Artykuł metodologiczny

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63664

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

W tym artykule

Podsumowanie

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Streszczenie

Rozpraszanie neutronów daje możliwość badania dynamiki w próbkach dla szerokiego zakresu energii w sposób nieniszczący i bez oznaczania innego niż deuter. W szczególności spektroskopia rozpraszania wstecznego neutronów rejestruje sygnały rozpraszania pod wieloma kątami rozpraszania jednocześnie i dobrze nadaje się do badania dynamiki systemów biologicznych w skali czasowej ps-ns. Dzięki zastosowaniuD2O, i ewentualnie deuterowanych składników buforowych, metoda ta umożliwia monitorowanie zarówno dyfuzji środka masy, jak i ruchów szkieletu i łańcucha bocznego (dynamiki wewnętrznej) białek w stanie ciekłym.

Dodatkowo, dynamika wody hydratacyjnej może być badana za pomocą proszków perdeuterowanych białek uwodnionych H2O. W artykule przedstawiono przebieg pracy zastosowany w instrumencie IN16B w Instytucie Laue-Langevin (ILL) w celu zbadania dynamiki białka i hydratacji wody. Wyjaśniono sposób przygotowania próbek roztworów i uwodnionych próbek białka w proszku za pomocą wymiany parowej. Procedura analizy danych zarówno dla dynamiki białek, jak i hydratacji wody jest opisana dla różnych typów zestawów danych (widma quasielastyczne lub skany ze stałym oknem), które można uzyskać za pomocą spektrometru rozpraszania wstecznego neutronów.

Metoda jest zilustrowana dwoma badaniami z udziałem białek amyloidowych. Wykazano, że agregacja lizozymu w sferyczne agregaty o wielkości μm - oznaczone cząstkami - zachodzi w jednoetapowym procesie w zakresie przestrzeni i czasu badanym na IN16B, podczas gdy dynamika wewnętrzna pozostaje niezmieniona. Ponadto badano dynamikę wody hydratacyjnej tau na uwodnionych proszkach białka perdeuterowanego. Wykazano, że ruchy translacyjne wody są aktywowane po utworzeniu włókien amyloidowych. Na koniec omówiono kluczowe etapy protokołu dotyczące tego, w jaki sposób rozpraszanie neutronów jest umiejscowione w odniesieniu do badania dynamiki w odniesieniu do innych eksperymentalnych metod biofizycznych.

Wprowadzenie

Neutron jest bezładunkową i masywną cząstką, która na przestrzeni lat była z sukcesem wykorzystywana do badania próbek w różnych dziedzinach, od fizyki fundamentalnej po biologię1. W zastosowaniach biologicznych szeroko wykorzystuje się rozpraszanie neutronów pod małym kątem, nieelastyczne rozpraszanie neutronów oraz krystalografię i reflektometrię neutronową2,3,4. Nieelastyczne rozpraszanie neutronów zapewnia pomiar dynamiki uśrednionej dla całego zespołu bez konieczności stosowania specyficznego znakowania jako takiego, oraz jakość sygnału, która nie zależy od rozmiaru ani rodzaju białka5. Pomiar można przeprowadzić w bardzo złożonym środowisku dla badanego białka, które naśladuje środowisko wewnątrzkomórkowe, takim jak deuterowany lizat bakteryjny, a nawet in vivo3,6,7. Do badania dynamiki można wykorzystać różne konfiguracje eksperymentalne, mianowicie: i) pomiar czasu przelotu (time-of-flight), zapewniający dostęp do dynamiki w zakresie sub-ps-ps, ii) rozpraszanie wsteczne (backscattering), zapewniające dostęp do dynamiki w zakresie ps-ns oraz iii) echo spinowe (spin-echo), zapewniające dostęp do dynamiki od ns do setek ns. Rozpraszanie wsteczne neutronów wykorzystuje prawo Bragga 2d sinθ = nλ, gdzie d jest odległością między płaszczyznami w krysztale, θ to kąt rozpraszania, n to rząd rozpraszania, a λ to długość fali. Zastosowanie kryształów do rozpraszania wstecznego w kierunku detektorów pozwala na osiągnięcie wysokiej rozdzielczości energetycznej, zazwyczaj ~0.8 µeV. Aby zmierzyć wymianę energii, stosuje się albo napęd Dopplera przenoszący kryształ w rozpraszaniu wstecznym w celu zdefiniowania i dostrojenia długości fali neutronów dopływających8,9,10 (Rysunek 1), albo konfigurację czasu przelotu kosztem obniżenia rozdzielczości energetycznej11.

