Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63677

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Streszczenie

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) są najczęściej używanymi technologiami obrazowania koherentnego rozpraszania Ramana. Obrazowanie hiperspektralne SRS i CARS oferuje informacje spektralne Ramana w każdym pikselu, co umożliwia lepszą separację różnych składów chemicznych. Chociaż obie techniki wymagają dwóch laserów wzbudzających, ich schematy wykrywania sygnału i właściwości spektralne są zupełnie różne. Celem tego protokołu jest wykonanie zarówno obrazowania hiperspektralnego SRS, jak i CARS na jednej platformie i porównanie dwóch technik mikroskopowych do obrazowania różnych próbek biologicznych. Metoda ogniskowania spektralnego jest stosowana do pozyskiwania informacji spektralnych za pomocą laserów femtosekundowych. Używając standardowych próbek chemicznych, porównuje się czułość, rozdzielczość przestrzenną i rozdzielczość spektralną SRS i CARS w tych samych warunkach wzbudzenia (tj. moc w próbce, czas przebywania pikseli, soczewka obiektywu, energia impulsu). Kontrasty obrazowe CARS i SRS dla próbek biologicznych są zestawiane i porównywane. Bezpośrednie porównanie osiągów CARS i SRS pozwoliłoby na optymalny wybór metody obrazowania chemicznego.

Wprowadzenie

Zjawisko rozpraszania Ramanowskiego zostało po raz pierwszy zaobserwowane w 1928 roku przez C. V. Ramana1. Podczas oddziaływania padającego fotonu z próbką może dojść do spontanicznego zdarzenia rozpraszania nieelastycznego, w którym zmiana energii fotonu odpowiada przejściu wibracyjnemu analizowanego związku chemicznego. Proces ten nie wymaga zastosowania znacznika chemicznego, co czyni go wszechstronnym narzędziem do analizy chemicznej bez konieczności znakowania, przy jednoczesnym minimalizowaniu zaburzeń próbki. Pomimo swoich zalet, spontaniczne rozpraszanie Ramanowskie cechuje się niskim przekrojem czynnym na rozpraszanie (zazwyczaj o 1011 rzędów wielkości niższym niż przekrój czynny absorpcji w podczerwieni [IR]), co wymusza długi czas akwizycji danych podczas analizy2. W związku z tym dążenie do zwiększenia czułości procesu rozpraszania Ramanowskiego jest niezbędne dla rozwoju technologii Ramanowskich w obrazowaniu w czasie rzeczywistym.

Jednym ze skutecznych sposobów na znaczne zwiększenie czułości rozpraszania Ramanowskiego są procesy koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CRS), w których zazwyczaj wykorzystuje się dwa impulsy laserowe do wzbudzenia przejść wibracyjnych cząsteczek3,4. Gdy różnica energii fotonów między dwoma laserami odpowiada modom wibracyjnym cząsteczek próbki, generowane są silne sygnały Ramanowskie. Dwiema najczęściej stosowanymi w obrazowaniu technikami CRS są koherentne rozpraszanie antystokesowskie (CARS) oraz stymulowane rozpraszanie Ramanowskie (SRS)5. W ciągu ostatnich dwóch dekad rozwój technologiczny sprawił, że mikroskopia CARS i SRS stały się potężnymi narzędziami do bezetykietowej kwantyfikacji oraz wyjaśniania zmian chemicznych w próbkach biologicznych.

Obrazowanie chemiczne za pomocą mikroskopii CARS można datować na 1982 rok, kiedy to po raz pierwszy zastosowano skanowanie laserowe do pozyskiwania obrazów CARS, co zademonstrowali Duncan i wsp.6. Modernizacja mikroskopii CARS została znacznie przyspieszona po szerokim zastosowaniu wielofotonowej mikroskopii fluorescencyjnej ze skanowaniem laserowym7. Wczesne prace grupy Xie z wykorzystaniem laserów o wysokiej częstotliwości powtarzania przekształciły CARS w szybką, bezetykietową platformę obrazowania chemicznego do charakterystyki cząsteczek w próbkach biologicznych8,9,10. Jednym z głównych problemów w obrazowaniu CARS jest obecność tła nieresonansowego, które zmniejsza kontrast obrazu i zniekształca widmo Ramana. Podjęto wiele wysiłków, aby albo zredukować tło nieresonansowe11,12,13,14,15, albo wyekstrahować rezonansowe sygnały Ramana z widm CARS16,17. Innym udoskonaleniem, które znacząco rozwinęło tę dziedzinę, jest hiperspektralne obrazowanie CARS, które umożliwia mapowanie spektralne w każdym pikselu obrazu przy poprawionej selektywności chemicznej18,19,20,21.

