Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63671

⸱

13 kwietnia 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven), 2Biomedical Research Institute (BIOMED), UHasselt, Hasselt University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.

Streszczenie

Zęby mają kluczowe znaczenie w życiu, nie tylko dla jedzenia, żucia i mowy, ale także dla dobrego samopoczucia psychicznego. Wiedza na temat rozwoju i biologii zębów człowieka jest niewielka. W szczególności niewiele wiadomo o nabłonkowych komórkach macierzystych zęba i ich funkcji. Udało nam się opracować nowatorski model organoidowy, zaczynając od ludzkiej tkanki zęba (tj. mieszków zębowych, wyizolowanych z usuniętych zębów mądrości). Organoidy są solidnie i długoterminowo rozszerzalne i podsumowują proponowany przedział komórek macierzystych nabłonka ludzkiego zęba pod względem ekspresji markerów, a także aktywności funkcjonalnej. W szczególności organoidy są zdolne do rozwijania procesu różnicowania ameloblastów, który zachodzi in vivo podczas amelogenezy. Ten unikalny model organoidu dostarczy potężnego narzędzia do badania nie tylko rozwoju ludzkich zębów, ale także patologii stomatologicznej i może utorować drogę do terapii regeneracyjnej zębów. Zastąpienie utraconych zębów zębem biologicznym opartym na tym nowym modelu organoidu może być atrakcyjną alternatywą dla obecnego standardowego wszczepiania materiałów syntetycznych.

Wprowadzenie

Zęby odgrywają kluczową rolę w przeżuwaniu, mowie i samopoczuciu psychicznym (obrazie siebie). Ząb ludzki składa się z wysoko zmineralizowanych tkanek o różnej gęstości i twardości1. Szkliwo zębów, główny składnik korony zęba, jest najbardziej zmineralizowaną tkanką w organizmie człowieka. Podczas tworzenia szkliwa (amelogenezy), gdy rozwijają się zęby, komórki macierzyste nabłonka zębów (DESC) różnicują się w komórki tworzące szkliwo (ameloblasty). Raz uformowane szkliwo jest rzadko naprawiane lub odnawiane z powodu apoptotycznej utraty ameloblastów na początku wyrzynania się zębów1. Odbudowa uszkodzonej tkanki szkliwa, spowodowanej urazem lub chorobą bakteryjną, jest obecnie realizowana przy użyciu materiałów syntetycznych; Są one jednak dotknięte istotnymi niedociągnięciami, takimi jak mikrowycieki, gorsza osteointegracja i zakotwiczenie, skończona żywotność i brak w pełni funkcjonalnej naprawy2. W związku z tym solidna i niezawodna hodowla ludzkich DEC ze zdolnością do generowania ameloblastów i potencjałem do wytwarzania zmineralizowanej tkanki byłaby dużym krokiem naprzód w dziedzinie regeneracji zębów.

Wiedza na temat fenotypu ludzkiego DESC i funkcji biologicznej jest rzadkością3,4,5. Co ciekawe, zaproponowano, że DES ludzkich zębów istnieją w resztkach komórek nabłonkowych Malasseza (ERM), skupiskach komórek obecnych w mieszku zębowym (DF), który otacza niewyrżnięte zęby i pozostaje obecny w więzadle przyzębia wokół korzenia po wyrzynaniu się zęba1. Stwierdzono, że komórki ERM hodowane wspólnie z miazgą zębową różnicują się w komórki podobne do ameloblastów i generują tkankę podobną do szkliwa6. Jednak dogłębne badania nad specyficzną rolą komórek ERM w (re-) generacji szkliwa były ograniczone ze względu na brak wiarygodnych modeli badawczych7. Obecne systemy hodowli in vitro ERM są utrudnione przez ograniczoną żywotność i szybką utratę fenotypu w standardowo stosowanych warunkach 2D8,9,10,11,12. W związku z tym bardzo potrzebny jest elastyczny system in vitro, który wiernie rozwijałby, badał i różnicował ludzkie DESC.

