Artykuł metodologiczny

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

DOI:

10.3791/63704

⸱

25 kwietnia 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) okazały się ważnymi regulatorami komórkowymi (supresory nowotworów, czynniki proonkogenne) raka i przerzutów. Większość opublikowanych badań koncentruje się na pojedynczym miRNA podczas charakteryzowania roli małych RNA w raku. Jednak ~30% ludzkich genów miRNA jest zorganizowanych w zgrupowane jednostki, które często ulegają współekspresji, co wskazuje na złożony i skoordynowany system regulacji niekodującego RNA. Dokładniejsze wyjaśnienie, w jaki sposób zgrupowane sieci miRNA działają wspólnie w celu regulacji wzrostu guza, agresywności raka i oporności na leki, jest wymagane przed translacją niekodujących małych RNA do kliniki.

Użycie procedury edycji genów za pośrednictwem CRISPR (ang. high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats) zostało wykorzystane do zbadania onkogennej roli genomowego klastra siedmiu genów miRNA zlokalizowanych w locus o długości ~35 000 pz w kontekście raka prostaty. W tym celu ludzkie linie komórkowe raka zostały zakażone wektorem lentiwirusowym dla indukowanej doksycykliną (DOX) nukleazy Cas9 hodowanej w pożywce zawierającej DOKS przez 48 godzin. Komórki zostały następnie poddane jednoczesnej trans aktywującemu CRISPR RNA (tracrRNA) skompleksowanemu z genomowymi oligonukleotydami CRISPR RNA (crRNA), aby umożliwić szybkie generowanie linii komórek rakowych niosących całą delecję klastra miRNA oraz indywidualne lub kombinacje delecji klastrów genów miRNA w ramach jednego eksperymentu.

Zaletą tego wysokoprzepustowego systemu edycji genów jest możliwość uniknięcia czasochłonnego subklonowania wektorów DNA, elastyczność w transfekowaniu komórek unikalnymi kombinacjami przewodników RNA w formacie 24-dołkowym oraz niższe koszty genotypowania PCR przy użyciu surowych lizatów komórkowych. Badania wykorzystujące to uproszczone podejście obiecują odkrycie funkcjonalnych redundancji i synergicznych/antagonistycznych interakcji między członkami klastra miRNA, co pomoże w scharakteryzowaniu złożonych małych niekodujących sieci RNA zaangażowanych w choroby ludzkie i lepiej wpłynie na przyszły projekt terapeutyczny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potrzebne są lepsze narzędzia badawcze, aby zbadać wpływ niekodujących RNA na choroby ludzkie. Rozregulowanie MiRNA jest często obserwowane w zaburzeniach u ludzi, takich jak rak, porównując profile ekspresji tych małych niekodujących RNA w tkankach i płynach ustrojowych (np. krwi, moczu) pacjentów z rakiem w porównaniu z osobami zdrowymi, nienowotworowymi, z zastosowaniem mikromacierzy, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i technologii głębokiego sekwencjonowania nowej generacji1,2. Ostatnie prace scharakteryzowały duży podzbiór tych miRNA jako czynniki supresorowe, onkogenne i przerzutowe, które kontrolują tworzenie się guza, postęp choroby i oporność na leki. Eksperymentalna nadekspresja i/lub regulacja w dół/utrata miRNA powoduje funkcjonalne i plejotropowe konsekwencje w komórce, odzwierciedlając szeroki zakres działań związanych z rakiem, które te niekodujące RNA koordynują - wzrost, apoptoza, różnicowanie, przebudowa chromatyny, angiogeneza, przejścia nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) i MET, metabolizm i odpowiedź immunologiczna3.

MiRNA są kodowane jako pojedyncze geny lub znajdują się w klastrach genomowych, które są transkrybowane w jądrze i intensywnie przetwarzane przed wygenerowaniem biologicznie dojrzałych, jednoniciowych ~22 nukleotydów (nt) gatunków miRNA zlokalizowanych w cytoplazmie4. Te małe RNA wywierają swoje działanie po transkrypcji i działają jako ujemne regulatory genów, które wiążą się z celami informacyjnego RNA (mRNA) w sposób specyficzny dla sekwencji, aby doprowadzić katalityczny kompleks wyciszający indukowany RNA (RISC) do miejsca mRNA, co powoduje degradację mRNA i / lub blok translacji białek. MiRNA są niezwykle liczną klasą niekodujących RNA w układach zwierzęcych, a 2,654 dojrzałe miRNA istnieją w ludzkim genomie (miRBase release 22.1)5. MiRNA zazwyczaj wiążą się z niepełną komplementarnością do swoich celów mRNA4. Dlatego pojedyncze miRNA może regulować dziesiątki do setek różnych celów mRNA i funkcjonalnie wpływać na szeroki zakres szlaków biologicznych. Aby zwiększyć złożoność mechanizmów opartych na miRNA, pojedyncze mRNA może być regulowane przez wiele odrębnych miRNA. W związku z tym trudno jest zbadać, w jaki sposób dysregulacja miRNA zaburza równowagę homeostatyczną organizmu i prowadzi do nowotworu złośliwego u ludzi.

Większość opublikowanych badań skupiała się na pojedynczym miRNA podczas charakteryzowania ich roli w zdarzeniach chorobotwórczych. Jednak ~30% ludzkich genów miRNA jest zorganizowanych w zgrupowane jednostki (zwykle ~10 kilozasad [kb]), które często są transkrybowane w tej samej orientacji i współwyrażane, co wskazuje na skoordynowany i złożony system regulacji niekodującego RNA6. Największym policistronicznym klastrem ludzkich miRNA jest klaster 14q32 składający się z 54 prekursorów miRNA. Jedną z najlepiej przebadanych zgrupowanych jednostek miRNA związanych z nowotworami u ludzi jest policistroniczny klaster miR-17-92 składający się z miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 i miR-92-1 znajdujących się w intronie 3 niekodującego RNA, c13orf25. Klaster miR-17-92 jest często amplifikowany w nowotworach układu krwiotwórczego i nadeksprymowany w guzach litych i ma ustaloną rolę onkogenną w promowaniu progresji cyklu komórkowego, apoptozy i angiogenezy7. Ponadto supresyjny klaster miR-15a i miR-16-1 zlokalizowany w intronie niekodującego genu Leu2 jest często deleczowany w białaczkach i regulowany w dół w dużym zakresie nowotworów, działając w celu blokowania wzrostu guza poprzez celowanie w gen antyapoptotyczny BCL2 i dodatkowe geny progresji cyklu komórkowego8. Klaster miR-888 jest podwyższony u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego o wysokim stopniu złośliwości i składa się z siedmiu genów miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b i -891a) zlokalizowanych na ludzkim chromosomie Xq27.39,10.

