Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zęby mają kluczowe znaczenie w życiu, nie tylko dla jedzenia, żucia i mowy, ale także dla dobrego samopoczucia psychicznego. Wiedza na temat rozwoju i biologii zębów człowieka jest niewielka. W szczególności niewiele wiadomo o nabłonkowych komórkach macierzystych zęba i ich funkcji. Udało nam się opracować nowatorski model organoidowy, zaczynając od ludzkiej tkanki zęba (tj. mieszków zębowych, wyizolowanych z usuniętych zębów mądrości). Organoidy są solidnie i długoterminowo rozszerzalne i podsumowują proponowany przedział komórek macierzystych nabłonka ludzkiego zęba pod względem ekspresji markerów, a także aktywności funkcjonalnej. W szczególności organoidy są zdolne do rozwijania procesu różnicowania ameloblastów, który zachodzi in vivo podczas amelogenezy. Ten unikalny model organoidu dostarczy potężnego narzędzia do badania nie tylko rozwoju ludzkich zębów, ale także patologii stomatologicznej i może utorować drogę do terapii regeneracyjnej zębów. Zastąpienie utraconych zębów zębem biologicznym opartym na tym nowym modelu organoidu może być atrakcyjną alternatywą dla obecnego standardowego wszczepiania materiałów syntetycznych.
Wprowadzenie
Zęby odgrywają kluczową rolę w przeżuwaniu, mowie i samopoczuciu psychicznym (obrazie siebie). Ząb ludzki składa się z wysoko zmineralizowanych tkanek o różnej gęstości i twardości1. Szkliwo zębów, główny składnik korony zęba, jest najbardziej zmineralizowaną tkanką w organizmie człowieka. Podczas tworzenia szkliwa (amelogenezy), gdy rozwijają się zęby, komórki macierzyste nabłonka zębów (DESC) różnicują się w komórki tworzące szkliwo (ameloblasty). Raz uformowane szkliwo jest rzadko naprawiane lub odnawiane z powodu apoptotycznej utraty ameloblastów na początku wyrzynania się zębów1. Odbudowa uszkodzonej tkanki szkliwa,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Badań UZ/KU Leuven (13/0104U). Usunięte trzecie zęby trzonowe (zęby mądrości) uzyskano po uzyskaniu świadomej zgody pacjentów.
1. Przygotowania
- Podgrzej 48-dołkową płytkę hodowlaną przez 15-20 godzin w inkubatorze o stężeniu 1,9% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Upłynnić podwielokrotność Matrigelu (o obniżonym czynniku wzrostu; bez czerwieni fenolowej; określana dalej jako matryca błony podstawnej; BMM) na lodzie (4 °C) przez co najmniej 2 godziny przed etapem 2.1.
UWAGA: Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania BMM. Upły....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rozwój organoidów zębowych
Przedstawiamy szczegółowy protokół tworzenia kultur organoidów z ludzkiej tkanki DF uzyskanej po ekstrakcji zęba mądrości (Rycina 1A). Wyizolowane DF są dysocjowane enzymatycznie i mechanicznie. Uzyskane komórki są hodowane w BMM w pożywkach, które zostały empirycznie zdefiniowane w celu optymalnego rozwoju i wzrostu organoidów (pożywka do organoidów zębowych; TOM)19.
