Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63684

⸱

23 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Centre for Virology, Vaccinology and Therapeutics, Hong Kong Science and Technology Park, 3State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, The University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia metodę pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzania organoidów płuc i wywoływania różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D, które wiernie kopiują nabłonek ludzkich dróg oddechowych.

Streszczenie

Brak solidnego modelu in vitro ludzkiego nabłonka oddechowego utrudnia zrozumienie biologii i patologii układu oddechowego. Opisujemy zdefiniowany protokół pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z dorosłych komórek macierzystych w tkance płucnej i indukowania różnicowania proksymalnego w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych. Organoidy płuc są następnie kolejno namnażane przez ponad 1 rok z wysoką stabilnością, podczas gdy zróżnicowane organoidy dróg oddechowych są wykorzystywane do morfologicznej i funkcjonalnej symulacji ludzkiego nabłonka dróg oddechowych na poziomie zbliżonym do fizjologicznego. W ten sposób tworzymy solidny model organoidowy nabłonka ludzkich dróg oddechowych. Długoterminowa ekspansja organoidów płucnych i zróżnicowanych organoidów dróg oddechowych generuje stabilne i odnawialne źródło, umożliwiając naukowcom rekonstrukcję i ekspansję komórek nabłonka ludzkich dróg oddechowych w szalkach hodowlanych. Ludzki system organoidów płuc zapewnia unikalny i fizjologicznie aktywny model in vitro do różnych zastosowań, w tym do badania interakcji wirus-gospodarz, testowania leków i modelowania chorób.

Wprowadzenie

Organoidy stały się solidnym i uniwersalnym narzędziem do modelowania in vitro rozwoju narządów oraz badania biologii i chorób. W przypadku hodowli w pożywce hodowlanej zdefiniowanej przez czynnik wzrostu, dorosłe komórki macierzyste (ASC) z różnych narządów mogą być namnażane w 3-wymiarowym (3D) i samoorganizujące się w przypominające narządy klastry komórkowe złożone z wielu typów komórek, zwanych organoidami. Laboratorium Cleversa poinformowało o wyprowadzeniu pierwszego organoidu pochodzącego z ASC, organoidu jelitowego ludzkiego, w 2009 roku1,2. Następnie organoidy pochodzące z ASC zostały stworzone dla różnych ludzkich narządów i tkanek, w tym prostaty3,4, wątroba5,6, żołądek7,8,9, trzcreas10, gruczoł sutkowy11, oraz płuco 12,13. Te organoidy pochodzące z ASC zachowały krytyczne właściwości komórkowe, strukturalne i funkcjonalne narządu rodzimego oraz zachowały stabilność genetyczną i fenotypową w hodowli długoterminowej ekspansji14,15.

Organoidy mogą być również pozyskiwane z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), w tym embrionalnych komórek macierzystych (ES) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS)16. Podczas gdy organoidy pochodzące z PSC wykorzystują mechanizmy rozwoju narządów do ich powstawania, ASC mogą być zmuszane do tworzenia organoidów poprzez odbudowę warunków, które naśladują niszę komórek macierzystych podczas fizjologicznej samoodnowy tkanek lub naprawy tkanek. Organoidy pochodzące z PSC są korzystnymi modelami do badania rozwoju i organogenezy, choć nie są w stanie osiągnąć porównywalnego poziomu dojrzewania organoidów pochodzących z ASC. Status dojrzewania podobny do płodu organoidów pochodzących z PSC i złożoność tworzenia tych organoidów znacznie uniemożliwiają ich szerokie zastosowanie w badaniu biologii i patologii w dojrzałych tkankach.

