Kwantyfikacja oddziaływań wiążących między Cu(II) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów

Summary

Ten artykuł skupia się na wykorzystaniu elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do badania i ilościowego określania termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami i białkami.

Abstract

Miedź(II) jest niezbędnym metalem w systemach biologicznych, nadając unikalne właściwości chemiczne biomolekułom, z którymi oddziałuje. Doniesiono, że bezpośrednio wiąże się z różnymi peptydami i odgrywa zarówno niezbędne, jak i patologiczne role, począwszy od pośredniczącej struktury, przez właściwości przenoszenia elektronów, po nadawanie funkcji katalitycznej. Kwantyfikacja powinowactwa wiązania i termodynamiki tych kompleksów peptydowych Cu(II) in vitro dostarcza informacji na temat termodynamicznej siły napędowej wiązania, potencjalnej konkurencji między różnymi jonami metali dla peptydu lub między różnymi peptydami dla Cu(II) oraz częstości występowania kompleksu peptydowego Cu(II) in vivo. Jednak ilościowe określenie termodynamiki wiązania może być trudne ze względu na niezliczone czynniki, w tym uwzględnienie wszystkich konkurujących równowag w eksperymencie miareczkowania, zwłaszcza w przypadkach, gdy brakuje dyskretnych uchwytów spektroskopowych reprezentujących peptyd, jon metalu bloku d i ich interakcje.

Tutaj dostępny jest solidny zestaw eksperymentów do dokładnego ilościowego określenia termodynamiki peptydu Cu(II). W artykule skoncentrowano się na zastosowaniu elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej w obecności i bez ligandów chromoforowych w celu zapewnienia potrzebnej kontroli spektroskopowej na Cu(II) oraz zastosowaniu bezznacznikowej kalorymetrii miareczkowania izotermicznego. W obu technikach eksperymentalnych proces jest opisany w taki sposób, aby uwzględniał wszystkie konkurujące ze sobą równowagi. Chociaż ten artykuł koncentruje się na Cu(II), opisany zestaw eksperymentów może mieć zastosowanie poza interakcjami Cu(II) z peptydem i zapewnić ramy dla dokładnej kwantyfikacji innych układów metal-peptyd w fizjologicznie istotnych warunkach.

Introduction

Biologia ewoluowała, aby wykorzystywać różnorodną chemię jonów metali potrzebnych do adaptacji i przetrwania życia w otaczającym środowisku. Szacuje się, że 25%-50% białek wykorzystuje jony metali do budowy i funkcji¹. Szczególna rola i stan redoks jonu metalu jest bezpośrednio związana ze składem i geometrią biologicznych ligandów, które go koordynują. Ponadto jony metali aktywnych redoks, takie jak Cu(II), muszą być ściśle regulowane, aby nie oddziaływały ze środkami utleniającymi za pomocą chemii podobnej do Fentona, tworząc reaktywne formy tlenu (ROS)^2,3,4. Zrozumienie sposobów wiązania i powinowactwa, które napędzają jego biochemię, powinno pomóc w wyjaśnieniu biologicznej roli jonu metalu.

Wiele technik jest używanych do badania oddziaływań wiążących metale i peptydy. Są to głównie techniki spektroskopowe, ale obejmują również symulacje komputerowe wykorzystujące dynamikę molekularną, co widać poprzez interakcje Cu(II) z fragmentem beta-amyloidu (Aβ)⁵. Szeroko stosowaną techniką spektroskopową, która jest dostępna dla wielu uniwersytetów, jest magnetyczny rezonans jądrowy (NMR). Wykorzystując paramagnetyczną naturę Cu(II), Gaggelli i in. byli w stanie pokazać, gdzie jon metalu wiąże się na petide poprzez relaksację pobliskich jąder⁶. Elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR) może być również wykorzystany do zbadania lokalizacji i trybu wiązania jonów metali paramagnetycznych⁷. Inne techniki spektroskopowe, takie jak dichroizm kołowy (CD), mogą opisywać koordynację wokół Cu(II) w układach takich jak układy tripeptydowe⁸, a spektrometria mas może pokazać stechiometrię i to, do których pozostałości jon metalu jest koordynowany za pomocą wzorców fragmentacji^9,10.