W ciągu ostatniej dekady, potężna technika hodowli nabłonkowych komórek macierzystych in vitro została z powodzeniem zastosowana do kilku typów (ludzkich) tkanek nabłonkowych w celu zbadania ich biologii, a także choroby13,14,15,16. Technologia ta umożliwia komórkom macierzystym nabłonka tkankowego samorozwój w struktury komórkowe 3D (tj. organoidy) po zasianiu do rusztowania naśladującego macierz zewnątrzkomórkową (ECM) (zwykle Matrigel) i hodowli w określonym pożywce replikującej sygnalizację niszy komórek macierzystych tkanki i / lub embriogenezę. Typowe czynniki wzrostu potrzebne do rozwoju organoidów obejmują naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i bezskrzydłe aktywatory miejsca integracji MMTV (WNT) 14,15,16. Powstałe w ten sposób organoidy charakteryzują się trwałą wiernością w naśladowaniu oryginalnych nabłonkowych komórek macierzystych tkanki, a także wysoką rozszerzalnością przy zachowaniu ich fenotypu i właściwości funkcjonalnych, pokonując w ten sposób często ograniczoną dostępność pierwotnych tkanek ludzkich nabytych w klinice. Aby ustalić organoidy, izolacja nabłonkowych komórek macierzystych z tkanki heterogenicznej (tj. obejmującej inne typy komórek, takich jak komórki mezenchymalne) przed hodowlą nie jest wymagana, ponieważ komórki mezenchymalne nie przyczepiają się do ECM ani nie rozwijają się w nim, co ostatecznie prowadzi do powstania czysto nabłonkowych organoidów13,16,17,18,19. Ta obiecująca i wszechstronna technologia doprowadziła do opracowania różnorodnych modeli organoidów z różnych ludzkich tkanek nabłonkowych. Jednak organoidy pochodzące z ludzkich zębów, cenne dla dogłębnych badań nad rozwojem, regeneracją i chorobami zębów, nie zostały jeszcze ustalone20,21. Niedawno udało nam się opracować taki nowy model organoidowy, zaczynając od tkanki DF z trzecich zębów trzonowych (zębów mądrości) pobranych od dorastających pacjentów19.

Tutaj opisujemy protokół tworzenia nabłonkowych kultur organoidowych z dorosłego ludzkiego zęba (tj. z DF trzecich zębów trzonowych) (Rysunek 1A). Powstałe w ten sposób organoidy wykazują ekspresję markerów macierzystych związanych z ERM, a jednocześnie są podatne na długoterminową ekspansję. Co ciekawe, w przeciwieństwie do większości innych modeli organoidów, zazwyczaj potrzebny EGF jest zbędny dla solidnego rozwoju i wzrostu organoidów. Co ciekawe, organoidy macierzyste wykazują właściwości różnicowania ameloblastów, naśladując w ten sposób cechy i procesy ERM/DESC zachodzące in vivo. Opisany tutaj nowy i unikalny model organoidów pozwala badać biologię, plastyczność i zdolność różnicowania DESC oraz otwiera drzwi do podjęcia pierwszych kroków w kierunku podejścia regeneracyjnego zębów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Badań UZ/KU Leuven (13/0104U). Usunięte trzecie zęby trzonowe (zęby mądrości) uzyskano po uzyskaniu świadomej zgody pacjentów.

1. Przygotowania

  1. Podgrzej 48-dołkową płytkę hodowlaną przez 15-20 godzin w inkubatorze o stężeniu 1,9% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Upłynnić podwielokrotność Matrigelu (o obniżonym czynniku wzrostu; bez czerwieni fenolowej; określana dalej jako matryca błony podstawnej; BMM) na lodzie (4 °C) przez co najmniej 2 godziny przed etapem 2.1.
    UWAGA: Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania BMM. Upłynniać BMM przez 15-20 godzin na lodzie i porcjować w temperaturze 1 ml w probówkach do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  4. Przygotuj pożywkę i przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm. Poniższe tomy są oparte na zbiorze DF ze wszystkich czterech trzecich zębów trzonowych, zwykle ekstrahowanych jednocześnie.
    1. Przygotować 20 ml pożywki do pobierania DF (Tabela 1): minimum niezbędnego podłoża orła (αMEM) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,5% amfoterycyny B i 1% penicyliny-streptomycyny. Przenieść 4 ml pożywki do pobierania DF do probówki o pojemności 15 ml i przenieść probówki na lód.
      UWAGA: Jedna probówka o pojemności 15 ml wystarcza na pacjenta do pobrania próbki (tj. dla czterech trzecich zębów trzonowych).
    2. Przygotować 20 ml pożywki z organoidów zębowych (zwanej dalej TOM; Tabela 2) przy użyciu pożywki zdefiniowanej bez surowicy (SFDM; Tabela 3). Przechowywać TOM w temperaturze 4 °C maksymalnie 2 tygodnie.
    3. Przygotować 8 ml pożywki dysocjacyjnej (Tabela 4), tj. soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej kolagenazę VI (3 mg/ml ) i dypazę II (4 mg/ml). Przed użyciem podgrzej pożywkę dysocjacyjną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut i przenieś ją do dwóch probówek o pojemności 15 ml (4 ml na probówkę) w celu dysocjacji czterech tkanek DF.
    4. Przygotować płytkę myjącą (12-dołkową) zawierającą: trzy studzienki z 70% EtOH, trzy studzienki z PBS i trzy studzienki z pożywką do zbierania DF.
    5. Przygotować 15 ml pożywki A na próbkę (tj. 5 ml na dwa DF na pacjenta; Tabela 5).
      UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać w sterylnych warunkach.