Klaster miR-888 mapuje się w locus HPCX1 (Dziedziczny rak prostaty, X-linked 1) obejmujący Xq27-2, który został zidentyfikowany przez analizę powiązań dziedzicznych rodowodów rodziny raka prostaty11,12,13,14,15,29. Charakterystyka funkcjonalna poszczególnych zgrupowanych członków miR-888 przy użyciu konwencjonalnych narzędzi do błędnej ekspresji miRNA - mimimiki miRNA i inhibitory antysensu - wykazała, że te miRNA odgrywają nakładające się role w regulacji wzrostu i inwazji guza prostaty9,10. Jednak te eksperymentalne metody nie nadają się łatwo do badania, w jaki sposób wiele zgrupowanych członków miR-888 działa synergistycznie lub antagonistycznie w niekodującej sieci RNA w celu kontrolowania homeostazy tkanek i progresji raka. Ten opisany, uproszczony protokół wykorzystujący wysokoprzepustową technologię edycji genów CRISPR jest modyfikowany w celu molekularnej analizy klastrów miRNA związanych z ludzkimi nowotworami (np. klaster miR-888), aby wypełnić tę lukę w wiedzy.

Bakteryjne geny CRISPR i związane z CRISPR (cas) pośredniczą w odporności adaptacyjnej przeciwko bakteriofagom16. Odkrycie tego starożytnego systemu nadzoru prokariotycznego zostało szybko zaadaptowane jako skuteczne narzędzie naukowe do łatwego namierzania dowolnego pożądanego locus genomowego i dokonywania zmian w sekwencji DNA w szerokim zakresie układów zwierzęcych i typów komórek, zarówno in vitro, jak i in vivo16,17. Technika ta jest bardzo obiecująca jako skuteczna metoda badania sieci miRNA w kontekście chorób u ludzi. W tym celu ten wysokoprzepustowy protokół edycji genów CRISPR do badania klastra miR-888 o długości ~ 35 kb na ludzkim chromosomie X w unieśmiertelnionych ludzkich liniach komórkowych raka prostaty (LNCaP, PC3-ML) został skonstruowany w celu zbadania, w jaki sposób członkowie klastra koordynują szlaki progresji raka. Podejście to można zastosować do scharakteryzowania dowolnego klastra miRNA i pozwala badaczom szybko wygenerować ludzkie linie komórkowe przenoszące całą delecję klastra miRNA oraz indywidualne i kombinowane delecje klastrów genów miRNA w ramach jednego eksperymentu.

W tej procedurze tworzone są stabilne linie komórkowe z indukowanym doksycykliną (DOX) systemem ekspresji lentiwirusowej, który umożliwia badaczowi kontrolowanie ekspresji genu Cas9 (csn1) związanego z CRISPR Streptococcus pyogenes za pomocą konstytutywnego promotora indukowanego przez DOX TRE3G. Dwudzielny system Tet-On 3G obejmuje konstytutywny promotor ludzkiego czynnika wydłużenia 1 alfa (hEF1alpha), który napędza transkrypcję zarówno genu Tet-On 3G, jak i genu oporności na blastycydynę (BlastR) jako transkryptu bicystronicznego. Białko transaktywatora Tet-On 3G wiąże się z promotorem TRE3G tylko w obecności DOX, co skutkuje solidną transkrypcją Cas9. W przypadku braku DOX nie ma podstawowej ekspresji Cas9 lub jest ona bardzo minimalna. W związku z tym badacz może indukować wysoką produkcję białka Cas9 w komórkach hodowanych w pożywkach uzupełnionych DOX podczas etapów edycji genu CRISPR i kontroli szybkiego usuwania białka CAS9 po wycofaniu DOX.

Ten protokół opisuje również projekt syntetycznych oligonukleotydów CRISPR RNA (crRNA) ukierunkowanych na regiony flankujące całe skupisko miRNA, poszczególne regiony spinki do włosów miRNA (premiRNA) i/lub podzbiory genów miRNA w klastrze. Każdy zaprojektowany crRNA zawiera unikalną 5'-końcową sekwencję prowadzącą 20 nt (komplementarną do sekwencji genomowej, która ma być celem ataku), po której następuje niezmienna sekwencja powtórzeniowa 22 nt S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3'), która umożliwia parowanie zasad z uniwersalnymi oligonukleotydami CRISPR RNA (tracrRNA) aktywującymi trans (tracrRNA)18. Razem, wyżarzone crRNA i tracrRNA (mieszany stosunek 1:1) działają jako przewodnik RNA dla tego protokołu (Rysunek 1A). W każdym eksperymencie dwa syntetyczne przewodnikowe RNA są transfekowane do komórek indukowanych przez DOX w celu powiązania i eskortowania bakteryjnego białka Cas9 do miejsc genomowego DNA (5' i 3') flankujących region klastra miRNA przeznaczony do usunięcia (Figura 1B).

Sekwencja motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) (5'-NGG-3' dla dzikiego typu S. pyogenes Cas9) musi być obecna w genomie komórki i znajdować się bezpośrednio obok sekwencji DNA 20 nt, na którą wskazuje przewodnik RNA17. Sekwencja PAM służy jako sygnał wiążący i pozycjonuje region katalityczny enzymu endonukleazy Cas9 w docelowym miejscu genomowego DNA, prowadząc następnie do skierowanego, dwuniciowego (ds) rozszczepienia DNA zlokalizowanego ~ 3 nt przed PAM. Maszyneria naprawy DNA komórki naprawia rozszczepione końce DNA, co może skutkować doskonałą ligacją, ale często dochodzi do niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), powodując małe insercje lub delecje (indele) w miejscu naprawy. Ponieważ miRNA są niekodującymi genami, często zlokalizowanymi w regionach międzygenowych i intronowych, indele te niosą ze sobą niskie ryzyko powstania niepożądanych mutacji nonsensownych/missense.

