Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

DOI:

10.3791/63677

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) są najczęściej używanymi technologiami obrazowania koherentnego rozpraszania Ramana. Obrazowanie hiperspektralne SRS i CARS oferuje informacje spektralne Ramana w każdym pikselu, co umożliwia lepszą separację różnych składów chemicznych. Chociaż obie techniki wymagają dwóch laserów wzbudzających, ich schematy wykrywania sygnału i właściwości spektralne są zupełnie różne. Celem tego protokołu jest wykonanie zarówno obrazowania hiperspektralnego SRS, jak i CARS na jednej platformie i porównanie dwóch technik mikroskopowych do obrazowania różnych próbek biologicznych. Metoda ogniskowania spektralnego jest stosowana do pozyskiwania informacji spektralnych za pomocą laserów femtosekundowych. Używając standardowych próbek chemicznych, porównuje się czułość, rozdzielczość przestrzenną i rozdzielczość spektralną SRS i CARS w tych samych warunkach wzbudzenia (tj. moc w próbce, czas przebywania pikseli, soczewka obiektywu, energia impulsu). Kontrasty obrazowe CARS i SRS dla próbek biologicznych są zestawiane i porównywane. Bezpośrednie porównanie osiągów CARS i SRS pozwoliłoby na optymalny wybór metody obrazowania chemicznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zjawisko rozpraszania Ramana zostało po raz pierwszy zaobserwowane w 1928 roku przez C. V. Raman1. Kiedy padający foton oddziałuje z próbką, może spontanicznie wystąpić zdarzenie rozpraszania nieelastycznego, w którym zmiana energii fotonu odpowiada przejściu wibracyjnemu analizowanych związków chemicznych. Proces ten nie wymaga użycia znacznika chemicznego, dzięki czemu jest wszechstronnym, bezetykietowym narzędziem do analizy chemicznej przy jednoczesnej minimalizacji zakłóceń próbki. Pomimo swoich zalet, spontaniczne rozpraszanie Ramana ma niski przekrój czynny rozpraszania (zwykle 1011 niższy niż przekrój absorpcyjny w podczerwieni [IR]), co wymaga długich czasów akwizycji do analizy2. W związku z tym dążenie do zwiększenia czułości procesu rozpraszania Ramana ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju technologii Ramanowskich w obrazowaniu w czasie rzeczywistym.

Jednym skutecznym sposobem na znaczne zwiększenie czułości rozpraszania Ramana są procesy spójnego rozpraszania Ramana (CRS), dla których zazwyczaj używa się dwóch impulsów laserowych do wzbudzania molekularnych przejść wibracyjnych3,4. Gdy różnica energii fotonów między dwoma laserami dopasuje się do modów wibracyjnych cząsteczek próbki, zostaną wygenerowane silne sygnały Ramana. Dwa najczęściej używane procesy CRS do obrazowania to koherentne rozpraszanie Ramana anty-Stokesa (CARS) i wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS)5. W ciągu ostatnich dwóch dekad rozwój technologiczny przyczynił się do udoskonalenia technik mikroskopii CARS i SRS, które stały się potężnymi narzędziami do bezznacznikowej kwantyfikacji i wyjaśniania zmian chemicznych w próbkach biologicznych.

Obrazowanie chemiczne za pomocą mikroskopii CARS można datować na 1982 rok, kiedy to po raz pierwszy zastosowano skanowanie laserowe do pozyskiwania obrazów CARS, co zostało zademonstrowane przez Duncan et al6. Modernizacja mikroskopii CARS została znacznie przyspieszona po szerokim zastosowaniu skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej wielofotonowej ze skaningiem laserowym7. Wczesne prace grupy Xie wykorzystujące lasery o wysokiej częstotliwości powtarzania sprawiły, że CARS stał się szybką, bezznacznikową, chemiczną platformą obrazowania do charakteryzacji cząsteczek w próbkach biologicznych8,9,10. Jednym z głównych problemów związanych z obrazowaniem CARS jest obecność nierezonansowego tła, które zmniejsza kontrast obrazu i zniekształca widmo Ramana. Podjęto wiele wysiłków, aby zredukować nierezonansowe tło11,12,13,14,15 lub wyodrębnić rezonansowe sygnały Ramana z widm CARS16,17. Kolejnym osiągnięciem, które znacznie rozwinęło tę dziedzinę, jest obrazowanie hiperspektralne CARS, które pozwala na mapowanie spektralne każdego piksela obrazu z ulepszoną selektywnością chemiczną18,19,20,21.

Stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) jest młodszą technologią obrazowania niż CARS, chociaż zostało odkryte wcześniej22. W 2007 roku opisano mikroskopię SRS przy użyciu źródła laserowego o niskiej częstotliwości powtarzania23. Wkrótce kilka grup zademonstrowało szybkie obrazowanie SRS przy użyciu laserów o wysokiej częstotliwości powtarzania24,25,26. Jedną z głównych zalet mikroskopii SRS w porównaniu z CARS jest brak nierezonansowego tła27, chociaż inne tła, takie jak modulacja międzyfazowa (XPM), absorpcja przejściowa (TA), absorpcja dwufotonowa (TPA) i efekt fototermiczny (PT), mogą wystąpić w przypadku SRS28. Ponadto sygnał SRS i stężenie próbki mają liniowe zależności, w przeciwieństwie do CARS, który ma kwadratową zależność od stężenia sygnału29. Upraszcza to kwantyfikację chemiczną i rozmieszanie spektralne. Wielokolorowy i hiperspektralny SRS ewoluował w różnych formach30,31,32,33,34,35,36, przy czym ogniskowanie spektralne jest jednym z najpopularniejszych podejść do obrazowania chemicznego37,38.

Zarówno CARS, jak i SRS wymagają skupienia promieni pompy i lasera Stokesa na próbce, aby dopasować przejście wibracyjne cząsteczek do wzbudzenia sygnału. Mikroskopy CARS i SRS mają ze sobą wiele wspólnego. Jednak fizyka leżąca u podstaw tych dwóch procesów i detekcji sygnałów związanych z tymi technologiami mikroskopowymi ma rozbieżności3,39. CARS jest procesem parametrycznym, w którym nie występuje sprzężenie energii netto foton-cząsteczka3. SRS jest jednak procesem nieparametrycznym i przyczynia się do transferu energii między fotonami a układami molekularnymi27. W CARS generowany jest nowy sygnał o częstotliwości anty-Stokesa, podczas gdy SRS objawia się jako transfer energii między pompą a wiązkami laserowymi Stokesa.

Sygnał CARS spełnia Eq (1)28.

figure-introduction-1 (1)

Tymczasem, sygnał SRS może być zapisany jako Eq (2)28.

figure-introduction-2 (2)

Tutaj, Ip, I s, ICARS i ΔISRS to odpowiednio intensywności wiązki pompy, wiązki Stokesa, sygnału CARS i sygnałów SRS. χ(3) jest nieliniową podatnością optyczną próbki trzeciego rzędu i jest wartością zespoloną złożoną z części rzeczywistych i urojonych.

Te równania wyrażają profile widmowe i zależność od koncentracji sygnału CARS i SRS. Różnice w fizyce skutkują rozbieżnymi schematami detekcji dla tych dwóch technologii mikroskopowych. Detekcja sygnału w CARS zwykle polega na separacji spektralnej nowo wygenerowanych fotonów i detekcji za pomocą lampy fotopowielacza (PMT) lub urządzenia sprzężonego z ładunkiem (CCD); w przypadku SRS wymiana energii między pompą a wiązkami Stokesa jest zwykle mierzona za pomocą szybkiej modulacji intensywności za pomocą modulatora optycznego i demodulacji za pomocą fotodiody (PD) sprzężonej ze wzmacniaczem lock-in.

Chociaż w ostatnich latach opublikowano wiele osiągnięć technologicznych i aplikacji zarówno w dziedzinie CARS, jak i SRS, na tej samej platformie nie przeprowadzono systematycznych porównań obu technik CRS, zwłaszcza dla mikroskopii hiperspektralnej CARS i SRS. Bezpośrednie porównania czułości, rozdzielczości przestrzennej, rozdzielczości spektralnej i możliwości separacji chemicznej pozwoliłyby biologom wybrać najlepszą metodę kwantyfikacji chemicznej. W niniejszym protokole przedstawiono szczegółowe kroki w celu skonstruowania multimodalnej platformy obrazowania z modalnościami hiperspektralnymi CARS i SRS w oparciu o system lasera femtosekundowego i ogniskowanie spektralne. Obie techniki zostały porównane w kierunku do przodu pod kątem rozdzielczości spektralnej, czułości detekcji, rozdzielczości przestrzennej i kontrastów obrazowania komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Instrumentalna konfiguracja do hiperspektralnego obrazowania CRS

UWAGA: Generowanie sygnału CRS wymaga użycia laserów o dużej mocy (tj. klasy 3B lub klasy 4). Należy przestrzegać protokołów bezpieczeństwa i przez cały czas pracy przy tak wysokich mocach szczytowych należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). Przed eksperymentowaniem zapoznaj się z odpowiednią dokumentacją. Protokół ten koncentruje się na projektowaniu ścieżki wiązki, ćwierkaniu impulsów femtosekundowych i optymalizacji warunków obrazowania. Ogólny układ optyczny tego hiperspektralnego mikroskopu CRS jest pokazany na Rysunek 1. Przedstawiona tutaj konfiguracja jest jedną z wielu istniejących konfiguracji dla mikroskopii CRS. System mikroskopowy CRS zastosowany w tym protokole jest zbudowany na femtosekundowym źródle lasera o podwójnym wyjściu i laserowym mikroskopie skaningowym.

