Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63651

⸱

28 marca 2022

 , 
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

W tym artykule

Podsumowanie

Pierwotne kultury glejowe Müllera uzyskane z siatkówki myszy stanowią bardzo solidne i niezawodne narzędzie do badania konwersji gleju w komórki progenitorowe siatkówki po leczeniu mikroRNA. Pojedyncze cząsteczki lub ich kombinacje mogą być badane przed ich późniejszym zastosowaniem w metodach in vivo.

Streszczenie

Glej Müllera (MG) są dominującym glejem w siatkówce nerwowej i mogą funkcjonować jako źródło regeneracji neuronów siatkówki. U niższych kręgowców, takich jak ryby, regeneracja napędzana przez MG zachodzi naturalnie; U ssaków wymagana jest jednak stymulacja pewnymi czynnikami lub manipulacja genetyczna/epigenetyczna. Ponieważ MG stanowią tylko 5% populacji komórek siatkówki, istnieje zapotrzebowanie na systemy modelowe, które pozwalają na badanie wyłącznie tej populacji komórek. Jednym z tych systemów modelowych są pierwotne hodowle MG, które są powtarzalne i mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, w tym do badań przesiewowych i identyfikacji cząsteczek/czynników, testowania związków lub czynników, monitorowania komórek i/lub testów funkcjonalnych. Model ten służy do badania potencjału mysiego MG do przekształcania się w neurony siatkówki po suplementacji lub hamowaniu mikroRNA (miRNA) poprzez transfekcję sztucznych miRNA lub ich inhibitorów. Zastosowanie myszy reporterowych specyficznych dla MG w połączeniu z znakowaniem immunofluorescencyjnym i sekwencjonowaniem jednokomórkowego RNA (scRNA-seq) potwierdziło, że 80%-90% komórek znalezionych w tych hodowlach to MG. Korzystając z tego modelu, odkryto, że miRNA mogą przeprogramować MG w komórki progenitorowe siatkówki (RPC), które następnie różnicują się w komórki podobne do neuronów. Zaletą tej techniki jest to, że kandydaci na miRNA mogą być testowani pod kątem ich skuteczności i wyników przed ich użyciem w zastosowaniach in vivo.

Wprowadzenie

Glej Müllera (MG) to dominujący glej w siatkówce nerwowej. Mają podobne funkcje w porównaniu z innymi komórkami glejowymi w innych częściach ośrodkowego układu nerwowego, takie jak utrzymanie homeostazy wody i jonów, odżywianie neuronów i ochrona tkanki. MG mają jeszcze jedną fascynującą cechę: chociaż są dojrzałymi glejami, nadal wyrażają wiele genów wyrażanych w komórkach progenitorowych siatkówki (RPC) w późnym okresie rozwoju1,2. Zakłada się, że to podobieństwo jest przyczyną naturalnie występującej regeneracji neuronów opartej na MG w siatkówce ryby po uszkodzeniu siatkówki3,4. Podczas tego procesu MG ponownie wchodzi do cyklu komórkowego i deróżnicuje się w RPC, które następnie różnicują się we wszystkich sześciu typach neuronów siatkówki. Chociaż zjawisko to występuje naturalnie u ryb, MG ssaków nie przekształcają się w neurony5,6. Można je jednak przeprogramować. Wykazano, że wiele czynników przeprogramowuje MG w RPC/neurony; wśród tych czynników jest podstawowy czynnik transkrypcyjny helisa-pętla-helisa (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1), który bierze udział w regeneracji ryb7,8. U myszy Ascl1 ulega ekspresji tylko w RPC podczas retinogenezy, ale nie występuje w dojrzałych MG lub neuronach siatkówki9.

Przeprogramowanie komórek bezpośrednio in vivo jest nie tylko wyzwaniem metodologicznym, ale także wymaga zgody instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt. Aby uzyskać zatwierdzenie, wymagane są wstępne dane dotyczące zastosowanego lub zmienionego czynnika (czynników), stężeń, skutków niedocelowych, mechanizmów leżących u podstaw objawów, toksyczności i skuteczności. Systemy hodowli komórkowych umożliwiają testowanie tych kryteriów przed użyciem w modelach in vivo. Ponadto, ponieważ MG stanowią tylko około 5% całej populacji komórek siatkówki10, hodowle MG pozwalają na badanie ich funkcji11, a także ich zachowania, w tym migracji12,13, proliferation14, reakcja stresowa na uraz/uszkodzenie15,16, ich interakcja z innymi typami komórek, takimi jak mikroglej17 lub komórki zwojowe siatkówki (RGC)18, lub ich potencjał neurogenny19,20,21. Wielu badaczy wykorzystuje unieśmiertelnione linie komórkowe do swoich badań, ponieważ mają one nieograniczony potencjał proliferacyjny i mogą być łatwo utrzymywane i transfekowane. Komórki pierwotne są jednak preferowane do testów biologicznie istotnych niż komórki unieśmiertelnione, ponieważ mają prawdziwe cechy komórkowe (ekspresję genów i białek) i, co ważniejsze, reprezentują pewien etap rozwoju, a zatem mają "wiek". Wiek zwierzęcia (a co za tym idzie komórek uzyskanych od zwierzęcia) jest szczególnie istotnym czynnikiem w przeprogramowywaniu komórek, ponieważ plastyczność komórek zmniejsza się wraz z postępem etapu rozwoju22.