figure-introduction-1
Rycina 1Schemat spektrometru neutronowego z rozpraszaniem wstecznym z napędem Dopplera. Wiązka wpadająca uderza w przerywacz (chopper) transformacji przestrzeni fazowej (PST).42, co zwiększa strumień w położeniu próbki. Następnie jest on rozpraszany wstecznie w kierunku próbki przez układ Dopplera, który wybiera energię E1 (cyjanowa strzałka). Neutrony są następnie rozpraszane przez próbkę (różne energie są reprezentowane przez kolory strzałek), a analizatory wykonane z kryształów Si 1 będą rozpraszać wstecznie jedynie neutrony o określonej energii E0 (tutaj strzałki koloru czerwonego). Zatem przekazanie pędu Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. otrzymuje się z wykrytej pozycji neutronu na matrycy detektorów, a transfer energii z różnicy E1- E0Czas przelotu oczekiwany dla impulsu neutronów wytworzonego przez PST jest wykorzystywany do odrzucenia sygnału z neutronów rozproszonych bezpośrednio w kierunku rurek detektora. Skrót: PST = transformacja przestrzeni fazowej (phase space transformation). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

W przypadku spektroskopii rozproszenia wstecznego głównym wkładem w sygnał z próbek bogatych w protony wodoru, takich jak białka, jest rozproszenie niespójne, dla którego intensywność rozproszenia Sinc(q, ω) przedstawiono w rów. (1)12

figure-introduction-2 (1)

Gdzie σinc to niekoherentny przekrój czynny rozpraszania rozważanego pierwiastka, k' to norma wektora falowego fali rozproszonej, k norma wektora falowego fali padającej, q (= k - k') to przekaz pędu, rj(t) wektor położenia atomu j w czasie t, a ω częstotliwość odpowiadająca transferowi energii między neutronem padającym a układem. Nawiasy kątowe oznaczają średnią ansamblową. Zatem rozpraszanie niekoherentne bada średnią ansamblową autokorelację pozycji pojedynczej cząstki w czasie i dostarcza informacji o autodynamice uśrednionej dla wszystkich atomów w układzie oraz różnych momentów początkowych (średnia ansamblowa). Funkcja rozpraszania jest transformatą Fouriera w czasie pośredniej funkcji rozpraszania I(q, t), którą można traktować jako transformatę Fouriera w przestrzeni funkcji korelacji van Hove’a przedstawionej w równaniu (2):

figure-introduction-3 (2)

Gdzie ρ(r,t) jest gęstością prawdopodobieństwa znalezienia atomu w pozycji r i czasie t13.

W przypadku procesu dyfuzji fickiowskiej, wyniki funkcji samodyfuzji (patrz równanie (3)) po podwójnej transformacji Fouriera w funkcji rozpraszania sprowadzają się do rozkładu Lorentza o szerokości linii określonej przez γ = Dq2.

figure-introduction-4 (3)

Opracowano i uznano za przydatne bardziej zaawansowane modele, takie jak model dyfuzji skokowej Singwiego i Sjölandera dla wewnętrznej dynamiki białek w skali ps-ns14 lub model rotacyjny Searsa dla wody hydratacyjnej15,16,17.

Na instrumencie do neutronowego rozpraszania wstecznego (NBS) IN16B8,9 w ILL w Grenoble we Francji (Rycina uzupełniająca S1), konfiguracja powszechnie stosowana w przypadku białek składa się z kryształów Si 1 dla analizatorów z napędem Dopplera służącym do dostrajania długości fali padającej (Rycina dodatkowa S2A), zapewniając tym samym dostęp do zakresu przekazu pędu ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 or zakres przenoszenia energii wynoszący -30 µeV < figure-introduction-5 < 30 µeV– odpowiadające przedziałom czasowym od kilku ps do kilku ns oraz odległościom rzędu kilku ÅDodatkowo instrument IN16B umożliwia przeprowadzanie elastycznego i nieelastycznego skanowania w stałym oknie (E/IFWS).10które obejmują akwizycję danych przy ustalonym transferze energii. Ponieważ strumień neutronów jest ograniczony, metoda E/IFWS pozwala na maksymalizację strumienia dla jednego transferu energii, co skraca czas akwizycji niezbędny do uzyskania satysfakcjonującego stosunku sygnału do szumu. Nowszą opcją jest tryb spektrometru rozproszonego wstecznie i czasu przelotu (BATS)11, co pozwala na pomiar szerokiego zakresu transferów energii (np. -150 µeV < figure-introduction-6 < 150 µeV), przy wyższym strumieniu niż w przypadku napędu Dopplera, jednak kosztem niższej rozdzielczości energetycznej (Rycina uzupełniająca S2B).

