Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Sepsa jest definiowana jako rozregulowana ogólnoustrojowa reakcja zapalna i immunologiczna na inwazję drobnoustrojów lub uszkodzenie tkanek, prowadząca do uszkodzenia narządu odległego od miejsca infekcji lub uszkodzenia. Wstrząs septyczny jest podgrupą sepsy charakteryzującą się niedociśnieniem utrzymującym się podczas resuscytacji objętościowej, ze znacznie zwiększonym ryzykiem śmiertelności¹. Opinia publiczna stała się bardziej świadoma tego zaburzenia podczas pandemii COVID-19. Pomimo wysokiej śmiertelności związanej z sepsą, ze względu na złożoność diagnozy brakuje kompleksowych danych epidemiologicznych na temat globalnego obciążenia sepsą. W 2017 roku na całym świecie odnotowano 48,9 miliona przypadków sepsy i 11 milionów zgonów, co stanowi 19,7% wszystkich zgonów na świecie². Co więcej, badanie dotyczące przedłużonego występowania infekcji i związanej z nią sepsy u pacjentów oddziału intensywnej terapii wykazało, że 62% pozytywnych izolatów od pacjentów to organizmy Gram-ujemne³.

Początkowo badania nad sepsą koncentrowały się na określeniu patogenezy drobnoustrojów. Jednak zrozumienie "hipotezy niebezpieczeństwa", która dyktuje, w jaki sposób gospodarz odróżnia siebie od nie-siebie, doprowadziło do przechylenia szali badań nad sepsą w kierunku zrozumienia reakcji gospodarza na atakujący patogen. Szeroko stosowane modele sepsy na myszach obejmują model endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem (LPS), modele sepsy wielodrobnoustrojowej, podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP) i stent ascendens zapalenia otrzewnej jelita grubego (CASP) oraz modele infekcji monobakteryjnych⁴.

Ustandaryzowaliśmy system modelu mysiego, wywołując sepsę otrzewnową za pomocą Salmonella Typhimurium. Ten model jest korzystny w stosunku do innych, ponieważ Salmonella Typhimurium jest patogenem wewnątrzkomórkowym, który naśladuje klinicznie istotny stan sepsy Gram-ujemnej. Wynik sepsy zapalenia otrzewnej w tym modelu jest ogólnoustrojowy, ze 100% śmiertelnością w ciągu 96 godzin po zakażeniu. Dlatego model ten odgrywa zasadniczą rolę w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza. W tym modelu sepsa jest wywoływana przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,5 miliona jednostek tworzących kolonie (CFU) Salmonella Typhimurium do 8-10-tygodniowej myszy C57BL/6. Zakażenie ogólnoustrojowe można potwierdzić poprzez ocenę obciążenia bakteryjnego narządów ~16 h po zakażeniu. W artykule przedstawiono posocznicę wywołaną przez Salmonella Typhimurium zapalenie otrzewnej u myszy, scharakteryzowano wynikające z tego zmiany w składzie komórek otrzewnej i określono ilościowo obciążenie bakteryjne w różnych narządach.

Wszystkie eksperymenty z użyciem Salmonella Typhimurium zostały przeprowadzone w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Należy zachować ostrożność, aby używać odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), zapewnić bezpieczeństwo i postępować zgodnie ze standardowymi metodami usuwania zagrożeń biologicznych BSL-2. Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt, IISc. Myszy były hodowane i utrzymywane w Centralnym Zakładzie Zwierząt IISc (numer rejestracyjny: 48/1999/CPCSEA, z dnia 1/3/1999), zatwierdzonym przez Ministerstwo Środowiska i Leśnictwa rządu Indii. Protokoły doświadczalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Celu, Kontroli i Nadzoru Doświadczeń na Zwierzętach z zatwierdzonym zezwoleniem o numerze CAF/Ethics/797/2020.

Definicja BSL2: Ocena BSL2 oznacza, że czynniki stwarzające zagrożenie biologiczne stanowią umiarkowane zagrożenie dla środowiska i personelu laboratoryjnego⁵.