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprogramować pierwotne MG za pomocą miRNA jako aktualną metodę in vitro do badania regeneracji. Ten model hodowli pierwotnej MG został opracowany w 2012 roku w celu oceny charakterystyki proliferacji komórek MG u myszy z nokautem P53 (myszy trp53-/-)23. Wykazano, że hodowane MG zachowują swoje cechy glejowe (tj. ekspresję białek S100β, Pax6 i Sox2 ocenianą za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego) i że przypominają one in vivo MG (mikromacierz MG oczyszczonego FACS)23. Wkrótce potem mRNA glejowe i ekspresja białka zostały zwalidowane i potwierdzone w innym podejściu przy użyciu wektorów wirusowych20. Kilka lat później potwierdzono, że zdecydowana większość komórek znalezionych w tych hodowlach to MG przy użyciu specyficznego dla MG Rlbp1CreERT:tdTomatoreporter mouse24. Co więcej, kwantyfikacja zestawu miRNA zarówno w MG oczyszczonym FACS, jak i hodowanym pierwotnym MG wykazała, że poziomy miRNA MG (mGLiomiR) nie różnią się zbytnio w hodowanym MG w fazie wzrostu. Wydłużone okresy hodowli powodują jednak zmiany w poziomach miRNA, a co za tym idzie w poziomach mRNA i ekspresji białek, ponieważ miRNA są regulatorami translacyjnymi25.

W 2013 roku ten model hodowli MG został wykorzystany do przetestowania różnych czynników transkrypcyjnych pod kątem ich zdolności do przeprogramowania MG na neurony siatkówki20. Stwierdzono, że Ascl1 jest bardzo solidnym i niezawodnym czynnikiem przeprogramowującym. Nadekspresja Ascl1 za pośrednictwem wektorów wirusowych indukowała zmiany morfologiczne, ekspresję markerów neuronalnych i nabywanie właściwości elektrofizjologicznych neuronów. Co ważniejsze, spostrzeżenia i wyniki uzyskane z tych pierwszych eksperymentów in vitro zostały z powodzeniem przeniesione do aplikacji in vivo22,26, wykazując, że pierwotne hodowle MG stanowią solidne i wiarygodne narzędzie do wstępnych badań przesiewowych czynników i oceny cech glejowych przed wdrożeniem in vivo.

Kilka lat temu pokazano, że wzbogacone w mózg miRNA miR-124, które jest również wysoko wyrażane w neuronach siatkówki, może indukować ekspresję Ascl1 w hodowlanych MG21. Ekspresję Ascl1 w żywych komórkach wizualizowano za pomocą myszy reporterowej Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Mysz reporterowa to genetycznie zmodyfikowana mysz, która ma gen reporterowy wstawiony do swojego DNA. Ten gen reporterowy koduje białko reporterowe, które w tym badaniu jest tdTomato, białkiem czerwonej fluorescencji. To białko reporterowe informuje o ekspresji interesującego genu, w tym przypadku Ascl1. Innymi słowy, komórki, które wyrażają Ascl1, zmienią kolor na czerwony. Ponieważ Ascl1 jest wyrażany tylko w RPCs9, ta mysz Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl umożliwia śledzenie konwersji MG do RPC z ekspresją Ascl1, co oznacza, że konwertujące komórki będą wyrażać czerwone fluorescencyjne białko reporterowe tdTomato. Jest to nieodwracalne etykietowanie, ponieważ DNA tych komórek jest zmienione. W związku z tym każde późniejsze różnicowanie neuronów zostanie uwidocznione, ponieważ etykieta tdTomato pozostaje w różnicujących się komórkach. Jeśli ekspresja Ascl1 RPC pochodząca z MG (z etykietą tdTomato) różnicuje się w neurony, neurony te nadal będą miały swoją czerwoną etykietę. Mysz ta umożliwia zatem nie tylko znakowanie RPC pochodzących od MG do obrazowania żywych komórek, ale także umożliwia mapowanie losów i śledzenie linii tych pochodzących z MG (czerwonych) RPC. Niedawno zidentyfikowano zestaw miRNA w RPC, a kultury MG myszy Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter wykorzystano do badań przesiewowych i testowania wpływu tych miRNA na zdolność i wydajność przeprogramowywania27. Okazało się, że jeden z kandydatów, miR-25 RPC-miRNA, jest zdolny do przeprogramowania hodowanego MG w komórki wykazujące ekspresję Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Te przeprogramowane komórki z czasem przyjmują cechy neuronalne, w tym morfologię neuronów (małe somaty i krótkie lub długie drobne procesy), ekspresję transkryptów neuronalnych mierzoną za pomocą scRNA-Seq, a także ekspresję białek neuronalnych zwalidowaną za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego27.

Tutaj protokół szczegółowo opisuje, jak hodować i transfekować MG z myszy P12 zaadaptowanych z poprzedniej pracy21,24,27. Do tego protokołu wybrano wspomniany miRNA miR-25, miRNA o wysokiej ekspresji w RPC, z niskimi poziomami ekspresji w MG lub neuronach siatkówki. W celu nadekspresji miR-25 stosuje się mysie mimiki miR-25, czyli sztuczne cząsteczki miRNA. Jako kontrolę wybiera się mimimikę miRNA z Caenorhabditis elegans, która nie pełni żadnej funkcji w komórkach ssaków. Wizualizacja konwersji MG na RPC została zrealizowana za pomocą myszy reporterowej RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), myszy o mieszanym tle (szczepy C57BL/6, S129 i ICR). Hodowlę tę można jednak przeprowadzić ze wszystkimi szczepami myszy, w tym ze szczepami typu dzikiego. W ciągu ostatnich kilku lat pierwotny protokół został zmodyfikowany w celu skrócenia czasu trwania fazy wzrostu i ogólnego okresu hodowli oraz zapewnienia bardziej solidnego statusu komórek glejowych i zminimalizowania stopnia degeneracji komórek, która występuje w dłuższych okresach hodowli. Wydłużono również regularne okno czasowe transfekcji z 3 h do 2 dni. Jak wspomniano wcześniej, chociaż obecny protokół opisuje hodowle MG jako narzędzie do badań nad regeneracją, metoda jest nie tylko przydatna do testowania czynników przeprogramowujących, ale może być również dostosowana do innych zastosowań, w tym badań nad zachowaniami migracyjnymi lub proliferacyjnymi MG, paradygmatami związanymi z urazami/uszkodzeniem komórek i/lub identyfikacją podstawowych mechanizmów i szlaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w SUNY College of Optometry.

UWAGA: Ten protokół hodowli składa się z trzech faz: wzrostu, transfekcji i fazy konwersji. Podsumowanie całego protokołu wraz z osią czasu znajduje się w Rysunek 1.