2. Dysocjacja mieszków zębowych

  1. Po zebraniu trzecich zębów trzonowych wraz z powiązanymi DF w pożywce (na lodzie), należy przenieść zawartość probówek na szalkę Petriego.
  2. Przytrzymaj ząb pęsetą i ostrożnie odizoluj DF za pomocą ostrza chirurgicznego.
    UWAGA: Ten krok wymaga praktyki; Uważaj na ostrze.
  3. Aby zmyć pozostałą krew z DFs, umieść tkanki DF na krótko w pierwszym dołku z 70% EtOH (płytka myjąca) na 20 s, a następnie przenieś do następnego dołka EtOH na 20 s, a następnie do trzeciego dołka EtOH (maksymalnie 1 minuta na 70% EtOH w sumie; dłuższy czas inkubacji spowoduje zmniejszenie żywotności komórek).
  4. Następnie kontynuuj płukanie w trzech studzienkach PBS (łącznie maksymalnie 2 minuty).
  5. Przepłukać DF w trzech pozostałych studzienkach zbiorczych DF (łącznie maksymalnie 20 minut).
  6. Przenieś opłukane DF na nową szalkę Petriego.
  7. Wyciąć mały kawałek jednego z DF (~5 mm2) do utrwalenia paraformaldehydu (PFA) (patrz sekcja 7) i przechowywać go na lodzie (maksymalnie przez 6 godzin) w probówce do mikrowirówki zawierającej 500 μl pożywki do zbierania DFA do czasu utrwalenia PFA.
  8. Resztę DF zmielić na małe kawałki (~1 mm2).
    UWAGA: Zaleca się natychmiastowe przetworzenie świeżo wyizolowanych tkanek DF w celu uzyskania optymalnego tworzenia organoidów i wydajności wzrostu, zamiast rozpoczynania od kriokonserwowanej tkanki, co skutkuje niższą wydajnością. Niemniej jednak na tym etapie możliwa jest kriokonserwacja pierwotnej tkanki DF (patrz pożywka do krioprezerwacji i protokół w punkcie 5).
  9. Przenieść rozdrobnione DF do 15 ml probówki zawierającej 4 ml wstępnie podgrzanej pożywki dysocjacyjnej i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 godziny
    UWAGA: Dodaj dwa DF na 4 ml wstępnie podgrzanej pożywki dysocjacyjnej (jedna probówka), aby zapewnić optymalną dysocjację.
  10. Co 15 minut pipetować pożywkę dysocjacyjną DF w górę iw dół za pomocą szklanej pipety Pasteura, aby przyspieszyć rozpad tkanek. Gdy kawałki DF nie są już obserwowane (zwykle po 1 godzinie), przystąp do dysocjacji DF za pomocą zwężonej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalną dysocjację DF, należy przełączyć się na pipetę Pasteura zwężoną przez polerowanie ogniowe nie później niż 1 godzina izolacji DF.
    1. W międzyczasie należy przygotować 10 ml pożywki A zawierającej 50 μl DNazy (0,2 mg/ml; Tabela 5).
  11. Dodać 5 ml pożywki A (zawierającej DNazę) do każdej probówki ze zdysocjowanym DF i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).
  12. Przefiltrować zawiesinę komórek (zawierającą pojedyncze komórki i małe grudki komórek) przez sitko do komórek o wielkości 40 μm, aby usunąć pozostałe duże fragmenty i (większość) tkanki włóknistej.
    1. Na tym etapie należy połączyć kilka probówek z dysocjowanym DF od jednego pacjenta.
  13. Przepłukać filtr 1 ml pożywki A. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Usunąć sklarowany osad, zawiesić osad w 1 ml SFDM (Tabela 3) i przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  15. Oblicz stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Zaniedbuj pozostałe grudki komórek.
  16. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

3. Założenie hodowli organoidów zębowych (Rysunek 1A i Rysunek 2A)

  1. Na podstawie uzyskanego numeru komórki oblicz liczbę studzienek, które można zasiać. Jedna kropla o pojemności 20 μl powinna zawierać 20 000 komórek. Ostateczna mieszanka składa się z zawiesiny komórek i BMM w stosunku 30:70.
  2. Usunąć odpowiednią ilość supernatantu i ponownie zawiesić w lodowatym BMM, aby uzyskać stosunek 70:30 BMM: zawiesina komórek do posiewu. Na przykład, gdy uzyska się 200 000 komórek, płytka 10 kropelek po 20 μl. W ten sposób usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie 60 μl zawiesiny komórek, dodać 140 μl lodowatego BMM i ponownie zawiesić.
    1. Zawiesić powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Po ponownym zawieszeniu w BMM probówkę mikrowirówki należy trzymać na lodzie.
      UWAGA: Utrzymywanie probówki mikrowirówki na lodzie ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zestalenia BMM.
  3. Odpipetować 20 μl kropelek BMM w środku studzienek podgrzanej 48-dołkowej płytki hodowlanej.
  4. Odwrócić płytkę do góry nogami, umieścić ją w inkubatorze o stężeniu 1,9% CO2 (% CO2 zgodnie z buforem SFDM) i pozostawić do zestalenia przez co najmniej 20 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Dodać inhibitor ROCK (RI; 10 μM) i amfoterycynę B (0,1%) do TOM i podgrzać pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Amfoterycyna B jest wrażliwa na światło.
  6. Wziąć 48-dołkową płytkę z inkubatora, umieścić pionowo i dodać 250 μl przygotowanej wstępnie podgrzanej pożywki do każdego dołka z kropelką/komórkami BMM i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o stężeniu 1,9% CO2 .
  7. Aby odświeżyć pożywkę (najlepiej co 2-3 dni), przechyl 48-dołkową płytkę pod kątem 45°, delikatnie usuń poprzednią pożywkę, unikając dotykania kropelki BMM, i dodaj 250 μl nowej wstępnie podgrzanej pożywki TOM.
    UWAGA: Zaleca się odświeżanie co najmniej trzy razy w tygodniu, aby uniknąć wyczerpania kluczowych składników odżywczych i czynników wzrostu. RI musi być dodawane do TOM tylko podczas początkowego wysiewu i w pierwszych dniach każdego pasażowania (patrz sekcja 4), aby zapobiec śmierci komórki przez anoikis i zwiększyć wzrost organoidów. Amfoterycyna B jest dodawana do pożywki tylko podczas pasażu 0 (P0) w celu zablokowania ewentualnego zanieczyszczenia grzybiczego.