1. Przygotowanie hodowli Salmonella Typhimurium

1. Dodaj 100 μl bulionu glicerolowego Salmonella Typhimurium NCTC 12023 do 3 ml bulionu Luria Bertani (LB). Inkubować kulturę przy 160 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc.
2. Umieść 50 μl wyhodowanej przez noc kultury w bulionie LB na płytce agarowej Salmonella Shigella (SS) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez ~12 godzin. Przechowuj płytkę agarową SS z koloniami bakterii w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed eksperymentem z infekcją in vivo.
3. Wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej SS za pomocą mikrokońcówki. Wyrzuć mikrokońcówkę do 3 ml bulionu LB i posadź przez noc przy 160 obr./min w temperaturze 37 °C.
4. Dodać 0,1 ml kultury bakteryjnej do 50 ml bulionu LB i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką przy 160 obr./min przez 3-4 godziny, aby osiągnąć logarytmiczną fazę wzrostu. Rozcieńczyć kulturę 2-krotnie za pomocą bulionu LB.
   UWAGA: Podczas fazy logarytmicznej komórki bakteryjne są w najlepszym zdrowiu i aktywnie się dzielą.
5. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) kultury przy długości fali światła 600 nm w spektrofotometrze lub czytniku mikropłytek. Gdy OD osiągnie 1,0, wykonaj dwie porcje 1 ml kultury w 1,5 ml probówek do mikrofuge.
6. Odwirować probówki o masie 7 750 × g przez 15 minut. Odrzucić supernatant i przemyć osad 1 ml 1x PBS 2x. Odwirować probówki o stężeniu 7 750 × g przez 15 min.
7. Ponownie zawiesić granulat w 0,5 ml 1x PBS w dwóch różnych probówkach do mikrofug o pojemności 1,5 ml. Połącz zawiesiny z obu probówek w jedną probówkę o pojemności 1,5 ml, zawierającą teraz ~ 2 × 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml.
8. Przygotować zawiesinę komórek bakteryjnych o stężeniu 1 × 10⁶ jtk/ml, rozcieńczając ten roztwór podstawowy.
   UWAGA: Zoptymalizuj CFU odpowiadający OD w określonych warunkach laboratoryjnych, aby określić CFU dla OD 1.0 przed rozpoczęciem eksperymentów.

2. Myszy i infekcje

1. Trzymanie 8-10-tygodniowych samców myszy C57BL/6 o wadze ~20 g w pomieszczeniu z czystym powietrzem w obiekcie dla zwierząt przez kilka dni w celu aklimatyzacji.
2. W dniu infekcji przytrzymaj mysz jedną ręką, przetrzyj skórę brzucha 70% etanolem i rozłóż tylne nogi, aby uzyskać lepszy dostęp do ściany brzucha.
3. Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,5 ml zawiesiny bakteryjnej o stężeniu 1 × 10⁶ jtk/ml za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Dlatego każda mysz otrzymuje 5 × 10⁵ CFU. Kontrolnie, niezakażone myszy otrzymują 0,5 ml samego PBS. Po zakażeniu należy umieścić posiew na płytce, aby sprawdzić rzeczywistą wstrzykniętą jtkwięk, która może wahać się od 0,2 do 0,8 miliona CFU/0,5 ml.
4. Umieść myszy z powrotem w klatkach zgodnie z przypisaniem.
5. Poświęć myszy za pomocą uduszenia CO₂ ~ 12-18 godzin po infekcji, aby uzyskać najlepszą odpowiedź. Zwykle wszystkie zarażone myszy umierają w ciągu 96 godzin. W przypadku niektórych interwencji eksperymentalnych niektóre myszy mogą przeżyć. Poddaj te myszy eutanazji po 96 godzinach. Należy również poddać eutanazji każdą mysz z temperaturą ciała poniżej 33,2 °C i ostrym cierpieniem po 96 godzinach jako humanitarny punkt końcowy.
   UWAGA: W tym modelu niektóre myszy mogą zacząć umierać po 12 godzinach od wstrzyknięcia Salmonelli. Dlatego odpowiednio zaplanuj eksperymenty obejmujące wiele punktów czasowych.