1. Przygotowanie pożywki i wszystkich wymaganych odczynników

UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego A2 lub B2 (BSC). W fazie wzrostu stosuje się pożywkę wzrostową o wysokiej zawartości surowicy, która składa się z podstawowego podłoża neuronalnego uzupełnionego naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF). W fazie konwersji stosuje się neurofizjologiczne podłoże podstawowe o niskiej surowicy uzupełnione suplementami neuronalnymi w celu zapewnienia różnicowania neuronów i przeżycia.

  1. Przygotuj pożywkę wzrostową (używaną w fazie wzrostu), uzupełniając 200 ml podstawowego podłoża neuronalnego 20 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, 10%), 1 ml 200 ml L-glutaminy (0,5%), 2 ml penicyliny/streptomycyny (1%) i 2 ml suplementu N2 (1%). Wykonaj sterylną filtrację (jednostki filtrujące o wielkości porów 0,22 μm). Przed użyciem podgrzej podłoże w kąpieli z metalowymi kulkami w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować pożywkę neuronalną (używaną w fazie konwersji) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów), uzupełniając 100 ml bezsurowicowej neurofizjologicznej pożywki podstawowej 2 ml suplementu neuronalnego B27 (2%), 1 ml suplementu N2 (1%), 20 μl 100 ng/ml neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF, rozpuścić w 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, stężenie końcowe 20 ng / ml), 20 μl 100 ng / ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z komórek glejowych (GDNF, rozpuszczony w sterylnym roztworze soli Hanksa [HBSS], stężenie końcowe 20 ng / ml), 500 μL 100 mg / ml Dibutyryl-cAMP (rozpuszczony w DMSO), 70 μl kwasu askorbinowego 50 ng / ml (rozpuszczony w sterylnym PBS) i 1,5 ml penicyliny/streptomycyny. Wykonaj sterylną filtrację (jednostki filtrujące o wielkości porów 0,22 μm). Przed użyciem wstępnie podgrzej podłoże w kąpieli z metalowymi kulkami w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Nośniki te można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
  3. Rozpuść odczynniki papainy, DNazy I i owomkoidu wymagane do dysocjacji siatkówki zgodnie z protokołem producenta. Podwielokrotność 750 μl papainy w sterylnych probówkach o pojemności 1,5 ml, 75 μl DNazy I w sterylnych probówkach o pojemności 0,6 ml i 750 μl inhibitora proteazy jajomkoidalnej w probówkach o pojemności 2 ml. Zamrozić podwielokrotności papainy i DNazy I w temperaturze -20 °C i utrzymać podwielokrotności ovomukoidów w temperaturze 4 °C, aby uniknąć degradacji odczynników. Rozmrozić w temperaturze pokojowej tuż przed użyciem.
    UWAGA: Papaina, DNaza I i Ovomukoid znajdują się w zestawie zwanym systemem dysocjacji papainy (patrz tabela materiałów).
  4. Rozpuścić poli-L-ornitynę (Poly-O) i Lamininę do powlekania szkiełka nakrywkowego, jeśli znakowanie immunofluorescencyjne przeprowadza się zgodnie z instrukcjami w arkuszu danych (Poly-O: 0,1 mg/ml w sterylnej wodzie; Laminina: rozcieńczyć 1,2 mg/ml w 1:50 w DMEM). Podwielokrotność poli-O i Lamininy (2,5 ml) i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Rozmrozić w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.
    UWAGA: Krok 1.4. jest wymagany tylko wtedy, gdy przeprowadza się znakowanie immunofluorescencyjne i laserową mikroskopię skaningową.

2. Myszy i ekstrakcja tkanek

UWAGA: Na potrzeby tych badań nad przeprogramowaniem, mysz Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl została stworzona przez skrzyżowanie myszy Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) z myszą tdTomatoSTOPfl/fl (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Ta mysz ma mieszane tło (C57BL/6, S129 i szczep ICR). Genotyp tej myszy jest pokazany w Rysunek 1A. W tym protokole można użyć wszystkich szczepów.