Drogi oddechowe człowieka, od nosa do końcowego oskrzelika, są wyściełane nabłonkiem dróg oddechowych, zwanym również pseudowarstwowym nabłonkiem rzęskowym, który składa się z czterech głównych typów komórek, tj. komórki rzęskowej, komórki kubkowej, komórki podstawnej i komórki maczugi. Stworzyliśmy organoid płuc ludzkich pochodzący z ASC z ludzkich tkanek płucnych we współpracy z lab12,13. Te organoidy płuc są kolejno namnażane w pożywce ekspansywnej przez ponad rok; Dokładny czas trwania różni się w zależności od różnych linii organoidów uzyskanych od różnych dawców. Jednak w porównaniu z natywnym nabłonkiem dróg oddechowych, te długotrwałe, rozszerzalne organoidy płuc nie są wystarczająco dojrzałe, ponieważ komórki rzęskowe, główna populacja komórek w ludzkich drogach oddechowych, są niedostatecznie reprezentowane w tych organoidach płuc. W związku z tym opracowaliśmy protokół różnicowania proksymalnego i wygenerowaliśmy organoidy dróg oddechowych 3D i 2D, które morfologicznie i funkcjonalnie fenokopiują nabłonek dróg oddechowych do poziomu zbliżonego do fizjologicznego.

Tutaj udostępniamy protokół wideo, który pozwala na uzyskanie organoidów ludzkich płuc z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzenie organoidów płuc i wywołanie różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of the University of Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 i UW21-695). Przed pobraniem tkanek uzyskano świadomą zgodę pacjentów.

1. Wyprowadzenie organoidu płuc człowieka

  1. Przygotowanie materiałów doświadczalnych
    1. Przygotuj podłoże podstawowe, uzupełniając zaawansowaną pożywkę DMEM/F12 o 2 mM glutaminy, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
    2. Przygotować pożywkę do ekspandowania organoidów płuc ludzkich, uzupełniając podłoże podstawowe 10% pożywką kondycjonowaną R-spondyną 1, 10% pożywką kondycjonowaną Noggin, 1x suplementem B27, 1,25 mM N-acetylocysteiny, 10 mM nikotynamidu, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng / ml fibroblistowego czynnika wzrostu (FGF)-7, 20 ng / ml FGF-10, i 100 μg/ml prymocyny (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Pożywkę kondycjonowaną R-spondyną 1 i Noggin można zastąpić komercyjną rekombinowaną R-spondyną 1 (500 ng / ml) i Noggin (100 ng / ml).
    3. Rozgrzej 24-dołkową płytkę do hodowli zawiesinowej w inkubatorze do hodowli komórkowych. Użyć standardowego inkubatora do hodowli komórkowych z 5% CO2 i nawilżoną atmosferą o temperaturze 37 °C. Rozmrozić matrycę piwniczną w lodówce o temperaturze 4 °C. Utrzymuj matrycę podstawową i pożywkę hodowlaną na lodzie podczas eksperymentowania.
  2. Izolacja komórek z ludzkich tkanek płucnych do hodowli organoidów 3D