  1. Upewnij się, że źródło lasera zapewnia dwa ciągi impulsów femtosekundowych (szerokość 120 fs) z częstotliwością powtarzania 80 MHz, w tym stałą długość fali przy 1,045 nm używaną jako wiązka Stokesa i przestrajalna długość fali od 680 do 1,300 nm używana jako wiązka pompy. Zsynchronizuj impulsy wyjściowe z różnicą opóźnień optycznych. Użyj ramy mikroskopu, aby skonstruować platformę obrazowania.
  2. Projektowanie ścieżki belki
    1. Aby kontrolować moc lasera na próbce, należy użyć kombinacji płytki półfalowej i rozdzielacza wiązki polaryzacyjnej (PBS) dla każdej wiązki laserowej.
    2. Zainstaluj modulator akustyczno-optyczny (AOM) w ścieżce wiązki laserowej Stokesa. Skoncentruj wiązkę z obiektywem o ogniskowej 150 mm w AOM i ponownie skolimuj wyjście 0 rzędu za pomocą obiektywu o ogniskowej 400 mm.
    3. Użyj tej samej pary soczewek (ogniskowe 150 mm i 400 mm), aby rozszerzyć wiązkę pompy, aby dopasować rozmiar wiązki laserowej do Stokesa.
    4. Umieść soczewki o ogniskowej 400 mm zarówno w pompie, jak i na ścieżkach wiązki Stokesa na oddzielnych jednowymiarowych stolikach translacyjnych w celu precyzyjnego dostrojenia rozbieżności wiązki i optymalizacji rozmiaru wiązki przed wejściem do mikroskopu.
    5. Skieruj wiązkę pompy za pomocą zwierciadła odbijającego pod kątem prostym zamontowanego na zmotoryzowanym stoliku translacyjnym w celu optycznego strojenia opóźnienia. Jeśli wiązka Stokesa wymaga opóźnienia optycznego, umieść te komponenty zamiast tego na jej ścieżce wiązki.
    6. Pozwól na połączenie obu wiązek w zwierciadle dichroicznym o długości fali granicznej przy ~ 1,000 nm (między długością fali pompy a Stokesem), tak aby wiązka Stokesa przechodziła przez zwierciadło dichroiczne, podczas gdy wiązka pompy była odbijana przez lustro dichroiczne. Wyślij współliniowo połączone wiązki laserowe do mikroskopu.
    7. Aby zaćwierkać pompę i belki Stokesa, umieść szklane pręty w ich ścieżkach wiązki. Szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 1.5.
    8. Aby potwierdzić prawidłowe wyrównanie i rozmiar wiązki, należy użyć przysłon irysowych za lustrem dichroicznym, a przed mikroskopem. W szczególności zainstaluj jeden w pozycji blisko, a drugi w pewnej odległości od lustra dichroicznego, aby potwierdzić dobre wyrównanie i zachodzenie wiązki na siebie. Użyj karty podglądu w podczerwieni lub przeglądarki podczerwieni, aby zobrazować wiązkę podczas wyrównywania.
    9. Użyj szybkiego PD i oscyloskopu, aby w przybliżeniu zmierzyć opóźnienie optyczne między pompą a impulsami Stokesa. Uruchom oscyloskop, pobierając próbkę ciągu impulsów laserowych.
    10. Zablokuj belkę pompy i pobierz próbkę wiązki Stokesa. Powiększ jeden z impulsów i umieść na nim pionowy kursor, aby zaznaczyć jego czasowe położenie na oscyloskopie.
    11. Odblokuj belkę pompy i zablokuj belkę Stokesa. Przesuń stopień opóźniający, aż impulsy pompy próbki tymczasowo wyrównają się z zaznaczoną pozycją.
  3. Laserowy mikroskop skaningowy
    1. Aby uzyskać pionową konfigurację mikroskopu, wyślij połączone wiązki laserowe przez peryskop, aby wspiąć się na odpowiedni poziom przed dotarciem do luster skanujących 2D galvo.
    2. Zmierz rozmiar wiązki laserowej przed mikroskopem i ustaw odpowiednią parę soczewek za lustrami galvo, aby rozszerzyć wiązkę laserową, aby jak najlepiej dopasować się do rozmiaru źrenicy wejściowej soczewki obiektywu.
    3. Skonstruuj system 4-f przy użyciu dwóch soczewek, z tylną aperturą soczewki obiektywu i środkiem dwóch luster galvo będących sprzężonymi płaszczyznami. Alternatywnie można użyć dwóch oddzielnych luster 1D galvo z dwoma systemami soczewek 4-f do skanowania laserowego.