  1. Noś rękawice i zdezynfekuj miejsce pracy, w tym mikroskop preparacyjny i wszystkie drobne narzędzia (kleszczyki precyzyjne Dumont #5 i zakrzywione kleszcze Dumont #7, cienkie nożyczki i nożyczki Vannas) 70% etanolem. Zdezynfekuj 10 cm czarne naczynie do rozwarstwiania pokryte silikonem, wystawiając je na działanie światła UV przez 20 minut.
  2. Przygotowanie naczyń i talerzy do ekstrakcji tkanek
    1. Przygotować 24-dołkową płytkę do pobrania oka i oddzielenia próbki (dwoje oczu na mysz w jednym dołku, oznaczone identyfikatorami myszy) z ~1 ml zimnego HBSS (4 °C) na studzienkę. Umieść 24-dołkową płytkę na lodzie.
    2. Napełnij sterylną 10-centymetrową szalkę Petriego (do mycia) i odkażone, pokryte silikonem naczynie preparacyjne kilkoma ml zimnego HBSS (4 °C), aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie pokryta HBSS.
    3. Przygotuj sterylną probówkę o pojemności 1,5 ml z 1 ml 70% etanolu.
    4. Przygotuj 12-dołkową płytkę hodowlaną, oznaczając ją numerem kultury, datą, szczepem i wszystkimi wymaganymi informacjami.
  3. Poddaj eutanazji myszy P12 przy użyciu dowolnej zatwierdzonej metody.
  4. Usuwanie oczu
    1. Delikatnie przytrzymaj główkę myszy kciukiem i palcem wskazującym wokół oka.
    2. Używając zakrzywionych kleszczy Dumont #7, delikatnie przejdź za gałkę oczną i przytnij nerw wzrokowy. Ostrożnie wyjmij oko.
      UWAGA: Jeśli używane są dorosłe myszy, nie używaj zakrzywionych kleszczy i nie ciągnij za oko. Zamiast tego ostrożnie przetnij wokół gałki oka za pomocą cienkich nożyczek; Przetnij nerw wzrokowy, ale nie przecinaj samego oka. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć gałkę oczną.
  5. Oczyszczanie gałek ocznych
    1. Zanurz na krótko gałkę oczną w probówce zawierającej etanol, aby uniknąć przeniesienia bakterii ze zwierzęcia.
    2. Umyć krótko gałkę oczną na 10-centymetrowej szalce Petriego przed umieszczeniem jej na płytce 24-dołkowej na lodzie.
  6. Powtórz kroki 2.4 i 2.5 dla pozostałych oczu. Podczas tego procesu utrzymuj płytkę studzienki na lodzie. Umieść dwoje oczu jednego zwierzęcia w naczyniu separacyjnym umieszczonym pod mikroskopem preparacyjnym ze źródłem światła.
  7. Ekstrakcja siatkówki
    1. Unieruchom jedną gałkę oczną, chwytając nerw wzrokowy i otaczającą go tkankę łączną wokół twardówki za pomocą cienkich kleszczyków Dumont #5 i ostrożnie dociśnij ją do naczynia preparacyjnego (rogówka do góry).
    2. Zrób otwór w środku rogówki za pomocą igły 30 G, aby umożliwić łatwiejszy dostęp nożyczkom Vannas.
    3. Wypreparuj rogówkę wokół ciała rzęskowego za pomocą nożyczek Vannas i ostrożnie usuń rogówkę, soczewkę, tęczówkę i ciało szkliste za pomocą cienkich kleszczyków Dumont #5. Rysunek 2A przedstawia muszlę oczną z siatkówką w środku.
    4. Wypreparuj twardówkę nożyczkami Vannas, aż do dotarcia do nerwu wzrokowego. Przytnij nerw wzrokowy i ostrożnie usuń siatkówkę za pomocą cienkich kleszczy Dumont #5.
    5. Użyj drugiej pary cienkich kleszczyków Dumont #5, aby docisnąć siatkówkę i umożliwić całkowite usunięcie ciała szklistego. Rysunek 2B przedstawia dwie pobrane siatkówki.
  8. Przenieś i umyj
    1. Wytnij około 2,5 cm końcówki sterylnej pipety transferowej, aby zwiększyć średnicę. Za pomocą tej końcówki podnieś (zassaj) całe siatkówki bez uszkadzania tkanki.
    2. Przenieś siatkówki na nową sterylną szalkę Petriego z zimnym HBSS (4 °C) i kołysz szalką (w przód i w tył, w lewo i w prawo).
    3. Za pomocą końcówki pipety transferowej ostrożnie dociśnij siatkówkę, aby zmyć komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE).
      UWAGA: Alternatywnie całą siatkówkę z soczewką i ciałem szklistym można usunąć z muszli ocznej. Następnie soczewka i ciało szkliste mogą zostać usunięte z pobranej siatkówki. Jeśli siatkówka jest rozerwana, upewnij się, że zebrałeś wszystkie części do dysocjacji; W przeciwnym razie nie będzie wystarczającej ilości tkanki, aby wytworzyć zlewające się warstwy komórek.
  9. Natychmiast umieść izolowaną siatkówkę w nowym, czystym dołku 24-dołkowej płytki wypełnionej 1 ml HBSS. Trzymaj 24-dołkową płytkę na lodzie podczas procesu preparacji.
  10. Powtórz kroki 2.7-2.9, aby wyizolować drugą siatkówkę.

3. Dysocjacja siatkówki

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki (aż do pobrania komórek) muszą być przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego A2 lub B2 (BSC).

  1. Przygotować mieszaninę dysocjacyjną papaina/DNaza I w następujący sposób.
    1. W przypadku sześciu siatkówek dodać 75 μl DNazy I do probówki zawierającej 750 μl papainy (z kroku 1.3) i dokładnie wymieszać (mieszanina dysocjacyjna).
    2. W celu indywidualnego przygotowania próbki, która jest wymagana w tym protokole, należy podzielić całkowitą objętość 825 μl na trzy podwielokrotności: 275 μl mieszaniny w jednej probówce o pojemności 1,5 ml na mysz (dwie siatkówki). Oblicz odpowiednio wymagane ilości DNazy I i papainy.
      UWAGA: W jednej probówce mieszaniny papainy/DNazy I można zdysocjować do sześciu siatkówk. Jednak przygotowanie pojedynczej próbki skutkuje mniejszą liczbą grudek i lepszym wzrostem komórek niż w próbkach łączonych.
  2. Przenieś dwie siatkówki do mieszaniny dysocjacji papainy/DNazy I. Użyć pipety transferowej o powiększonej średnicy końcówki (krok 2.8.1), pobrać siatkówki, poczekać, aż siatkówki osiądą na dnie końcówki, a następnie uwolnić siatkówki bez nadmiernego HBSS do probówki zawierającej mieszaninę papainy/DNazy I.
  3. Umieścić na nutatorze i inkubować przez 10 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ).
  4. Oddziel komórki, ostrożnie pipetując w górę i w dół (około 20-30 razy) za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Po dysocjacji komórek (tj. w wyniku uzyskania jednorodnego roztworu bez kawałków) dodaj 275 μl inhibitora proteazy jajomkoidalnej z zestawu do dysocjacji papainy, aby zneutralizować papainę. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Jeśli sześć siatkówk zostało zdysocjowanych w 825 μl mieszaniny papainy/DNazy I, wymagane jest 825 μl owomkoidu.
  5. Odwirować mieszaninę przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Dodać naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, 1 μl na 1 ml pożywki wzrostowej, rozpuszczony w 200 μg/ml w PBS) do obliczonej objętości pożywki wzrostowej (1 ml na mysz) wstępnie ogrzanej w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W zależności od projektu doświadczalnego, na początku okresu hodowli można dodać marker proliferacji 5-etynylo-2'-deoksyurydynę (EdU), a także 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT) lub inne wymagane czynniki.
  7. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Nie dotykaj granulki na dnie tuby.
  8. Usunąć supernatant ostrożnie i całkowicie. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 500 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF.
  9. Przenieś zawiesinę komórek do jednego dołka na oznakowanej płytce 12-dołkowej (Rysunek 2C). Przepłukać probówkę kolejnymi 500 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF i dodać ją do dołka (całkowita objętość 1 ml na studzienkę).
  10. Powtórzyć kroki 3.8 i 3.9 dla wszystkich pozostałych próbek.
  11. Ostrożnie obróć płytkę studzienki trzy razy (w przód iw tył; w lewo i w prawo). Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, CO2).
    UWAGA: Jeśli używane są myszy transgeniczne, wykonaj genotypowanie dla każdego zwierzęcia ( Rysunek 2D). Zidentyfikuj myszy z dodatnim i ujemnym wynikiem rekombinazy Cre i odpowiednio oznacz płytkę. W tym protokole do kolejnych kroków wykorzystano tylko komórki myszy reporterowych z dodatnim wynikiem rekombinazy Cre. Komórki próbek Cre ujemnych są zamrażane i wykorzystywane do innych zastosowań.