    1. Pobieraj świeżo wycięte ludzkie tkanki płucne o wielkości około 0,5 cm od pacjentów, którzy przechodzą resekcję chirurgiczną z powodu różnych chorób. Tkanki płuc należy przetransportować w 30 ml podłoża podstawowego o temperaturze pokojowej i przetworzyć tak szybko, jak to możliwe, w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Tkanki płuc rozdrobnić na małe kawałki (0,5-1 mm) za pomocą sterylnego skalpela w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm. Przemyć kawałki tkanek 10 ml zimnego podłoża podstawowego w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 8 ml podłoża podstawowego uzupełnionego kolagenazą w końcowym stężeniu 2 mg/ml. Trawić kawałki tkanki, potrząsając probówką z prędkością 120 obr./min przez 30-40 min w temperaturze 37 °C.
    4. Pipetować w górę i w dół przez 20x, aby ścinać strawione kawałki tkanki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Ułóż sitko o wielkości 100 μm na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i przefiltruj zawiesinę.
    5. Odzyskaj kawałki tkanek na sitku z podłożem podstawowym i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, a następnie wykonaj drugą rundę ścinania i filtrowania. Dodatkowe ścinanie i filtrowanie można wykonać 1x-2x, aby wyizolować więcej komórek, zwłaszcza gdy pobierany jest mały kawałek tkanki (np. <0,5 cm).
    6. Dodać FBS do przepływu o końcowym stężeniu 2%, aby zakończyć trawienie, a następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml podłoża podstawowego, a następnie odwirować w sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    8. (Opcjonalnie) Jeśli w osadzie widocznych jest wiele erytrocytów (oszacowanych na podstawie koloru osadu), ponownie zawieś osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie dodać 10 ml podłoża podstawowego do probówki, a następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    9. Zawiesić osad w zimnej matrycy piwnicznej i trzymać na lodzie. Dodać 80-160 μl macierzy podstawnej dla komórek odzyskanych z tkanki płucnej o wielkości około 0,5 cm; Ilość wystarcza do wysiania 2-4 kropel.
    10. Dozować 40 μl zawiesiny do każdego dołka wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki do hodowli zawiesiny. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut. Pozwól, aby matryca piwnicy zestaliła się, tworząc kroplę.
    11. Dodać 500 μl pożywki do ekspandowania ludzkich organoidów płucnych uzupełnionej 5 nM hereguliny beta-1 do każdego dołka i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    12. Odświeżaj podłoże co 3 dni. Usuń stare podłoże, zachowując nienaruszoną kroplę i ostrożnie dodaj świeże podłoże. Pasaż organoidów po inkubacji przez 10-14 dni. Heregulinę beta-1 należy stosować tylko w początkowej hodowli przed pierwszym pasażem.
    13. Obserwuj organoidy pod mikroskopem, aby upewnić się, że organoidy nie są osadzone o bardzo dużej gęstości komórek. Jeśli kropelka rozpadnie się z powodu zbyt dużej gęstości komórek, odzyskaj i ponownie osadź organoidy i komórki o większej objętości macierzy podstawowej, aby wytworzyć więcej kropelek o niższej i pożądanej gęstości komórek.