4. Amplifikacja i pasażowanie hodowli organoidów zębowych (Rysunek 1B i Rysunek 2B)

  1. Pasaż organoidów między 10 a 14 dniem hodowli.
    UWAGA: Unikaj hodowli przez dłuższy czas, ponieważ długotrwała hodowla może ograniczyć odrastanie organoidów i zdolność do przechodzenia. Tylko w początkowym okresie rozwoju (P0) organoidy mogą być hodowane przez okres do 20 dni, w zależności od ich tempa wzrostu (do osiągnięcia maksymalnej średnicy ±200 μm).
  2. Usuń pożywkę z dołków z organoidami, które muszą zostać przepasane. W ramach jednego warunku hodowli połącz do czterech zlewających się studzienek (patrz Rysunek 2C).
  3. Aby zebrać organoidy, dodać 400 μl lodowatego SFDM na studzienkę bezpośrednio na kroplę BMM i wielokrotnie pipetować pożywkę w górę iw dół, aż cała kropla BMM zostanie usunięta.
    1. W przypadku łączenia studzienek, należy przenieść 400 μl z pierwszego dołka do następnego (i tak dalej), aby usunąć zawierające organoidy kropelki BMM ze wszystkich studzienek, które należy zebrać.
  4. Przenieść usunięty zespół organoidu BMM do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie powtarzać krok 4.3, aż wszystkie struktury organoidów zostaną zebrane z dołków.
  5. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Podgrzej porcję TrypLE Express (uzupełnioną RI w temperaturze 5 μM) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Na probówkę mikrowirówkową z organoidami potrzebna jest objętość 400 μl TrypLE Express.
  7. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl TrypLE. Inkubować zawiesinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 12 minut.
  8. Dodać 400 μl lodowatego SFDM w celu inaktywacji enzymu i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  9. Wstępnie pokryj końcówkę (objętość patrz poniżej) lodowatym SFDM i ponownie zawieś osad organoidowy.
    1. Aby uniknąć utraty organoidów, należy ponownie użyć tej samej (wstępnie pokrytej) końcówki w jak największym stopniu, nie narażając na szwank sterylności.
      UWAGA: Objętość SFDM wymagana do ponownego zawieszenia osadu zależy od liczby uzyskanych struktur organoidowych i aktualnego numeru przejścia.
    2. Z reguły w przypadku pasaży od P0 do P2-3 (na ogół nadal wytwarzających niewielką liczbę organoidów) używa się objętości 200 μl SFDM. Z pasaży, P3-4 lub wyższych (na ogół dających większą liczbę organoidów) należy użyć objętości 700 μl SFDM.
      UWAGA: Obie procedury są określane odpowiednio jako metoda "dolnego przejścia" i "górnego przejścia" (patrz kroki 4.10 i 4.11). Prawidłowe zastosowanie różnych metod ma kluczowe znaczenie dla skutecznego pasażowania organoidów. W przypadku metody wyższego pasażu organoidy są łatwiej tracone i nie powinny być stosowane do małej liczby organoidów (tj. w P0 do P2-3). Jednak metoda wyższego pasażu jest potrzebna do skutecznej dysocjacji większych ilości organoidów.
  10. Metoda dolnego przejścia: Zawiesić osad w 200 μl lodowatego SFDM. Dociśnij całkowicie opróżnioną końcówkę pipety do dna probówki mikrowirówki, aby zmniejszyć jej średnicę. Sprawdź, czy średnica jest wystarczająco mała (wolniejsze zasysanie, przepływ jest przekrzywiony, ale nie zablokowany). Pigazować w górę i w dół przez 5 minut, aby mechanicznie rozbić organoidy.
  11. Metoda wyższego przejścia: Ponownie zawiesić granulat w 700 μl lodowatego SFDM za pomocą końcówki P1000. Dodaj końcówkę P200 (bez filtra) na wierzch tej końcówki P1000 i wstępnie pokryj lodowatym SFDM. Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków powietrza, regulując ustawienie objętości pipety w celu zasysania co najmniej 90% objętości pożywki (z organoidami). Pigazować w górę i w dół przez 5 minut, aby mechanicznie rozbić organoidy.
  12. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym (przy 4-krotnym powiększeniu), czy uzyskano głównie pojedyncze komórki z (tylko) kilkoma nierozproszonymi strukturami.
  13. Dodać 500 μl lodowatego SFDM do probówki mikrowirówki i delikatnie wymieszać zdysocjowaną mieszaninę komórek ze świeżym SFDM przez pipetowanie.
  14. Pozwól dużym, nierozproszonym strukturom osadzać się przez 10 minut, umieszczając pionowo probówkę mikrowirówki na lodzie.
    UWAGA: Konieczne jest usunięcie nierozproszonych struktur, ponieważ negatywnie wpływają one na przechodzenie organoidów. Do inicjacji organoidów (P0) ten etap sedymentacji nie jest potrzebny.
  15. Zebrać supernatant (~500-1000 μl w zależności od metody pasażowania) zawierający pojedyncze komórki i małe skupiska komórek; przenieść do nowej probówki do mikrowirówek i wirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  16. Oblicz stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Zaniedbuj pozostałe grudki komórek.
  17. Policz, ile studzienek można zasiać i oblicz odpowiedni stosunek zawiesiny komórek do BMM, jak opisano powyżej (sekcja 3).
  18. Dodaj 70% BMM do osadu komórkowego i utrzymuj probówkę mikrowirówki na lodzie.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby probówka mikrowirówki znajdowała się na lodzie, aby uniknąć zestalenia BMM.
  19. Dalej postępować zgodnie z krokiem 3.3 do punktu 3.7 i ponownie przejść między 10. a 14. dniem hodowli.