4. Faza wzrostu

UWAGA: Faza wzrostu trwa około 4-5 dni (Rysunek 1B). W celu dodawania cieczy do studzienek zawierających komórki, pipeta musi być skierowana na ścianę studzienki, a ciecz musi być uwalniana powoli, aby uniknąć oderwania się komórek. Nie pipetować bezpośrednio na komórki.

  1. Jeden dzień po dysocjacji usuń pożywkę i dodaj 1 ml świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF.
  2. W dniu 3 usuń pożywkę i dodaj 1 ml HBSS (temperatura pokojowa), aby usunąć resztki komórek. Kołysz się delikatnie w przód iw tył od lewej do prawej. Usuń HBSS, powtórz etap mycia i dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF.
  3. Monitoruj komórki każdego dnia i oceniaj ich stan wzrostu, aż komórki osiągną 90%-100% konflufluacji. Rysunek 3 pokazuje przykład dobrego wzrostu MG w czasie. Sprawdź, czy nie ma możliwego zanieczyszczenia lub śmierci komórki (rysunek uzupełniający 1). Wyrzuć skażone kultury.
    UWAGA: Aby monitorować i rejestrować stan komórek, wykonuj obrazy w różnych powiększeniach za pomocą mikroskopu świetlnego z dołączoną kamerą i obiektywami 4x, 10x lub 20x. W tym badaniu używany jest mikroskop fluorescencyjny.

5. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych z powłoką poli-L-ornitynową (Poly-O) i Lamininą

UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy przeprowadza się znakowanie immunofluorescencyjne i konfokalną laserową mikroskopię skaningową. Do prawidłowego obrazowania wymagane są okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 12 mm). Protokół powlekania można również znaleźć w arkuszu danych pożywki neuronalnej (patrz tabela materiałów).

  1. Sterylne szkiełka nakrywkowe należy ostrożnie umieścić na środku każdej studzienki 24-dołkowej płytki za pomocą sterylnych kleszczyków Dumont #2AP.
    UWAGA: Umieść szkiełka nakrywkowe na środku studni. Umieszczenie szkiełek nakrywkowych blisko ściany studni spowoduje problemy z napięciem powierzchniowym w kolejnych krokach.
  2. Rozmrozić 2,5 ml podwielokrotności polio-o w temperaturze pokojowej i umieścić 100 μl na środku każdego szkiełka nakrywkowego.
  3. Inkubować płytkę dołka przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  4. Usuń Poly-O i umyj studzienkę szkiełkiem nakrywkowym trzy razy ~ 1 ml sterylnej wody.
  5. Pozostaw płytkę studzienki do wyschnięcia na noc w BSC. Rozmrozić 2,5 ml Lamininy w temperaturze 4 °C przez noc.
  6. Następnego ranka dodać 100 μl Lamininy na środek każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  7. Usuń Laminin ostrożnie i całkowicie.
  8. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C, jeśli przejście nie może być wykonane natychmiast.
    UWAGA: Powlekane szkiełka nakrywkowe w przygotowanych płytkach można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C.

6. Przejście komórkowe w celu usunięcia ocalałych neuronów

UWAGA: Przejście komórkowe jest niezbędne do usunięcia komórek nerwowych, a nie do zwiększenia populacji komórek. Glej dzieli się tylko kilka razy i nie będzie dalej rósł po pasażu. Nie rozcieńczać zawiesin komórkowych. Komórki z jednej studzienki zlewającej się płytki 12-dołkowej można rozprowadzić na jednym dołku płytki 12-dołkowej lub dwóch dołkach płytki 24-dołkowej. W przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych powlekanych powlekana jest tylko około jedna trzecia szkiełka nakrywkowego. Dlatego sześć szkiełek nakrywkowych znajdujących się na 24-dołkowej płytce z zlewającymi się komórkami (~ 80%-90%) można uzyskać z jednego dołka zlewających się komórek 12-dołkowej płytki. Można również wybrać inne proporcje, aby zwiększyć lub zmniejszyć gęstość komórek. Do tego protokołu używa się jednej myszy reporterowej Cre+ [jeden eksperyment, dwa zabiegi: miR-25 lub kontrola-miR; kontrpróby techniczne n = 3 (trzy szkiełka nakrywkowe na zabieg), replika biologiczna n = 1]. Liczba kontrprób technicznych i biologicznych może być różnie zdefiniowana w zależności od projektu doświadczalnego.