2. Ekspansja organoidów płuc ludzkich

  1. Przygotuj pipetę Pasteura, spalając końcówkę pipety Pasteura na płomieniu, takim jak palnik Bunsena, aby zwęzić otwór o średnicy od 1,5 mm do około 1,0 mm. Ostudzić pipety, a następnie przeprowadzić sterylizację w autoklawie w celu sterylizacji. Zwilż pipety podłożem podstawowym, aby uniknąć przyczepiania się i utraty komórek podczas mechanicznego ścinania.
  2. Pasaż organoidów płucnych z mechanicznym ścinaniem
    1. Użyj końcówki o pojemności 1 ml i pipetuj w górę iw dół, aby rozbić otrzymane powyżej kropelki. Następnie przenieś organoidy wraz z pożywką do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dostosuj objętość do 10 ml zimnym podłożem podstawowym. Odrzucić sklarowany osad po odwirowaniu w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C
    2. Ponownie przemyć organoidy 10 ml zimnego podłoża podstawowego. Zawiesić organoidy w 2 ml zimnego podłoża podstawowego. Pipetować w górę i w dół, aby ścinać organoidy na małe kawałki za pomocą pipety Pasteura.
    3. Uzupełnić podłożem podstawowym do całkowitej objętości 10 ml, a następnie odwirować w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić fragmenty organoidów zimną matrycą podstawową wystarczającą do umożliwienia ekspansji 1:3 do 1:5. Trzymaj na lodzie.
    4. Umieścić 40 μl zawiesiny organoidów w każdym dołku wstępnie podgrzanej płytki 24-dołkowej. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut. Niech matryca piwnicy zestali się.
    5. Dodać 500 μl pożywki do ekspanderowania organoidów płucnych do każdej studzienki i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych. Odświeżaj podłoże co 3 dni. Organoidy należy przechodzić co 2 tygodnie w stosunku 1:3 do 1:5.
  3. Pasaż organoidów płucnych z trypsynizacją
    UWAGA: Trypsyna jest preferowana, gdy trudno jest ścinać organoid płuc na małe kawałki za pomocą pipety Pasteura lub rozmiar organoidów jest bardzo zmienny, lub późniejsze eksperymenty wymagają organoidów o bardziej jednolitym rozmiarze.
    1. Zebrać organoidy płuc, jak pokazano w kroku 2.2.1. Zawiesić organoid w 1 ml enzymu dysocjującego i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
    2. Dodać 1 ml podłoża podstawowego do probówki. Ścinać organoidy mechanicznie, pipetując organoidy w górę i w dół na małe kawałki za pomocą pipety Pasteura. Sprawdź rozmiar fragmentów organoidów pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu. Następnie dodaj 40 μl FBS, aby zakończyć trawienie.
      UWAGA: Określić wielkość fragmentów organoidów pod mikroskopem zgodnie z układem doświadczalnym. Jeśli eksperyment wymaga więcej organoidów lub organoidów o bardziej jednolitym rozmiarze, należy je rozciąć na mniejsze kawałki lub nawet pojedyncze komórki. Następnie mija więcej czasu, prawdopodobnie 3 tygodnie, zanim organoidy będą gotowe do eksperymentów.
    3. Uzupełnić podłożem podstawowym do końcowej objętości 10 ml, a następnie odwirować w sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić kawałki organoidów w zimnej matrycy podstawowej o objętości wystarczającej do przejścia w stosunku 1:5-1:10. Trzymaj na lodzie.
    4. Umieścić 40 μl zawiesiny organoidów w każdym dołku wstępnie podgrzanej płytki 24-dołkowej. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut. Niech matryca piwnicy zestali się.
    5. Uzupełnić 500 μl pożywki do ekspandowania organoidów płucnych na dołek i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych. Odświeżaj podłoże rozszerzające co 3 dni. Pasaż organoidów po 2-3 tygodniach.
      UWAGA: Około 100 organoidów jest zamontowanych w kropli 40 μl matrycy podstawowej. Organoidy płuc zwykle rosną lepiej przy stosunkowo dużej gęstości komórek. Ponownie osadź organoidy o mniejszej gęstości komórek, jeśli kropelki rozpadną się lub rosnące organoidy przyczepią się do siebie z powodu zbyt dużej gęstości komórek.

3. Różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

  1. Przygotować proksymalną pożywkę różnicującą (pożywkę PD), uzupełniając podstawową ośrodek granicy faz powietrze-ciecz 1x suplementem granicy faz powietrze-ciecz, 1x suplementem do konserwacji granicy faz powietrze-ciecz, 4 μg/ml heparyny, 1 μM hydrokortyzonu, 10 μM Y-27632 i 10 μM DAPT (patrz Tabela materiałów).
  2. Organoidy 3D dróg oddechowych
    1. Inkubować organoidy płuc w pożywce ekspansyjnej przez 7-10 dni po pasażowaniu za pomocą mechanicznego ścinania. Wymień nośnik rozprężny na nośnik PD. Inkubować organoidy w pożywce PD przez 14 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    2. Wyrzuć pożywkę PD z każdej studzienki. Dodać bufor lizatu komórkowego, aby zebrać zróżnicowany organoid dróg oddechowych w celu ekstrakcji RNA i wykrycia ekspresji genów komórkowych za pomocą testu RT-qPCR.
    3. Alternatywnie, inkubować organoidy w temperaturze 37 °C przez 60 minut po dodaniu 10 mM EDTA w celu rozdzielenia organoidów na pojedyncze komórki, a następnie przeprowadzić analizę metodą cytometrii przepływowej w celu zbadania populacji komórek. Organoidy są gotowe do różnych manipulacji eksperymentalnych.
  3. Organoid dróg oddechowych 2D
    1. Przygotuj wystarczającą ilość organoidów płuc 3D do hodowli różnicowania 2D. Łącznie 1,3 x 105 i 4,5 x 105 komórek są wymagane odpowiednio dla 24-dołkowej przepuszczalnej wkładki nośnej i 12-dołkowej przepuszczalnej wkładki nośnej.
    2. Po tym, jak organoidy płuc 3D rosną w pożywce ekspansywnej przez 2 tygodnie, trawią organoidy na pojedyncze komórki i wysiewają się do wkładek 24-dołkowych i 12-dołkowych, aby wytworzyć organoidy dróg oddechowych 2D.
    3. Wstępnie inkubować inserty z podłożem podstawowym przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Dodać 250 μl i 500 μl podłoża podstawowego odpowiednio do górnej i dolnej komory płytki 24-dołkowej. W przypadku płytki 12-dołkowej dodać 500 μl i 1 000 μl podłoża podstawowego odpowiednio do górnej i dolnej komory.
    4. Zbierz organoidy płuc 3D zgodnie z opisem w kroku 2.2.1. Zawiesić organoidy w 1 ml enzymu dysocjującego i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
    5. Dodać 1 ml podłoża podstawowego do probówki. Pigazuj w górę iw dół, aby ścinać organoidy na pojedyncze komórki za pomocą pipety Pasteura i sprawdzaj komórki pod mikroskopem. Następnie dodaj 40 μl FBS, aby zakończyć trawienie.
    6. Przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przefiltrowaną zawiesinę komórkową przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Uzupełnić podłożem podstawowym do całkowitej objętości 10 ml, a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Zawiesić osad zebrany z 24 kropelek (40 μl) w 1-2,5 ml pożywki do ekspandowania organoidów płucnych w zależności od gęstości komórek w kropelkach. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek pod mikroskopem. Dostosuj stężenie komórek do 1,3 x 106/ml (dla wkładek 24-dołkowych) lub 9 x 105/ml (dla wkładek 12-dołkowych).
    8. Usuń podłoże podstawowe z górnej i dolnej komory. Dodać 500 μl i 1 000 μl podłoża rozprężnego do dolnej komory odpowiednio wkładki 24-dołkowej i wkładki 12-dołkowej. Zasiewy 100 μl i 500 μl zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 3.3.7 umieścić w komorze wierzchołkowej odpowiednio wkładki 24-dołkowej i wkładki 12-dołkowej.
    9. Inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2 dni. Wymień pożywkę rozprężną na pożywkę wyładowań niezupełnych zarówno w komorze wierzchołkowej, jak i dolnej płytek. Inkubować organoidy w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 14 dni i odświeżać pożywkę PD co 3 dni.
      UWAGA: Ruchome rzęski są dostrzegalne w organoidach 3D i 2D pod mikroskopem od 7 dnia po inkubacji w pożywce PD. Po 14 dniach hodowli różnicującej w pożywce PD organoidy dróg oddechowych są dojrzałe do różnych manipulacji eksperymentalnych.
    10. Mierz przeznabłonkową rezystancję elektryczną (TEER) co drugi dzień za pomocą systemu pomiaru oporu elektrycznego zgodnie ze standardowym protokołem opisanym w17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia otrzymywanie ludzkich organoidów płuc z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Świeżą tkankę płuc człowieka sieka się na małe kawałki, a następnie trawi kolagenazą. Powstałe pojedyncze komórki osadza się w macierzy błony podstawnej i inkubuje w medium do ekspansji organoidów płuc uzupełnionym o koktajl czynników niszy w celu wzrostu nabłonkowych komórek macierzystych (krok 1.1.2). Rycina 1 przedstawia mikrofotografię świeżo wyizolowanych komórek płuc osadzonych w macierzy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ludzkie drogi oddechowe są wyściełane nabłonkiem dróg oddechowych, znanym również jako pseudostratyfikowany nabłonek rzęskowy. Główne typy komórek nabłonka górnych dróg oddechowych to komórki rzęskowe, które umożliwiają skoordynowany ruch ich rzęsek wierzchołkowych w celu wydalenia śluzu i wdychanych cząstek z dróg oddechowych, komórki kubkowe, które produkują i wydzielają śluz oraz komórki podstawne, które wyściełają błonę podstawną i biorą udział w regeneracji. W małych drogach oddechowych, takich jak oskrzeliki, prost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