Ważną właściwością rozpraszania neutronów jest to, że przekrój czynny na rozpraszanie niespójne σinc jest 40 razy większy dla wodoru niż dla deuteru i jest pomijalny dla innych pierwiastków powszechnie występujących w próbkach biologicznych. W związku z tym dynamikę białek w środowisku ciekłym można badać, stosując bufor zdeuterylowany, natomiast stan proszkowy pozwala na badanie albo wewnętrznej dynamiki białek przy użyciu uwodornionego proszku białkowego hydratyzowanego D2O, albo badanie wody hydratacyjnej dla całkowicie zdeuterylowanego proszku białkowego hydratyzowanego H2O. W stanie ciekłym rozpraszanie neutronów wstecznych zazwyczaj pozwala na jednoczesny dostęp do samodyfuzji środka masy białek (dyfuzja typu Fickowskiego) oraz ich dynamiki wewnętrznej. Ta druga obejmuje ruchy szkieletu i łańcuchów bocznych, zazwyczaj opisywane tzw. modelem dyfuzji skokowej lub innymi modelami3,18. W uwodornionych proszkach białkowych dyfuzja białek nie występuje i modelowana musi być jedynie dynamika wewnętrzna. W przypadku wody hydratacyjnej wkłady ruchów translacyjnych i rotacyjnych cząsteczek wody wykazują inną zależność od przeniesienia pędu q, co pozwala na ich rozróżnienie w procesie analizy danych17.

Niniejsza praca ilustruje metodę rozproszonego neutronowego powrotnego z wykorzystaniem badania białek, które wykazują zdolność do rozwijania się, agregowania w kanoniczną formę składającą się ze stosów pasm β — tzw. wzoru cross-β19,20 — oraz tworzenia wydłużonych włókien. Jest to tzw. agregacja amyloidowa, która jest szeroko badana ze względu na jej kluczową rolę w schorzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera czy Parkinsona21,2. Badania nad białkami amyloidowymi są również motywowane funkcjonalną rolą, jaką mogą one pełnić23,24, lub ich wysokim potencjałem w opracowywaniu nowych biomateriałów25. Fizykochemiczne uwarunkowania agregacji amyloidowej pozostają niejasne i mimo ogromnego postępu w ostatnich latach, nie opracowano ogólnej teorii agregacji amyloidów21,26.

Agregacja amyloidów wiąże się ze zmianami w strukturze i stabilności białka w czasie, których badanie naturalnie obejmuje dynamikę powiązaną ze stabilnością konformacyjną białka, jego funkcją oraz krajobrazem energetycznym białka27. Dynamika jest bezpośrednio powiązana ze stabilnością konkretnego stanu poprzez wkład entropowy w przypadku najszybszych ruchów28, a funkcja białka może być podtrzymywana przez ruchy w różnych skalach czasowych: od sub-ps dla białek światłoczułych29 do ms dla ruchów domen, które mogą być wspomagane przez dynamikę w skali pikosekund i nanosekund30.

Przedstawione zostaną dwa przykłady wykorzystania spektroskopii neutronowego rozpraszania wstecznego do badania białek amyloidowych: jeden w stanie ciekłym w celu analizy dynamiki białek oraz drugi w stanie uwodnionego proszku w celu zbadania dynamiki wody hydratacyjnej. Pierwszy przykład dotyczy agregacji lizozymu w sfery o rozmiarach µm (tzw. cząsteczki), śledzonej w czasie rzeczywistym5, a drugi porównania dynamiki wody w stanach natywnym i zagregowanym ludzkiego białka tau31.

Lizozym jest enzymem uczestniczącym w obronie immunologicznej, składającym się ze 129 reszt aminokwasowych. Lizozym może tworzyć cząstki w buforze deuterowanym przy pD 10,5 i temperaturze 90 °C. Za pomocą rozpraszania neutronów wykazaliśmy, że ewolucja czasowa współczynnika dyfuzji środka masy lizozymu przebiega zgodnie z kinetyką jednowykładniczą fluorescencji tioflawiny T (fluorescencyjnej sondy stosowanej do monitorowania tworzenia się amyloidowych struktur cross-β32), co wskazuje, że powstawanie cząsteczkowych superstruktur oraz wzorów cross-β zachodzi w jednym kroku z tą samą szybkością. Co więcej, dynamika wewnętrzna pozostała stała w trakcie całego procesu agregacji, co można wyjaśnić albo szybką zmianą konformacyjną, której nie można zaobserwować za pomocą instrumentów NBS, albo brakiem znaczącej zmiany energii wewnętrznej białka podczas agregacji.