Poprzez zastosowanie syntetycznych oligonukleotydów RNA (wyżarzonych crRNA i tracrRNA, stosunek molowy 1:1) kodujących dla prowadzącego kompleksu RNA w tych eksperymentach, ta strategia nokautu genów pozwala uniknąć czasochłonnego subklonowania wektorów DNA i pozwala na ogromną elastyczność w transfekowaniu unikalnych kombinacji przewodnika RNA do komórek w formacie 24-dołkowym. Przygotowanie surowych lizatów komórkowych do badań przesiewowych genotypu PCR pozwala również uniknąć kosztownych i czasochłonnych metod oczyszczania DNA, umożliwiając jednocześnie usprawnienie generowania linii komórkowych pojedynczej kolonii i analizy fenotypowej. Rzeczywiście, ten wysokoprzepustowy protokół edycji genów CRISPR został z powodzeniem wykorzystany do transfekcji hodowanych linii komórkowych raka prostaty (LNCaP, PC3-ML) z 32 unikalnymi kombinacjami przewodnika RNA w jednym eksperymencie i generowania linii nokautujących niosących delecje dla całego regionu klastra miR-888 o wielkości ~35 kb; mniejsze kombinacje delecji dla członków klastra miR-888 należących do rodzin miR-743 i miR-891a; a także delecje dla poszczególnych członków miRNA w klastrze miR-888. Badania takie jak te dostarczą jaśniejszego zrozumienia, w jaki sposób zgrupowane miRNA działają wspólnie w celu regulacji wzrostu guza, agresywności i oporności na leki, zanim przetłumaczą miRNA na praktykę kliniczną jako narzędzia terapeutyczne i diagnostyczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie do edycji genów CRISPR i projektowanie przewodnika RNA do generowania linii komórkowych nokautujących klastry miRNA

  1. Utwórz plik DNA zawierający pełną sekwencję genomową interesującego regionu klastra miRNA (międzygenowego, intronicznego) i co najmniej 1 kB otaczających regionów genomu za pomocą oprogramowania do adnotacji sekwencji DNA19.
    1. Użyj narzędzia do edycji cech w utworzonym pliku DNA, aby oznaczyć docelowe locus klastra miRNA (międzygenowe, introniczne) i każdą pojedynczą sekwencję spinki do włosów miRNA należącą do klastra miRNA, a także zanotować inne pobliskie geny kodujące i niekodujące i/lub cechy regulatorowe5,20,21,22.
    2. Upewnij się, że regiony miRNA przeznaczone do delecji nie zakłócają przypadkowo pobliskich genów kodujących białka, genów niekodujących lub ważnych regulatorowych elementów DNA.
      UWAGA: Weź pod uwagę złożoność genomu (np. duplikacje/fuzje chromosomów) linii komórkowej użytej w tym protokole.
  2. Zaprojektuj syntetyczne crRNA ukierunkowane na 20 nt sekwencji genomowego DNA otaczającej cały klaster miRNA, poszczególne regiony spinki do włosów miRNA (pre-miRNA) i/lub podzbiory genów miRNA w klastrze za pomocą bioinformatycznego narzędzia do projektowania RNA (np. 23). Upewnij się, że odpowiedni enzym Cas9 jest zapisany w narzędziu do projektowania przewodnika RNA (tj. S. pyogenes Cas9).
    UWAGA: Zsyntetyzowany crRNA będzie zawierał tę unikalną 5'-końcową sekwencję prowadzącą 20 nt (komplementarną do celu DNA), po której nastąpi niezmienna sekwencja powtórzeń 22 nt S. pyogenes, aby umożliwić parowanie zasad ze zsyntetyzowanym uniwersalnym oligonukleotydem tracrRNA. Wyżarzone razem będą pełnić funkcję przewodnika RNA w tym protokole.
    1. Odwołując się do utworzonego pliku DNA (Krok 1.1.), wprowadź ~150 nt sekwencji DNA znajdującej się bezpośrednio przed (5') lub za (3') locus spinki do włosów/klastra miRNA przeznaczonego do delecji w narzędziu oprogramowania do projektowania RNA przewodnika bioinformatycznego23.
      UWAGA: Narzędzie do projektowania zidentyfikuje unikalne sekwencje 20 nt dla projektu oligonukleotydu crRNA, które znajdują się bezpośrednio w sąsiedztwie sekwencji PAM (na niedocelowej nici DNA) (np. Sekwencja S. pyogenes Cas9 PAM NGG). Poniżej przedstawiono przykład projektu crRNA ukierunkowanego na miejsce bezpośrednio przed (5') locus genu mir-891a (w szczególności 5A(891a) omówionego w sekcji reprezentatywnych wyników i tabeli 1).
      1. Otwórz narzędzie do projektowania RNA23.
      2. Wprowadź nazwę 5A(891a) w oknie Wprowadź nazwę.
      3. W oknie Wprowadź sekwencję DNA wprowadź 150 nt sekwencji genomowej znajdującej się bezpośrednio przed (5') genem prekursorowym mir-891a: 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCTCT-3'