Stymulowane rozproszenie Ramanowskie (SRS) jest nowszą technologią obrazowania niż CARS, mimo że zostało odkryte wcześniej22. W 2007 roku opisano mikroskopię SRS z wykorzystaniem źródła laserowego o niskiej częstotliwości powtarzania impulsów23. Wkrótce kilka grup zademonstrowało szybkie obrazowanie SRS przy użyciu laserów o wysokiej częstotliwości powtarzania impulsów24,25,26. Jedną z głównych zalet mikroskopii SRS nad CARS jest brak tła nierezonansowego27, choć w przypadku SRS mogą wystąpić inne rodzaje tła, takie jak modulacja krzyżowa fazy (XPM), absorpcja przejściowa (TA), absorpcja dwufotonowa (TPA) oraz efekt fototermiczny (PT)28. Ponadto sygnał SRS i stężenie próbki pozostają w relacji liniowej, w przeciwieństwie do CARS, gdzie zależność sygnału od stężenia jest kwadratowa29. Upraszcza to kwantyfikację chemiczną i rozplatanie widmowe (spectral unmixing). Wielokolorowe i hiperspektralne SRS ewoluowały w różnych formach30,31,32,33,34,35,36, przy czym ogniskowanie widmowe (spectral focusing) jest jednym z najpopularniejszych podejść w obrazowaniu chemicznym37,38.

Zarówno CARS, jak i SRS wymagają ogniskowania wiązek lasera pompującego i Stokesa na próbce, aby dopasować je do przejścia wibracyjnego cząsteczek w celu wzbudzenia sygnału. Mikroskopy CARS i SRS mają również wiele wspólnych cech. Jednak fizyka leżąca u podstaw tych dwóch procesów oraz detekcja sygnałów stosowana w tych technologiach mikroskopowych wykazują pewne różnice3,39. CARS jest procesem parametrycznym, w którym nie dochodzi do netto sprzężenia energii między fotonami a cząsteczkami3. SRS natomiast jest procesem nieparametrycznym i przyczynia się do transferu energii między fotonami a układami molekularnymi27. W CARS generowany jest nowy sygnał o częstotliwości anty-Stokesa, podczas gdy SRS objawia się jako transfer energii między wiązkami lasera pompującego i Stokesa.

Sygnał CARS spełnia równanie (1)28.

Równanie koherentnego antystokesowskiego rozpraszania Ramanowskiego (CARS), wzór na intensywność optyczną, równanie I_CARS.     (1)

W tym czasie sygnał SRS można zapisać zgodnie z równaniem (2)28.

Wzór na stymulowane rozpraszanie Ramanowskie, ΔISRS ∝ Im(χ(3)) Ip Is, odnosi się do analizy sygnału optycznego.    (2)

W tym przypadku Ip, Is, ICARS oraz ΔISRS to odpowiednio natężenia wiązki pompowania, wiązki Stokesa, sygnału CARS i sygnałów SRS. χ(3) to nieliniowa podatność optyczna trzeciego rzędu próbki, która jest wartością zespoloną składającą się z części rzeczywistej i urojonej.

Równania te opisują profile widmowe oraz zależność sygnału od stężenia w technikach CARS i SRS. Różnice w fizyce tych zjawisk skutkują odmiennymi schematami detekcji dla tych dwóch technologii mikroskopii. Detekcja sygnału w CARS zazwyczaj obejmuje separację widmową nowo wygenerowanych fotonów i detekcję za pomocą lampy fotopowielającej (PMT) lub urządzenia o ładunku sprzężonym (CCD); w przypadku SRS wymiana energii między wiązką pompową a wiązką Stokesa jest zazwyczaj mierzona poprzez szybką modulację intensywności przy użyciu modulatora optycznego i demodulację za pomocą fotodiody (PD) sprzężonej z wzmacniaczem synchronicznym.

Choć w ostatnich latach opublikowano wiele opracowań dotyczących rozwoju technologicznego i zastosowań w dziedzinach CARS oraz SRS, nie przeprowadzono systematycznych porównań tych dwóch technik CRS na tej samej platformie, szczególnie w odniesieniu do hiperspektralnej mikroskopii CARS i SRS. Bezpośrednie porównania czułości, rozdzielczości przestrzennej, rozdzielczości spektralnej oraz możliwości separacji chemicznej pozwoliłyby biologom na wybór najlepszej metody do ilościowego oznaczania składników chemicznych. W niniejszym protokole przedstawiono szczegółowe kroki budowy multimodalnej platformy obrazowania z funkcjami hiperspektralnego CARS i SRS, opartej na femtosekundowym systemie laserowym i skupianiu spektralnym. Obie techniki porównano w kierunku przednim pod kątem rozdzielczości spektralnej, czułości detekcji, rozdzielczości przestrzennej oraz kontrastów obrazowania komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konfiguracja aparatury do hiperspektralnego obrazowania CRS

UWAGA: Generowanie sygnału CRS wymaga zastosowania laserów o wysokiej mocy (tj. klasy 3B lub 4). Podczas pracy z tak wysokimi mocami szczytowymi należy przestrzegać protokołów bezpieczeństwa i przez cały czas stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE). Przed rozpoczęciem eksperymentów należy zapoznać się z właściwą dokumentacją. Niniejszy protokół koncentruje się na projektowaniu toru wiązki, chirpingu impulsów femtosekundowych oraz optymalizacji warunków obrazowania. Ogólny schemat optyczny tego hiperspektralnego mikroskopu CRS przedstawiono na Rysunku 1. Przedstawiona tutaj konfiguracja jest jedną z wielu istniejących konfiguracji mikroskopii CRS. System mikroskopii CRS wykorzystany w tym protokole opiera się na femtosekundowym źródle laserowym z podwójnym wyjściem oraz mikroskopie skaningowym.