Ludzkie białko tau jest białkiem wewnętrznie nieuporządkowanym (IDP), składającym się z 41 aminokwasów w przypadku tzw. izoformy 2N4R, która bierze istotny udział w chorobie Alzheimera3. Wykorzystując neutronowe rozpraszanie wsteczne na proszkach perdeuteryzowanego białka tau, wykazaliśmy, że dynamika wody hydratacyjnej jest zwiększona w stanie włókien, przy większej populacji cząsteczek wody podlegających ruchom translacyjnym. Wynik ten sugeruje, że wzrost entropii wody hydratacyjnej może napędzać fibrylację amyloidową białka tau.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie buforu deuterowanego dla białek w stanie ciekłym

  1. Rozpuścić wszystkie składniki buforu w czystym D2O.
  2. Jeśli elektroda pH została skalibrowana w H2O, należy skorygować pD zgodnie ze wzorem pD = pH + 0,4, używając NaOD lub DCl34.
    UWAGA: Zastosowanie D2O zamiast H2O może wpłynąć na rozpuszczalność białek, co może wymagać dostosowania warunków buforu (np. poprzez niewielką zmianę stężenia soli).

2. Przygotowanie proszków uwodnionych H2O z perdeuteryzowanego białka

  1. Przygotować uchwyt na próbkę.
    1. Dokładnie wyczyścić płaski uchwyt próbek z aluminium wraz z uszczelką z drutu indowego i śrubami, używając wody i etanolu, a następnie pozostawić do wyschnięcia.
      UWAGA: Należy użyć płaskiego uchwytu na próbkę, aby proszek mógł zostać jednorodnie rozprowadzony po powierzchni. Ilość proszku powinna być wystarczająca, aby mógł on pozostać między ściankami i nie wysypać się podczas pionowego ustawienia uchwytu na próbkę.
    2. Zważ oddzielnie poszczególne elementy uchwytu próbki – dno, pokrywkę oraz drucik indowy – na wadze precyzyjnej.
    3. Umieść uszczelkę z drutu indowego o średnicy 1 mm w rowku dolnej części uchwytu próbki, pozostawiając niewielki zakład w miejscu łączenia obu końców (Rysunek 2A).
    4. Umieść odpowiednią ilość liofilizowanego białka (zazwyczaj ok. 10 mg białka) w taki sposób, aby wypełniło wewnętrzną powierzchnię dna uchwytu na próbkę.
  2. Nawodnij proszek białkowy.
    1. Umieść uchwyt na próbkę w deskrypcie z szalką Petriego zawierającą P2O5 proszek przez 24 h, aby całkowicie wysuszyć proszek białkowy35 (Rycina 2B). Zważ suchą dolną część uchwytu na próbkę zawierającą uszczelkę z indu oraz suchy proszek, aby otrzymać masę msuchy.
      OSTROŻNIE: P2O5 Proszek jest silnie żrący.
    2. Usuń P2O5 z deskykatora i umieścić płytkę Petriego z D2wewnątrz. Regularnie kontroluj masę proszku, aby sprawdzić poziom hydratacji h = mhyd / msuchy gdzie mhyd oraz msuchy odpowiadają odpowiednio masie proszku uwodnionego i proszku suchego.
      UWAGA: W przypadku białek silnie hydrofobowych, takich jak insulina, konieczne może być zwiększenie temperatury wewnątrz deskykatora w celu uzyskania wyższej ciśnienia pary i osiągnięcia pożądanego poziomu hydratacji h.
    3. Powtórz kroki 2.2.1 i 2.2.2 co najmniej trzykrotnie, aby prawidłowo zamienić wszystkie wodory wymienne na deuterony.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować cykle liofilizacji i rozpuszczania w czystej wodzie destylowanej (D)2O można wykorzystać w celu uzyskania lepszej wymiany H/D, pod warunkiem że nie wpłynie to na białko.
    4. Nawilżyć proszek do poziomu nieco powyżej wartości pożądanej, pozostawić dolną część uchwytu próbki z drutem indowym i nawilżonym proszkiem na wadze precyzyjnej i poczekać, aż masa powoli spadnie do wartości pożądanej, aby uzyskać docelowe h (zazwyczaj 0,2–0,4 w przypadku białka globularnego średniej wielkości, które ma zostać pokryte jedną pełną warstwą hydratacyjną).
    5. Szybko załóż pokrywkę na dolną część i najpierw zamknij uchwyt na próbkę za pomocą czterech śrub, aby zatrzymać wymianę oparów (Rycina dodatkowa S3A).
    6. Włożyć i dokręcić wszystkie pozostałe śruby, aż szczelina między dolną częścią a pokrywą nie będzie widoczna (Rycina dodatkowa S3B).
    7. Zważ szczelnie zamknięty uchwyt z próbką, aby sprawdzić, czy po eksperymencie neutronowym nie doszło do utraty nawodnienia w wyniku nieszczelności.