    4. Po kondensatorze zaprojektuj 2-calowe lustro obrotowe, aby odbijać wiązki laserowe w celu zbierania sygnału. Umieść soczewkę o średnicy 2 w ścieżce przesyłanej wiązki, aby w pełni zebrać i skupić sygnały transmisyjne do detektorów.
    5. Skierować sygnały CARS do PMT za pomocą zwierciadła dichroicznego z odcięciem przy 776 nm i pozwolić na wykrycie przesyłanych sygnałów SRS przez PD. Użyj filtra pasmowoprzepustowego (655/30 nm) przed PMT, aby odrzucić szczątkowe impulsy laserowe wzbudzenia. Użyj filtra krótkoprzepustowego (980 nm krótkoprzepustowego) przed PD, aby zablokować wiązkę Stokesa przed wejściem do detektora.
    6. W celu detekcji sygnału CARS należy podłączyć przedwzmacniacz i przetwornicę prądowo-napięciową po PMT i przed wysłaniem sygnału do systemu akwizycji danych. Dostosuj napięcie PMT, aby zoptymalizować sygnał i kontrast obrazu.
    7. Użyj generatora funkcyjnego, aby modulować AOM na częstotliwości 1-10 MHz i użyj tej samej częstotliwości, co odniesienie dla demodulacji lock-in. Użyj wzmacniacza typu lock-in, aby wyodrębnić sygnały SRS przed akwizycją danych.
  4. Akwizycja i wyświetlanie danych
    1. Przeprowadzanie akwizycji danych za pomocą karty do cyfrowej akwizycji danych (DAQ) w połączeniu z listwą zaciskową.
    2. Użyj wyjść analogowych z DAQ do sterowania lustrami galvo i wejściami analogowymi do akwizycji sygnału.
    3. Korzystaj z oprogramowania napisanego przez Lab opartego na LabVIEW z jednoczesnym wyświetlaniem wielokanałowym do przeglądania i zapisywania obrazów w czasie rzeczywistym (patrz Plik uzupełniający).
  5. Ćwierkanie źródła femtosekundowego i pomiar rozdzielczości spektralnej
    UWAGA: Aby uzyskać dobrą rozdzielczość spektralną za pomocą ogniskowania spektralnego, szklane pręty są używane do wprowadzania dyspersji i ćwierkania impulsów laserowych od femtosekundy do pikosekundy. Aby osiągnąć najlepszą rozdzielczość spektralną, częstotliwość ćwierkania wiązki pompy musi być równa częstotliwości wiązki Stokesa. W przypadku tego systemu laserowego najlepszą rozdzielczość spektralną można osiągnąć, dzwoniąc wyjściowymi impulsami lasera o prędkości ~120 kl./s do 3,4 ps dla pompy i 1,8 ps dla Stokesa. Ćwierkanie to uzyskuje się za pomocą kombinacji 4+1 (cztery w wiązce kombinowanej, jeden tylko w belce Stokesa) kombinacji prętów szklanych o średnicy 150 mm (SF-57), jak opisano poniżej, i powinno osiągnąć rozdzielczość spektralną 15 cm-1. Czas trwania impulsu można zmierzyć za pomocą autokorelatora.
    1. Włóż jeden pręt szklany o średnicy 150 mm tylko do ścieżki wiązki Stokesa.
    2. Włóż dwa szklane pręty o średnicy 150 mm do połączonej ścieżki pompy/wiązki Stokesa za rozdzielaczem wiązki dichroicznej. Aby zwiększyć ćwierkanie, pozwól, aby połączone wiązki laserowe dwukrotnie przeszły przez dwa szklane pręty, umieszczając dielektryczne lustro na jednym końcu prętów.
    3. Aby zmierzyć rozdzielczość spektralną, należy przygotować próbkę wzorcowej substancji chemicznej (np. dimetylosulfotlenku [DMSO]) wciśniętej między dwa szklane szkiełka nakrywkowe i skanować stopień opóźniający, aż do uzyskania maksymalnego sygnału.
    4. Przesuń opóźnienie optyczne o 1 000 μm w kierunku przesunięcia ku czerwieni. Następnie uruchom 200 klatek z prędkością 10 μm/krok w kierunku przesunięcia ku błękitowi, aby zebrać stos obrazów hiperspektralnych.
    5. Aby przekonwertować numery ramek na liczby falowe, wykonaj regresję liniową, używając symetrycznych (2,913 cm-1) i asymetrycznych (2,994 cm-1) C-H rozciągających się od DMSO i odpowiadających im numerów ramek40.