J. Z., C. L. i M. C. C. są wymienieni jako wynalazcy w patencie na organoidy dróg oddechowych (publikacja nr: US-2021-0207081-A1). Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Centrum Nauk Panoromicznych i Jednostce Mikroskopu Elektronowego, Wydziałowi Medycyny Li Ka Shing, University of Hong Kong, za pomoc w obrazowaniu konfokalnym i cytometrii przepływowej. Prace te były częściowo wspierane przez fundusze z Funduszu Zdrowia i Badań Medycznych (HMRF, 17161272 i 19180392) Biura ds. Żywności i Zdrowia; Ogólny Fundusz Badawczy (GRF, 17105420) Rady ds. Grantów Badawczych; oraz Health@InnoHK, Komisja ds. Innowacji i Technologii, rząd Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkong.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do hodowli organoidów płuc
Advanced DMEM/F12Invitrogen
12634010-A8301Tocris2939500nM
B27 suplementInvitrogen17504-0441x
Cultrex Matryca błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu, typ 2 (BME 2)Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF-7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMAX (glutamina)Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 mM
Heregulina β-1Peprotech100-035 nM
N-AcetylocysteinaSigma-AldrichA91651,25 mM
NikotynamidSigma-AldrichN063610 mM
Noggin (pożywka warunkowa)domowej roboty- 10x
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 &mikro; g / ml
Rspondin1 (pożywka warunkowa)domowej roboty-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 &mikro; M
Y-27632Tocris12545 & mikro; M
proksymalny środek różnicujący
DAPTTocris263410 &mikro;
M Roztwór heparynyStemCell Technology79804 & mikro; g / ml
Roztwór podstawowy hydrokortyzonuTechnologia komórek macierzystych79251 i mikro; M
PneumaCult-ALI 10X Suplementuzupełniający interfejs powietrzno-cieczowy
PneumaCult-ALI Basal MediumStemCell Technology05001interfejs powietrza i cieczy podłoże podstawowe
PneumaCult-ALI Suplementinterfejsu cieczy powietrznej
Y-27632Tocris125410 µ M
Equipment
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoBaker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 lub 800Mikroskop konfokalnyZeiss
Inkubator CO2Thermo Fisher Scientific42093483
StereomikroskopOlympus CorporationCKX31SF
WirówkaEppendorf5418BG040397
Pipetor serologicznyEppendorf
ZEN black lub ZEN blue oprogramowanieOprogramowanie analityczne Zeiss
Consumables
12mm Trans-wellStemCell Technology#38023
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCellstar665970
15- i 50 ml stożkowe probówkiThermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCellstar662160
6.5mm Trans-wellStemCell Technology#38024
Medyczna jednostka filtrująca strzykawkę, 0,22 i mikro; mRurki do mikropipet Sigma-AldrichSLGPR33RB
Końcówki do mikropipet
Szkło do pipet PasteuraThermo Fisher Scientific22-378893
Pipety serologiczne (5 ml, 10 ml, 25 ml)Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
Przeciwciała
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Koza Anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Koza Anty-Królik Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
Kozia Anty-Szczur Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Mysz Anty-Cytokeratyna 5Abcamab128190
Mysz Anti-FOX J1Invitrogen14-9965-82
Mysz Anti-Mucin 5ACAbcamab3649
Mysz Anti-β-tubulina 4SigmaT7941
Królik Anti-p63Abcamab124762
Szczura Anty-Uteroglobina/CC-10R& Systemy DMAB4218-SP
strong>Inny odczynnik
TrypLE Select Enzyme (10X)Thermo Fisher ScientificA1217701enzym dysocjacyjny
konserwacyjny Suplement do konserwacji Micropipette Eppendorf Eppendorf Thermo Fisher Scientific TFLR140-200-Q21190531 <

Bibliografia

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  5. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  9. Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
  10. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  11. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  12. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  13. Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  16. Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
  17. Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
  18. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098(2015).
  19. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
  20. Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
  21. Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
  22. Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
  23. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  24. Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
  25. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
  26. Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
  27. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  28. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  29. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  30. Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
  31. Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508(2021).
  32. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  33. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  34. Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura organoid wnab onek dr g oddechowychizolacja kom rek macierzystychmacierz b ony podstawnejekspansja organoid wtypy kom rek nab onkowychanaliza RT qPCR
Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.