Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje indukcję monobakteryjnej sepsy Gram-ujemnej w systemie mysim. Model jest przydatny w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza podczas sepsy.

Streszczenie

Sepsa to rozregulowana odpowiedź immunologiczna gospodarza na inwazję drobnoustrojów lub uszkodzenie tkanek, prowadząca do uszkodzenia narządów w miejscu odległym od miejsca infekcji lub uszkodzenia. Obecnie szeroko stosowane mysie modele sepsy obejmują endotoksemię wywołaną lipopolisacharydem (LPS), podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP) oraz systemy modelowe infekcji monobakteryjnych. Protokół ten opisuje metodę badania odpowiedzi gospodarza podczas septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy. S. Typhimurium, Gram-ujemny patogen wewnątrzkomórkowy, powoduje chorobę brzuszną u myszy.

Ten protokół omawia przygotowanie hodowli, indukcję septycznego zapalenia otrzewnej u myszy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe oraz metody badania ogólnoustrojowych reakcji gospodarza. Ponadto przedstawiono ocenę obciążenia bakteryjnego w różnych narządach oraz analizę metodą cytometrii przepływowej podwyższonej liczby granulocytów obojętnochłonnych w płukaniu otrzewnowym. Salmonella Sepsa wywołana typhimurium u myszy prowadzi do wzrostu cytokin prozapalnych i szybkiego naciekania neutrofili w jamie otrzewnej, co prowadzi do krótszego przeżycia.

Każdy krok w tym protokole został zoptymalizowany, co zaowocowało wysoką powtarzalnością patogenezy septycznego zapalenia otrzewnej. Model ten jest przydatny do badania odpowiedzi immunologicznych podczas sepsy bakteryjnej, roli różnych genów w postępie choroby oraz wpływu leków łagodzących sepsę.

Wprowadzenie

Sepsa jest definiowana jako rozregulowana ogólnoustrojowa reakcja zapalna i immunologiczna na inwazję drobnoustrojów lub uszkodzenie tkanek, prowadząca do uszkodzenia narządu odległego od miejsca infekcji lub uszkodzenia. Wstrząs septyczny jest podgrupą sepsy charakteryzującą się niedociśnieniem utrzymującym się podczas resuscytacji objętościowej, ze znacznie zwiększonym ryzykiem śmiertelności¹. Opinia publiczna stała się bardziej świadoma tego zaburzenia podczas pandemii COVID-19. Pomimo wysokiej śmiertelności związanej z sepsą, ze względu na złożoność diagnozy brakuje kompleksowych danych epidemiologicznych na temat globalnego obciążenia sepsą. W 2017 roku na całym świecie odnotowano 48,9 miliona przypadków sepsy i 11 milionów zgonów, co stanowi 19,7% wszystkich zgonów na świecie². Co więcej, badanie dotyczące przedłużonego występowania infekcji i związanej z nią sepsy u pacjentów oddziału intensywnej terapii wykazało, że 62% pozytywnych izolatów od pacjentów to organizmy Gram-ujemne³.

Początkowo badania nad sepsą koncentrowały się na określeniu patogenezy drobnoustrojów. Jednak zrozumienie "hipotezy niebezpieczeństwa", która dyktuje, w jaki sposób gospodarz odróżnia siebie od nie-siebie, doprowadziło do przechylenia szali badań nad sepsą w kierunku zrozumienia reakcji gospodarza na atakujący patogen. Szeroko stosowane modele sepsy na myszach obejmują model endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem (LPS), modele sepsy wielodrobnoustrojowej, podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP) i stent ascendens zapalenia otrzewnej jelita grubego (CASP) oraz modele infekcji monobakteryjnych⁴.