      4. Zaznacz pole Włącz sprawdzanie swoistości, aby wykluczyć witryny niedocelowe wykryte obliczeniowo przez program. Wybierz odpowiedni organizm (np. człowieka [Homo sapiens]).
      5. Określ prawidłowy enzym Cas9 PAM zastosowany w badaniach, w tym przypadku Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, aby wygenerować następujące ustawienia domyślne: PAM względem celu: Po; Powtórz sekwencję: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; W stosunku do przewodnika: 3; Docelowa długość sekwencji: 20; Cięcie względem celu 5' startu: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Kliknij przycisk Dalej, aby wyświetlić wyniki syntetycznej syntezy crRNA.
        UWAGA: W tym przykładzie sugerowane crRNA do syntezy rozpozna cel DNA ATACATGCTGATAGTTACAC i będzie zlokalizowane w sąsiedztwie PAM:AGG.
    2. Odwołaj się do pliku DNA (utworzonego w kroku 1.1) w celu określenia najlepszych kandydujących sekwencji docelowych crRNA 20 nt, które znajdują się najbliżej locus miRNA, które mają zostać usunięte i mają najwyższą swoistość dla zamierzonego celu genomowego.
      1. Użyj narzędzi do obliczeniowej analizy poza ukierunkowaniem, aby ocenić potencjalną swoistość crRNA i przewidzieć potencjalne miejsca niedocelowe w loci genomu niezwiązanych z docelowym regionem zainteresowania klastra miRNA (np. 24,25,26,27).
      2. Zapisz potencjalne wyniki poza celowaniem do późniejszego wykorzystania podczas genotypowania linii komórek klonalnych CRISPR pojedynczej kolonii metodą PCR (krok 4.2.6.).
        UWAGA: Zakres komplementarności sekwencji dzielonej między zaprojektowanym oligonukleotydem crRNA a genomową sekwencją docelową będzie dyktował, jak selektywnie enzym Cas9 rozszczepia genom w tym locus. Ponieważ przewodnik RNA wygrzewa się do celu genomowego w kierunku od 3 'do 5', niedopasowania na końcu 5' docelowej sekwencji DNA (pierwsze 8-10 zasad) często blokują rozszczepienie, w którym pośredniczy Cas9. Jeśli genomowa sekwencja docelowa ma homologię z innym locus genomowym, z wyjątkiem pierwszych ośmiu zasad sekwencji DNA, przewiduje się, że ten przewodnik RNA będzie miał niską szansę na przesunięcie w tym miejscu.
      3. Zaprojektuj cztery unikalne crRNA dla każdego docelowego locus miRNA: dwa zaprojektowane crRNA do celowania w komplementarne sekwencje DNA bezpośrednio 5' spinki / klastra miRNA (5'A, 5'B) i dwa zaprojektowane crRNA do celowania w komplementarne sekwencje DNA natychmiast 3' spinki / klastra miRNA (3'A, 3'B).
        UWAGA: Podczas wykonywania transfekcji CRISPR (w sekcji 3) cztery możliwe kombinacje par przewodnikowych RNA 5' i 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) zostaną przetestowane dla każdego docelowego locus miRNA, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wygenerowania udanych delecji locus miRNA w jednym eksperymencie.
      4. Użyj narzędzia do edycji cech w utworzonym pliku DNA (Krok 1.1.), aby oznaczyć docelową sekwencję DNA (z sąsiednim PAM) dla każdego zaprojektowanego crRNA do syntezy.
  3. Zaprojektuj i zsyntetyzuj startery PCR (do przodu, do tyłu) flankujące docelowe regiony klastra miRNA w celu genotypowania linii komórkowych CRISPR (i oznacz startery w utworzonym pliku DNA).
    1. W przypadku genotypowania linii komórkowych niosących małe delecje genomowe dla ściśle zgrupowanych lub pojedynczych miRNA, należy zaprojektować startery PCR (do przodu, do tyłu) znajdujące się około 150 pz po każdej stronie miejsca cięcia/regionu nokautu Cas9, które umożliwią wykrycie zarówno fragmentów DNA typu dzikiego (~600 pz), jak i nokautującego (~300 pz) w pojedynczej reakcji PCR za pomocą elektroforezy żelowej.
    2. W przypadku genotypowania linii komórkowych niosących duże delecje genomowe dla kombinacji prekursorów miRNA lub całego klastra miRNA, ponownie zaprojektuj startery PCR (do przodu, do tyłu) znajdujące się około 150 pz po każdej stronie miejsca cięcia/nokautu Cas9. Należy pamiętać, że jeśli docelowa delecja klastra miRNA ma długość >4 kb, reakcja PCR prawdopodobnie wykryje tylko mniejszy (~ 300 pz) fragment DNA z nokautem, ale nie fragment DNA typu dzikiego. Dlatego należy zaprojektować dodatkowe startery PCR (do przodu, do tyłu), które mogą wykryć obecność lub brak wewnętrznych genów klastra miRNA, aby wspomóc proces badań przesiewowych i zweryfikować homozygotyczne linie komórkowe nokautu.