3. Przeprowadzenie eksperymentu niekoherentnego rozpraszania neutronów

  1. Omów i dwukrotnie sprawdź konfigurację instrumentu niezbędnego do eksperymentu z lokalnym koordynatorem na kilka tygodni przed wyznaczonym czasem dostępu do wiązki (beamtime).
  2. Przygotuj próbkę w stanie ciekłym.
    1. Rozpuść białko w buforze deuterowanym.
    2. Określ odpowiednią objętość cieczy do umieszczenia w uchwycie próbki, używając wody (upewnij się, że po zamknięciu uchwytu nie nastąpi przepełnienie; Rysunek 2C).
      UWAGA: Następne kroki (3.3 i 3.4) opisują eksperyment przeprowadzony na spektrometrze NBS IN16B w ILL8,9, z wykorzystaniem kriokomory jako środowiska próbki. System sterowania instrumentem będzie się różnić w zależności od urządzenia, ale zasady działania pozostają takie same.
  3. Wprowadź próbkę.
    1. Dokładnie osusz pręt do próbki (Rysunek 2D) i usuń poprzednią próbkę, jeśli taka była, po uprzednim sprawdzeniu, że dawka promieniowania jonizującego jest niższa niż 10 µSv/h przed kontaktem z jakimkolwiek materiałem (w ILL).
    2. Umieść próbkę, sprawdź właściwe centrowanie względem centrum wiązki (Rysunek dodatkowy S4) i włóż pręt z próbką do kriokomory (Rysunek 2D). Włącz pompę próżniową, aby osiągnąć ciśnienie poniżej 10-3 bar, a następnie wypłucz powietrze z wnętrza kriokomory, powtarzając następującą czynność trzy razy: napełnij kriokomorę gazem helu, aż zostanie osiągnięte ciśnienie atmosferyczne, a następnie ponownie usuń gaz za pomocą pompy próżniowej.
      UWAGA: W przypadku płaskiego uchwytu próbki, musi on być zorientowany pod kątem 45° względem nadchodzącej wiązki. Przydatny zakres przeniesienia pędu może zostać ograniczony z powodu absorpcji i rozpraszania przez komórkę. Do zamaskowania niektórych części uchwytu próbki (np. śrub, grubych elementów) można użyć silnego absorbera neutronów, takiego jak kadm).
    3. Wprowadź do kriokomory niewielką ilość gazu helu, tak aby ciśnienie wynosiło ~0,05 bar.
  4. Zbierz dane (np. używając NOMAD na IN16B w ILL, przyjmuje się, że użytkownik preferuje temperaturę 20 K przed zarejestrowaniem widma kwazielastycznego rozpraszania neutronów (QENS), następnie E/IFWS podczas rampy temperaturowej do 310 K z prędkością 0,5 K/min i na koniec QENS przy 310 K).
    1. Używając NOMAD, w zakładce execution, przeciągnij i upuść kontroler FurnaceCryostat w obszarze Launch Pad. Ustaw temperaturę na 20 K. Użyj trybu fast oraz czasu timeout wynoszącego 30 min, aby temperatura miała czas się ustabilizować. Kliknij ikonę obracających się strzałek, aby uruchomić proces w tle, co pozwoli na zbieranie danych podczas obniżania temperatury.
    2. Przeciągnij i upuść kontroler IN16DopplerSettings, ustaw profil prędkości na Accurate velocity określony przez Max ΔE, wartość 0,0 µeV oraz 128 kanałów, aby uzyskać konfigurację EFWS.
    3. Przeciągnij i upuść kontroler Count, wpisz w polu Subtitle nazwę umożliwiającą łatwą identyfikację danych i ustaw 60 powtórzeń dla skanów 30 s (Rysunek dodatkowy S5A).
    4. Przeciągnij i upuść kontroler IN16DopplerSettings, ustaw profil prędkości na Sine określony przez Speed o wartości 4,5 m/s oraz 2 048 kanałów, aby uzyskać konfigurację QENS.
    5. Przeciągnij i upuść kontroler Count z 4 powtórzeniami skanów 30 min (Rysunek dodatkowy S5B).
    6. Dla rampy temperaturowej przeciągnij i upuść kontroler FurnaceCryostat, ustaw temperaturę na 310 K, ustaw Ramp na SetPoint z Δ = 0,05 K i 6 s. Użyj czasu time out wynoszącego 20 min (Rysunek dodatkowy S6A).
    7. Użyj pętli for loop z 65 powtórzeniami. Wewnątrz wstaw kontroler IN16DopplerSettings analogicznie do kroku 3.4.2, a następnie pojedynczy pomiar 30 s. Następnie wstaw IN16DopplerSettings, jak opisano wcześniej, ale stosując przesunięcie energetyczne (energy offset) wynoszące 1,5 µeV i 1 024 kanały, a następnie pojedynczy pomiar 3 min (Rysunek dodatkowy S6B).
    8. Aby zarejestrować ostatni pomiar QENS przy 310 K, przeciągnij i upuść kontrolery IN16DopplerSettings oraz Count skonfigurowane zgodnie z opisem w krokach 3.4.4 i 3.4.5.
    9. Naciśnij przycisk start (prawy trójkąt na dole okna), aby uruchomić skrypt.
      UWAGA: Każdy eksperyment będzie wymagał zebrania danych kalibracyjnych; mianowicie: pomiaru pustej komórki do korekcji odejmowania lub absorpcji, samego buforu w różnych zastosowanych temperaturach do modelowania tła oraz pomiaru wanadu (lub równoważnie próbki w temperaturze 10 K lub niższej), aby uzyskać funkcję rozdzielczości instrumentu.