Niektóre z tych technik, takie jak NMR, są bezznacznikowe, ale wymagają dużych stężeń peptydu, co stanowi wyzwanie dla badań. Inna popularna technika, zwana spektroskopią fluorescencyjną, została wykorzystana do powiązania pozycji tyrozyny lub tryptofanu z hartowaniem z klasy Cu(II)11^,12. Podobnie, ta technika może pokazać zmiany strukturalne w wyniku wiązania Cu(II) class¹³. Jednak wyzwania związane z tymi badaniami wiązania metal-peptyd polegają na tym, że badają one aminokwasy chromoforowe, takie jak tyrozyna, które nie wszystkie systemy mają, że jon metalu wiąże się w klasycznym modelu i że technika ta może nie sprzyjać w warunkach fizjologicznych. Rzeczywiście, pojawia się kilka peptydów, które nie zawierają takich aminokwasów chromoforowych lub wiążą się z klasycznymi modelami, co wyklucza stosowanie tych technik^14,15. W tym artykule szczegółowo opisano podejścia do oceny właściwości wiązania w tych scenariuszach w warunkach fizjologicznie istotnych.

Ligandy biologiczne mogą przyjmować różne stany protonacji, które mogą wpływać na wiązanie jonów metali, takie jak pierścień imidazolowy na histydynie. Jeśli pH nie jest konsekwentnie utrzymywane, wyniki mogą być zawiłe lub sprzeczne. Z tego powodu są niezbędnym składnikiem w badaniu oddziaływań metal-białko/peptyd. Wykazano jednak, że wiele korzystnie oddziałuje z jonami metali^16,17. Oprócz konkurowania z interesującą cząsteczką biologiczną, bufor może mieć podobne atomy koordynujące, które mogą być trudne do odróżnienia od koordynujących atomów peptydu lub białka. W niniejszej pracy skupiono się na elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) jako dwóch uzupełniających się technikach badania oddziaływań Cu(II)-peptyd, ze szczególnym uwzględnieniem wyboru buforu.

Elektroniczna spektroskopia absorpcyjna to szybka, szeroko dostępna technika badania oddziaływań wiążących metale. Naświetlanie światłem w ultrafiolecie (UV) lub w zakresie widzialnym może prowadzić do absorpcji pasm d-d skoncentrowanych na metalu, które dostarczają cennych informacji na temat klasyfikacji ligandów, geometrii metali i pozornego powinowactwa wiązań^18,19. W przypadku tych kompleksów bezpośrednie miareczkowanie jonów metali do roztworów białek lub peptydów może określić ilościowo stechiometrię wiązania i pozorne powinowactwo wiązania. W niektórych przypadkach, takich jak konfiguracje elektronowe d⁵ lub d¹⁰, kompleks nie absorbuje światła (tj. jest spektroskopowo cichy). W tych spektroskopowo cichych kompleksach metali przejściowych ograniczenia te można obejść, stosując konkurencyjny ligand, który po skoordynowaniu z jonem metalu daje wykrywalne pasma przenoszenia ładunku. W obu przypadkach podejście to ogranicza się do ilościowego określenia tylko stechiometrii i pozornego powinowactwa wiązania, a żaden wgląd w entalpię wiązania nie jest dostarczany bez przybliżeń.

Uzupełniając informacje uzyskane z elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej, ITC jest atrakcyjną techniką do bezpośredniego i rygorystycznego oznaczania entalpii wiązania²⁰. ITC bezpośrednio mierzy ciepło uwalniane lub zużywane podczas wiązania, a ponieważ miareczkowanie odbywa się przy stałym ciśnieniu, mierzone ciepło jest entalpią wszystkich równowag (ΔH_ITC). Ponadto określa się ilościowo stechiometrię zdarzenia wiązania (n) i pozorne powinowactwo wiązania (K_ITC). Na podstawie tych parametrów wyznaczana jest energia swobodna (ΔG_ITC) i entropia (ΔS_ITC), zapewniając termodynamiczny obraz zdarzenia wiązania. Ponieważ nie opiera się na absorpcji światła, ITC jest idealną techniką dla spektroskopowo cichych gatunków, na przykład kompleksów jonów metali d⁵ lub d¹⁰. Ponieważ jednak kalorymetria mierzy ciepło, wszelkie niedopasowane systemy buforowe i nieuwzględnione równowagi mogą niekorzystnie wpłynąć na analizę w celu dokładnego określenia termodynamiki wiązania jonów metali i należy dołożyć wszelkich starań, aby uwzględnić te czynniki²⁰. Jeśli ITC jest wykonywane z odpowiednim rygorem, jest solidną techniką określania termodynamiki kompleksów metal-białko/peptyd.

