Neutron to bezładunkowa i masywna cząstka, która przez lata była z powodzeniem wykorzystywana do badania próbek w różnych dziedzinach, od fizyki podstawowej po biologię1. Do zastosowań biologicznych szeroko stosowane są rozpraszanie neutronów pod małym kątem, rozpraszanie neutronów nieelastycznych oraz krystalografia neutronów i reflektometria2,3,4. Nieelastyczne rozpraszanie neutronów zapewnia uśredniony zespołowo pomiar dynamiki bez konieczności specjalnego znakowania per se, oraz jakość sygnału, która nie zależy od wielkości ani białka5. Pomiar można wykonać przy użyciu wysoce złożonego środowiska dla badanego białka, które naśladuje podłoże wewnątrzkomórkowe, takiego jak deuterowany lizat bakteryjny lub nawet in vivo3, 6,7. Do badania dynamiki można wykorzystać różne konfiguracje eksperymentalne, a mianowicie: i) dostęp do dynamiki sub-ps-ps dający czas przelotu, ii) dający rozpraszanie wsteczne dostęp do dynamiki ps-ns oraz iii) dający echo spinowe dostęp do dynamiki od ns do setek ns. Rozpraszanie wsteczne neutronów wykorzystuje prawo Bragga 2d sinθ = nλ, gdzie d to odległość między płaszczyznami w krysztale, θ to kąt rozpraszania, n to porządek rozpraszania, a λ to długość fali. Zastosowanie kryształów do rozpraszania wstecznego w kierunku detektorów pozwala na osiągnięcie wysokiej rozdzielczości energii, zwykle ~0,8 μeV. Do pomiaru wymiany energii używa się albo napędu dopplerowskiego przenoszącego kryształ w rozpraszaniu wstecznym, aby zdefiniować i dostroić długość fali przychodzących neutronów8,9,10 (Rysunek 1), albo można użyć ustawienia czasu przelotu kosztem spadku rozdzielczości energii11.

Rysunek 1: Szkic spektrometru rozpraszania wstecznego neutronów z napędem dopplerowskim. Nadchodząca wiązka uderza w transformację przestrzeni fazowej (PST) chopper42, co zwiększa strumień w pozycji próbki. Następnie jest rozpraszany wstecznie w kierunku próbki przez napęd dopplerowski, który wybiera energię E1 (niebieskozielona strzałka). Neutrony są następnie rozpraszane przez próbkę (z różnymi energiami reprezentowanymi przez kolor strzałek), a analizatory, wykonane z kryształów Si 111, będą rozpraszać wstecznie tylko neutrony o energii właściwej E0 (tutaj czerwone strzałki). Stąd przeniesienie pędu q uzyskuje się z wykrytego położenia neutronu na matrycy detektora, a transfer energii uzyskuje się z różnicy E1- E0. Czas przelotu oczekiwany dla impulsu neutronowego wytwarzanego przez PST jest używany do odrzucenia sygnału z neutronów rozproszonych bezpośrednio w kierunku lamp detektorowych. Skrót: PST = przemiana przestrzeni fazowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Dla spektroskopii rozpraszania wstecznego, główny wkład w sygnał z próbek bogatych w protony wodoru, takich jak białka, pochodzi z niespójnego rozpraszania, dla którego intensywność rozpraszania Sinc(q, ω) jest pokazana przez Eq (1)12
(1)
Gdzie σinc jest niespójnym przekrojem poprzecznym rozważanego pierwiastka, k' jest normą rozproszonego wektora falowego, k jest normą przychodzącego wektora falowego, q (= k - k') transferem pędu, rj(t) wektorem położenia atomu j w czasie t, a ω częstotliwością odpowiadającą transferowi energii między przychodzącym neutronem a układem. Nawiasy kątowe oznaczają średnią zespołową. W związku z tym rozpraszanie niekoherentne bada uśrednioną przez zespół samokorelację pozycji atomów pojedynczych cząstek z czasem i daje uśrednioną autodynamikę dla wszystkich atomów w układzie i różnych początków czasu (średnia zespołowa). Funkcja rozpraszania jest transformatą Fouriera w czasie pośredniej funkcji rozpraszania I(q, t), którą można rozpatrywać jako transformatę Fouriera w przestrzeni funkcji korelacji van Hove'a pokazanej przez Eq (2):
(2)
Gdzie ρ(r,t) to gęstość prawdopodobieństwa znalezienia atomu w pozycji r i czasie t13.
Dla procesu dyfuzji Fickiego, funkcja samodzielnej dyfuzji (patrz Eq (3)) następuje po podwójnej transformacji Fouriera w funkcji rozpraszania składającej się z Lorentza o szerokości linii podanej przez γ = Dq2.
(3)
Bardziej wyrafinowane modele zostały opracowane i uznane za użyteczne, takie jak model dyfuzji skokowej autorstwa Singwi i Sjölandera dla wewnętrznej dynamiki białek ps-ns14 lub model rotacji Sears dla wody nawadniającej15,16,17.
Na instrumencie do rozpraszania wstecznego neutronów (NBS) IN16B8,9 w ILL, Grenoble, Francja (Rysunek uzupełniający S1), układ powszechnie stosowany z białkami składa się z kryształów Si 111 dla analizatorów z napędem dopplerowskim do dostrojenia przychodzącej długości fali (Rysunek uzupełniający S2A), dając tym samym dostęp do zakresu transferu pędu ~0,2 A-1 < q < ~2 A-1 i zakres transferu energii -30 μeV <
< 30 μeV-odpowiadające skalom czasowym od kilku ps do kilku ns i odległościom kilku A. Ponadto IN16B oferuje możliwość wykonywania elastycznych i nieelastycznych skanów w oknie stałym (E/IFWS)10, które obejmują akwizycję danych przy stałym transferze energii. Ponieważ strumień jest ograniczony podczas pracy z neutronami, E/IFWS pozwala na maksymalizację strumienia dla jednego transferu energii, skracając w ten sposób czas akwizycji potrzebny do uzyskania satysfakcjonującego stosunku sygnału do szumu. Nowszą opcją jest tryb spektrometru rozpraszania wstecznego i czasu przelotu (BATS)11, który umożliwia pomiar szerokiego zakresu transferów energii (np. -150 μeV <
< 150 μeV), o wyższym strumieniu niż w przypadku napędu Dopplera, ale kosztem niższej rozdzielczości energetycznej (rysunek uzupełniający S2B).