Organoidy zazwyczaj rozwi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje wydajne i powtarzalne wytwarzanie organoidów, począwszy od ludzkiego zęba. Zgodnie z naszą wiedzą, jest to pierwsza metodologia tworzenia organoidów (nabłonkowych) opartych na obecnej koncepcji, począwszy od ludzkiej tkanki zębowej. Organoidy są długotrwale rozszerzalne i wykazują fenotyp łodygi nabłonka zębów, powielając DEC wcześniej zgłoszone w kompartmencie ERM DF7. Co więcej, organoidy odtwarzają funkcjonalne cechy DESC/ERM, w tym rozwój procesu różnicowania ameloblastów<.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor korespondencyjny zapewnia, że wszyscy autorzy ujawnili wszelkie konflikty interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni wszystkim pracownikom Chirurgii Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej (MKA) UZ Leuven, jak również pacjentom, za ich nieocenioną pomoc w zbieraniu świeżo pobranych trzecich zębów trzonowych. Chcielibyśmy również podziękować dr Reinhilde Jacobs i dr Elisabeth Tijskens za pomoc w pobraniu próbek. Prace te były wspierane przez granty z KU Leuven (BOF) i FWO-Flanders (G061819N). L.H. jest doktorantem FWO (1S84718N).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml Probówka do mikrowirówek | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 ml Probówka wirówkowa | Corning | 430052 | |
| 2-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-dołkowe płaskie płytki | denne Corning | 3548 | |
| 50 ml Probówka wirówkowa | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | ||
| Agaroza | Lonza | 50004 | |
| Albumina bydlęca (klasa hodowli komórkowych) | Serva | 47330.03 | |
| Przeciwciało AMELX | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amfoterycyna B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (bez witaminy A) | Gibco | 12587-010 | |
| Kaseta | VWR | ||
| Katalaza z wątroby bydlęcej | Przeciwciało Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 | Abcam | ab34485 | |
| Sitko do komórek, 40 i mikro; m | Falcon | 352340 | |
| Toksyna | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Kwas cytrynowy | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| Przeciwciało CK14 | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Kolagenaza IV | Gibco | 17104-019 | |
| Szkło osłonowe | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dyspaza II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 bez Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM w proszku o wysokiej zawartości glukozy | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Serum osła | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Stacja robocza do zatapiania, 220 do 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Absolut etanolu, ≥ 99,8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= zasadowa FGF) | R& D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Zawiera 1% β-merkaptoetanol rozpuszczony w buforze do lizy |
| Szklana pipeta Pasteura | Mechanizmy Niko | 170-40050 | |
| Glicyna | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (inhibitor ROCK, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulina z trzustki bydła | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Przeciwciało ITGA6 | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (o obniżonym czynniku wzrostu; bez czerwieni fenolowej) | Corning | 15505739 | |
| Szkiełko mikroskopowe | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0,22 μ m | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum niezbędne medium eagle (α MEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mysie przeciwciało IgG (Alexa 555) | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylo-L-cysteina | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nikotynamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| Przeciwciało P63 | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Długopis znakujący |
| Paraformaldehyd (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Sól sodowa penicyliny G | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicylina-streptomycyna (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| szalka | PetriegoCorning | 353002 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipeta (P20, P200, P1000) | Eppendorf lub inne | 2231300006 | |
| Plastikowa pipeta transferowa (3,5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Przeciwciało drugorzędowe IgG królika (Alexa 488) | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Skalpel (ostrze chirurgiczne) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R& D Systems | 464-SH-200 | |
| Formy silikonowe (blok grzewczy) | VWR | 720-1918 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Wodorowęglan sodu (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Pirogronian sodu (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| Przeciwciało SOX2 | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | System PCR w czasie rzeczywistym | |
| Stericup-GP, 0,22 i mikro; m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterylny filtr górny z probówką wirówkową, 0,22 & mu; m | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterylne 1000 μ L końcówki do pipet z filtrem | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μ L końcówki do pipet z filtrem | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μ Końcówki do pipet L z filtrem i bez | Greiner | 739288 | |
| Sterylne H2O | Fresenius | B230531 | |
| Sól siarczanu streptomycyny | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Indeks górny III do syntezy pierwszej nici supermix | Invitrogen | 11752-050 | Zestaw do odwrotnej transkrypcji |
| Procesor tkanek | Thermo Scientific | ||
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Medium montażowe Vectashield + DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Medium montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Ksyleny, 99%, do biochemii i histologii | VWR | 2,89,75,325 |
Bibliografia
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