Tutaj używany jest chromoforycznie cichy peptyd wiążący miedź, peptyd C, aby zademonstrować komplementarne zastosowanie tych dwóch technik. Peptyd C jest produktem rozszczepienia 31 reszt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) powstającym podczas dojrzewania insuliny; brakuje mu reszt chromoforowych, ale wykazano, że wiąże Cu(II) z fizjologicznie istotnym powinowactwem^14,15. Miejsce wiązania Cu(II) składa się z łańcuchów bocznych glutaminianu i asparaginianu, a także N-końca peptydu^14,15. Te koordynujące się atomy bardzo przypominają te z wielu powszechnie używanych systemów buforowych. W tym miejscu pokazano tandemowe zastosowanie pasm d-d i przenoszenia ładunku w elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i ITC w ilościowym określaniu termodynamiki wiążącej Cu(II) z peptydem C. Podejście wynikające z badania wiązania Cu(II) z peptydem C można zastosować do innych jonów metali i układów białkowo-peptydowych.

Protocol

1. Elektroniczna spektroskopia absorpcyjna: bezpośrednie miareczkowanie z konkurencją buforową

1. Przygotowanie próbki
   1. Przygotować buforowany roztwór 50 mM 2-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-2-(hydroksymetylo)propano-1,3-diolu (bisTris) o pH 7,4 przy użyciu wody ultraczystej o oporności >18 MΩ). Usuń jony metali śladowych poprzez inkubację z żywicą o wysokim powinowactwie przez co najmniej 2 godziny, a następnie filtrację.
   2. Rozpuścić lub rozcieńczyć znaną ilość peptydu w buforze niezawierającym metalu.
      UWAGA: Podczas monitorowania pasm d-d o małych współczynnikach ekstynkcji²¹, należy stosować wyższe stężenia peptydu. W tym przypadku końcowe stężenie peptydu C w roztworze buforowym wynosiło 300 μM (objętość zależy od wielkości kuwety). Peptyd C został zsyntetyzowany w procesie syntezy peptydów w fazie stałej i jest szczegółowo opisany w innym miejscu w literaturze¹⁴.
   3. Rozpuścić znaną masę CuCl₂ w ultraczystej wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu 10-15 mM.
      UWAGA: Ważne jest, aby początkowo rozpuścić sól metalu w niebuforowanej wodzie, aby zapobiec wytrącaniu się. Można stosować inne sole Cu(II), ale należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że anion jest słabo skoordynowany.
2. Przeprowadzanie eksperymentu
   1. Włącz elektroniczny spektrofotometr absorpcyjny i pozwól mu się rozgrzać przez ~15-20 minut przed użyciem. Uruchom oprogramowanie spektrofotometru i skonfiguruj parametry, takie jak zakres skanowania (200-900 nm), szybkość skanowania (200 nm/s) i korekcja linii bazowej podwójnej wiązki (więcej parametrów znajduje się w pliku uzupełniającym).
   2. Zbierz linię bazową bez kuwet ani próbek na ścieżkach wiązki.