3. Ocena narządów za pomocą CFU

1. Poświęć zainfekowaną mysz przez uduszenie CO₂ i przetrzyj brzuch kawałkiem bawełny zamoczonym w 70% etanolu. Rozetnij skórę brzucha. Zapoznaj się z artykułem Raya i Dittela, aby zapoznać się z protokołem wideo na temat zbierania płynu z płukania otrzewnowego⁶. Rozciąć jamę otrzewnej i zebrać interesujące nas narządy do probówek do mikrofuge. Dodatkowo, ponieważ krew u myszy z sepsą ulega szybkiej koagulacji, a jej ilości są niewielkie, należy ją szybko zebrać po złożeniu w ofierze.
   UWAGA: Ten film pokazuje wyliczenie narządu CFU z wątroby, ponieważ wątroba ulega rozległym uszkodzeniom histopatologicznym w tym modelu sepsy.
2. Wytnij mały kawałek wątroby i umieść go w probówce do mikrofuge.
   UWAGA: Można go przechowywać na lodzie maksymalnie przez 2-3 godziny przed przejściem do następnego kroku.
3. Zważ i przenieś kawałki do probówek do mikrowirówek. Najlepiej pokroić kawałki o wadze ~10-15 mg dla prawidłowej homogenizacji. Używaj całych narządów w przypadku mniejszych, takich jak węzły chłonne krezkowe (MLN) lub grasica.
4. Dodaj 0,5 ml 1x PBS do probówki i homogenizuj narządy za pomocą homogenizatora ręcznego. Upewnij się, że narządy są całkowicie homogenizowane. Uzupełnić objętość do objętości 1 ml, dodając 0,5 ml 1x PBS.
5. Odwirować probówki o stężeniu 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
6. Zebrać supernatant do świeżych probówek do mikrofuge i przygotować rozcieńczenia 1 × 10⁻¹ i 10⁻² na płytce 96-dołkowej.
7. Rozprowadzić 50 μl rozcieńczalnika na świeżych płytkach agarowych ze stali stalowej i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
8. Policz liczbę kolonii, które pojawiają się w każdym stanie i znormalizuj dane za pomocą masy narządu, korzystając z równania (1):
   CFU/mg = (1)
   UWAGA: Liczba 20 jest używana we wzorze do przeliczania kolonii na płytkę na CFU/ml. Liczbę tę uzyskuje się, dzieląc 1 ml przez ilość danej objętości platerowanej kultury - w tym przypadku 50 μl.
   Na przykład, jeśli 100 kolonii znajduje się na płytce agarowej SS, gdzie rozprowadza się 50 μl rozcieńczenia 1 × ^10-1 homogenizowanego narządu o wadze 10 mg, to
   CFU/mg =

4. Analiza cytometryczna przepływowa różnych populacji komórek odpornościowych w wysięku otrzewnowym

1. Zbierz komórki otrzewnej zgodnie z wcześniejszym opisem Raya i Dittela⁶.
2. Zawiesić osad komórkowy z płynu z płukania otrzewnowej w 1 ml RPMI uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Wylicz całkowitą liczbę komórek w płukaniu otrzewnej za pomocą hemocytometru. Dostosuj liczbę ogniw tak, aby każda rurka otrzymywała 0,2-0,5 miliona komórek.
   UWAGA: Płukanie otrzewnej u myszy z posocznicą może zawierać erytrocyty, które prawdopodobnie pojawiają się z powodu krwotoku. Uważaj, aby wykluczyć erytrocyty podczas liczenia komórek otrzewnej. W mikroskopie jasnego pola erytrocyty wydają się znacznie mniejsze niż komórki odpornościowe. Wyglądają one jak płaskie krążki lub pączki, okrągłe, z wgłębieniem pośrodku, ale nie puste. Krokiem do lizy RBC może być dodany⁷.
3. Odwirować komórki w temperaturze 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, wyrzucić supernatant i umyć komórki 1x 1x zimnym PBS. Odwirować komórki w temperaturze 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
4. Blokować receptory Fc na PEC za pomocą blokera FcR (rozcieńczenie 1:400), przygotowanego w buforze blokującym składającym się z 5% FBS i 0,02% azydku sodu w PBS. Inkubować na lodzie przez 15 minut.
5. Odwirować komórki w temperaturze 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant. Rozcieńczyć przeciwciała sprzężone z fluorochromem będące przedmiotem zainteresowania w buforze blokującym. Użyj rozcieńczenia anty-mysiego LY6G w stosunku 1:500, aby wybarwić neutrofile.
   UWAGA: Inne populacje komórek odpornościowych można również wykryć za pomocą, na przykład, anty-mysiej witaminy B220 dla komórek B, anty-mysiej CD3 dla limfocytów T i anty-mysiej F4/80 dla makrofagów.
6. Inkubować ~ 0,2 miliona komórek w 200 μl rozcieńczonych roztworów przeciwciał w oddzielnych probówkach. Jako kontrolę ujemną odłożyć jedną probówkę w każdym typie fluorochromu dla niebarwionej kontroli w celu inkubacji komórek z 200 μl buforu blokującego bez przeciwciała.
7. Próbki należy inkubować na lodzie przez 45 minut, przerywając stukanie co 15 minut.
8. Odwirować komórki w temperaturze 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez ~15 minut w temperaturze pokojowej, jeśli muszą być przechowywane przez kilka dni. Najlepiej jednak jest uzyskać dane ze świeżo wybarwionych próbek za pomocą cytometru przepływowego.
9. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego FACS (2% FBS w PBS). Uzyskaj dane w cytometrze przepływowym.