2. Generowanie stabilnych linii komórkowych lentiwirusowych przenoszących indukowaną przez DOX kasetę ekspresji Cas9

UWAGA: Wykonuj wszystkie prace związane z hodowlą komórek i wirusami w certyfikowanym kapturze bezpieczeństwa biologicznego, korzystając z procedur BSL2 i techniki aseptycznej.

  1. Określ odpowiedni typ linii komórkowej do badań CRISPR i preferowane podłoża wzrostowe.
    UWAGA: Protokół ten został opracowany dla linii komórkowych ludzkiego raka prostaty LNCaP (preferowane podłoże: RPMI, 10% płodowa surowica bydlęca [FBS]) i PC3-ML (preferowane podłoże: DMEM, 10% FBS).
  2. Wykonaj krzywą "śmierci" blasticydyny, aby określić optymalne stężenie leku do wyboru dla komórek zakażonych lentiwirusem przenoszących kasetę genu oporności na blastidynę (krok 2.3.).
    1. Umieść komórki w 11 dołkach na 24-dołkowej płytce i rosną w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w preferowanym podłożu do około 75% konfluencji.
    2. Rozcieńczyć blasticydynę (zapas roboczy 1 mg/ml) w preferowanym podłożu o stężeniu końcowym w zakresie od 0,1 do 10 μg/ml i rozcieńczyć w odstępach co 1 μg/ml.
    3. Oznacz dołki 24-dołkowej płytki z nasionami od 1 do 11. Usuń pożywkę wzrostową ze studzienek i zastąp ją odpowiednimi stężeniami blasticydyny.
    4. Zmieniaj pożywkę o odpowiednich stężeniach blasticydyny co drugi dzień przez 7-10 dni.
    5. Badaj komórki codziennie w czasie trwania i określ minimalne stężenie blasticydyny wymagane do zabicia wszystkich komórek w ciągu 5-7 dni.
      UWAGA: Krzywa "zabijania" blasticydyny będzie musiała zostać wykonana dla każdej konkretnej linii komórkowej użytej do eksperymentów z edycją genów CRISPR.
  3. Zainfekować komórki lentiwirusem przenoszącym indukowaną przez DOX kasetę ekspresji Cas9 i przeprowadzić selekcję blasticydyny przy użyciu optymalnego stężenia określonego w kroku 2.2.
    1. W trzech dołkach 6-dołkowej płytki wysiewać od 5 ×10 4 komórek do dołka i rosnąć w preferowanym podłożu w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc (ON).
    2. Następnego dnia rozmrozić na lodzie wektor ekspresyjny lentiwirusa dla indukowanego przez DOX Cas9 (Lenti-iCas9). Delikatnie wymieszać (nie wirować cząsteczek wirusa).
      UWAGA: Przechowuj lentiwirusa w porcjach w temperaturze -80 °C, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania, co zmniejszy miano wirusa i skuteczność infekcji.
    3. Obliczyć objętość potrzebną do transdukcji 5 × 104 komórek z wirusem przy wielokrotności infekcji 0,3 (MOI = 0,3) na podstawie stężenia miana wirusa.
    4. Odpipetować odpowiednią objętość wirusa do 250 μl (na studzienkę) preferowanej pożywki bez surowicy i antybiotyków, uzupełnionej 0,8 μg/ml bromku heksadimetryny. Delikatnie wymieszaj.
      UWAGA: Bromek heksadimetryny jest polimerem kationowym, który zwiększa adsorpcję wirusa i skuteczność infekcji.
    5. Usuń nośnik. Dodać 250 μl przygotowanej pożywki transdukcyjnej z wirusem Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) do komórek i inkubować ON w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . (Skróć czas inkubacji do 4-6 godzin, jeśli komórki wykazują toksyczne działanie związane z wirusem.)
    6. Zastąp pożywkę świeżą preferowaną pożywką i pozwól komórkom zregenerować się przez 1-2 dni.
    7. Przeprowadzaj selekcję blasticydyny na zakażonych komórkach przez 10-14 dni, używając optymalnego stężenia blasticydyny pochodzącego z krzywej "zabijania" opisanej w kroku 2.2.
      1. Równolegle hoduj niezakażone komórki w pożywce o optymalnym stężeniu blasticydyny, która ma być wykorzystana jako kontrola pozytywna do selekcji wirusowej.
    8. Zmieniaj pożywkę uzupełnioną optymalnym stężeniem blasticydyny co 3 dni w trakcie selekcji, aby usunąć martwe komórki.
      UWAGA: Tylko komórki, które przetrwają selekcję blasticydyny, będą miały zintegrowany wektor lentiwirusowy.
    9. Rozwiń wybrane przez blasticydynę linie komórkowe Lenti-iCas9.
      UWAGA: Zapisz numer przejścia komórki przy każdym rozszerzeniu.
      1. Zamrozić część komórek Lenti-iCas9 w preferowanym podłożu uzupełnionym 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w celu długotrwałego przechowywania kriowialnego.
      2. Przeanalizuj część komórek Lenti-iCas9 za pomocą western blot9, aby zidentyfikować linię komórkową wykazującą najbardziej wytrzymałe poziomy białka Cas9 indukowane przez DOX (patrz Krok 2.3.).
  4. Wykonaj krzywą stężenia doksycykliny na nowo powstałych liniach komórkowych Lenti-iCas9 w celu określenia optymalnych warunków indukcji białka Cas9.
    1. Ustaw cztery niezależne płytki 6-dołkowe dla każdej badanej linii komórkowej, aby wykonać ten przebieg czasowy stężenia DOX. Płytka 5 × 104 komórki na studzienkę z każdej płytki 6-dołkowej i rosnąć w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w preferowanym podłożu przez 24 godziny.
    2. Rozcieńczyć DOX (zapas roboczy 1 mg/ml) w preferowanym podłożu z końcową krzywą stężenia DOX w zakresie od 0, 50, 100, 150, 250 do 500 ng/ml.
    3. Oznacz dołki każdej 6-dołkowej płytki z nasionami od 1 do 6. Usuń pożywkę i zastąp ją odpowiednimi stężeniami DOX. Hoduj płytki 1-4 do następujących punktów czasowych: 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny indukcji DOX; i 120 godzin po odstawieniu DOX (początkowo 72 godziny po odstawieniu DOX).
    4. Zbierz dołki płytki w każdym punkcie czasowym przy użyciu odpowiednich metod (np. trypsynizacji). Przechowywać granulki komórkowe w temperaturze -80 °C. Przetwarzać granulki komórkowe w buforze RIPA w celu izolacji lizatu i analizy Cas9 western blot.
      1. Uruchom 40 μg lizatu komórkowego dla każdej próbki w czasie indukcji DOX za pomocą denaturującego 4%-12% żelu Bis-Tris i przenieś białka do błony immunoblot.
      2. Zhybrydyzuj błonę immunoblot z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko Cas9, aby wykryć białko 160 kDa. Normalizuj poziomy Cas9 za pomocą genu porządkowego, takiego jak GAPDH (37 kDa).
    5. Na podstawie wyników western blot określ optymalne stężenie DOX do indukcji Cas9 w liniach komórkowych Lenti-iCas9.
      UWAGA: Ten kurs czasowy pokaże również, jak ściśle regulowana jest ekspresja Cas9 po 120 godzinach od usunięcia DOX.
    6. Ustanowienie kolonii jednokomórkowych dla linii komórkowych Lenti-iCas9 wykazujących silną ekspresję białka Cas9 w celu optymalizacji transfekcji CRISPR (w sekcji 3).

3. Przeprowadzanie reakcji CRISPR poprzez indukcję Cas9 i syntetyczną transfekcję RNA prowadzącego komórek przy użyciu formatu wysokoprzepustowego

UWAGA: Diagram przepływu pracy jest pokazany w Rysunek 1.