Ważną właściwością rozpraszania neutronów jest to, że niespójny przekrój czynnyσ inc ma 40 razy wyższą wartość dla wodoru niż dla deuteru i jest pomijalny dla innych pierwiastków powszechnie występujących w próbkach biologicznych. Dlatego dynamikę białek w środowisku ciekłym można badać za pomocą buforu deuterowanego, a stan proszku pozwala na badanie wewnętrznej dynamiki białka za pomocą uwodornionego proszku białkowego uwodnionegoD2O, lub badanie wody hydratacyjnej dla perdeuterowanego proszku białkowego uwodnionegoH2O. W stanie ciekłym rozpraszanie wsteczne neutronów zazwyczaj umożliwia jednoczesny dostęp do samodyfuzji białek w środku masy (dyfuzja typu Fickiana) i ich wewnętrznej dynamiki. Te ostatnie to ruchy szkieletowe i łańcuchowe zwykle opisywane przez tzw. model dyfuzji skokowej lub inne3,18. W uwodornionych proszkach białkowych dyfuzja białek jest nieobecna i należy modelować tylko dynamikę wewnętrzną. W przypadku wody hydratacyjnej udział ruchów translacyjnych i obrotowych cząsteczek wody wykazuje różną zależność od przeniesienia pędu q, co pozwala na ich rozróżnienie w procesie analizy danych17.
Ten artykuł ilustruje metodę rozpraszania wstecznego neutronów z badaniem białek, które okazały się zdolne do rozwinięcia, agregacji do kanonicznej formy składającej się ze stosów β-nici - tak zwany wzór krzyżowania β 19,20-i tworzą wydłużone włókna. Jest to tak zwana agregacja amyloidu, która jest szeroko badana ze względu na jej centralną rolę w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera czy Parkinsona21,22. Badania nad białkami amyloidowymi są również motywowane funkcjonalną rolą, jaką mogą odgrywać23,24 lub ich wysokim potencjałem w rozwoju nowych biomateriałów25. Fizykochemiczne determinanty agregacji amyloidu pozostają niejasne i nie jest dostępna żadna ogólna teoria agregacji amyloidu, pomimo ogromnego postępu w ciągu ostatnich lat21,26.
Agregacja amyloidu implikuje zmiany w strukturze i stabilności białek w czasie, których badanie naturalnie implikuje dynamikę, związaną ze stabilnością konformacji białka, funkcją białka i krajobrazem energetycznym białka27. Dynamika jest bezpośrednio związana ze stabilnością określonego stanu poprzez entropiczny wkład dla najszybszych ruchów28, a funkcja białka może być podtrzymywana przez ruchy w różnych skalach czasowych od sub-ps dla białek wrażliwych na światło29 do ms dla ruchów domenowych, co może być ułatwione przez dynamics picosecond-nanosecond30.
Przedstawione zostaną dwa przykłady wykorzystania spektroskopii rozpraszania wstecznego neutronów do badania białek amyloidowych, jeden w stanie ciekłym do badania dynamiki białek, a drugi w stanie uwodnionego proszku do badania dynamiki wody hydratucyjnej. Pierwszy przykład dotyczy agregacji lizozymu na kule o wielkości μm (zwane cząstkami), które następują w czasie rzeczywistym5, a drugi to porównanie dynamiki wody w stanach natywnych i zagregowanych białka ludzkiego białka tau31.
Lizozym jest enzymem zaangażowanym w obronę immunologiczną i składa się ze 129 reszt aminokwasowych. Lizozym może tworzyć cząstki stałe w zdeuterowanym buforze przy pD 10,5 i temperaturze 90 °C. W przypadku rozpraszania neutronów wykazaliśmy, że ewolucja w czasie współczynnika dyfuzji środka masy lizozymu jest zgodna z pojedynczą wykładniczą kinetyką fluorescencji tioflawiny T (sonda fluorescencyjna używana do monitorowania tworzenia wzorców β krzyżowych amyloidu32), co wskazuje, że tworzenie nadbudówek cząstek stałych i wzorców β krzyżowych zachodzi w jednym kroku z tą samą szybkością. Co więcej, wewnętrzna dynamika pozostała niezmienna przez cały proces agregacji, co można wytłumaczyć albo szybką zmianą konformacyjną, której nie można zaobserwować na instrumentach NBS, albo brakiem znaczącej zmiany wewnętrznej energii białka podczas agregacji.
Ludzkie białko tau jest wewnętrznie nieuporządkowanym białkiem (IDP) składającym się z 441 aminokwasów dla tzw. izoformy 2N4R, która jest szczególnie zaangażowana w chorobę Alzheimera33. Wykorzystując rozpraszanie wsteczne neutronów na proszkach perdeuterowanego białka tau, wykazaliśmy, że dynamika wody hydratacyjnej wzrasta w stanie włókna, przy czym większa populacja cząsteczek wody ulega ruchom translacyjnym. Wynik sugeruje, że wzrost entropii wody hydratującej może napędzać migotanie amyloidu tau.