  1. Należy upewnić się, że źródło laserowe generuje dwa ciągi impulsów femtosekundowych (o szerokości 120 fs) z częstotliwością repetycji 80 MHz, w tym stałą długość fali 1,045 nm wykorzystywaną jako wiązka Stokesa oraz regulowaną długość fali w zakresie od 680 do 1 300 nm wykorzystywaną jako wiązka pompująca. Impulsy wyjściowe należy zsynchronizować za pomocą optycznego opóźnienia. Do zbudowania platformy obrazowania należy wykorzystać stelaż mikroskopu.
  2. Projektowanie toru wiązki
    1. Aby kontrolować moc lasera na próbce, należy zastosować kombinację płytki półfalowej i polaryzacyjnego dzielnika wiązki (PBS) dla każdej wiązki laserowej.
    2. Zainstaluj modulator akustyczno-optyczny (AOM) na drodze wiązki lasera Stokesa. Skup wiązkę za pomocą soczewki o ogniskowej 150 mm do wnętrza AOM, a następnie ponownie skolimuj wiązkę 0th rejestruj obraz za pomocą obiektywu o ogniskowej 400 mm.
    3. Użyj tej samej pary soczewek (o ogniskowych 150 mm i 400 mm), aby rozszerzyć wiązkę pompową tak, aby jej rozmiar odpowiadał rozmiarowi wiązki lasera Stokesa.
    4. Umieść soczewki o ogniskowej 400 mm w torach wiązki pompującej oraz wiązki Stokesa na osobnych jednowymiarowych przesuwkach w celu precyzyjnego dostrojenia rozbieżności wiązki i optymalizacji rozmiaru wiązki przed wprowadzeniem jej do mikroskopu.
    5. Skieruj wiązkę pompową za pomocą zwierciadła odbijającego pod kątem prostym, zamontowanego na zmotoryzowanym stole translacyjnym w celu regulacji opóźnienia optycznego. Jeśli wymagane jest opóźnienie optyczne wiązki Stokesa, umieść te komponenty w jej ścieżce wiązki.
    6. Należy połączyć obie wiązki na lustrze dichroicznym o długości fali odcięcia wynoszącej około 1 000 nm (pomiędzy długością fali pompy a długością fali Stokesa), tak aby wiązka Stokesa przechodziła przez lustro dichroiczne, podczas gdy wiązka pompy była przez nie odbijana. Połączone kolinearnie wiązki laserowe należy skierować do mikroskopu.
    7. Aby wprowadzić chirp wiązki pompowania i wiązki Stokesa, należy umieścić pręty szklane na ich ścieżkach przejścia. Szczegóły znajdują się w kroku 1.5.
    8. Aby potwierdzić prawidłowe ustawienie i rozmiar wiązki, należy zastosować przysłony irysowe za lustrem dichroicznym i przed mikroskopem. W szczególności należy zainstalować jedną przysłonę w pozycji bliskiej lustru dichroicznemu, a drugą w pewnej odległości od niego, aby potwierdzić prawidłowe wyrównanie i nakładanie się wiązek. Do wizualizacji wiązki podczas ustawiania należy użyć karty do podglądu IR lub wizualizatora IR.
    9. Należy użyć szybкого detektora fotodiodowego (PD) oraz oscyloskopu, aby przybliżone zmierzyć opóźnienie optyczne między impulsami pompowymi a impulsami Stokesa. Oscyloskop należy wyzwalć poprzez próbkowanie serii impulsów laserowych.
    10. Zablokuj wiązkę pompowania i zarejestruj wiązkę Stokesa. Powiększ jeden z impulsów i umieść na nim kursor pionowy, aby zaznaczyć jego położenie w czasie na oscyloskopie.
    11. Odblokuj wiązkę pompowania i zablokuj wiązkę Stokesa. Przesuwaj człon opóźniający, aż impulsy pompowania próbki zostaną wyrównane czasowo z zaznaczoną pozycją.
  3. Mikroskop skaningowy laserowy
    1. W przypadku konfiguracji mikroskopu odwróconego, należy skierować połączone wiązki laserowe przez peryskop, aby wzniosły się na odpowiedni poziom przed dotarciem do dwuwymiarowych skanujących luster galwanometrycznych.
    2. Zmierzyć średnicę wiązki lasera przed mikroskopem i dobrać odpowiednią parę soczewek za lustrami galwanometrycznymi, aby rozszerzyć wiązkę lasera w celu optymalnego dopasowania jej do rozmiaru źrenicy wejściowej obiektywu.
    3. Zbuduj układ 4-f, wykorzystując dwie soczewki w taki sposób, aby tylna apertura obiektywu oraz środek dwóch zwierciadeł galwanometrycznych stanowiły płaszczyzny sprzężone. Alternatywnie, w celu skanowania laserowego, należy zastosować dwa oddzielne jednowymiarowe zwierciadła galwanometryczne z dwoma układami soczewek 4-f.
