspomagające kardiomiocytyStem Cell Technologies5027
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
ultradźwiękowy środek sprzęgającyCARENT22396269389
Y-27632SelleckS6390
Equipment and supplies
Applied BiosystemsThermo Fisher Scientific7500 Kriostat Real-Time PCR
Mikroskop fluorescencyjny
drobne nożyczki anatomiczneFine Science Tools15000-08
drobne kleszcze preparacyjneFine Science Tools11255-20
MikrostrzykawkaHamilton7633
Aparat anestezjologicznyMATRXVMR
System obrazowania ultrasonograficznego małych zwierząt o ultrawysokiej rozdzielczościVisualSonicsVevo 2100
Software
Statystyczne rozwiązania produktowe i usługoweIBM21
Image JNIH1,48
Human mitochondria Startery DNA
sekwencja startera do przoduCCGCTACCATAATCATCGCTAT
odwrotna sekwencja starteraTGCTAATACAATGCCAGTCAGG
Leica CM1950 Olympus IX83 Małe zwierzę

Bibliografia

  1. Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
  2. Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  3. Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
  4. Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
  5. Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
  6. Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
  7. Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  8. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
  9. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
  10. Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
  11. Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
  12. Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
  13. Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
  14. Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
  15. Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
  16. Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
  17. Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873(2021).
  18. Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
  19. Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
  20. Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
  21. Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452(2019).
  22. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).
  23. Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).
  24. Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
  25. Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167(2019).
  26. Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

indukowane pluripotencjalne komórki macierzystezawał mięśnia sercowegonaprowadzanie ultradźwiękowewstrzyknięcie przezskórneregeneracja sercatransplantacja komórkowadostarczanie pod kontrolą echokardiografiiludzkie mtDNAocena angiogenezy
Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.