  1. Sprawdź, czy komórki są zlewające się w 90%-100% (również na brzegu studzienki; Rysunek 3E,F).
  2. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml HBSS (temperatura pokojowa) do umycia. Delikatnie kołysz talerzem (w przód iw tył, w lewo i w prawo). Całkowicie usuń HBSS.
  3. Dodać 500 μl wstępnie podgrzanego roztworu zawierającego trypsynę (wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C w kąpieli z metalowymi kulkami) w celu odłączenia komórek od studzienki. Kołysz delikatnie (w przód i w tył, od lewej do prawej) i inkubuj przez 2 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  4. Przenieść płytkę z inkubatora do BSC. Przechylając się, zassaj roztwór zawierający trypsynę i rozprowadź go ostrożnie i powoli kilka razy w studzience, aż komórki całkowicie się oderwą. Trzymaj płytkę pod światło i upewnij się, że na dole nie pozostały żadne komórki.
  5. Przenieść tę zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 300 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając 600 μl (100 μl na studzienkę na 6 dołków/szkiełka nakrywkowe) wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej (uzupełnionej EGF; 1:1000). i pipetowanie w górę iw dół ~30-40 razy.
    UWAGA: Komórki można w tym czasie zamrozić w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie i rozmrozić zgodnie ze standardowymi protokołami rozmrażania linii komórkowych. Jeśli komórki zostaną zamrożone, nie zostaną ponownie zawieszone w pożywce uzupełnionej EGF (pożywce wzrostowej). Zostaną one ponownie zawieszone w pożywce zasadowej (bez EGF) i roztworze zamrażającym (stosunek 1/1). Kroki od 6.1.1 do 6.6.2 opisują etapy zamrażania komórek. Jeśli żadna komórka nie została zamrożona, przejdź do kroku 6.7.
    1. Przygotować roztwór do zamrażania, mieszając 100 μl DMSO i 400 μl FBS (całkowita objętość 500 μl na studzienkę/próbkę).
    2. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej. Dodać zawiesinę komórek do 500 μl roztworu do zamrażania DMSO/FBS (całkowita objętość 1 ml). Trzymaj probówki na lodzie, dopóki wszystkie próbki nie zostaną przetworzone. Zamrażać komórki w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Komórki nasienne poprzez umieszczenie 100 μl zawiesiny komórek/pożywki o objętości 600 μl (krok 6.6) w środku sześciu powlekanych szkiełek nakrywkowych (patrz krok 5) płytki 24-dołkowej. Ostrożnie umieścić płytkę w inkubatorze i pozwolić komórkom osiąść.
    UWAGA: 100 μl zawiesiny komórek o objętości 600 μl (pobranej z jednego dołka płytki 12-dołkowej) spowoduje zbieżność komórek w 90%-100%, co jest wymagane do transfekcji.
  8. Po 3 godzinach sprawdź komórki, aby zobaczyć, czy osiadły na szkiełku nakrywkowym. Dodać 400 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF.
    UWAGA: Komórki są zwykle gotowe do transfekcji następnego dnia (Rysunek 3G). Jeśli nie zlewają się (90%-100%), pozostaw je na kolejny dzień. Jeśli nadal nie zlewają się, nie używaj ich do transfekcji. Jeśli prowadzone są inne dalsze zastosowania, takie jak profilowanie miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR lub western blot, komórki muszą zostać przeniesione na 12-dołkowe płytki (stosunek 1:1; nie jest wymagana obróbka płytki) i zebrane w celu ekstrakcji RNA/białka.

7. Transfekcja

UWAGA: Faza transfekcji składa się z 3-godzinnej fazy w samym pożywce transfekcyjnej (procedury transfekcji są opisane w instrukcji transfekcji dołączonej do odczynnika do transfekcji) i fazy wydłużonej, w której odczynnik transfekcji i miRNA są nadal obecne, ale dodawana jest pożywka neuronalna z wymaganymi suplementami (całkowity czas trwania to 2 dni; Rysunek 1B). W tym protokole transfekowane zostanie sześć dołków: trzy dołki otrzymają przeprogramowane miRNA miR-25, a trzy dołki otrzymają kontrolne miRNA.

  1. Sprawdź, czy komórki osiągnęły 90% zbieżności i zapisz/zobrazuj komórki przed transfekcją.
  2. Usuń pożywkę wzrostową i dodaj 500 μl HBSS (temperatura pokojowa), aby umyć komórki.
  3. Usunąć HBSS i dodać 400 μl zredukowanej pożywki surowicy używanej do transfekcji. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  4. Przygotować mieszaninę do transfekcji, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole odczynnika do transfekcji producenta. Wykonaj dwie mieszaniny: mieszaninę odczynników do transfekcji i mieszaninę miRNA (patrz ilustracja 1B).
    1. Przygotuj mieszaninę odczynników do transfekcji: W przypadku płytki 24-dołkowej na jedną studzienkę potrzeba 49 μl zredukowanej pożywki surowicy i 1 μl odczynnika do transfekcji (łącznie 50 μl). W przypadku sześciu studzienek 294 μl zredukowanej pożywki surowicy i 6 μl odczynnika do transfekcji łączy się i dobrze miesza, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    2. Przygotuj mieszaninę mimiczną miRNA: W przypadku płytki 24-dołkowej na jedną studzienkę wymagana jest całkowita objętość 50 μl mieszaniny mimicznej. Trzy dołki otrzymają kontrolne miRNA, a pozostałe trzy dołki zostaną potraktowane miR-25. W przypadku tego protokołu stosuje się stężenie końcowe 200 nM.
      1. W przypadku leczenia miR-25 (trzy dołki) 150 μl zredukowanej pożywki surowicy i 3 μl mimików miR-25 (100 μM roztwór podstawowy) łączy się i dobrze miesza, delikatnie pipetując w górę iw dół. Inkubować przez 5 min.
        W przypadku leczenia kontrolnego naśladującego (trzy dołki) 150 μl zredukowanej pożywki surowicy i 3 μl kontrolnej pożywki miRNA (100 μM roztwór podstawowy) łączy się i dobrze miesza, delikatnie pipetując w górę iw dół. Inkubować przez 5 min.
        UWAGA: Objętość miRNA naśladuje zależność od potrzebnego współczynnika rozcieńczenia i stężenia (20-500 nM). Można również stosować inhibitory miRNA (antagomiRs) lub inne cząsteczki, w tym plazmidy. Możliwe jest również transfekowanie kombinacji cząsteczek.
  5. Połącz mieszaninę mimiczną miRNA i mieszaninę odczynników do transfekcji. Mieszać ostrożnie, pipetując powoli i dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (zgodnie z instrukcjami producenta).
  6. Dodawać powyższą mieszaninę transfekcji kroplami i powoli na wierzch komórek, blisko powierzchni pożywki w studzience za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Delikatnie kołysz talerzem (w przód iw tył, od lewej do prawej).
  7. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  8. Po 3 godzinach dodaj pożywkę neuronalną do studzienek (500 μl na studzienkę) uzupełnioną 4-hydroksytamoksyfenem (5 mM zapasu rozpuszczonego w 2,58 ml etanolu, stężenie końcowe 250 nM) w celu aktywacji rekombinazy Cre i 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU, 10 mM roztwór podstawowy rozpuszczony w 2 ml DMSO, 1 μM stężenie końcowe) w celu śledzenia proliferacji komórek.
    UWAGA: Wiadomo, że 4-hydroksytamoksyfen i EdU są czynnikami rakotwórczymi dla ludzi, teratogenami i mutagenami. Przeczytaj kartę charakterystyki substancji niebezpiecznej przed użyciem i załóż rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny. Oba odczynniki należy rozpuścić zgodnie z zaleceniami producenta. Nie wdychać substancji/mieszaniny. Po użyciu szczelnie zamknąć. Odpady należy utylizować zgodnie z przepisami krajowymi i lokalnymi. Umyć ręce i twarz po pracy z substancją.
  9. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2 dni (Rysunek 1B).