    4. Za kondensorem należy zaprojektować lustro odchylające o średnicy 2 cali, które będzie odbijać wiązki laserowe w celu zbierania sygnału. W ścieżce wiązki przechodzącej należy umieścić soczewkę o średnicy 2 cali, aby w pełni zebrać i skupić sygnały transmisji na detektorach.
    5. Kieruj sygnały CARS do PMT za pomocą lustra dichroicznego z punktem odcięcia przy 776 nm, a transmitowane sygnały SRS pozwól wykryć za pomocą PD. Przed PMT zastosuj filtr pasmowy (655/30 nm), aby odrzucić pozostałości impulsów lasera wzbudzającego. Przed PD zastosuj filtr krótkoprzepustowy (krótkoprzepustowy 980 nm), aby zablokować wniknięcie wiązki Stokesa do detektora.
    6. Aby wykryć sygnał CARS, należy podłączyć przedwzmacniacz oraz przetwornik prądowo-napięciowy za PMT, przed przesłaniem sygnału do systemu akwizycji danych. Napięcie PMT należy dostosować w celu optymalizacji sygnału i kontrastu obrazu.
    7. Należy użyć generatora funkcji do modulacji AOM z częstotliwością 1–10 MHz, a tę samą częstotliwość wykorzystać jako referencję dla demodulacji w detektorze lock-in. Przed akwizycją danych należy użyć wzmacniacza lock-in do wyekstrahowania sygnałów SRS.
  4. Pozyskiwanie i wyświetlanie danych
    1. Przeprowadź akwizycję danych przy użyciu karty akwizycji danych (DAQ) wraz z kostką zaciskową.
    2. Należy wykorzystać wyjścia analogowe modułu DAQ do sterowania lustrami galwanometrycznymi oraz wejścia analogowe do akwizycji sygnału.
    3. Należy użyć oprogramowania napisanego w środowisku LabVIEW, wyposażonego w symultaniczny wyświetlacz wielokanałowy do podglądu w czasie rzeczywistym i zapisywania obrazów (patrz Plik uzupełniający).
  5. Chirpowanie źródła femtosekundowego i pomiar rozdzielczości widmowej
    UWAGA: Aby uzyskać dobrą rozdzielczość spektralną przy zastosowaniu ogniskowania spektralnego (spectral focusing), używa się szklanych prętów w celu wprowadzenia dyspersji i rozciągnięcia (chirp) impulsów laserowych z femtosekundowych do pikosekundowych. Aby osiągnąć najlepszą rozdzielczość spektralną, szybkość rozciągnięcia wiązki pompowania musi być równa szybkości rozciągnięcia wiązki Stokesa. W przypadku tego układu laserowego najlepszą rozdzielczość spektralną można uzyskać, rozciągając wyjściowe impulsy laserowe o czasie trwania ~120 fs do 3,4 ps dla wiązki pompowania i do 1,8 ps dla wiązki Stokesa. Rozciągnięcie to osiąga się poprzez zastosowanie kombinacji 4+1 (cztery w wiązce połączonej, jedna tylko w wiązce Stokesa) szklanych prętów (SF-57) o długości 150 mm, zgodnie z poniższym opisem, co powinno pozwolić na uzyskanie 15 cm-1 rozdzielczość spektralna. Czas trwania impulsu można zmierzyć przy użyciu autokorelatora.
    1. Wprowadź jedną szklaną prętkę o długości 150 mm wyłącznie w tor wiązki Stokesa.
    2. Wprowadź dwie szklane pręty o długości 150 mm do wspólnej ścieżki wiązki pompy i wiązki Stokesa za dichroicznym dzielnikiem wiązki. Aby zwiększyć chirp, ustaw lustro dielektryczne na jednym z końców prętów, tak aby połączone wiązki laserowe przeszły przez oba szklane pręty dwukrotnie.
    3. Aby zmierzyć rozdzielczość widmową, należy przygotować próbkę standardowego związku chemicznego (np. dimetylosulfotlenku [DMSO]) dociśniętą pomiędzy dwiema lamelkami szklanymi, a następnie przesuwać platformę opóźniającą aż do uzyskania maksymalnego sygnału.
    4. Przesuń linię opóźnienia optycznego 1,000 µm w kierunku przesunięcia ku czerwieni. Następnie zarejestruj 200 klatek przy 10 µm/step w kierunku przesunięcia ku niebieskiemu w celu zebrania stosu obrazów hiperspektralnych.
    5. Aby przekonwertować numery klatek na liczby falowe, należy przeprowadzić regresję liniową, wykorzystując symetryczny (2 913 cm-1) i asymetryczne (2,994 cm-1) drgania rozciągające C-H z DMSO oraz odpowiadające im numery klatek40.