    6. Użyj sygnału XPM do pomiaru spektralnego profilu intensywności ogniskowania. Zamknij do połowy membranę kondensatora i przenieś ostrość na czyste szkiełko nakrywkowe. Zbierz taką samą liczbę kroków, jak w przypadku hiperspektralnego SRS. Aby zmierzyć nierezonansowe tło CARS, skup się na szklanym szkiełku nakrywkowym i zbierz taką samą liczbę kroków dla hiperspektralnych pomiarów CARS.
  6. Optymalizacja stosunku sygnału do szumu (SNR) obrazów
    1. Przygotuj próbkę chemiczną do wyrównania systemu. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.1 w celu przygotowania próbki.
      UWAGA: DMSO jest dobrym wyborem, ponieważ jest to powszechna laboratoryjna substancja chemiczna z silnymi sygnałami Ramana i dobrze oddzielonymi symetrycznymi i asymetrycznymi pikami C-H.
    2. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i w razie potrzeby dodaj wodę lub olej immersyjny do soczewki obiektywu lub kondensatora. Prawidłowo przesuń krawędź kropli DMSO w polu view i wyreguluj soczewkę obiektywu, aby uzyskać najlepszą ostrość. Wyśrodkuj kondensator za pomocą metody oświetlenia Köhlera41. Całkowicie otwórz membranę skraplacza.
    3. Dostosuj długość fali wiązki pompy do 800 nm (1,045 nm Stokesa), aby celować w szczyt 2,913 cm-1 CH3. Ustaw moc zarówno pompy, jak i wiązki Stokesa na ~30 mW przed mikroskopem, regulując płytkę półfalową (moc ~10 mW na płaszczyźnie próbki).
    4. W przypadku SRS ustaw wzmocnienie wzmacniacza lock-in na ~10 ze stałą czasową 7 μs (w przypadku korzystania z czasu przebywania pikseli 10 μs). Upewnij się, że stała czasowa jest krótsza niż czas przebywania piksela. Użyj Demod R jako wyjścia AUX dla sygnałów SRS.
    5. W przypadku CARS wyślij wyjście PMT do przedwzmacniacza i konwertera prądowo-napięciowego. Użyj DAQ, aby uzyskać dane wyjściowe z konwertera.
    6. Ustaw parametry akwizycji obrazu w oprogramowaniu do akwizycji. Użyj liczby pikseli 200 x 200 przy rozmiarze skanowania ~100 x 100 μm2. Upewnij się, że obraz zawiera zarówno kroplę DMSO, jak i pusty obszar.
    7. Zeskanuj próbkę i sprawdź obraz na ekranie komputera. Skanuj zmotoryzowany stopień opóźnienia w belce Stokes/pompy, monitorując obrazy w czasie rzeczywistym. Skanuj opóźnienie, aż sygnał zostanie zmaksymalizowany.
    8. Przesuń kroplę DMSO, aby pokryć całe pole view i sprawdź, czy maksimum sygnału DC jest wyśrodkowane na obrazie (sygnał jest zależny od wiązki pompy). Dostosuj położenie belki pompy za pomocą lustra lub przesunięcie napięcia w oprogramowaniu do obrazowania.
    9. Po optymalizacji DC wyreguluj lustra wiązki Stokesa, aż sygnał AC zostanie zmaksymalizowany, dostosowując wartość progową, aby wyświetlić ~50% nasycenia. Sprawdź, czy nasycenie jest wyśrodkowane na obrazie. Jeśli nie, dostosuj lusterka tylko w belce Stokesa. Monitoruj sygnał podczas osiowania jako informację zwrotną w czasie rzeczywistym na temat jakości osiowania.
    10. Aby określić SNR, wybierz mały obszar obrazu DMSO i zmierz wartość średnią. W przypadku szumu wybierz mały obszar w pustym obszarze obrazu i określ zarówno średnią wartość, jak i odchylenie standardowe. Odejmij średnią wartość szumu od średniej wartości sygnału i podziel wyniki przez odchylenie standardowe pustego obszaru.
    11. Jeśli obliczony stosunek sygnału do szumu (SNR) nie jest wystarczająco wysoki (zwykle 800-1 000 dla SRS i 10 000 > dla CARS przy napięciu PMT 0,4 V przy tej kombinacji mocy), sprawdź i ponownie zoptymalizuj nakładanie się wiązki, rozmiary wiązki i pozycję stopnia opóźniającego, dostosuj AOM i zmieniaj częstotliwość modulacji generatora funkcyjnego, aż do uzyskania oczekiwanego SNR.