8. Konwersja komórek

UWAGA: Faza konwersji komórek trwa około 5-6 dni (Rysunek 1B), ale możliwe są dłuższe okresy.

  1. Codziennie sprawdzaj komórki pod kątem pomyślnej indukcji ekspresji tdTomato, potencjalnej śmierci komórki i/lub zanieczyszczenia. Gęstość komórek nie zmienia się (Rysunek 4). Pierwsze słabe komórki znakowane czerwoną fluorescencją można zaobserwować 1 dzień po leczeniu 4-hydroksytamoksyfenem. Do monitorowania i obrazowania komórek wymagany jest mikroskop fluorescencyjny.
    UWAGA: W tym badaniu do obrazowania na żywo używany jest mikroskop fluorescencyjny. Zdjęcia są wykonywane obiektywami 4x, 10x lub 20x.
  2. Dwa dni po transfekcji usuń pożywkę i dodaj 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki neuronalnej uzupełnionej 4-hydroksytamoksyfenem i EdU do każdej studzienki.
  3. Zastępuj pożywkę świeżą pożywką co drugi dzień, aż do zebrania komórek.
  4. Wykonuj obrazy na żywo w celu oceny i oceny liczby komórek czerwonej fluorescencji (eksprymujących Ascl1) i ich zmian morfologicznych ( Rysunek 4 i Figura 5A-C).

9. Pobieranie komórek: utrwalanie do znakowania immunofluorescencyjnego

UWAGA: Komórki mogą być zbierane do innych dalszych zastosowań, w tym masowych lub scRNA-Seq, RT-qPCR, lub western blot.

  1. Usunąć pożywkę i dodać 500 μl zimnego HBSS (4 °C) do dołka i delikatnie kołysać płytką (w przód iw tył, od lewej do prawej). Usuń HBSS.
  2. Utrwal komórki, dodając 500 μl 2% paraformaldehydu (PFA) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Wykonaj znakowanie immunofluorescencyjne zgodnie z ustalonymi protokołami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje sposób hodowli komórek MG z siatkówek myszy P12 oraz metodę przeprogramowania tych komórek w neurony siatkówki za pomocą miR-25 z wykorzystaniem myszy reporterowej RPC Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl . Metoda ta została zastosowana w poprzednich pracach, w których szczegółowo opisano inne odpowiednie miRNA (mimetyki lub inhibitory, jako pojedyncze cząsteczki lub w kombinacjach) do przeprogramowania MG w RPC, które następnie przyjmują charakterystykę komórek neuronal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje, jak wyhodować MG ze zdysocjowanych siatkówek myszy w celu przeprogramowania badań przy użyciu miRNA. Jak wykazano i potwierdzono w wielu poprzednich badaniach, zdecydowana większość (80%-90%) komórek znalezionych w tych kulturach to MG20,23,24. Ta metoda jest bardzo solidną i niezawodną techniką, a wyniki można łatwo odtworzyć, jeśli protokół jest przestrzegany prawidłowo21,27

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Uniwersytet Waszyngtoński złożył wniosek patentowy zawierający niektóre z ustaleń zawartych w tym raporcie wraz z wynalazcami Nikolasem Jorstadem, Stefanie G. Wohl i Thomasem A. Rehem. Patent nosi tytuł "Metody i kompozycje stymulujące regenerację siatkówki.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Ann Beaton i wszystkim członkom laboratorium za ich wkład w pracę nad manuskryptem. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Toma Reha, Julii Pollak i Russa Taylora za wprowadzenie pierwotnych kultur MG jako narzędzia przesiewowego do SGW podczas stażu podoktorskiego na Uniwersytecie Waszyngtońskim w Seattle. Badanie zostało sfinansowane z grantu Empire Innovation Program (EIP) dla SGW oraz funduszy start-up od SUNY Optometry dla SGW, a także nagrody R01EY032532 od National Eye Institute (NEI) dla SGW.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Animals
Ascl1-CreERT mysz Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J Jaxlaboratories#012882Myszy Ascl1-CreERT skrzyżowano z myszami tdTomato-STOPfl
/fl  Klasa B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotypowanie jest wymagane w celu identyfikacji myszy Ascl1CreER dodatnich
odczynników
Z)-4-hydroksytamoksyfen, ≥ 98% izomer ZSigma-AldrichH7904-5MGrozpuszczony w etanolu, zamrożone podwielokrotności
16 % roztwór wodny paraformaldehydu (PFA)VWR100504-7822% PFA wykonane z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), zamrożone podwielokrotności
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment IgG Anty-Królicze IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152Rozcieńczenie 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment IgG IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-ludzkie Otx2, R& D SystemsFisher ScientificAF1979rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-królicze MAP2Sigma-AldrichM9942-200ULrozcieńczenie 1:250
Przeciwciała przeciwko białku czerwonej fluorescencji (RFP) -ABIN334653 rozcieńczenie online 1:500
Kwas askorbinowySTEMCELL Technologies72132rozpuszczony w PBS, mrożone podwielokrotności
Suplement B-27Fisher Scientific17-504-044mrożone podwielokrotności
Brain Phys NeuronalMedium STEMCELL Technologies05790używane jako podłoże neuronalne w sekcji 1.2, przechowywać w temperaturze 4 ° C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 647Fisher ScientificC10340odtworzyć następującą instrukcję, 4° C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (DMSO), mrożone podwielokrotności
dimetylosulfotlenku (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Fisher ScientificMT35010CVmrożone podwielokrotności
Gibco  Opti-MEM Obniżona pożywka surowicy, suplement GlutaMAXFisher Scientific51-985-034przechowywać w 4 stopniach; C
Gibco  TrypLE Express Enzyme (1X), czerwień fenolowaFisher Scientific12-605-028stosowany jako roztwór zawierający trypsynę, przechowywać w temperaturze 4 &; C
HBSSFisher Scientific14-025-134sklep pod adresem 4 ° C
Białko myszy Laminin, naturalneFisher Scientific23-017-015