   3. Używając dwóch dopasowanych kuwet w spektrofotometrze dwuwiązkowym, załaduj jedną kuwetę 115 μl ultraczystej wody, a drugą kuwetę 115 μl próbki peptydu. Upewnij się, że w kuwetach nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ będą one zakłócać sygnał.
   4. Umieść kuwetę z ultraczystą wodą w wiązce referencyjnej, a kuwetę z peptydem w wiązce próbki.
   5. Zbierz widmo absorpcyjne peptydu wolnego od metalu (apo).
   6. Dodać substechiometryczną ilość (0,5 równoważnika, 150 μM) roztworu Cu(II) do kuwety z próbką peptydu. Upewnij się, że objętość dodanego Cu(II) jest mniejsza niż 3 μl i zapisz objętość do późniejszej analizy.
   7. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać roztwór, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Pozwól roztworowi reagować i równoważyć się przez 5 minut i zapisz widmo absorpcyjne.
   8. Powtórzyć dodawanie podwielokrotności Cu(II) jak w kroku 1.2.6 do roztworu peptydu dla następujących równoważników: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 i 5,0 (lub łącznie 300, 450, 600, 900 i 1,500 μM). Upewnij się, że zapisałeś całkowitą objętość dodanego Cu(II) i całkowitą objętość kuwety.
      UWAGA: Jeśli wymagana jest większa rozdzielczość, zmniejsz odstępy między odpowiednikami.
   9. Wyjmij sample kuweta i dokładnie wyczyść zgodnie ze wskazówkami producenta.
   10. Dodać buforowany roztwór bez peptydu i zapisać widmo absorpcyjne. Powtórzyć dodawanie podwielokrotności Cu(II) jak w krokach 1.2.5-1.2.8, rejestrując widmo absorpcyjne dla każdego równoważnika Cu(II).
   11. Eksportuj wszystkie widma jako pliki csv do przetworzenia. Dokładnie wyczyść kuwety zgodnie z instrukcjami producenta i wyłącz spektrofotometr.
3. Przetwarzanie danych
   1. Załaduj wszystkie widma do programu arkusza kalkulacyjnego.
   2. Odejmij widmo tylko buforowe (0 μM Cu(II)) od każdego innego widma, aby usunąć wszelkie cechy absorbancji z samego buforu.
   3. Znormalizować każde widmo, aby uwzględnić rozcieńczenie wynikające z dodania roztworu Cu(II) (krok 1.2.6). Zobacz plik uzupełniający, Eq (1)¹⁴ dla przykładu normalizacji, gdzie_{v initial} to objętość (115 μL) peptydu dodanego do kuwety, v_Cu(II) to objętość roztworu Cu(II) dodanego w kroku 1.2.6, a_{widmo odjęte buforem} Abs to dane uzyskane w kroku 1.2.7.
   4. Sporządź wykres wszystkich widm, aby zidentyfikować obszary zmian.
      UWAGA: Typowe pasma d-d z kompleksów Cu(II) mieszczą się w zakresie od 500 do 750 nm. To miareczkowanie spektrofotometryczne może być trudne ze względu na mały współczynnik ekstynkcji z pasm d-d, które są przejściami zabronionymi przez Laporte'a w geometrii oktaedrycznej²¹. Jeśli absorbancja jest zbyt słaba, alternatywnym podejściem jest zastosowanie ligandów chromoforowych, które powodują powstawanie pasm przenoszenia ładunku po związaniu się z Cu(II) (patrz sekcja 2).