5. Kriokonserwacja organoidów zębów

  1. Zbierz i oddziel organoidy, jak wspomniano powyżej, w celu pasażowania (krok 4). Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki do kriokonserwacji zawierającej SFDM (70%), FBS (20%) i DMSO (10%).
  3. Przenieść zawiesinę do kriowialu i umieścić ją na lodzie. Umieścić kriowiale w kriogenicznym pudełku i przenieść do -80 °C (na co najmniej 4 godziny).
  4. W ciągu 1 miesiąca przenieść zamrożone próbki do ciekłego azotu w celu długotrwałego (>12 miesięcy) przechowywania.

6. Rozmrażanie kriokonserwowanych organoidów zębowych

  1. Przed rozpoczęciem procedury rozmrażania należy umieścić jedną probówkę o pojemności 15 ml na kriowial na lodzie zawierającym 10 ml SFDM z 20% FBS.
  2. Usuń kriowial z ciekłego azotu i umieść go na lodzie.
    UWAGA: Wykonaj poniższe kroki tak szybko, jak to możliwe i unikaj zbyt długiego czasu rozmrażania (>5 min), a także zbyt długich przerw między krokami (>5 min), ponieważ takie wydłużenie zmniejszy przeżycie komórek.
  3. Umieść kriowial w ciepłej łaźni wodnej (37 °C) do rozmrożenia (~1-2 min).
  4. Natychmiast przenieść zawartość kriowialu do lodowatej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć 9 ml supernatantu i odwirować pozostały 1 ml przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml lodowatego SFDM.
  6. Przenieś zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
  7. Policz, ile studzienek można zasiać i oblicz odpowiedni stosunek zawiesiny komórek do BMM, jak opisano powyżej (sekcja 3).
  8. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w stosunku 70:30 BMM:TOM i trzymać na lodzie.
  9. Dalej postępować zgodnie z krokiem 3.3 do 3.7 i przejść między dniem 10 a dniem 14 hodowli.

7. Utrwalanie i zatapianie parafiny w organoidach zębowych

UWAGA: Ta procedura (w tym sekcje 8 i 9) może być również zastosowana do pierwotnej tkanki DF.