  1. Na papierze zmapuj kombinacje par crRNA, które zostaną transfekowane do każdej studzienki 24-dołkowej płytki ukierunkowanej na cały klaster miRNA, różne zgrupowane kombinacje genów miRNA, a także poszczególnych członków klastra miRNA.
    1. Na mapie oznacz cztery dołki na docelowe locus miRNA. Niech każda studzienka reprezentuje reakcję transfekcji, z dwoma unikalnymi crRNA umieszczonymi 5' i 3' pożądanego locus genomowego nokautu miRNA i tracrRNA (wyżarzony stosunek molowy 1:1).
    2. Upewnij się, że każda z czterech znakowanych studzienek reprezentuje unikalną parę crRNA do transfekcji (np. 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      UWAGA: Konstrukcja dwóch 5' crRNA i dwóch 3' crRNA flankujących każdy docelowy locus miRNA (sekcja 1) umożliwia wygenerowanie czterech możliwych par 5' i 3' przewodnikowych RNA w reakcji transfekcji.
  2. Płytkę na linii komórkowej Lenti-iCas9 w 5 x 104 komórki/basenik 24-dołkowej płytki w preferowanym podłożu zawierającym zoptymalizowane stężenie DOX (określone w kroku 2.4.). Hoduj komórki przez 24-48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu indukowania ekspresji białka Cas9.
  3. Transfekcja komórek Lenti-iCas9 za pomocą przygotowanych 5' i 3' prowadzących RNA.
    1. Zsyntetyzowane oligonukleotydy crRNA i tracrRNA należy rozpuścić w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia podstawowego 10 μM. Przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C.
    2. Oznaczyć cztery probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml na docelowy locus miRNA w oparciu o mapę eksperymentalną zaprojektowaną w kroku 3.1., reprezentującą cztery możliwe kombinacje par crRNA 5' i 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
    3. W każdej probówce wymieszać ze sobą stosunek molowy tracrRNA i unikalnych crRNA (5' i 3') w stosunku molowym 1:1, aby utworzyć 2 μM prowadzący kompleks RNA przy użyciu następującej reakcji (końcowa objętość 10 μL):
      1. Dodać 2,5 μl tracrRNA (zapas 10 μM), 1,25 μl crRNA umiejscowionego 5' (zapas 10 μM), 1,25 μl crRNA umieszczonego 3' (zapas 10 μM) i 5 μl 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Mikrowirówka przez 30 s przy 16 000 × g do wymieszania. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
    4. Do każdej probówki dodać 40 μl zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM) do 10 μl reakcji z kompleksem przewodnika RNA (całkowita objętość 50 μl). Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.
    5. W czystej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml delikatnie wymieszać 2 μl odczynnika do transfekcji28 (patrz UWAGA 3.3.5.1.) i 48 μl zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM, końcowa objętość 50 μl), pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      1. Przygotować wzorcową mieszaninę odczynnika do transfekcji, mnożąc ilość odczynnika (2 μl) i zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM, 48 μl) przez liczbę dołków do transfekcji, plus 10% dodatkowej objętości w celu uwzględnienia niewielkich niedokładności pipetowania.
        UWAGA: Wybierz odczynnik do transfekcji, który jest zoptymalizowany pod kątem transfekcji oligonukleotydów małych RNA i CRISPR RNA, a także dla typu linii komórkowej28.
    6. Do każdej probówki zawierającej 50 μl mieszaniny prowadzącego RNA (z etapu 3.3.4) dodać 50 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji (z etapu 3.3.5). Pipetuj mieszaninę powoli w górę iw dół raz, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    7. Dodać 400 μl pożywki wolnej od antybiotyków uzupełnionej DOX (optymalne stężenie) do każdej probówki zawierającej 100 μl mieszaniny przewodnika RNA/transfekcji. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać.
  4. Usunąć pożywkę z komórek Lenti-iCas9 indukowanych przez DOX (krok 3.2.). Dodać 500 μl mieszaniny pożywki/DOX/przewodnika RNA/transfekcji w oparciu o eksperymentalną mapę na 24-dołkowej płytce (krok 3.1.). Inkubować transfekowane komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Zastąp pożywkę świeżą preferowaną pożywką bez DOX (aby usunąć białko Cas9 z komórek). Pozostawić komórki do regeneracji przez kolejne 24-48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  6. Zbierz transfekowane komórki (trypsynizacja) i przygotuj się do genotypowania i rozcieńczania pojedynczych komórek.
    UWAGA: Komórki reprezentują mieszaną populację zawierającą transfekowane komórki CRISPR, edytowane genem i nietransfekowane, dzikiego typu. Ten krok określi wydajność edycji CRISPR przed zainwestowaniem czasu/zasobów w ekspansję kolonii jednokomórkowych.
    1. Przemyj komórki 1x 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Inkubować komórki w 100 μl trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i przenieść komórki do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml pożywki.
    2. Odwrócić w celu wymieszania i mikrowirować komórki przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze 20 °C. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS.
    3. Mikrowirować umyte komórki przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze 20 °C. Usunąć PBS i ponownie zawiesić osad komórek w 150 μl preferowanej pożywki.
  7. Określ liczbę komórek na mikrolitr ze 150 μl zawieszonych komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego przyrządu do liczenia komórek.
  8. Rozdzielić 150 μl zawieszonych komórek na trzy części.
    1. Zamrozić 1/3 transfekowanych komórek (50 μl) w pożywce plus 10% DMSO (końcowa objętość 150 μl) w kriowialach w celu przyszłej ekspansji/długoterminowego przechowywania.
    2. Przenieś 1/3 transfekowanych komórek (50 μl) do czystej probówki PCR o pojemności 0,2 ml w celu genotypowania.
      1. Mikrowirować komórki przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze 4 °C i usunąć pożywkę.
      2. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl PBS.
      3. Mikrowirować komórki przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze 4 °C i usunąć PBS. Granulki komórkowe o mieszanej populacji należy przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C.
      4. Przetwarzaj osad komórkowy do genotypowania, korzystając z przepływu pracy opisanego w sekcji 4.
    3. Przygotować końcową 1/3 komórek (50 μl) do rozcieńczenia i posiewu w formacie 96-dołkowej płytki w celu wytworzenia kolonii jednokomórkowych.
      1. Na podstawie liczby komórek w kroku 3.7 obliczyć rozcieńczenia wymagane do uzyskania 10, 5, 2 i 1 komórki w 100 μl pożywki na basenie płytki 96-dołkowej.
      2. Używając 12-kanałowego pipetora wielokanałowego i sterylnego zbiornika na odczynniki, dodaj 100 μl rozcieńczonych komórek na studzienkę do dwóch rzędów płytki (łącznie 24 dołki) na każde rozcieńczenie (10, 5, 2 lub 1 komórka na studzienkę). Odczekaj 4-6 tygodni, aż komórki urosną do zbiegu w celu ekspansji kolonii jednokomórkowej. Obserwuj komórki co tydzień pod mikroskopem świetlnym i zwróć uwagę, czy kolonie reprezentują kolonie jedno- czy wielokomórkowe.
      3. Zbierz ~10-15 kolonii jednokomórkowych do genotypowania (sekcja 4). Zidentyfikuj co najmniej trzy niezależne, nokautujące, jednokomórkowe linie kolonii dla każdego docelowego locus miRNA. Zachowaj linie jednokomórkowe typu dzikiego jako kontrolki.
        UWAGA: Liczba badań przesiewowych będzie zależeć od typu linii komórkowej i wpływu fenotypu nokautu miRNA na wzrost/żywotność komórek.