2. Elektronowa spektroskopia absorpcyjna: konkurencja peptydów z ligandem chromoforycznym

1. Przygotowanie próbki
   1. Rozpuścić 1,10-fenantrolinę (fen) w ultraczystej wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie ~1 mM.
   2. Oprócz przygotowania próbki opisanej w sekcji 1.1 dla peptydu (etap 1.1.2) i Cu(II) (etap 1.1.3), należy przygotować 10 μM Cu(II) i 40 μM roztwór phen w buforze ([Cu(phen)₃]²⁺). Upewnij się, że objętość wypełnia kuwetę.
2. Przeprowadzanie eksperymentu
   1. Uruchomić elektroniczny spektrofotometr absorpcyjny jak w krokach 1.2.1 i 1.2.2, ale ustawić zakres skanowania na 200-400 nm.
   2. W dwóch dopasowanych kuwetach załaduj jedną kuwetę 115 μl ultraczystej wody, a drugą kuwetę 115 μl roztworu [Cu(phen)₃]²⁺. Umieścić kuwetę z wodą w wiązce referencyjnej, a kuwetę z roztworem [Cu(phen)₃]²⁺ w wiązce próbki.
   3. Zbierz widmo absorpcyjne kompleksu metal-ligand
   .
   4. Dodać stechiometryczną ilość (≈1 równoważnika, ≈10 μM) peptydu do roztworu [Cu(phen)₃]²⁺. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać, ale uważaj, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Zapisz objętość dodanego peptydu do przyszłej analizy.
      UWAGA: Używając kuwet o pojemności 115 μL, dodanie 3,83 μL peptydu 300 μM daje końcowe stężenie peptydu 9,7 μM.
   5. Inkubować roztwór przez 5 minut, aby osiągnąć równowagę. Zapisz widmo absorpcyjne.
      UWAGA: Jeśli powinowactwo wiązania metal-peptyd i metal-ligand są podobne, stężenie dodanego peptydu będzie musiało być w dużym nadmiarze. Pamiętaj, aby wziąć pod uwagę całkowitą objętość peptydu dodanego do normalizacji.
   6. Powtórzyć dodawanie podwielokrotności peptydów do roztworu [Cu(phen)₃]²⁺ dla następujących przybliżonych równoważników: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 i 26. Zanotować objętość dodanego peptydu, aby można było określić stężenie rozcieńczone.
   7. Wyjmij sample i dokładnie wyczyść kuwetę zgodnie z instrukcjami producenta. Zbierz widmo bufora. Zebrać widmo peptydu 50 μM w buforze.
   8. Eksportuj wszystkie dane jako pliki csv do przetworzenia i wyczyść kuwety zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Przetwarzanie danych
   1. Załaduj widma do arkusza kalkulacyjnego i odejmij widmo bufora od innych widm.
   2. Znormalizuj widma zgodnie z plikiem uzupełniającym, korektor (2)¹⁴.
   3. Korzystając ze współczynnika ekstynkcji dla [Cu(phen)₃]²⁺ przy 265 nm (_{ε max} = 90 000 ^{M-1 cm-1})²², określ stężenie [Cu(phen)₃]²⁺ przy każdym dodaniu peptydu.
   4. Dla każdego dodania peptydu oznaczyć stężenie kompleksu peptydowego Cu(II), odejmując pozostałe stężenie [Cu(phen)₃]²⁺, jak określono w kroku 2.3.2, od początkowego stężenia [Cu(phen)₃]²⁺ (przy 0 μM peptydu).
   5. Oblicz stężenie wolnego liganda phen za pomocą równania w pliku uzupełniającym, Eq (3)¹⁴.
   6. Oblicz stężenie wolnego peptydu za pomocą pliku uzupełniającego, Eq (4)¹⁴, gdzie [peptyd]_stock reprezentuje nierozcieńczony peptyd miareczkowany do kuwety, V₁ oznacza objętość dodanego peptydu podstawowego, V₂ to całkowita objętość kuwety, a [Cu²⁺-peptyd] określa się w kroku 2.3.4.
   7. Oblicz eksperymentalne powinowactwo wiązania (K_ex) za pomocą korektora (5) w pliku uzupełniającym²³.
   8. Powiąż stałą dysocjacji peptydu Cu(II) z K_ex przez Eq (6)²³ w pliku uzupełniającym, gdzie K_{d,Cu(II)-phen} = 1,0 × 10-9 (patrz ²²). Określ średnią i odchylenie standardowe od wszystkich wyznaczonych stałych dysocjacji.
      UWAGA: W stosunku 4:1 phen:Cu(II), [Cu(phen)₃]²⁺, [Cu(phen)₂^]2+ i [Cu(phen)]2+ i [Cu(phen)]²⁺ występują w roztworze, a peptyd będzie chelatował Cu(II) z dala od gatunku ([Cu(phen)]²⁺) o najsłabszym wiązaniu²².