2. Analiza obrazu i przetwarzanie danych

  1. Analiza SNR
    1. Otwórz oprogramowanie ImageJ. Aby zaimportować zapisany plik .txt próbki DMSO, kliknij Plik | Import | Obraz tekstowy | Otwarty.
    2. Po zaimportowaniu obrazu naciśnij CTRL+shift+C, aby wyświetlić funkcję jasności i kontrastu (B&C). Aby znaleźć maksymalny sygnał próbki, naciskaj przycisk auto w B&C, aż obszar próbki DMSO pojawi się nasycony.
    3. Kliknij narzędzie do zaznaczania owalu w interfejsie ImageJ i podświetl niewielki obszar nasyconego obszaru DMSO. Po podświetleniu naciśnij M, aby zmierzyć średnią i odchylenie standardowe wybranego obszaru.
    4. Aby zmierzyć tło, wyreguluj paski w funkcji B&C, aż będzie można zaobserwować sygnał pustego obszaru. Kliknij owalne zaznaczenie i podświetl obszar tła o tym samym rozmiarze, co w kroku 2.1.3. Upewnij się, że wybrany region nie zawiera DMSO. Naciśnij M, aby zmierzyć statystyki wybranego obszaru.
    5. Oblicz stosunek sygnału do szumu zgodnie z krokiem 1.6.10.
  2. Przetwarzanie hiperspektralnych obrazów CRS
    1. Zaimportuj plik .txt zgodnie z krokiem 2.1.1. Po zaimportowaniu kliknij Obraz | Stosy | Narzędzia | Montaż do stosu... , aby przekonwertować plik na stos obrazów.
    2. Przewiń montaż, aż zobaczysz pierwszy szczyt DMSO. Wybierz region na DMSO i kliknij Obraz | Stos | Wykreśl profil osi Z, aby wykreślić intensywność w funkcji widma liczby ramek. Aby wyodrębnić surowe dane spektralne, kliknij listę i skopiuj dane profilu.
    3. Aby przeliczyć odzyskane widmo na jednostki liczby falowej, należy przeprowadzić regresję liniową zgodnie z opisem w kroku 1.5.5.
  3. Przyrząd do pomiaru rozdzielczości spektralnej
    UWAGA: Funkcje Lorentza są używane do dopasowania widm SRS i CARS28.
    1. Otwórz oprogramowanie do dopasowywania, a następnie skopiuj i wklej dane regresji liniowej do programu. Aby dopasować dane SRS, wyróżnij dane, a następnie wykreśl je jako wykres punktowy.
    2. Wyciągnij wykres punktowy. Kliknij na Analiza | Wartości szczytowe i linia bazowa | Wielokrotne dopasowanie szczytowe | Otwórz okno dialogowe, aby wyświetlić analizator szczytów. Po rozwinięciu sprawdź, czy dane wejściowe są bieżącym wykresem i zmień funkcję szczytu na Lorentza (Lorentza).
    3. Kliknij dwukrotnie każdy z dwóch szczytów DMSO na wykresie, aby podświetlić regiony, które mają zostać dopasowane. Następnie kliknij Otwórz NLfit, aby wyświetlić okno dopasowania. Kliknij przycisk Dopasuj do zbieżności, a następnie OK, aby zobaczyć tabelaryczne podsumowanie współczynników dopasowania (patrz równanie (3)).
      UWAGA: Poniższe równanie przedstawia format funkcji Lorentza w oprogramowaniu. A1/2 to amplitudy dopasowanych pików, w1/2 to szerokości dopasowanych pików, a wartości x01/02 to środki dopasowanych pików. Zmienną niezależną jest x, a zmienną zależną jest y.
      figure-protocol-1 (3)
    4. Aby dopasować spektralny CARS, kliknij na Analiza | Dopasowanie | Dopasowanie krzywej nieliniowej | Otwórz okno dialogowe. Wybierz kategorię: nowa, aby zdefiniować nową funkcję dla CARS. Użyć dwuszczytowej funkcji dopasowania CARS zdefiniowanej poniżej (patrz korektor (4)) dla dopasowania spektralnego CARS.
      figure-protocol-2 (4)
  4. Określanie rozdzielczości przestrzennej
    UWAGA: Przed tym krokiem ważne jest, aby znać konwersję między rozmiarem piksela przy określonym powiększeniu, liczbą piksela i rozmiarem kroku w μm. Można to zrobić, używając próbki o znanej średnicy, która jest większa niż oczekiwana rozdzielczość obrazowania, mierząc jej profil linii i dopasowując funkcję Gaussa w celu wyznaczenia pełnej szerokości przy połowie wartości maksimum (FWHM). Można stosować docelowe rozdzielczości lub jednorodne próbki, takie jak kulki polimerowe.
    1. Uzyskaj obraz komórek lub cząstek polimeru o średnicy mniejszej niż 200 nm.
    2. Użyj funkcji ImageJ, aby narysować linię w poprzek najmniejszej cząstki na obrazie.
    3. Naciśnij K, aby wykreślić profil intensywności.
    4. Kliknij listę w wyskakującym okienku i skopiuj informacje do oprogramowania do dopasowania.
    5. Narysuj profil w oprogramowaniu do dopasowania i użyj dopasowania Gaussa (kliknij na Analiza | Dopasowanie | Dopasowanie krzywej nieliniowej | Otwieranie okna dialogowego | Kategoria: Funkcje podstawowe; Funkcja: Gauss).
    6. Odczytaj szerokość piku po dopasowaniu. Użyj konwersji pikseli na rozmiar, aby uzyskać rzeczywistą rozdzielczość mikroskopu.