4. Analiza danych - QENS

  1. Zaimportuj zestaw danych, używając metody 'IN16B_QENS.process()' w oprogramowaniu Python nPDyn v3.x36
    >>>> z nPDyn.dataParsers importuj IN16B_QENS

    >>> próbka = IN16B_QENS(
    ...<ścieżka do plików danych>
    ... [detGroup=<plik grupowania detektorów lub liczb całkowitych w formacie XML
    ...format>]
    ... ).process()

    >>> sample = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. Wykonaj korekty danych (opcjonalnie) za pomocą następujących poleceń (szczegółowe informacje znajdują się w dokumentacji nPDyn, Rysunek 3):
    # przyjmuje się, że dane dla pustej komórki, wanadu i buforu
    # zostały już zaimportowane do zbiorów danych o nazwach „empty_cell”, „vanadium”,
    # oraz odpowiednio „bufor”.

    # dla odejmowania pustych komórek z zastosowaniem współczynnika skalowania
    # (błędy są propagowane automatycznie)
    >>> próbka = próbka - 0,95 * pusta_komórka

    # do korekty przy użyciu współczynnika Paalmana-Pinga
    # (wzajemnie wykluczające się z powyższym przykładem)
    >>> próbka = próbka.absorptionCorrection(empty_cell)

    # do normalizacji
    >>> próbka = próbka.normalize(wanad)

    # do grupowania wzdłuż osi obserwowalnej
    obserwowalną wartością jest tutaj czas agregacji
    >>> sample = sample.bin(3, axis=0)
  3. Dopasuj dane kalibracyjne. Próbki zestawu danych – pustą komórkę, bufor deuterowany (jeśli jest wymagany) oraz wanad – można dopasować przy użyciu wbudowanych modeli lub modelu zdefiniowanego przez użytkownika (patrz dokumentacja nPDyn):
    >>> z nPDyn.models.builtins import (
    ... model PVoigt,
    ... modelWater,
    modelKalibrowanyD2O,
    ...     )

    # wbudowane modele wykorzystują wektor kolumnowy pędu
    # przenoszenie wartości q
    >>> q = vanadium.q[:, None]

    # wanad jest dopasowywany przy użyciu profilu pseudo-Voigta
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Użyj wbudowanego modelu wody hydratacyjnej o nazwie „modelWater”. Model ten jest odczytywany zgodnie z równaniem (4)17
    figure-protocol-1 (4)
    Gdzie a0, ar, oraz at są skalarami uwzględniającymi odpowiednio względny wkład sygnału sprężystego, ruchów obrotowych oraz ruchów translacyjnych; j1(qd) jest lth rzędu sferycznej funkcji Bessela, gdzie q oznacza przekaz pędu; d to odległość O-H w cząsteczce wody; δ(ω) to delta Diraca, która jest tutaj mnożona przez EISF; N to najwyższy rząd użytej funkcji sferycznej Bessela (zazwyczaj ~5); figure-protocol-2 i figure-protocol-3 odpowiednio lorentzowskie ruchy rotacyjne i translacyjne; b(q) to stały człon tła. Sferyczne funkcje Bessela określają wzgludećny wkład każdego stanu momentu pędu cząsteczek wody, a liczba N jest wyznaczana na podstawie zakresu przeniesienia pędu q. W przypadku typowego spektrometru NBS człony do N = 4 niemal całkowicie wyjaśniają sygnał (Rycina dodatkowa S7).
    tutaj równanie 2 jest wykorzystywane do obliczeń wody hydratacyjnej
    # splot z funkcją rozdzielczości i dodawanie
    # Tło D2O jest wyznaczane automatycznie za pomocą
    # dostarczone argumenty
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=wanad,
    ... bkgd=bufor,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    UWAGA: Aby zachować pełną rygorystyczność, wkłady ruchów rotacyjnych i translacyjnych powinny zostać poddane splotowi. Sukces modelu addytywnego należy przypisać obecności odrębnych populacji wody na powierzchni białka oraz ograniczonemu zakresowi dostępnej energii.
  5. Użyj poniższych danych do wykreślenia (Rysunek 4):
    >>> z nPDyn.plot importuj plot
    >>> wykres(próbka)