    6. Wykorzystaj sygnał XPM do pomiaru profilu intensywności ogniskowania spektralnego. Przymknij częściowo przysłonę kondensora i ustaw ostrość na pustą szkiełko nakrywkę. Zbierz taką samą liczbę kroków, jak w przypadku hiperspektralnego SRS. Aby zmierzyć tło nierozdzielcze CARS, ustaw ostrość na szklaną nakrywkę i zbierz taką samą liczbę kroków, jak dla pomiarów hiperspektralnych CARS.
  6. Optymalizacja stosunku sygnału do szumu (SNR) w obrazowaniu
    1. Przygotuj próbkę chemiczną do wyrównania systemu. Postępuj zgodnie z procedurą przygotowania próbki opisaną w kroku 3.1.
      UWAGA: DMSO jest dobrym wyborem, ponieważ jest to powszechnie stosowany w laboratorium odczynik o silnych sygnałach Ramana i dobrze rozdzielonych symetrycznych oraz asymetrycznych pikuach wiązań C-H.
    2. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i w razie potrzeby dodaj wodę lub olej imersyjny do obiektywu lub kondensora. Odpowiednio przesuń krawędź kropli DMSO w polu widzenia i ustaw obiektyw, aby uzyskać optymalną ostrość. Wycentruj kondensor, stosując metodę oświetlenia Köhlera.41Całkowicie otwórz przysłonę kondensora.
    3. Dostrój długość fali wiązki pompowania do 800 nm (Stokes 1 045 nm), aby celować w obszar 2 913 cm⁻¹-1 CH3 szczyt. Przed wprowadzeniem do mikroskopu ustaw moc obu wiązek – pompy i Stokesa – na ok. 30 mW, regulując płytkę lambda półfalową (moc w płaszczyźnie próbki powinna wynosić ok. 10 mW).
    4. W przypadku SRS ustaw wzmocnienie wzmacniacza lock-in na ok. 10 przy stałej czasowej wynoszącej 7 µs (przy użyciu) 10 µs czas przebywania wiązki na pikselu). Należy upewnić się, że stała czasowa jest mniejsza niż czas przebywania wiązki na pikselu. Do wyjścia AUX dla sygnałów SRS należy użyć funkcji Demod R.
    5. W przypadku CARS należy skierować sygnał wyjściowy PMT do przedwzmacniacza i przetwornika prądowo-napięciowego. Do rejestracji sygnału wyjściowego z przetwornika należy wykorzystać system DAQ.
    6. Ustaw parametry akwizycji obrazu w oprogramowaniu do akwizycji. Użyj rozdzielczości 200 x 200 pikseli przy rozmiarze skanowania ok. 100 x 100 µm2Upewnij się, że na obrazie znajduje się zarówno kropla DMSO, jak i obszar pusty.
    7. Zeskanuj próbkę i sprawdź obraz na ekranie komputera. Przesuń zmotoryzowaną platformę opóźniającą w wiązce Stokesa/pompowania, monitorując obrazy w czasie rzeczywistym. Skanuj opóźnienie do momentu uzyskania maksymalnego sygnału.
    8. Przesuń kroplę DMSO tak, aby pokryła całe pole widzenia, i sprawdź, czy maksimum sygnału DC znajduje się w centrum obrazu (sygnał zależy od wiązki pompowania). Skoryguj pozycję wiązki pompowania poprzez lustro lub offset napięcia w oprogramowaniu do obrazowania.
    9. Po optymalizacji prądu stałego (DC) należy dostosować lustra wiązki Stokesa tak, aby zmaksymalizować sygnał prądu przemiennego (AC), regulując wartość progu w celu uzyskania nasycenia na poziomie ok. 50%. Należy sprawdzić, czy nasycenie znajduje się w centrum obrazu. W przeciwnym razie należy precyzyjnie ustawić wyłącznie lustra w wiązce Stokesa. Sygnał należy monitorować podczas wyrównywania, traktując go jako informację zwrotną w czasie rzeczywistym na temat jakości wyrównania.
    10. Aby wyznaczyć stosunek sygnału do szumu (SNR), należy wybrać niewielki obszar na obrazie DMSO i zmierzyć jego wartość średnią. W celu określenia poziomu szumu należy wybrać niewielki obszar w pustym regionie obrazu i wyznaczyć zarówno średnią wartość, jak i odchylenie standardowe. Od średniej wartości sygnału należy odjąć średnią wartość szumu, a następnie podzielić wynik przez odchylenie standardowe pustego regionu.
    11. Jeśli obliczony stosunek sygnału do szumu (SNR) nie jest wystarczająco wysoki (zazwyczaj 800–1000 dla SRS i >10 000 dla CARS przy napięciu PMT wynoszącym 0,4 V przy tej kombinacji mocy), należy sprawdzić i ponownie zoptymalizować nakładanie się wiązek, rozmiary wiązek oraz pozycję modułu opóźniającego, precyzyjnie nastroić AOM oraz zmieniać częstotliwość modulacji generatora funkcji, aż do uzyskania oczekiwanego stosunku sygnału do szumu (SNR).