3. Kalorymetria miareczkowa izotermiczna

1. Przygotowanie próbki
   1. Przygotować buforowany roztwór 15 mM kwasu 3-morfolinopropano-1-sulfonowego (MOPS) o pH 7,4 przy użyciu wody ultraczystej (rezystancja >18 MΩ). Usunąć jony metali śladowych poprzez inkubację z żywicą o wysokim powinowactwie przez co najmniej 2 godziny, a następnie filtrację próżniową przez membranę 0,45 μm w butelce.
   2. Rozpuścić znaną masę CuCl₂ w ultraczystej wodzie, aby przygotować roztwór o stężeniu ≈50-100 mM. Rozcieńczyć ten roztwór Cu(II) do buforu, aby otrzymać 1,0 ml roztworu o końcowym stężeniu 1,4 mM Cu(II). Zanotować dokładną objętość użytego roztworu CuCl₂
   .
   3. Rozpuścić lub rozcieńczyć roztwór peptydu w buforze, aby uzyskać 450 μl roztworu peptydu o stężeniu 154 μM. Upewnij się, że do roztworu peptydowego zostanie dodana taka sama proporcja dodatkowej wody ultraczystej z kroku 3.1.2, co zmniejszy ciepło rozcieńczenia i zwiększy stosunek sygnału do szumu.
   4. Po przygotowaniu próbek należy upewnić się, że roztwory mają takie samo pH i, w razie potrzeby, odpowiednio dostosować.
   5. Opcjonalny krok: Odgazowanie roztworów w celu zminimalizowania mikropęcherzyków załadowanych do ITC.
2. Przeprowadzanie eksperymentu
   1. Włącz funkcję ITC. Uruchom oprogramowanie ITC, aby uruchomić urządzenie. Poczekaj na pierwszą inicjalizację, która poprosi o ponowne umieszczenie biurety w domu; Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
   2. Zdejmij pokrywę z komórki referencyjnej. Usunąć wodę z celi referencyjnej i spłukać trzykrotnie 450 μl odgazowanej ultraczystej wody.
   3. Powoli nabierać ultraczystą wodę do oznaczenia 450 μl strzykawki ładującej, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do strzykawki. Włożyć strzykawkę ładującą do kuwety referencyjnej tak, aby znajdowała się ≈1 mm od dna, a następnie powoli wstrzykiwać część roztworu, aż w strzykawce ładującej pozostanie 150 μl. Kilkakrotnie przesunąć tłok strzykawki ładującej w górę i w dół o ≈25 μl, aby usunąć pęcherzyki na powierzchni komórki. Powoli wstrzykiwać, aż tłok osiągnie oznaczenie 100 μl na strzykawce ładującej, dozując w ten sposób łącznie 350 μl ultraczystej wody do celi referencyjnej, a następnie założyć pokrywę kuwety referencyjnej.
   4. Usunąć resztki roztworu z celi próbki i obciążyć 450 μl 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) za pomocą strzykawki ładującej. Moczyć przez 10 minut, aby upewnić się, że jony metali śladowych zostały usunięte, ponieważ EDTA wiąże metale śladowe.
   5. Usunąć roztwór EDTA (ze związanymi jonami metali śladowych) i dokładnie przepłukać strzykawkę ładującą dużą ilością ultraczystej wody.
   6. Wyczyść ITC zgodnie ze wskazówkami producenta, przepłukując sample cell ultraczystą wodą.
   7. Kondycjonować celę próbki, przepłukując ją co najmniej trzykrotnie 450 μl buforu.
   8. Usuń bufor, który kondycjonuje próbkę komórki. Załadować roztwór peptydu do celi próbki za pomocą strzykawki ładującej (wykonaj krok 3.2.3).
   9. Przepłukać strzykawkę do miareczkowania 200 μl roztworu buforowego. W tym celu należy zdjąć tłok i za pomocą mikropipety odpipetować bufor przez otwór w górnej części szklanej strzykawki do miareczkowania, przez strzykawkę i wyjąć igłę znajdującą się poniżej.
   10. Całkowicie włożyć tłok do strzykawki do miareczkowania.
   11. Zanurzyć końcówkę igły strzykawki do miareczkowania w roztworze metalu i powoli pociągnąć tłok do góry, powodując wypełnienie strzykawki roztworem metalu i powstanie pusta objętość w górnej części szklanej strzykawki do miareczkowania. Usunąć większość pustej przestrzeni, obracając strzykawkę do miareczkowania równolegle do podłogi, wyjąć tłok i lekko przechylić szklaną część w kierunku podłogi. Delikatnie potrząsnąć strzykawką do miareczkowania, tak aby roztwór przesunął się do końca szklanej części strzykawki do miareczkowania i wypełnił większość pustej przestrzeni, ale upewnij się, że pozostały 2-3 μl pustej objętości. Trzymając strzykawkę równolegle do podłogi, ponownie włożyć tłok.
   12. Trzymać strzykawkę do miareczkowania pionowo, zanurzyć końcówkę igły z powrotem w roztworze metalu i wcisnąć tłok w dół, aż powietrze przestanie wydostawać się z igły. Załadować strzykawkę do miareczkowania, powoli pociągając tłok do góry do poziomu nieco powyżej oznaczenia 50 μl, trzymając końcówkę igły w roztworze.