Ustandaryzowaliśmy system modelu mysiego, wywołując sepsę otrzewnową za pomocą Salmonella Typhimurium. Ten model jest korzystny w stosunku do innych, ponieważ Salmonella Typhimurium jest patogenem wewnątrzkomórkowym, który naśladuje klinicznie istotny stan sepsy Gram-ujemnej. Wynik sepsy zapalenia otrzewnej w tym modelu jest ogólnoustrojowy, ze 100% śmiertelnością w ciągu 96 godzin po zakażeniu. Dlatego model ten odgrywa zasadniczą rolę w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza. W tym modelu sepsa jest wywoływana przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,5 miliona jednostek tworzących kolonie (CFU) Salmonella Typhimurium do 8-10-tygodniowej myszy C57BL/6. Zakażenie ogólnoustrojowe można potwierdzić poprzez ocenę obciążenia bakteryjnego narządów ~16 h po zakażeniu. W artykule przedstawiono posocznicę wywołaną przez Salmonella Typhimurium zapalenie otrzewnej u myszy, scharakteryzowano wynikające z tego zmiany w składzie komórek otrzewnej i określono ilościowo obciążenie bakteryjne w różnych narządach.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z użyciem Salmonella Typhimurium były prowadzone w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Należy zadbać o stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE), zapewnienie bezpieczeństwa oraz przestrzeganie standardowych metod utylizacji odpadów biologicznych poziomu BSL-2. Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalny Komitet Etyki ds. Zwierząt (Institutional Animal Ethics Committee) IISc. Myszy hodowano i utrzymywano w Centralnym Obiekcie dla Zwierząt IISc (numer rejestracyjny: 48/1999/CPCSEA z dnia 1/3/1999), za zgodą Ministerstwa Środowiska i Lasów Rządu Indii. Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Celu, Kontroli i Nadzoru nad Eksperymentami na Zwierzętach (Committee for Purpose and Control and Supervision of Experiments on Animals) pod numerem zezwolenia CAF/Ethics/797/2020.

Definicja BSL2: Poziom BSL2 oznacza, że czynniki biologicznie niebezpieczne stanowią umiarkowane zagrożenie dla środowiska oraz personelu laboratoryjnego⁵.

1. Przygotowanie hodowli Salmonella Typhimurium         

1. Do 3 mL bulionu Luria Bertani (LB) dodać 100 µL zamrożonego w glicerolu szczepu Salmonella Typhimurium NCTC 12023. Hodowlę inkubować przy 160 rpm w temperaturze 37 °C przez noc.
2. 50 µL hodowli nocnej w bulionie LB wysiać metodą smugową na płytkę z agarem Salmonella Shigella (SS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez ok. 12 h. Płytkę z agarem SS z koloniami bakterii przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed eksperymentem z infekcją in vivo.
3. Z wyseianej płytki z agarem SS pobrać pojedynczą kolonię za pomocą mikrokońcówki. Wyrzucić mikrokońcówkę do 3 mL bulionu LB i hodować przy 160 rpm w temperaturze 37 °C przez noc.
4. Do 50 mL bulionu LB dodać 0,1 mL hodowli bakteryjnej i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką przy 160 rpm przez 3-4 h, aż do osiągnięcia fazy logarytmicznej wzrostu. Hodowlę rozcieńczyć dwukrotnie bulionem LB.
   UWAGA: W fazie logarytmicznej komórki bakteryjne są w optymalnej kondycji i aktywnie się dzielą.
5. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) hodowli przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru lub czytnika mikropłytek. Po osiągnięciu OD 1,0 przygotować dwie alikwoty po 1 mL hodowli w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
6. Probówki wirować przy 7 750 × g przez 15 min. Odrzucić nadsącz i przemyć osad 1 mL 1x PBS (powtórzyć 2 razy). Probówki wirować przy 7 750 × g przez 15 min.
7. Osad resuspender w 0,5 mL 1x PBS w dwóch oddzielnych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Połączyć zawiesiny z obu probówek w jednej probówce 1,5 mL, która zawiera obecnie ok. 2 × 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL.
8. Przygotować zawiesinę komórek bakteryjnych o stężeniu 1 × 10⁶ CFU/mL poprzez rozcieńczenie tego roztworu zapasowego.
   OSTREŻENIE: Przed rozpoczęciem eksperymentów należy zoptymalizować wartość CFU odpowiadającą OD w konkretnych warunkach laboratoryjnych, aby określić liczbę CFU dla OD 1,0.

2. Myszy i infekcje

1. Mysz samce szczepu C57BL/6 w wieku 8–10 tygodni o masie ciała ok. 20 g utrzymuj przez kilka dni w pomieszczeniu z czystym powietrzem w zwierzęciu w celu aklimatyzacji.
2. W dniu infekcji należy utrzymać mysz jedną ręką, przemyć skórę brzucha 70% etanolem i rozsunąć tylne kończyny, aby zapewnić lepszy dostęp do powłoki brzusznej.
3. Wstrzyknąć 0,5 mL 1 × 10⁶ zawiesinę bakteryjną o stężeniu CFU/ml drogą dosytroniczną za pomocą strzykawki 1 ml. W związku z tym każda mysz otrzymuje 5 × 10⁵ CFU. Myszy kontrolne, niezinfekowane, otrzymują 0,5 ml samego PBS. Po infekcji należy wysiać kulturę na podłoże, aby sprawdzić faktyczną liczbę wstrzykniętych CFU, która może wynosić od 0,2 do 0,8 mln CFU/0,5 ml.
4. Umieść myszy z powrotem w klatkach zgodnie z przypisaniem.
5. Uśmierć myszy przy użyciu CO₂ uduszenie w ok. 12–18 h po zakażeniu dla uzyskania najlepszej odpowiedzi. Zazwyczaj wszystkie zakażone myszy giną w ciągu 96 h. W przypadku niektórych interwencji eksperymentalnych część myszy może przeżyć. Takie myszy należy poddać eutanazji po 96 h. Należy również poddać eutanazji każdą mysz z temperaturą ciała poniżej 33.2 °C or ostry stres w 96. godzinie jako humanitarny punkt końcowy.
   UWAGA: W tym modelu niektóre myszy mogą zacząć ginąć po 12 h od Salmonella wstrzyknięcie. Należy zatem odpowiednio zaplanować eksperymenty obejmujące wiele punktów czasowych.