4. Genotypowanie PCR linii komórkowych CRISPR przy użyciu surowych lizatów komórkowych

  1. Zbierz pojedyncze, jednokomórkowe kolonie z prawie zlewających się studzienek na 96-dołkowej płytce.
    UWAGA: Usuwanie pożywki/PBS opisane w tych krokach można wykonać ręcznie za pomocą aspiratora próżniowego w komorze bezpieczeństwa biologicznego, ale należy uważać, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Podczas zasysania należy użyć nowej sterylnej "żółtej" końcówki pipetowej o pojemności 200 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej, w której każda wymieniona żółta końcówka jest mocno umieszczona na końcu sterylnej szklanej pipety pastwiskowej podłączonej do aspiratora próżniowego.
    1. Przemyć studzienki 1x 100 μL PBS. Zassać PBS.
    2. Dodać 50 μl trypsyny i inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Delikatnie pipetować w górę i w dół, a następnie przenieść zawieszone komórki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml pożywki.
    4. Odwrócić, aby wymieszać i delikatnie granulować komórki w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze 20 °C.
    5. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml PBS. Delikatnie przesuń rurkę, aby rozbić granulkę i odwróć kilka razy, aby wymieszać.
    6. Mikrowirować przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze 20 °C w celu osadzenia komórek.
    7. Usunąć PBS i ponownie zawiesić osad w 300 μl świeżego PBS.
    8. Podzielić próbkę o objętości 300 μl na dwie części.
      1. Przenieść 200 μl komórek (2/3 osadu) do dołka na 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml preferowanej pożywki. Po walidacji genotypu użyj tych komórek do rozszerzenia linii komórkowych nokautujących za pośrednictwem CRISPR do analizy funkcjonalnej.
      2. Przenieś 100 μl komórek (1/3 osadu) do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Mikrowirować przez 5 minut przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Wyjąć PBS. Przechowywać granulki w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotować surowe lizaty komórkowe do genotypowania i analizy sekwencji przy użyciu starterów PCR zaprojektowanych w kroku 1.3. Włączyć do tych eksperymentów lizaty komórkowe przygotowane z komórek nietransfekowanych w celu wykorzystania ich jako kontroli pozytywnych typu dzikiego.
    1. Zawiesić osad komórkowy w 4 μl 5x buforu polimerazy DNA (patrz tabela materiałów, stężenie końcowe 1x), 1 μl proteinazy K (zapas 20 ng / ml), 1 μl RNazy A (zapas 10 ng / ml) i wodzie wolnej od nukleaz do całkowitej objętości 20 μl.
    2. Poddać komórki lizie w termocyklerze za pomocą programu PCR: 56 °C przez 30 min i 96 °C przez 5 minut. Przechowuj lizaty komórkowe w temperaturze -20 °C.
    3. Przeprowadź reakcję PCR przy użyciu zaprojektowanych starterów PCR (do przodu, do tyłu), które otaczają miejsca docelowe 5' i 3' przewodnika RNA (Tabela 1).
      UWAGA: Bufor polimerazy DNA i warunki termocyklera będą zależeć od enzymu polimerazy DNA Taq użytego w reakcji PCR. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem polimerazy DNA Phusion HF.
      1. Ustaw mieszaninę reakcyjną PCR na lodzie: 5 μL 5x buforu polimerazy DNA, 0,5 μL startera forward PCR (zapas 10 μM), 0,5 μL startera reverse PCR (zapas 10 μM), 0,5 μL 10 mM dNTP, 0,25 μL polimerazy DNA, 1-4 μL lizatu komórkowego, i woda wolna od nukleaz o łącznej objętości 25 μl.
      2. Uruchom reakcję PCR w termocyklerze za pomocą programu: 98 °C przez 3 min i 35 cykli po 98 °C przez 10 s, 62 °C przez 15 s, 72 °C przez 15 s, a następnie 72 °C przez 10 min. Przytrzymaj przez 4 °C. Patrz: UWAGA 4.2.3. ponad.
    4. Załaduj produkty PCR na 1% żel agarozowy w celu analizy elektroforetycznej.
    5. Wyodrębnij DNA z wyizolowanych fragmentów PCR o przewidywanej wielkości cząsteczki dla genotypów nokautujących (i typu dzikiego). Przygotuj próbki do sekwencjonowania DNA.
    6. Sprawdź, czy reakcja CRISPR zakończyła się sukcesem i wykonaj sekwencjonowanie DNA wyizolowanych fragmentów PCR, aby zidentyfikować miejsce cięcia Cas9 i potwierdzić delecję locus miRNA.
      1. Wyizoluj co najmniej trzy niezależne linie komórkowe nokautujące dla każdego locus miRNA, na który ukierunkowuje się CRISPR. Zachowaj linie komórkowe typu dzikiego (i heterozygotycznego) do wykorzystania jako kontrola w dalszych badaniach funkcjonalnych.
      2. Wykonaj analizę qRT-PCR lub northern blot, aby potwierdzić, że linie komórkowe nokautu nie wyrażają dojrzałego miRNA dla usuniętego locus.
        UWAGA: Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) jest najbardziej ostateczną metodą walidacji edycji genów CRISPR i off-targetingu.
      3. Przetestuj efekty CRISPR poza celowaniem za pomocą PCR, które zostały przewidziane obliczeniowo (krok 1.2.3.)24,25,26,27.
      4. Jeśli rozległe badania przesiewowe kolonii jednokomórkowych dają tylko heterozygotyczne genotypy, powtórz transfekcję przewodnika RNA w jednokomórkowych liniach heterozygotycznych.
        UWAGA: Niemożność uzyskania homozygotycznych linii komórkowych z nokautem może wskazywać na śmiertelne skutki spowodowane utratą miRNA lub nieodłączną złożonością genomową (np. duplikacje/fuzje chromosomów) rodzicielskiej linii komórkowej, które wymagają dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten wysokoprzepustowy protokół delecji CRISPR został z powodzeniem wykorzystany przy użyciu transfekcji indukowanych Cas9 linii komórek raka ludzkiego LNCaP i PC3-ML z syntetycznymi oligonukleotydowymi RNA ukierunkowanymi na klaster miR-888, które były badane w kontekście raka prostaty. Klaster miR-888 został początkowo zidentyfikowany na ekranie profilowania ekspresji jako podwyższony u pacjentów z rakiem prostaty z chorobą o wysokim stopniu złośliwości w porównaniu z pacjentami o niskim stopniu złośliwości i bez raka