   13. Ostrożnie włożyć szklaną część strzykawki do miareczkowania do biurety i dokręcić do oporu. Gdy niewielka ilość roztworu wydostanie się ze strzykawki do miareczkowania w wyniku ściśnięcia tłoka, należy użyć lekkiej, delikatnej wycieraczki, aby ostrożnie wchłonąć roztwór bez dotykania końcówki igły.
   14. Włożyć biuretę ze strzykawką do miareczkowania do celi próbki i mocno ją zamocować.
   15. Skonfiguruj parametry w oprogramowaniu ITC. Zaczynając od Instrument Control, ustaw szybkość mieszania (typowe szybkości mieszania wahają się od 150 do 350 obr./min) i temperaturę, w której zostanie przeprowadzony eksperyment (zwykle 25 °C). Wprowadź stężenia strzykawki i komórek w jednostkach milimolowych w obszarze Szczegóły eksperymentu.
   16. W sekcji Experiment Method (Metoda eksperymentu) wybierz opcję Incremental Tiration (Miareczkowanie przyrostowe). Kliknij Setup (Konfiguracja) i określ 20 wstrzyknięć po 2,5 μl. Jeśli do zaobserwowania zdarzenia wiązania wymagana jest większa rozdzielczość, należy zwiększyć liczbę wstrzyknięć i zmniejszyć objętość na wstrzyknięcie. Wprowadź odstęp czasowy między każdym wstrzyknięciem, tak aby był wystarczająco długi, aby sygnał zrównoważył się i powrócił do linii podstawowej, zwykle 300 s.
   17. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć eksperyment i określić miejsce zapisywania danych.
   18. Po zakończeniu eksperymentu wyczyść celę próbki i strzykawkę do miareczkowania.
   19. Przeprowadź wszystkie eksperymenty w co najmniej trzech egzemplarzach, aby zapewnić precyzyjne zbieranie danych.
   20. Przeprowadź eksperyment kontrolny, w którym roztwór metalu jest miareczkowany do roztworu buforowanego (pod nieobecność peptydu), aby upewnić się, że ciepło rozcieńczania jonu metalu jest małe i że nie ma niewyjaśnionych równowag. Jeśli ciepło rozcieńczania jest duże, należy rozważyć inny system buforowy, jeśli to możliwe.
3. Przetwarzanie danych
   1. Uruchom oprogramowanie do analizy ITC i załaduj plik danych do analizy.
   2. Przejdź do zakładki Linia bazowa i sprawdź termogram. Zwróć uwagę na wszelkie egzogenne ciepło wydzielające się lub pochłaniane z pęcherzyków powietrza lub innych artefaktów na termogramie. Poszukaj kolców, które nie są spowodowane wstrzyknięciem roztworu metalu.
   3. Upewnij się, że linia bazowa wygenerowana przez oprogramowanie analityczne jest zgodna z częścią danych po wstrzyknięciu i zrównoważeniu. Jeśli odchyla się, użyj punktów obrotu linii bazowej, aby dostosować linię bazową. Upewnij się, że regiony integracji obejmują pik wygenerowany w wyniku wstrzyknięcia metalu, ale nie zawierają żadnych pęcherzyków powietrza ani artefaktów na termogramie znalezionym w kroku 2. Odejmij linię bazową od termogramu.
      UWAGA: Ten rodzaj manipulacji jest zalecany tylko po zebraniu wielu termogramów, aby eksperymentator wiedział, co jest rzeczywistymi danymi, a co artefaktem, ponieważ dostosowanie linii bazowej i regionów integracji może drastycznie wpłynąć na dane.
   4. Przejdź do okna Modelowanie, aby rozpocząć dopasowywanie danych, w którym oprogramowanie analityczne pokaże zintegrowane i znormalizowane dane dla każdego wstrzyknięcia.
   5. Kliknij lewym przyciskiem myszy odniesienie pierwszego wtrysku, aby usunąć je z algorytmu dopasowania.
      UWAGA: Jest to powszechne, ponieważ dochodzi do niewielkiego wymieszania titranta z roztworem komórek próbki, co prowadzi do niedokładnego dozowania zębów trzonowych w pierwszym wstrzyknięciu.
   6. W sekcji Modele wybierz opcję Puste (stałe) z menu rozwijanego Styl, które jest oparte na końcowej entalpii wtrysku i zostanie odjęte od każdego punktu danych, biorąc pod uwagę ciepło rozcieńczenia. Ponadto wybierz opcję Niezależny (lub najlepszy model dla systemu) z drugiego menu rozwijanego Styl, aby dopasować dane.
      UWAGA: W przypadku standardowych interakcji powiązań 1:1 najczęściej spotykanym modelem jest model niezależny.
   7. Dopasuj dane za pomocą dwóch modeli, naciskając zielony przycisk odtwarzania z Σ.
      UWAGA: Innym programem do przetwarzania danych ITC jest SEDPHAT²⁴.
   8. Uwzględnij wszystkie konkurujące ze sobą równowagi w analizie post hoc opisanej wcześniej przez Grossoehme i wsp.²⁰.