3. Ocena CFU w organach

1. Uśmierć zakażoną mysz poprzez uduszenie CO₂, a następnie przemyj brzuch kawałkiem waty nasączonej 70% etanolem. Rozetnij skórę brzucha. W celu zapoznania się z protokołem wideo dotyczącym pobierania płynu z płukania otrzewnej, należy odwołać się do artykułu Raya i Dittela⁶. Rozetnij jamę otrzewną i pobierz interesujące organy do probówek typu microfuge. Dodatkowo, ponieważ krew u myszy z sepsą szybko krzepnie, a jej ilość jest niewielka, należy ją pobrać niezwłocznie po uśmierceniu zwierzęcia.
   UWAGA: Niniejsze wideo prezentuje oznaczanie liczby CFU w organach na przykładzie wątroby, ponieważ w tym modelu sepsy wątroba ulega rozległym uszkodzeniom histopatologicznym.
2. Wytnij mały fragment wątroby i umieść go w probówce typu microfuge.
   UWAGA: Fragment ten można przechowywać w lodzie przez maksymalnie 2-3 h przed przejściem do następnego kroku.
3. Zważ i przenieś fragmenty do probówek do mikrocentryfugi. W celu zapewnienia prawidłowej homogenizacji zaleca się wycinanie fragmentów o masie ~10-15 mg. W przypadku mniejszych organów, takich jak węzły chłonne krezkowe (MLNs) lub grasica, należy użyć całych organów.
4. Do probówki dodaj 0,5 mL 1x PBS i zhomogenizuj organy za pomocą homogenizatora ręcznego. Upewnij się, że organy zostały całkowicie zhomogenizowane. Uzupełnij objętość do 1 mL, dodając 0,5 mL 1x PBS.
5. Wiruj probówki z prędkością 200 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
6. Zbierz nadsącz do nowych probówek typu microfuge i przygotuj rozcieńczenia 1 × 10⁻¹ oraz 10⁻² na płytce 96-dołkowej.
7. Wyjałowuj 50 µL rozcieńczalnika na świeże płytki z agarem SS i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 12 h.
8. Policz liczbę kolonii, które pojawiły się w każdym wariancie, i znormalizuj dane względem masy organu, korzystając z równania (1):
   CFU/mg = (1)
   UWAGA: Liczba 20 w formule służy do przeliczenia liczby kolonii na płytce na CFU/mL. Wartość ta wynika z podzielenia 1 mL przez objętość wysianej kultury – w tym przypadku 50 µL.
   Na przykład, jeśli na płytce z agarem SS stwierdzono 100 kolonii, przy wysianiu 50 µL rozcieńczenia 1 × 10^-1 zhomogenizowanego organu o masie 10 mg, to
   CFU/mg =