5. Analiza danych – rampa temperatury, elastyczne skanowanie z oknem stałym (EFWS)

  1. Należy zastosować procedurę analogiczną do tej opisanej w sekcji 4, aby znormalizować dane z rampy temperaturowej względem sygnału w najniższej temperaturze (zazwyczaj 10 K):
    >>> from nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> sample = IN16B_FWS(
    ... <path to data files>,
    ... detGroup=[detGroup=<integer or detector grouping file in XML format>]
    ... ).process()

    # normalizacja za pomocą 5 pierwszych punktów na osi
    # obserwowalnej, które odpowiadają temperaturze
    >>> sample /= sample[:5].mean(0)

    # zakres transferu pędu q użyty tutaj jest mniejszy,
    # ponieważ zastosowany model jest prawidłowy tylko dla niskich q
    >>> sample = sample.get_q_range(0.2, 0.8)
  2. Na początek należy użyć prostego modelu gaussowskiego, którego szerokość jest określona przez tzw. średni kwadrat przemieszczenia (MSD). Należy zbudować i dopasować model, korzystając z następujących poleceń:
    >>> import numpy as np
    >>> from nPDyn.models import Parameters, Model, Component

    # a jest czynnikiem skalującym
    >>> params = Parameters(
    ... a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> model = Model(params)
    >>> model.addComponent(Component(
    … 'gaussian',
    … lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    … ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, None])

    >>> plot(sample)
    UWAGA: Przybliżenie gaussowskie jest zawsze prawidłowe dla q2MSD << 1, jednak do względnego porównania próbek można zastosować szerszy zakres transferu pędu. Opracowano bardziej zaawansowane modele, które wykraczają poza przybliżenie gaussowskie37,38,39.

6. Analiza danych – sprężyste i niesprężyste skanowanie z ustalonym oknem (E/IFWS)

  1. Podobnie jak w kroku 4, zaimportuj zbiór danych, korzystając z klasy „IN16B_FWS”:
    >>> z nPDyn.dataParsers importuj IN16B_FWS

    >>> próbka = IN16B_FWS(
    ...<ścieżka do plików danych>
    ... [detGroup=<plik grupowania detektorów lub liczba całkowita w formacie XML>]
    ... ).process()

    >>> próbka = próbka.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. Dopasuj dane kalibracyjne oraz dane z próbek.
    1. Analiza danych E/IFWS z wykorzystaniem uogólnionego średniokwadratowego przemieszczenia (MSD)40 lub poprzez traktowanie ich jako widma gruboziarnistego rozproszonego nieelastycznego rozpraszania neutronów (coarse-QENS), zawierające jedynie kilka punktów danych na osi energii. W przypadku traktowania E/IFWS jako coarse-QENS, modele stosowane dla QENS są wykorzystywane do dopasowania całego zbioru danych E/IFWS jednocześnie (globalne dopasowanie transferów energii i transferów pędu).
      UWAGA: W niniejszym przypadku zastosowano to drugie rozwiązanie – wykorzystanie modeli QENS dla danych E/IFWS – w sytuacji, gdy narzucono zależność od przeniesienia pędu dla dyfuzji środka masy oraz wewnętrznej dynamiki białek.
    2. Modeluj dynamikę białek w cieczach, korzystając z następującego równania (5) ('modelProteinJumpDiff' w nPDyn):
      figure-protocol-4 (5)
      Gdzie R(Proszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który należy przetłumaczyć na język polski.,ω) jest funkcją rozdzielczości; β skalar niezależny dla każdego przeniesienia pędu q; a0 jest to elastyczny niespójny czynnik strukturalny (EISF); figure-protocol-5 rozkład Lorentza uwzględniający dyfuzję środka masy o szerokości określonej przez równanie (6); figure-protocol-6 jest rozkładem lorentza obejmującym dyfuzję środka masy oraz wkład zgodny z modelem dyfuzji skokowej14 uwzględniając dynamikę wewnętrzną (Równ. (7); figure-protocol-7 będąc sygnałem dopasowanym z D2O przeskalowano zgodnie z jego ułamkiem objętościowym w próbce.
      γ = Dsq2  (6)
      Ds gdzie współczynnik samodyfuzji.
      figure-protocol-8 (7)
      Di gdzie współczynnik dyfuzji pozornej dla dynamiki wewnętrznej i τ czas relaksacji dla ruchów dyfuzyjnych.
      >>> z nPDyn.models.builtins import (
      ... modelPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      modelKalibrowanyD2O,
      ... )