  1. Utrwalanie organoidów zębowych w PFA
    1. Usuń pożywkę z każdej studzienki, jak w kroku 4.2.
    2. Zebrać organoidy, usuwając kroplę BMM (krok 4.3). Przenieść mieszaninę BMM i organoidów do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    3. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usunąć supernatant i dodać 500 μl 4% PFA i inkubować przez minimum 30 minut (maksymalnie 1 h) w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.
      UWAGA: Używaj kaptura chemicznego podczas pracy z PFA.
    5. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i przepłukać osad organoidowy PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    6. Przemyć osad organoidowy (krok 7.1.5) dodatkowo dwa razy. Obracać utrwalone organoidy w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Zawiesić granulat w 500 μl 70% EtOH (w wodzie dejonizowanej). Organoidy należy przechowywać do 1 miesiąca w 70% EtOH w temperaturze 4 °C.
  2. Osadzanie organoidów zębowych w agarozie i parafinie
    UWAGA: Aby skutecznie zatopić organoidy w parafinie, potrzebny jest dodatkowy etap zatapiania w agarozie.
    1. Odwirować organoidy utrwalone PFA w 70% EtOH przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
    2. Przygotuj 2% roztwór agarozy w 30 ml PBS w szklanej butelce. Podgrzej mieszaninę agarozy i PBS w kuchence mikrofalowej, aż do uzyskania żelowej struktury (około 2,5 minuty przy 600 W).
    3. Równolegle dodaj 30 ml PBS do innej szklanej butelki i podgrzej w kuchence mikrofalowej (około 2,5 minuty przy 600 W). Pozostaw roztwór agarozy do ostygnięcia przez 1 minutę.
    4. Odetnij koniec końcówki P200, aby umożliwić precyzyjną pracę z roztworem agarozy i uniknąć pęcherzyków powietrza.
    5. Rozgrzej końcówkę P200 w ciepłym PBS, pipetując kilka razy w górę i w dół.
    6. Dodać 150 μl podgrzanego roztworu agarozy do osadu organoidowego i delikatnie odpipetować mieszaninę organoidów i agarozy (z minimalnym ponownym wymieszaniem), unikając pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Minimalne ponowne zawieszenie pozwoli na lepsze zlokalizowanie organoidów w żelu agarozowym podczas cięcia mikrotomowego, ponieważ organoidy są wtedy bliżej siebie.
    7. Natychmiast przenieś mieszaninę organoidów i agarozy do tej samej nasadki probówki do mikrowirówki, umieść probówkę poziomo i pozwól agarozie zestalić się (~20 min w temperaturze pokojowej). W międzyczasie oznacz kasety.
    8. Po zestaleniu usuń żel agarozowy z nasadki mikrowirówki za pomocą pęsety i przenieś go do oznaczonej kasety.
    9. Przenieś kasetę zawierającą agarozę do zlewki zawierającej 50% EtOH w wodzie dejonizowanej. Przykryj zlewkę parafilmem, aby uniknąć parowania EtOH.
      UWAGA: Objętość zlewki zależy od liczby kaset.
    10. Próbki należy przetwarzać w procesorze tkanek przez noc.
      UWAGA: Ponieważ parafina krzepnie w temperaturze pokojowej, następujące kroki należy wykonać szybko.
    11. Podgrzej blok grzewczy w stacji osadzania przez 15 minut.
    12. Wyjmij żel agarozowy zawierający organoidy zamknięty w kasecie i umieść go we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym. Zdejmij nakrętkę z kasety i odłóż ją na bok do późniejszego użycia.
    13. Wypełnij pozostały blok grzewczy parafiną.
      UWAGA: Sprawdź pęsetą, czy żel agarozowy zawierający organoidy nadal znajduje się na dnie bloku grzewczego. Ze względu na swoją niewielką wagę może zacząć unosić się na wodzie, powodując utratę próbki.
    14. Umieść nasadkę kasety na górze bloku grzewczego. Pozwól mu zastygnąć przez 30 minut na zimnym talerzu. Wyjąć blok grzewczy i przechowywać bloki parafinowe w temperaturze 4 °C.