4. Analiza cytometryczna przepływowa różnych populacji komórek odpornościowych w wysięku otrzewnowym

1. Należy zebrać komórki otrzewnej zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej przez Raya i Dittela⁶.
2. Osad komórkowy z płynu z płukania otrzewnej należy resuspender w 1 mL pożywki RPMI uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Całkowitą liczbę komórek w płynie z płukania otrzewnej należy określić za pomocą hemocytometru. Liczbę komórek należy dostosować tak, aby do każdej probówki trafiło 0,2-0,5 miliona komórek.
   UWAGA: Płyn z płukania otrzewnej u myszy z sepsą może zawierać erytrocyty (RBC), które prawdopodobnie pojawiają się wskutek krwawienia. Należy uważać, aby wykluczyć erytrocyty podczas liczenia komórek otrzewnej. W mikroskopie w świetle przechodzącym erytrocyty wydają się znacznie mniejsze niż komórki układu odpornościowego. Mają one postać płaskich dysków lub pączków, są okrągłe, z wgłębieniem w centrum, ale nie są puste w środku. Można dodać etap lizy erytrocytów⁷.
3. Komórki należy odwirować przy 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 min, odlać nadsącz i wyprać komórki 1x zimnym 1x PBS. Następnie komórki należy odwirować przy 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
4. Receptory Fc na PECs należy zablokować za pomocą blokera FcR (rozcieńczenie 1:400), przygotowanego w buforze blokującym składającym się z 5% FBS i 0,02% azotku sodu w PBS. Inkubować na lodzie przez 15 min.
5. Komórki należy odwirować przy 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Nadsącz należy odlać. Przeciwciała koniugowane z fluorochromem należy rozcieńczyć w buforze blokującym. Do barwienia neutrofili należy użyć rozcieńczenia 1:500 przeciwciał anti-mouse LY6G.
   UWAGA: Inne populacje komórek odpornościowych można również wykryć, stosując na przykład anti-mouse B220 dla limfocytów B, anti-mouse CD3 dla limfocytów T oraz anti-mouse F4/80 dla makrofagów.
6. Około 0,2 miliona komórek w 200 µL rozcieńczonych roztworów przeciwciał należy inkubować w osobnych probówkach. Jako kontrolę negatywną, dla każdego typu fluorochromu, należy odstawić jedną probówkę jako kontrolę niebarwioną, inkubując komórki w 200 µL buforu blokującego bez przeciwciał.
7. Próbki należy inkubować na lodzie przez 45 min, delikatnie mieszając poprzez stukanie co 15 min.
8. Komórki należy odwirować przy 200 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Nadsącz należy odlać. Jeśli komórki mają być przechowywane przez kilka dni, należy je utrwalić 4% paraformaldehydem przez około 15 min w temperaturze pokojowej. Zaleca się jednak pozyskanie danych z cytometru przepływowego z nowo zbarwionych próbek.
9. Komórki należy resuspender w 200 µL buforu do barwienia FACS (2% FBS w PBS). Następnie należy pozyskać dane za pomocą cytometru przepływowego.

Wyniki

Szczegółowa charakterystyka odpowiedzi immunologicznej gospodarza z wykorzystaniem tego konkretnego modelu została przedstawiona w poprzednich publikacjach^8,9. W tej sekcji przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników opisanego protokołu. Model ten ma na celu wywołanie systemowej infekcji S. Typhimurium poprzez wstrzyknięcie hodowli bakteryjnej do jamy otrzewnej w celu wywołania sepsy. Aby potwierdzić infekcję, lizaty wątroby i śledziony myszy z sepsą n...

Dyskusja

W artykule opisano metodę wywoływania ciężkiej postaci sepsy bakteryjnej poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie Salmonella Typhimurium. Ten model jest korzystny w stosunku do innych, ponieważ Salmonella Typhimurium jest patogenem wewnątrzkomórkowym, a zatem wysoce patogennym, naśladującym klinicznie istotny stan sepsy Gram-ujemnej. Wynik sepsy zapalenia otrzewnej w tym modelu jest ogólnoustrojowy, ze 100% śmiertelnością w ciągu 96 godzin po zakażeniu. Dlatego model ten odgrywa zasadniczą rolę w badaniu zapa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały eksploatacyjne
1 mL Sterylna strzykawka z igłą 26 G	Beckton Dickinson, Singapur	303060
1,5 ml probówka do mikrowirówek	Tarsons, USA	500010
10 ml sterylna strzykawka z igłą 21 G	Beckton Dickinson, Hiszpania	307758
50 ml kolba stożkowa	Tarsons, USA	441150
50 ml Stopniowa probówka	Tarsons, USA	546041
50 ml Stopniowa probówka wirówkowa	Tarsons, USA	546021
Rozsiewacz komórek	VWR, USA	VWRU60828-680
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	HiMedia, Bombaj, Indie	TS1006
Etanol	Merck	100983
bloker FcR	BD Biosciences	553142
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	10270-106
FITC Szczur anty-mysi Ly6G (klon 1A8)	BD Pharmingen	551460
Glicerol	Sigma-Aldrich	G9012
Ręczny homogenizator	-
hemocytometr (komora licząca Neubauera)	Rohem, Indie	I.S. 10269
Luria Bertani Broth	HiMedia, Bombaj, Indie	M1245
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
Petriplates	Tarsons, USA	460091
RPMI	Himedia, Bombaj, Indie	AT060-10X1L
Salmonella-Shigella Agar	HiMedia, Bombaj, Indie	M108
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002
Equipments
Wirówka	Kubota
	BD FACSverse
Inkubator	N-biotek
Spektrofotometr	Shimadzu
Maszyna do ważenia	Sartorius

wirówkowa Cytometr przepływowy