      # wbudowane modele wykorzystują wektor kolumnowy pędu
      # przenoszenie wartości q
      >>> q = vanadium.q[:, None]

      wanad dopasowano przy użyciu profilu pseudo-Voigta
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # dla czystego D2O, model z kalibrowaną szerokością linii
      # dla różnych temperatur jest zawarty w nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # w tym przypadku do próbek ciekłych stosuje się równanie 3
      # splot z funkcją rozdzielczości i dodawanie
      Tło D2O jest wyznaczane automatycznie przy użyciu podanych argumentów
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=wanad,
      ... tło=bufor,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Wykreśl dopasowane dane, korzystając z:
    >>> z nPDyn.plot import plot
    >>> wykres(próbka)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Agregację lizozymu w cząstki przeprowadzono w temperaturze 90 °C przy stężeniu białka 50 mg/mL w buforze deuterowanym (0.1 M NaCl przy pD 10.5). Powstawanie cząstek jest inicjowane przez wzrost temperatury do 90 °C i następuje w ciągu 6 h (Rycina dodatkowa S8). Akwizycja danych została przeprowadzona na urządzeniu IN16B, zgodnie z opisanym powyżej protokołem (dane są na stałe archiwizowane przez ILL i dostępne pod adresem http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-81).

Spekt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Spektroskopia neutronowa jest jedyną metodą, która pozwala na sondowanie uśrednionej zespołowo dynamiki ps-ns próbek białek, niezależnie od wielkości białka lub złożoności roztworu, gdy stosuje się deuterację6. W szczególności, badając samodyfuzję zespołów białkowych w roztworze, można jednoznacznie określić rozmiar hydrodynamiczny takich zespołów. Niemniej jednak metoda ta jest zwykle ograniczona przez niski strumień neutronów, co oznacza długi czas akwizycji i wymóg dużej ilości próbki (zwykle 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Michaeli Zamponi z Jülich Centre for Neutron Science w Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Niemcy, za część eksperymentów z rozpraszaniem neutronów przeprowadzonych na instrumencie SPHERES. Prace te skorzystały z działań konsorcjum Laboratorium Deuteracji (DLAB) finansowanego przez Unię Europejską w ramach umów HPRI-2001-50065 i RII3-CT-2003-505925 oraz z działalności finansowanej przez Brytyjską Radę ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC) w ramach Institut Laue Langevin EMBL DLAB w ramach grantów GR/R99393/01 i EP/C015452/1. Uznaje się wsparcie ze strony Komisji Europejskiej w ramach 7. programu ramowego w ramach akcji kluczowej: Wzmacnianie europejskiej przestrzeni badawczej, infrastruktura badawcza [umowa 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot i Christian Beck dziękują Federalnemu Ministerstwu Edukacji i Badań Naukowych (BMBF, grant nr 05K19VTB) za sfinansowanie ich stypendiów podoktorskich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aluminiowy uchwytNiedostępny w handlu. Albo lokalna osoba kontaktowa na instrumencie może je dostarczyć, albo mogą być one wyprodukowane na podstawie rysunku technicznego, który może być dostarczony przez lokalny kontakt.
Chlorek deuteru, 35 % wag. w D2O, ≥ 99 atom % DSigma-Aldrich
543047
Tlenek deuteru (D, 99,9%)EurisotopDLM-4DR-PK
Wysokopróżniowy smar silikonowy Dow CorningSigma-AldrichZ273554-1EA
Etanol 96%, EMSURE Reag. Ph EurSigma-Aldrich1.5901
Eksykator szklanyVWR&nbsp; 75871-660
Szklana płyta eksykatora, 140 mmVWR89038-068
Drut indowy, średnica 1,0 mm (0,04 cala), Puratronic, 99,999%Alfa Aesar00470.G1
Lizozym z białka jaja kurzego dializowany, liofilizowany, proszek, ~100 000 U/mgSigma-Aldrich62970
nPDynv3.xpatrz github.com/kpounot/nPDyn, funkcje modelu do montażu zawarte również w oprogramowaniu
Waga OHAUS AX324 Adventurer, kalibracja wewnętrznaDutscher92641
Pięciotlenek fosforu, ReagentPlus, 99%Sigma-Aldrich214701
Pipeta ErgoOne 0,5-10 μ LPipeta StarlabS7100-0510
ErgoOne 100-1,000 μ LPipeta StarlabS7100-1000
ErgoOne 20-200 μ LStarlabS7100-2200
Końcówka do pipet TipOne 1,000 μ LStarlabS1111-6001
Końcówka do pipet TipOne 10 μ LStarlabS1111-3200
Końcówka do pipet TipOne 200 μ LStarlabS1111-0206
Roztwór deuterotlenek sodu, 40 % wag. w D2O, 99,5 atomu % DSigma-Aldrich372072
na próbkę

Bibliografia

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7(2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580(2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490(2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102(2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908(2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015(2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997(2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904(2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

rozpraszanie neutron w z powrotnym odbiciemdynamika bia ekkwazielastyczne rozpraszanie neutron wskany z ustalonym oknemdyfuzja molekularnabia ka amyloidalnebufor deuterowanypiec kriogeniczny

Powiązane artykuły