8. Mikrotomowe cięcie i barwienie organoidów zębów (Rysunek 2B i Rysunek 3A-C)

  1. Mikrotomowe sekcje bloków parafiny zawierających organoidy
    1. Pokrój 5 μm skrawki organoidów zębów w blokach parafinowych za pomocą mikrotomu.
    2. Umieść plastry parafiny na szkiełku mikroskopowym. Umieścić szkiełko mikroskopowe na ciepłej płytce w temperaturze 37 °C i zalać wodą dejonizowaną za pomocą pipety Pasteura.
    3. Pozostaw szkiełko mikroskopu do wyschnięcia na noc.
  2. Barwienie skrawków organoidów zębów
    1. Odparafinować skrawki organoidów (na szkiełku mikroskopowym) w piecu przez 1 godzinę w temperaturze 58 °C.
    2. Ponownie uwodnić skrawki organoidów (na szkiełku mikroskopowym) w zmniejszającej się serii EtOH wewnątrz kaptura chemicznego w następującej kolejności:
      Ksylen 2x przez 3 min każdy
      100% EtOH 2x przez 3 min każdy
      95% EtOH 2x przez 3 min każdy
      90% EtOH 2x przez 3 min każdy
      70% EtOH 3x przez 3 min każdy
      UWAGA: Używaj kaptura chemicznego podczas pracy z ksylenem.
    3. Opłucz szkiełko mikroskopu w wodzie z kranu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie płucz go w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Pobrać antygen, umieszczając skrawki organoidów (na szkiełku mikroskopowym) we wstępnie podgrzanym buforze cytrynianowym (10 mM kwasu cytrynowego w wodzie dejonizowanej o pH 6; w plastikowym pojemniku; wstępnie podgrzane przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C) przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C.
    5. Pozwól, aby szkiełko mikroskopu ostygło przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz szkiełko mikroskopu w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie w PBS zawierającym 0,1% Triton-X (PBT) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Użyj pisaka do znakowania, aby stworzyć hydrofobową barierę na granicach każdego slajdu.
    7. Blok przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze suchej temperatury w buforze blokującym (zawierającym 1,5 mg/ml glicyny, 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczonej w PBT) plus 10% surowicy osła.
      UWAGA: Zazwyczaj na szkiełko mikroskopowe potrzeba 300 μl buforu blokującego plus 10% surowicy osła.
    8. Umieść szkiełko mikroskopowe w wilgotnej komorze. Użyj hermetycznego pudełka, w którym zmieszczą się wszystkie szkiełka i zwilż kilka papierowych chusteczek wodą, aby umieścić je na dnie pudełka. Zapobiegnie to wysychaniu szkiełek podczas kolejnych etapów barwienia.
    9. Usunąć bufor blokujący, dodać przeciwciało pierwszorzędowe (Tabela 6) przygotowane w buforze blokującym plus 1% surowicy osła i inkubować szkiełko pokryte roztworem przeciwciała przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby należy ponownie wykonać obramowanie pisaka.
    10. Umyć szkiełko mikroskopu trzykrotnie w PBT w temperaturze RT przez 10 minut, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej (75-150 obr./min).
    11. Dodać przeciwciało drugorzędowe (Tabela 6), przygotowane w buforze blokującym plus 1% surowicy osła, i inkubować przez 1 godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
    12. Usunąć bufor blokujący i umyć szkiełko mikroskopu trzykrotnie w PBT w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej.
    13. Dodać pożywkę do mocowania zapobiegającą blaknięciu z DAPI (1 do 3 kropel) na szklanym szkiełku nakrywkowym i zamontować ją na wierzchu sekcji organoidów (na szkiełku mikroskopowym). Kontynuuj obrazowanie; Szkiełka należy przechowywać maksymalnie przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C.

9. Ekstrakcja RNA i RT-qPCR organoidów zębów (Rysunek 2B i Rysunek 3D)

  1. Ekstrakcja RNA organoidów zębów
    1. Usuń podłoże z każdej studzienki (krok 4.2).
    2. Zebrać organoidy poprzez usunięcie kropelki BMM (krok 4.3), przenieść mieszaninę BMM i organoidów do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć supernatant, energicznie zawiesić w 350 μl 1% β-merkaptoetanolu rozpuszczonego w buforze do lizy (tabela materiałów) i umieścić na lodzie.
      UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności z β-merkaptoetanolem w okapie chemicznym.
      UWAGA: Na tym etapie próbki można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze -80 °C. Przed przystąpieniem do kroku 9.1.4 należy rozmrozić próbki na lodzie.
    4. Wirować próbki, aż nie zaobserwuje się już żadnych struktur organoidowych.
    5. Kontynuuj ekstrakcję RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. RT-qPCR organoidów zębów (Tabela 7)
    1. Odwrotna transkrypcja (RT) RNA19 przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Analizuj otrzymane próbki cDNA za pomocą SYBR Green-based quantitative PCR (qPCR)19 przy użyciu systemu Real-Time PCR (tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozwój organoidów zębowych
Przedstawiamy szczegółowy protokół tworzenia kultur organoidów z ludzkiej tkanki DF uzyskanej po ekstrakcji zęba mądrości (Rycina 1A). Wyizolowane DF są dysocjowane enzymatycznie i mechanicznie. Uzyskane komórki są hodowane w BMM w pożywkach, które zostały empirycznie zdefiniowane w celu optymalnego rozwoju i wzrostu organoidów (pożywka do organoidów zębowych; TOM)19.