Results

Celem było ilościowe określenie i potwierdzenie termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydem C przy użyciu uzupełniających technik elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i ITC. Ze względu na solidny charakter elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej przeprowadzono bezpośrednie miareczkowanie Cu(II) do 300 μM C-peptydu (Rysunek 1). Dodanie 150 μM Cu(II) spowodowało natychmiastowy wzrost pasma przy 600 nm, przypisany pasmu d-d Cu(II) i kontynuowało wzrost do momentu dodania 300 μM Cu(II). Dalsza addycja...

Discussion

W artykule przedstawiono solidną metodę ilościowego określania powinowactwa i termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami. Kompleksy z Cu(II) idealnie nadają się do monitorowania pasma absorpcji d-d w miejscu metalu ze względu na konfigurację elektronową d⁹ . Chociaż współczynnik ekstynkcji jest niewielki, co wymaga większych stężeń kompleksu, aby uzyskać wiarygodny sygnał, miareczkowanie Cu(II) do peptydu może szybko dostarczyć wglądu w stechiometrię wiązania i przybliżone powinowactwo wiązania. Jednak dostrzeż...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,10-fenantrolina	Sigma Aldrich	131377-25G
Bufor bis-Tris	Fisher	BP301-100
Membrana butelkowa 0,45 mikrona	Nalgene	296-4545	Dopuszczalny jest każdy system filtracji, który usuwa żywicę bez wprowadzania zanieczyszczeń
Chlorek miedzi(II)	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Elektroniczny spektrofotometr absorpcyjny	Varian	Cary 5000	Innym odpowiednim czułym spektrofotometrem jest dopuszczalna
żywica o wysokim powinowactwie	Sigma Aldrich	C7901-25G
Kalorymetr miareczkowania izotermicznego (ITC)	TA Instrumenty	Nano ITC Oprogramowanie
	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137– 148) może być również używany
Oprogramowanie ITC	TA Instruments	ITCRun
lekka delikatna wycieraczka	Kimwipe	34155
strzykawka ładująca	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
dopasowane kuwety	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Upewnij się, że okienko kuwety o małej objętości odpowiada wysokości wiązki spektrofotometru
Bufor MOPS	Alfa Aesar	A12914
	Cary	WinUV Scan
arkusz kalkulacyjny	Microsoft	Excel	Każdy odpowiedni program do arkuszy kalkulacyjnych będzie działał
strzykawka do miareczkowania	TA Instruments	5346
woda ultraczysta	Millipore Sigma	Milli-Q	Każda woda jest w porządku, o ile >18 MΩ opór