mrożone podwielokrotności, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutaminaFisher Scientific25-030-081mrożone podwielokrotności
miRIDIAN mikroRNA Naśladuje Horyzont Kontroli NegatywnejCN-001000-01-50rozpuszczony w wodzie wolnej od RNaz (200 &mikro; M), zamrożone podwielokrotności
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p naśladujeHorizonC-310564-05-0050rozpuszczony w wodzie wolnej od RNaz (200 &mikro; M), mrożone podwielokrotności
N-2 SuplementFisher Scientific17-502-048mrożone podwielokrotności
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049stosowane jako pożywka wzrostowa w sekcji 1.1, przechowywać w temperaturze 4 & st; C
System dysocjacji papainyWorthington BiochemicznyLK003153odtworzony w zrównoważonym roztworze soli Earle'a, mrożone podwielokrotności
Penicylina StreptomycynaFisher Scientific15-140-122mrożone podwielokrotności
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Bromowodorek poli-L-ornitynySigma-AldrichP4538-50MGrozpuszczony w sterylnej wodzie, zamrożone podwielokrotności
Rekombinowane ludzkie białko BDNFR& D Systems248-BDB-050/CFrozpuszczony w sterylnych PBS i FBS, mrożone podwielokrotności
Rekombinowane mysie białko EGF FisherScientific2028EG200rozpuszczone w sterylnym PBS, mrożone podwielokrotności
Rekombinowane białko szczurze GDNF FisherScientific512GF010odtworzone w sterylnym PBS, zamrożone podwielokrotności
Rodamina Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka IgG anty-szczurzego (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150Rozcieńczenie 1:1,000
Medium do montażu na szkiełkuFisher ScientificOB100-01
Odczynnik do transfekcji (Lipofectamina 3000)Fisher ScientificL3000015przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
plasticware/supplies
0,6 ml probówka do mikrowirówekFisher Scientific50-408-120
1,5 ml probówka do mikrowirówekFisher Scientific50-408-129
10 &mikro; L WSKAZÓWKA  Filtr sterylny  Końcówki do pipetFisher Scientific02-707-439
100 µ L WSKAZÓWKA  sterylny filtr Końcówki do pipetFisher Scientific02-707-431
1000 µ L TIP sterylny filtr Końcówki do pipetFisher Scientific02-707-404
2,0 ml probówka do mikrowirówkiFisher Scientific50-408-138
20 µ L WSKAZÓWKA  sterylny filtr Końcówki do pipetFisher Scientific02-707-432
Pipety o regulowanej objętości (2,5, 10, 20, 100, 200 i 1000 i mikro; L)Eppendorf2231300008
Jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific13-669-12
Multiwell Płaskie płytki denne z pokrywkami, Liczba studzienek=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Płytki z płaskim dnem z pokrywkami, Liczba studzienek=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterylny filtr 10ML jednorazowy serologiczny PipetyFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterylny filtr 50ML Jednorazowe pipety serologiczneFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterylny filtr 5ML Jednorazowe pipety serologiczneFisher Scientific13-676-10H
Bezpudrowe rękawice nitryloweFisher Scientific19-130-1597B
Okrągłe szkiełka nakrywkowe (średnica 12 mm, grubość 0,17 - 0,25 mm)Fisher Scientific22293232
, wielkość porów = 0,22 i mikro; mFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermo Scientific1310
Wielofunkcyjny mikroskop fluorescencyjny Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Mikroskop stereoskopowy z zoomem lornetkowymVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Jednorazowe szalki Petriego (średnica 100 mm)VWR25384-088
Kleszcze Dumont #5 - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Kleszcze Dumont #55 - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Kleszcze zakrzywione Dumont #7 - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Wirówka Eppendorf 5430 REppendorf
Cienkie nożyczki - ostrenarzędzia naukowe14058-11
Nożyczki McPherson-Vannas, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metalowa wanna z koralikamiLab Armor74309-714
Mikser nutacyjny, elektryczny=115V, 60Hz, prędkości=24 obr/minVWR82007-202
Silikonowa dyssekcja szalki Petriego (90 mm średnica)Oprzyrządowanie systemów żywychDD-ECON-90-BLK-5PK
Pęseta, ekonomiczna #5World Precision Instruments501979
Inkubator CO2 z płaszczem wodnymVWR10810-744
(Filtr próżniowy 2231000508

Bibliografia

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632(2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330(2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759(2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423(2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377(2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556(2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204(2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603(2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279(2020).
  37. Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817(2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615(2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408(2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

glej komórek Müllerapierwotna hodowla komórkowakomórki progenitorowe siatkówkiregeneracja siatkówkiznakowanie immunofluorescencyjnesekwencjonowanie RNA pojedynczych komórekróżnicowanie neuronalnetransfekcja komórekmedycyna regeneracyjna
Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.