2. Analiza obrazu i przetwarzanie danych

  1. Analiza SNR
    1. Otwórz oprogramowanie ImageJ. Aby zaimportować zapisany plik .txt z próbką DMSO, kliknij File | Import | Text Image | Open.
    2. Po zaimportowaniu obrazu naciśnij CTRL+shift+C, aby wywołać funkcję jasności i kontrastu (B&C). Aby znaleźć maksymalny sygnał próbki, naciskaj przycisk auto w oknie B&C , aż obszar próbki DMSO stanie się nasycony.
    3. Kliknij narzędzie zaznaczania oval w interfejsie ImageJ i zaznacz niewielki obszar nasyconego regionu DMSO. Po zaznaczeniu naciśnij M, aby zmierzyć średnią i odchylenie standardowe wybranego obszaru.
    4. Aby zmierzyć tło, dostosuj suwaki w funkcji B&C, aż będzie widoczny sygnał z pustego obszaru. Kliknij zaznaczenie oval i zaznacz obszar tła o tej samej wielkości, co w kroku 2.1.3. Upewnij się, że wybrany obszar nie zawiera DMSO. Naciśnij M, aby zmierzyć statystyki wybranego obszaru.
    5. Oblicz SNR zgodnie z krokiem 1.6.10.
  2. Przetwarzanie hiperspektralnych obrazów CRS
    1. Zaimportuj plik .txt zgodnie z krokiem 2.1.1. Po zaimportowaniu kliknij Image | Stacks | Tools | Montage to Stack..., aby przekonwertować plik na stos obrazów.
    2. Przewijaj montaż, aż pojawi się pierwszy piki DMSO. Zaznacz obszar na DMSO i kliknij Image | Stack | Plot Z-axis Profile , aby wykreślić widmo intensywności w funkcji numeru klatki. Aby wyodrębnić surowe dane spektralne, kliknij list i skopiuj dane profilu.
    3. Aby przekonwertować odzyskane widmo na jednostki liczby falowej, przeprowadź regresję liniową zgodnie z opisem w kroku 1.5.5.
  3. Dopasowanie w celu pomiaru rozdzielczości spektralnej
    UWAGA: Do dopasowania widm SRS i CARS stosuje się funkcje Lorentza28.
    1. Otwórz oprogramowanie do dopasowywania, a następnie skopiuj i wklej dane z regresji liniowej do programu. Aby dopasować dane SRS, zaznacz dane, a następnie przedstaw je na wykresie punktowym.
    2. Wywołaj wykres punktowy. Kliknij Analysis | Peaks and Baseline | Multiple Peak Fit | Open Dialog, aby otworzyć analizator piki. Po otwarciu upewnij się, że wejściem jest aktualny wykres i zmień funkcję piku na Lorentza (Lorentz).
    3. Kliknij dwukrotnie każdy z dwóch piki DMSO na wykresie, aby zaznaczyć obszary do dopasowania. Następnie kliknij Open NLfit, aby otworzyć okno fitting . Kliknij przycisk Fit until converged, a następnie OK, aby wyświetlić tabelaryczne podsumowanie współczynników dopasowania (patrz równanie (3)).
      UWAGA: Poniższe równanie przedstawia format funkcji Lorentza w oprogramowaniu. A1/2 to amplitudy dopasowanych piki, w1/2 to szerokości dopasowanych piki, a wartości x01/02 to środki dopasowanych piki. Zmienną niezależną jest x, a zmienną zależną y.
      Formuła podwójnego Lorentza, dopasowanie spektralne, analiza równania, model widma absorpcyjnego.     (3)
    4. W przypadku dopasowania spektralnego CARS kliknij Analysis | Fitting | Nonlinear curve fit | Open Dialog. Wybierz category: new, aby zdefiniować nową funkcję dla CARS. Do dopasowania spektralnego CARS użyj zdefiniowanej poniżej funkcji dopasowania CARS dla dwóch piki (patrz równanie (4)).
      Równanie dopasowania statystycznego, człony Gaussa i Lorentza w formule analizy spektralnej. (4)
  4. Wyznaczanie rozdzielczości przestrzennej
    UWAGA: Przed tym krokiem ważne jest poznanie przelicznika między rozmiarem piksela przy konkretnym powiększeniu, liczbą pikseli a rozmiarem kroku w µm. Można to zrobić, używając próbki o znanej średnicy, większej niż oczekiwana rozdzielczość obrazowania, mierząc jej profil liniowy i dopasowując funkcję Gaussa w celu wyznaczenia wartości pełnej szerokości w połowie maksimum (FWHM). Można zastosować wzorce rozdzielczości lub jednorodne próbki, takie jak kule polimerowe.
    1. Wykonaj obrazowanie komórek lub cząstek polimerowych o średnicy mniejszej niż 200 nm.
    2. Użyj programu ImageJ, aby narysować linię przez najmniejszą cząstkę na obrazie.
    3. Naciśnij K, aby wykreślić profil intensywności.
    4. Kliknij list w wyskakującym oknie i skopiuj informacje do oprogramowania do dopasowywania.
    5. Wykreśl profil w oprogramowaniu do dopasowywania i zastosuj dopasowanie Gaussa (kliknij Analysis | Fitting | Nonlinear curve fit | Open Dialog | Category: Basic Functions; Function: Gauss).
    6. Odczytaj szerokość piku po dopasowaniu. Użyj przelicznika pikseli na rozmiar, aby uzyskać rzeczywistą rozdzielczość mikroskopu.