3. Przygotowanie próbek do hiperspektralnego obrazowania CRS

  1. Przygotowanie preparatów obrazowych i próbek chemicznych
    1. Umieść kawałek taśmy dwustronnej na szkiełku nakrywkowym i wytnij mały prostokątny kształt taśmy ze środka umieszczonej taśmy, aby stworzyć otwartą przestrzeń do umieszczenia próbki.
    2. Odpipetować 1-2 μl czystego DMSO i dozować kroplę w środku pustego miejsca.
    3. Ostrożnie umieść górne szkiełko nakrywkowe i delikatnie dociśnij krawędzie szkiełek nakrywkowych, aby uszczelnić komorę, upewniając się, że próbka DMSO nie styka się z krawędziami taśmy.
    4. Do eksperymentów z wrażliwością należy przygotować seryjne rozcieńczenia DMSO w tlenku deuteru (D2O), aby uzyskać zakres stężeń 50%-0%. Pobrać 1-2 μl każdego roztworu i przygotować sprasowane próbki, jak opisano powyżej.
  2. Przygotowanie komórek
    1. Zasiaj komórki w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (lub większym) w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
    2. Inkubować komórki w komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 przez noc lub dłużej, aż do osiągnięcia ~50%-80% zgryzienia.
    3. Zobrazuj żywe komórki bezpośrednio lub utrwal komórki za pomocą 10% roztworu formaliny do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównania rozdzielczości spektralnej
Rysunek 2 porównuje rozdzielczość spektralną mikroskopii hiperspektralnej SRS (Rysunek 2A) i CARS (Rysunek 2B) przy użyciu próbki DMSO. Dla widma SRS zastosowano dwie funkcje Lorentza (patrz krok protokołu 2.3) w celu dopasowania widma, a rozdzielczość 14,6 cm-1 uzyskano przy użyciu piku 2,913 cm-1. W przypadku CARS do dopasowania wykorzystano funkcję dopasowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tu protokół opisuje budowę multimodalnego mikroskopu CRS oraz bezpośrednie porównanie obrazowania CARS i SRS. W przypadku budowy mikroskopu krytycznymi etapami są przestrzenne i czasowe nakładanie się wiązki oraz optymalizacja rozmiaru wiązki. Zaleca się użycie próbki standardowej, takiej jak DMSO, przed obrazowaniem biologicznym w celu optymalizacji SNR i kalibracji przesunięć Ramana. Bezpośrednie porównanie obrazów CARS i SRS pokazuje, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, podczas gdy SRS daje lep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez fundusz startowy Wydziału Chemii Uniwersytetu Purdue.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw skanerów 2D galvoThorlabsGVS002
Modulator akustyczno-optycznyIsometM1205-P80L-0,5
Sterownik AOMIsomet532B-2
Karta akwizycji danychNational InstrumentsPCle 6363Filtr na zamówienie niestandardowe (980 sp)
Stopień opóźniającyZaberX-LSM050A
Deuter tlenekMillipore Sigma151882-100G
Lustro dichroiczne do kombinacji wiązkiThorlabsDMLP1000
Lustro dichroiczne do separacji sygnałówSemrockFF776-Di01-25x36
DMSOMiliporeSigma200-664-3
MIA PaCa 2 KomórkiATCCCRL-1420
Femtosekundowy system laserowySpectral PhysicsInSightX3+
Filtr do SAMOCHODÓWChromaAT655/30m
Filtr do SRSChromaET980sp
Generator funkcyjnyRigolDG1022Z
Pręty szklaneLattice Electro OpticsSF-57
Płyta półfalowaNewport10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020National InstrumentsTo jest oprogramowanie do akwizycji obrazu
Wzmacniacz blokującyZurich InstrumentHF2LI
Obudowa mikroskopuOlympusBX51W1
Soczewka obiektywuOlympusUPLSAPO60XW
Origin Pro 2019bOriginLab CorporationTo jest oprogramowanie do dopasowania spektralnego
OscyloskopTektronixTBS2204B
FotodiodaHamamatsuS3994-01
Detektor PMTHamamatsuH7422P-40
PMT Wzmacniacz napięciaAdvanced Research Instrument Corp.PMT4V3
Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki kostkaThorlabsPBS255
Listwa zaciskowaNational InstrumentsBNC-2110