Szczegółowa charakterystyka odpowiedzi immunologicznej gospodarza przy użyciu tego konkretnego modelu jest pokazana w poprzednich publikacjach8,9. W tej sekcji przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników opisanego protokołu. Model ten ma na celu wywołanie ogólnoustrojowego zakażenia S. Typhimurium przez dootrzewnowe wstrzyknięcie kultury bakteryjnej w celu wywołania sepsy. Aby potwierdzić infekcję, lizaty wątroby i śledziony od myszy septycznych rozprowadzono na płytkach agarowych SS i policzono liczbę kolonii. W Rysunek 1, obrazy płytek agarowych SS wskazują obciążenie narządów CFU w wątrobie i śledzionie myszy sepistycznych. Homogenizowane lizaty narządowe rozprowadzono w rozcieńczeniu 1 × 10−1 i inkubowano w temperaturze 37 °C. Kolonie Typhimurium pojawiły się po ~12 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C. Ponadto, po zakażeniu myszy, posiewy z krwi i płukania otrzewnej są zgłaszane jako dodatnie dla komórek bakteryjnych8. Wyniki te wskazały, że komórki bakteryjne wstrzyknięte dootrzewnowo rozprzestrzeniały się ogólnoustrojowo i kolonizowały narządy wewnętrzne. Część płytki jest pokazana jako powiększona wstawka w celu podkreślenia kolonii. Patogen z powodzeniem rozprzestrzenił się ogólnoustrojowo i skolonizował narządy wewnętrzne.

Rysunek 2 pokazuje surowice wyizolowane od zdrowych i septycznych myszy. Objętość krwi do pobrania przez nakłucie serca od myszy septycznych wynosi zwykle 100-200 μL, czyli mniej niż u zdrowych myszy, gdzie można uzyskać ~500 μL krwi. W rezultacie objętość surowicy wyizolowanej z septycznej krwi myszy jest niska. Zjawisko to występuje z powodu zwiększonej krzepliwości krwi u myszy septycznych . Co więcej, surowice myszy septycznych wykazują wyraźne czerwone zabarwienie, co wskazuje na występowanie rozległej hemolizy8,9.

Jak pokazano w Rysunek 3, przeprowadzono immunofenotypowanie komórek wysięku otrzewnowej metodą cytometrii przepływowej w celu oceny infiltracji neutrofili w jamie otrzewnowej u zdrowych i septycznych myszy. Ponieważ neutrofile wyrażają białko LY6G na powierzchni komórki, do barwienia populacji komórek neutrofilów użyto przeciwciała anty-LY6G znakowanego FITC. Obrazy te reprezentują dane od jednej zdrowej i dwóch zainfekowanych myszy. Po pozyskaniu danych komórki zostały bramkowane tak, aby zawierały tylko pojedyncze punkty na wykresie FSC-A i SSC-A. Następnie narysowano wykresy histogramu i wykres kropkowy. Tutaj myszy septyczne wykazywały zwiększoną infiltrację neutrofili w jamie otrzewnej.

Rysunek 1: Wizualizacja CFU narządu po zakażeniu. Narządy poddano homogenizacji zgodnie z opisem w protokole. Lizat rozprowadzono na płytkach agarowych SS za pomocą rozsiewacza. Obrazy płytek rozsianych w rozcieńczeniu 1 × 10-1 homogenizowanych lizatów (A) wątroby i (B) śledziony. Część płyty jest pokazana jako powiększona wstawka w celu wyróżnienia kolonii. Powiększenie wstawkowe = 13x (obszar). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zwiększona hemoliza u myszy septycznych. Krew zebrano do probówek do mikrowirówek i pozostawiono w spokoju w temperaturze pokojowej na 30 minut. Skrzep usunięto przez odwirowanie probówek o masie 2000 × g przez 10 minut w wirówce z chłodzeniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Profilowanie populacji neutrofili metodą cytometrii przepływowej w płynie z płukania otrzewnej. Płyn z płukania otrzewnej pobrano 16 godzin po zakażeniu. Komórki otrzewnej wybarwiono przeciwciałem anty-LY6G znakowanym FITC. Myszy septyczne wykazywały zwiększoną infiltrację neutrofili w jamie otrzewnej. Skróty: FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; LY6G = locus G6D kompleksu antygenu limfocytów 6; SSC-A = obszar rozrzutu bocznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.