3. Przygotowanie próbek do hiperspektralnego obrazowania CRS

  1. Przygotowanie szkiełek do obrazowania i próbek chemicznych
    1. Nanieś kawałek dwustronnej taśmy na szkiełko nakrywkę i wytnij w środku taśmy mały prostokąt, aby stworzyć wolną przestrzeń do umieszczenia próbki.
    2. Pipetuj 1-2 µL czystego DMSO i nanieś kroplę w centrum powstałego otworu.
    3. Ostrożnie nałóż górną nakrywkę i delikatnie dociśnij krawędzie szkiełkek, aby uszczelnić komorę, upewniając się, że próbka DMSO nie styka się z krawędziami taśmy.
    4. Do eksperymentów nad czułością przygotuj rozcieńczenia seryjne DMSO w tlenku deuteru (D2O), aby uzyskać zakres stężeń od 50% do 0%. Pobierz 1-2 µL każdego roztworu i przygotuj próbki prasowane zgodnie z powyższym opisem.
  2. Przygotowanie komórek
    1. Wysiej komórki w naczyniu o średnicy 35 mm z szklanym dnem (lub większym) w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny.
    2. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez noc lub dłużej, aż do uzyskania konfluencji na poziomie ~50%-80%.
    3. Obrazuj żywe komórki bezpośrednio lub utrwal komórki 10% roztworem formaliny przed obrazowaniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównanie rozdzielczości spektralnej
Rysunek 2 przedstawia porównanie rozdzielczości spektralnej mikroskopii hiperspektralnej SRS (Rysunek 2A) i CARS (Rysunek 2B>) z wykorzystaniem próbki DMSO. W przypadku widma SRS do dopasowania widma zastosowano dwie funkcje Lorentza (patrz krok protokołu 2.3), a rozdzielczość wyniosła 14,6 cm-1 dla piku 2 913 cm-1. Dla CARS do dopasowania wykorzystano ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tu protokół opisuje budowę multimodalnego mikroskopu CRS oraz bezpośrednie porównanie obrazowania CARS i SRS. W przypadku budowy mikroskopu krytycznymi etapami są przestrzenne i czasowe nakładanie się wiązki oraz optymalizacja rozmiaru wiązki. Zaleca się użycie próbki standardowej, takiej jak DMSO, przed obrazowaniem biologicznym w celu optymalizacji SNR i kalibracji przesunięć Ramana. Bezpośrednie porównanie obrazów CARS i SRS pokazuje, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, podczas gdy SRS daje lep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez fundusz startowy Wydziału Chemii Uniwersytetu Purdue.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw skanerów 2D galvoThorlabsGVS002
Modulator akustyczno-optycznyIsometM1205-P80L-0,5
Sterownik AOMIsomet532B-2
Karta akwizycji danychNational InstrumentsPCle 6363Filtr na zamówienie niestandardowe (980 sp)
Stopień opóźniającyZaberX-LSM050A
Deuter tlenekMillipore Sigma151882-100G
Lustro dichroiczne do kombinacji wiązkiThorlabsDMLP1000
Lustro dichroiczne do separacji sygnałówSemrockFF776-Di01-25x36
DMSOMiliporeSigma200-664-3
MIA PaCa 2 KomórkiATCCCRL-1420
Femtosekundowy system laserowySpectral PhysicsInSightX3+
Filtr do SAMOCHODÓWChromaAT655/30m
Filtr do SRSChromaET980sp
Generator funkcyjnyRigolDG1022Z
Pręty szklaneLattice Electro OpticsSF-57
Płyta półfalowaNewport10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020National InstrumentsTo jest oprogramowanie do akwizycji obrazu
Wzmacniacz blokującyZurich InstrumentHF2LI
Obudowa mikroskopuOlympusBX51W1
Soczewka obiektywuOlympusUPLSAPO60XW
Origin Pro 2019bOriginLab CorporationTo jest oprogramowanie do dopasowania spektralnego
OscyloskopTektronixTBS2204B
FotodiodaHamamatsuS3994-01
Detektor PMTHamamatsuH7422P-40
PMT Wzmacniacz napięciaAdvanced Research Instrument Corp.PMT4V3
Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki kostkaThorlabsPBS255
Listwa zaciskowaNational InstrumentsBNC-2110