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619(1928).
  2. Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515(2020).
  3. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 883-909 (2008).
  4. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 507-530 (2011).
  5. Suhalim, J. L., Boik, J. C., Tromberg, B. J., Potma, E. O. The need for speed. Journal of Biophotonics. 5 (5-6), 387-395 (2012).
  6. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Optics Letters. 7 (8), 350-352 (1982).
  7. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  8. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  9. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory, and applications. The Journal of Physical Chemistry B. 108 (3), 827-840 (2004).
  10. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807(2005).
  11. Cheng, J. -X., Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. An epi-detected coherent anti-Stokes Raman scattering (E-CARS) microscope with high spectral resolution and high sensitivity. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (7), 1277-1280 (2001).
  12. Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. Time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Imaging based on Raman free induction decay. Applied Physics Letters. 80 (9), 1505-1507 (2002).
  13. Marks, D. L., Boppart, S. A. Nonlinear interferometric vibrational imaging. Physical Review Letters. 92 (12), 123905(2004).
  14. Ganikhanov, F., Evans, C. L., Saar, B. G., Xie, X. S. High-sensitivity vibrational imaging with frequency modulation coherent anti-Stokes Raman scattering (FM CARS) microscopy. Optics Letters. 31 (12), 1872-1874 (2006).
  15. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241-243 (2006).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  17. Masia, F., Karuna, A., Borri, P., Langbein, W. Hyperspectral image analysis for CARS, SRS, and Raman data. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (8), 727-734 (2015).
  18. Knutsen, K. P., Johnson, J. C., Miller, A. E., Petersen, P. B., Saykally, R. J. High spectral resolution multiplex CARS spectroscopy using chirped pulses. Chemical Physics Letters. 387 (4-6), 436-441 (2004).
  19. Okuno, M., Kano, H., Leproux, P., Couderc, V., Hamaguchi, H. -o Ultrabroadband multiplex CARS microspectroscopy and imaging using a subnanosecond supercontinuum light source in the deep near infrared. Optics Letters. 33 (9), 923-925 (2008).
  20. Masia, F., Glen, A., Stephens, P., Borri, P., Langbein, W. Quantitative chemical imaging and unsupervised analysis using hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 85 (22), 10820-10828 (2013).
  21. Pegoraro, A. F., Slepkov, A. D., Ridsdale, A., Moffatt, D. J., Stolow, A. Hyperspectral multimodal CARS microscopy in the fingerprint region. Journal of Biophotonics. 7 (1-2), 49-58 (2014).
  22. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  23. Ploetz, E., Laimgruber, S., Berner, S., Zinth, W., Gilch, P. Femtosecond stimulated Raman microscopy. Applied Physics B. 87 (3), 389-393 (2007).
  24. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  25. Nandakumar, P., Kovalev, A., Volkmer, A. Vibrational imaging based on stimulated Raman scattering microscopy. New Journal of Physics. 11 (3), 033026(2009).
  26. Slipchenko, M. N., Le, T. T., Chen, H., Cheng, J. -X. High-speed vibrational imaging and spectral analysis of lipid bodies by compound Raman microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (21), 7681-7686 (2009).
  27. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  28. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 415-445 (2015).
  29. Prince, R. C., Frontiera, R. R., Potma, E. O. Stimulated Raman scattering: from bulk to nano. Chemical Reviews. 117 (7), 5070-5094 (2017).
  30. Lu, F. -K., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Physics. 110 (15-16), 1927-1932 (2012).
  31. Ozeki, Y., et al. High-speed molecular spectral imaging of tissue with stimulated Raman scattering. Nature Photonics. 6 (12), 845-851 (2012).
  32. Wang, P., et al. Label-free quantitative imaging of cholesterol in intact tissues by hyperspectral stimulated raman scattering microscopy. Angewandte Chemie International Edition. 125 (49), 13280-13284 (2013).
  33. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  34. Liao, C. -S., et al. Microsecond scale vibrational spectroscopic imaging by multiplex stimulated Raman scattering microscopy. Light: Science & Applications. 4 (3), 265(2015).
  35. Liao, C. -S., et al. Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances. 1 (9), 1500738(2015).
  36. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  37. Andresen, E. R., Berto, P., Rigneault, H. Stimulated Raman scattering microscopy by spectral focusing and fiber-generated soliton as Stokes pulse. Optics Letters. 36 (13), 2387-2389 (2011).
  38. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  39. Zhang, C., Aldana-Mendoza, J. A. Coherent Raman scattering microscopy for chemical imaging of biological systems. Journal of Physics: Photonics. , (2021).
  40. Martens, W. N., Frost, R. L., Kristof, J., Theo Kloprogge, J. Raman spectroscopy of dimethyl sulphoxide and deuterated dimethyl sulphoxide at 298 and 77 k. Journal of Raman Spectroscopy. 33 (2), 84-91 (2002).
  41. Gill, G. W. Cytopreparation: Principles & Practice. Gill, G. W. , Springer. New York. 309-323 (2013).
  42. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  43. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  44. Lu, F. -K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Slipchenko, M. N., et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 135 (10), 2613-2619 (2010).
  46. Slipchenko, M. N., Zhou, B., Pinal, R., Teresa Carvajal, M., Cheng, J. -X. RAMAN-chemical imaging of solid dosage forms based on stimulated Raman scattering. American Pharmaceutical Review. 15 (3), 66(2012).
  47. Sarri, B., et al. Discriminating polymorph distributions in pharmaceutical tablets using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 50 (12), 1896-1904 (2019).
  48. Fussell, A. L., Kleinebudde, P., Herek, J., Strachan, C. J., Offerhaus, H. L. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy visualizes pharmaceutical tablets during dissolution. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (89), e51847(2014).
  49. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging). Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  50. Lim, R. S., et al. Multimodal CARS microscopy determination of the impact of diet on macrophage infiltration and lipid accumulation on plaque formation in ApoE-deficient mice [S]. Journal of Lipid Research. 51 (7), 1729-1737 (2010).
  51. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  52. Tabish, T. A., Narayan, R. J., Edirisinghe, M. Rapid and label-free detection of COVID-19 using coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Mrs Communications. 10 (4), 566-572 (2020).
  53. Camp, C. H., et al. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nature Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  54. Wei, L., et al. Live-cell bioorthogonal chemical imaging: stimulated Raman scattering microscopy of vibrational probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  55. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  56. Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  57. Steuwe, C., Kaminski, C. F., Baumberg, J. J., Mahajan, S. Surface enhanced coherent anti-Stokes Raman scattering on nanostructured gold surfaces. Nano Letters. 11 (12), 5339-5343 (2011).
  58. Fast, A., Kenison, J. P., Syme, C. D., Potma, E. O. Surface-enhanced coherent anti-Stokes Raman imaging of lipids. Applied Optics. 55 (22), 5994-6000 (2016).
  59. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  60. Yampolsky, S., et al. Seeing a single molecule vibrate through time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering. Nature Photonics. 8 (8), 650-656 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hiperspektralne SRSogniskowanie widmowepr bki biologicznekrople lipidowestosunek sygna u do szumurozdzielczo spektralnaobrazowanie bez znakowania

Powiązane artykuły