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura edycji genów CRISPR pozwala badaczowi szybko wygenerować cały panel linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji klastrów miRNA. Transfekcja syntetycznych przewodnikowych RNA składających się z 5' i 3' genomowych crRNA specyficznych dla miejsca wyżarzanych syntetycznym tracrRNA (stosunek molowy 1:1) w tym protokole pozwala uniknąć czasochłonnego subklonowania wektorów plazmidowych i pozwala na bardziej elastyczny i wysokoprzepustowy projekt eksperymentalny przy użyciu formatu 24-dołkowego. Gen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linie komórkowe PC3-ML zostały uprzejmie dostarczone przez Marka Stearna (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey pomagał w genotypowaniu PCR. Praca ta była wspierana przez Breedan Adams Foundation Grant, Ryan Translational Research Fund oraz Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) dla AE-K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do PCR 0,2 ml, płaska nakrętkaFisher14-230-225Plastikowe
probówki do mikrowirówek 1,5 mlSeal-Rite1615-5500Plastikowe naczynia
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowychCorning Costar  09761146Plasticware
5x Phusion HF BufferThermo ScientificF-518Lodczynnik PCR, genotypowanie
6-dołkowej płytki do hodowli tkankowejFisherFB012927Plasticware
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFalcon08-772-2CPlasticware
Przeciwciało anty-CRISPR-Cas9 [7A9-3A3], mysi monoklonalnyodczynnik AbCamab191468Western blot; 160 kDa; rozcieńczenie 1:200
Antybiotyk-Antybiotyk (100x)Gibco15240062Odczynnik kulturowy Tisuue
BLAST wyszukiwarka nukleotydówNational Center for BiotechnologyInformation NA;strona internetowa: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Chlorowodorek, Streptomyces griseochromogenesCalbiochemOdczynnik CAS 589205CRISPR; Chemiczny, Zapas roboczy = 1 mg/ml w wodzie
Countess 3 Automatyczny licznik komórekInvitrogenA50298Sprzęt; Licznik komórek
Probówki kriogeniczneThermo Scientific50001012Plasticware
Dharmacon CRISPR Design ToolHorizon Discovery Ltd.NA Freeware; strona internetowa: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT odczynnik do transfekcji siRNA #2Dharmacon, Inc.T-2002-02Odczynnik do transfekcji; Linie komórkowe LNCaP i PC3-ML
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher  BP231100Odczynnik do hodowli Tisuue
DMEM Medium z L-glutaminą, 4,5 g / L glukozy i pirogronianu soduOdczynnikMT10013CVTisuue; Pożywka dla komórek PC3-ML
Chlorowodorek doksycykliny, Gotowy roztwórSigma-AldrichD3072-1MLodczynnik CRISPR; Chemiczny, zapas roboczy = 1 mg / ml zapas w wodzie
DPBS, bez wapnia, bez magnezuOdczynnik do hodowli Gibco14190144Tisuue
Edit-R CRISPR-Cas9 Syntetyczny tracrRNA, 20 nmol, zaprojektowanyDharmacon, Inc.U-002005-20Odczynnik CRISPR; Uniwersalne oligonukleotydy tracrRNA
Edit-R Zmodyfikowany syntetyczny crRNA,
odsolony/odchroniony, 2 nmol		Dharmacon, Inc.odczynnik crRNA-460XXXCRISPR; Zaprojektowane oligonukleotydy crRNA
EditR Indukowalne lentiwirusowe cząstki nukleazy hEF1aBlastCas9, 50 μ L, 107 TU/mLDharmacon, Inc.VCAS11227odczynnik CRISPR; Lenti-iCas9; Indukowany doksycykliną lentiwirusowy system wektorowy Streptococcus pyogenes Cas9
Ensembl przeglądarka genomicznaEnsemblNAFreeware; strona internetowa: [ensembl.org] Zastosowanie: Przeglądarka genomu do identyfikacji seuqnces nukleotydowych zawierających klaster miRNA i otaczające sekwencje genowe/regulatorowe.
Przeciwciało GAPDH (FL-335), poliklonalne królikaSanta Cruz Biotechnologysc25778Odczynnik Western blot; 37 kDa; rozcieńczenie 1:500
Zestaw do ekstrakcji fragmentów DNA w żelu/PCRIBI ScientificIB47010Odczynnik do elektroforezy w żelu kwasu nukleinowego
Gibco Płodowa surowica bydlęca, certyfikowanaGibco16000044Odczynnik do hodowli Tisuue
Bromek heksadimetrynyMilliporeSigmaH9268Odczynnik CRISPR; Chemiczny, Zapas roboczy = 0,8 mg/ml
Immobilon-FL PVDF MembranaMilliporeSigmaIPFL10100odczynnik Western blot; bufor blokujący nitrocelulozę
(TBS)LI-COR927-60001Odczynnik Western blot
IRDye 680RD Goat anty-mysie przeciwciało wtórne IgGLI-COR926-68070Odczynnik Western blot
IRDye 800CW Kozie przeciwciało anty-IgG IgGLI-COR926-32211Odczynnik Western blot
MikrowirówkaEppendorf  5425 RPlasticware
miRBase microRNA viewermiRBaseNAFreeware; website: [mirbase.org] Zastosowanie: Borowser wymienia wszystkie adnotowane spinki do włosów miRNA, dojrzałe sekwencje miRNA i związane z nimi mapowanie klastrowanych miRNA w obrębie 10 kb.
NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 10-dołkowyodczynnik InvitrogenNP0321BOXWestern blot
System obrazowania Odyssey CLxLI-CORCLx; Obrazowanie Western blot
Opti-MEM Zredukowana surowica MediumGibco31985062Odczynnik do transfekcji
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis SystemOwlD2-BPSprzęt; System elektroforezy żelowej z kwasami nukleinowymi
Startery PCR, zaprojektowane (jednoniciowe oligonukleotydy DNA)Zintegrowany odczynnik do PCR w technologii DNANA, genotypowanie
Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion (2 U /µ L)Odczynnik PCR Thermo ScientificF530S, genotypowanie
RIPA Lysis Buffer 10xMiliporeSigma20-188Western blot odczynnik
Proteinaza K Roztwór (20 mg / ml),Invitrogen25530049genotypowanie
RNazy, DNazy i wolne od proteazy (10 mg / ml)Odczynnik Thermo ScientificEN0531PCR, genotypowanie
RPMI 1640 MediumGibcoMT10041CVodczynnik do hodowli Tisuue; Nośniki do komórek LNCaP
SnapGene ViewerSnap GeneNAFreeware; strona internetowa: [snapgene.com]  Zastosowanie: Program do adnotacji sekwencji DNA do tworzenia pliku DNA do projektowania gRNA, który  zwraca uwagę na locus klastra miRNA (międzygenowy, introniczny), każdą pojedynczą sekwencję spinki do włosów miRNA należącą do klastra miRNA oraz inne pobliskie geny kodujące i niekodujące i/lub cechy regulatorowe
TrypLE Select Enzyme (1x), bez odczynnikaGibco12563029Tisuue czerwieni fenolowej; Rekombinowana trypsyna
UltraPure AgarozaInvitrogen16500100Odczynnik do elektroforezy żelu z kwasem nukleinowym
Veriti 96-well Fast Thermal CyclerThermoFisher Scientific4375305Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electro-Cell Electrophoresis SystemInvitrogenEI0001Sprzęt; System elektroforezy w żelu białkowym
do hodowli Corning Sprzęt odczynnik PCR klasy RNA, do hodowli barwników

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
  20. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
  23. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
  24. Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
  25. Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
  26. Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
  27. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  28. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
  29. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  30. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  31. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  32. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sieci niekoduj cego RNAlinie kom rkowe rakaindukcja bia ka Cas9genotypowanie PCRprojektowanie gRNAtransfekcja lentiwirusowapojedyncze kolonie kom rkoweelektroforeza w elu

Powiązane artykuły