Bibliografia

  1. Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619(1928).
  2. Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515(2020).
  3. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 883-909 (2008).
  4. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 507-530 (2011).
  5. Suhalim, J. L., Boik, J. C., Tromberg, B. J., Potma, E. O. The need for speed. Journal of Biophotonics. 5 (5-6), 387-395 (2012).
  6. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Optics Letters. 7 (8), 350-352 (1982).
  7. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  8. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  9. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory, and applications. The Journal of Physical Chemistry B. 108 (3), 827-840 (2004).
  10. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807(2005).
  11. Cheng, J. -X., Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. An epi-detected coherent anti-Stokes Raman scattering (E-CARS) microscope with high spectral resolution and high sensitivity. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (7), 1277-1280 (2001).
  12. Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. Time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Imaging based on Raman free induction decay. Applied Physics Letters. 80 (9), 1505-1507 (2002).
  13. Marks, D. L., Boppart, S. A. Nonlinear interferometric vibrational imaging. Physical Review Letters. 92 (12), 123905(2004).
  14. Ganikhanov, F., Evans, C. L., Saar, B. G., Xie, X. S. High-sensitivity vibrational imaging with frequency modulation coherent anti-Stokes Raman scattering (FM CARS) microscopy. Optics Letters. 31 (12), 1872-1874 (2006).
  15. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241-243 (2006).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  17. Masia, F., Karuna, A., Borri, P., Langbein, W. Hyperspectral image analysis for CARS, SRS, and Raman data. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (8), 727-734 (2015).
  18. Knutsen, K. P., Johnson, J. C., Miller, A. E., Petersen, P. B., Saykally, R. J. High spectral resolution multiplex CARS spectroscopy using chirped pulses. Chemical Physics Letters. 387 (4-6), 436-441 (2004).
  19. Okuno, M., Kano, H., Leproux, P., Couderc, V., Hamaguchi, H. -o Ultrabroadband multiplex CARS microspectroscopy and imaging using a subnanosecond supercontinuum light source in the deep near infrared. Optics Letters. 33 (9), 923-925 (2008).
  20. Masia, F., Glen, A., Stephens, P., Borri, P., Langbein, W. Quantitative chemical imaging and unsupervised analysis using hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 85 (22), 10820-10828 (2013).
  21. Pegoraro, A. F., Slepkov, A. D., Ridsdale, A., Moffatt, D. J., Stolow, A. Hyperspectral multimodal CARS microscopy in the fingerprint region. Journal of Biophotonics. 7 (1-2), 49-58 (2014).
  22. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  23. Ploetz, E., Laimgruber, S., Berner, S., Zinth, W., Gilch, P. Femtosecond stimulated Raman microscopy. Applied Physics B. 87 (3), 389-393 (2007).
  24. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  25. Nandakumar, P., Kovalev, A., Volkmer, A. Vibrational imaging based on stimulated Raman scattering microscopy. New Journal of Physics. 11 (3), 033026(2009).
  26. Slipchenko, M. N., Le, T. T., Chen, H., Cheng, J. -X. High-speed vibrational imaging and spectral analysis of lipid bodies by compound Raman microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (21), 7681-7686 (2009).
  27. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  28. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 415-445 (2015).
  29. Prince, R. C., Frontiera, R. R., Potma, E. O. Stimulated Raman scattering: from bulk to nano. Chemical Reviews. 117 (7), 5070-5094 (2017).
  30. Lu, F. -K., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Physics. 110 (15-16), 1927-1932 (2012).
  31. Ozeki, Y., et al. High-speed molecular spectral imaging of tissue with stimulated Raman scattering. Nature Photonics. 6 (12), 845-851 (2012).
  32. Wang, P., et al. Label-free quantitative imaging of cholesterol in intact tissues by hyperspectral stimulated raman scattering microscopy. Angewandte Chemie International Edition. 125 (49), 13280-13284 (2013).
  33. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  34. Liao, C. -S., et al. Microsecond scale vibrational spectroscopic imaging by multiplex stimulated Raman scattering microscopy. Light: Science & Applications. 4 (3), 265(2015).
  35. Liao, C. -S., et al. Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances. 1 (9), 1500738(2015).
  36. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  37. Andresen, E. R., Berto, P., Rigneault, H. Stimulated Raman scattering microscopy by spectral focusing and fiber-generated soliton as Stokes pulse. Optics Letters. 36 (13), 2387-2389 (2011).
  38. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  39. Zhang, C., Aldana-Mendoza, J. A. Coherent Raman scattering microscopy for chemical imaging of biological systems. Journal of Physics: Photonics. , (2021).
  40. Martens, W. N., Frost, R. L., Kristof, J., Theo Kloprogge, J. Raman spectroscopy of dimethyl sulphoxide and deuterated dimethyl sulphoxide at 298 and 77 k. Journal of Raman Spectroscopy. 33 (2), 84-91 (2002).
  41. Gill, G. W. Cytopreparation: Principles & Practice. Gill, G. W. , Springer. New York. 309-323 (2013).
  42. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  43. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  44. Lu, F. -K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Slipchenko, M. N., et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 135 (10), 2613-2619 (2010).
  46. Slipchenko, M. N., Zhou, B., Pinal, R., Teresa Carvajal, M., Cheng, J. -X. RAMAN-chemical imaging of solid dosage forms based on stimulated Raman scattering. American Pharmaceutical Review. 15 (3), 66(2012).
  47. Sarri, B., et al. Discriminating polymorph distributions in pharmaceutical tablets using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 50 (12), 1896-1904 (2019).
  48. Fussell, A. L., Kleinebudde, P., Herek, J., Strachan, C. J., Offerhaus, H. L. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy visualizes pharmaceutical tablets during dissolution. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (89), e51847(2014).
  49. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging). Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  50. Lim, R. S., et al. Multimodal CARS microscopy determination of the impact of diet on macrophage infiltration and lipid accumulation on plaque formation in ApoE-deficient mice [S]. Journal of Lipid Research. 51 (7), 1729-1737 (2010).
  51. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  52. Tabish, T. A., Narayan, R. J., Edirisinghe, M. Rapid and label-free detection of COVID-19 using coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Mrs Communications. 10 (4), 566-572 (2020).
  53. Camp, C. H., et al. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nature Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  54. Wei, L., et al. Live-cell bioorthogonal chemical imaging: stimulated Raman scattering microscopy of vibrational probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  55. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  56. Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  57. Steuwe, C., Kaminski, C. F., Baumberg, J. J., Mahajan, S. Surface enhanced coherent anti-Stokes Raman scattering on nanostructured gold surfaces. Nano Letters. 11 (12), 5339-5343 (2011).
  58. Fast, A., Kenison, J. P., Syme, C. D., Potma, E. O. Surface-enhanced coherent anti-Stokes Raman imaging of lipids. Applied Optics. 55 (22), 5994-6000 (2016).
  59. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  60. Yampolsky, S., et al. Seeing a single molecule vibrate through time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering. Nature Photonics. 8 (8), 650-656 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hiperspektralne SRSogniskowanie widmowepr bki biologicznekrople lipidowestosunek sygna u do szumurozdzielczo spektralnaobrazowanie bez znakowania
Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.