Organoidy zazwyczaj rozwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje wydajne i powtarzalne wytwarzanie organoidów, począwszy od ludzkiego zęba. Zgodnie z naszą wiedzą, jest to pierwsza metodologia tworzenia organoidów (nabłonkowych) opartych na obecnej koncepcji, począwszy od ludzkiej tkanki zębowej. Organoidy są długotrwale rozszerzalne i wykazują fenotyp łodygi nabłonka zębów, powielając DEC wcześniej zgłoszone w kompartmencie ERM DF7. Co więcej, organoidy odtwarzają funkcjonalne cechy DESC/ERM, w tym rozwój procesu różnicowania ameloblastów<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor korespondencyjny zapewnia, że wszyscy autorzy ujawnili wszelkie konflikty interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni wszystkim pracownikom Chirurgii Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej (MKA) UZ Leuven, jak również pacjentom, za ich nieocenioną pomoc w zbieraniu świeżo pobranych trzecich zębów trzonowych. Chcielibyśmy również podziękować dr Reinhilde Jacobs i dr Elisabeth Tijskens za pomoc w pobraniu próbek. Prace te były wspierane przez granty z KU Leuven (BOF) i FWO-Flanders (G061819N). L.H. jest doktorantem FWO (1S84718N).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml Probówka do mikrowirówekEppendorf30120.086
15 ml Probówka wirówkowaCorning430052
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM-6250
48-dołkowe płaskie płytkidenne Corning3548
50 ml Probówka wirówkowaCorning430290
A83-01Sigma-Aldrich
AgarozaLonza50004
Albumina bydlęca (klasa hodowli komórkowych)Serva47330.03
Przeciwciało AMELXSanta Cruzsc-365284
Amfoterycyna BGibco15200018
B27 (bez witaminy A)Gibco12587-010
KasetaVWR
Katalaza z wątroby bydlęcejPrzeciwciało Sigma-AldrichC100
CD44Abcamab34485
Sitko do komórek, 40 i mikro; mFalcon352340
ToksynaSigma-AldrichC8052
Kwas cytrynowySigma-AldrichC0759
Przeciwciało CK14Thermo Fisher ScientificMA5-11599
Kolagenaza IVGibco17104-019
Szkło osłonoweVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
CryovialThermo Fisher Scientific375353
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dyspaza IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12 bez FeInvitrogen074-90715A
DMEM w proszku o wysokiej zawartości glukozyGibco52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
Serum osłaSigma-AldrichD9663 - 10ML
Stacja robocza do zatapiania, 220 do 240 VacThermo Fisher Scientific12587976
Absolut etanolu, ≥ 99,8% (EtOH)Fisher ChemicalE/0650DF/15
Surowica bydlęca płodu (FBS)Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2 (= zasadowa FGF)R& D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTZawiera 1% β-merkaptoetanol rozpuszczony w buforze do lizy
Szklana pipeta PasteuraMechanizmy Niko170-40050
GlicynaVWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632 (inhibitor ROCK, RI)Sigma-Aldrich688001
Insulina z trzustki bydłaSigma-AldrichI6634
Przeciwciało ITGA6Sigma-AldrichHPA012696
L-GlutaminaGibco25030024
Matrigel (o obniżonym czynniku wzrostu; bez czerwieni fenolowej)Corning15505739
Szkiełko mikroskopoweThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0,22  μ mMilliporeSLGV033R
Minimum niezbędne medium eagle (α MEM)Sigma-AldrichM4526
mysie przeciwciało IgG (Alexa 555)Thermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-acetylo-L-cysteinaSigma-AldrichA7250
NikotynamidSigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
Przeciwciało P63Abcamab124762
Pap PenSigma-AldrichZ377821-1EADługopis znakujący
Paraformaldehyd (PFA), 16%Merck8.18715
Sól sodowa penicyliny GSigma-AldrichP3032
Penicylina-streptomycyna (Pen/Strep)Gibco15140-122
szalkaPetriegoCorning353002
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010-015
Pipeta (P20, P200, P1000)Eppendorf lub inne2231300006
Plastikowa pipeta transferowa (3,5  mL)Sarstedt86.1171.001
Przeciwciało drugorzędowe IgG królika (Alexa 488)Thermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
Skalpel (ostrze chirurgiczne)Swann-Morton207
SHHR& D Systems464-SH-200
Formy silikonowe (blok grzewczy)VWR720-1918
Chlorek sodu (NaCl)BDH102415K
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Merck106329
Pirogronian sodu (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP-5280
Przeciwciało SOX2Abcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificSystem PCR w czasie rzeczywistym
Stericup-GP, 0,22 i mikro; mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterylny filtr górny z probówką wirówkową, 0,22 & mu; mMilliporeSCGP00525
Sterylne 1000 μ L końcówki do pipet z filtremGreiner740288
Sterile 20 μ L końcówki do pipet z filtremGreiner774288
Sterile 200 μ Końcówki do pipet L z filtrem i bezGreiner739288
Sterylne H2OFreseniusB230531
Sól siarczanu streptomycynySigma-AldrichS6501
Indeks górny III do syntezy pierwszej nici supermixInvitrogen11752-050Zestaw do odwrotnej transkrypcji
Procesor tkanekThermo Scientific
TransferrinServa36760.01
Triton X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Medium montażowe Vectashield + DAPILabconsult NVH-1200Medium montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
Ksyleny, 99%, do biochemii i histologiiVWR2,89,75,325
SML0788720219112505356

Bibliografia

  1. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
  2. Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
  3. Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
  4. Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357(2016).
  5. Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038(2016).
  6. Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
  7. Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
  8. Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
  9. Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
  10. Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
  11. Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
  12. Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
  13. Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
  14. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  15. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
  18. Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
  19. Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153(2022).
  20. Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
  21. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963(2020).
  22. Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
  23. Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
  24. Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
  25. Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
  26. Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
  29. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  30. Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194(2018).
  31. Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
  32. Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519(2021).
  33. Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166(2020).
  34. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  35. Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797(2020).
  36. Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy z bamieszek z bowyepitelialne kom rki macierzyster nicowanie ameloblast wtworzenie szkliwahodowla organoid wmacierz b ony podstawnejregeneracja z babiologia kom rek macierzystychekspresja marker w
Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.