Artykuł metodologiczny

Wizualizacja ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej

DOI:

10.3791/63706

⸱

15 lutego 2022

 , 
1Department of Microbiology, School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, 2National Experimental Teaching Demonstration Center of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest łatwa do oceny i dokładniejsza oraz nie wymaga specjalistycznego sprzętu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruchliwość bakterii jest kluczowa dla patogenności bakterii, tworzenia biofilmu i odporności na leki. Ruchliwość bakterii ma kluczowe znaczenie dla inwazji i/lub rozprzestrzeniania się wielu gatunków chorobotwórczych. Dlatego ważne jest, aby wykryć ruchliwość bakterii. Warunki wzrostu bakterii, takie jak tlen, pH i temperatura, mogą wpływać na wzrost bakterii i ekspresję wici bakteryjnych. Może to prowadzić do zmniejszenia ruchliwości, a nawet utraty ruchliwości, co skutkuje niedokładną oceną ruchliwości bakterii. Opierając się na reakcji barwnej chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolowego (TTC) przez wewnątrzkomórkowe dehydrogenazy żywych bakterii, TTC dodano do tradycyjnego półstałego agaru w celu wykrycia ruchliwości bakterii. Wyniki pokazały, że ta półstała metoda agaru TTC do wykrywania ruchliwości bakterii jest prosta, łatwa w obsłudze i nie wymaga dużych i drogich instrumentów. Wyniki wykazały również, że największą ruchliwość zaobserwowano w pożywce półstałej przygotowanej z 0,3% agarem. W porównaniu z tradycyjną pożywką półstałą wyniki są łatwiejsze do oceny i dokładniejsze.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruchliwość bakterii odgrywa kluczową rolę w patogeniczności bakterii, tworzeniu biofilmu i odporności na leki1. Ruchliwość bakterii jest ściśle związana z chorobotwórczością i jest niezbędna do kolonizacji bakteryjnej podczas wczesnej infekcji komórek gospodarza2. Tworzenie biofilmu jest ściśle związane z ruchliwością bakterii, w której bakterie przylegają do powierzchni pożywki stałej poprzez ruchliwość. Od dawna uważa się, że ruchliwość bakterii jest dodatnio skorelowana z tworzeniem biofilmu. Wysoki stopień lekooporności bakterii spowodowany biofilmem może prowadzić do uporczywych infekcji, które stanowią zagrożenie dla zdrowia ludzkiego3,4,5. Dlatego ważne jest, aby wykryć ruchliwość bakterii. Test ruchliwości bakterii służy głównie do badania ruchliwości różnych form bakterii w stanie żywym, które mogą pośrednio określać obecność lub brak wici, a tym samym odgrywają ważną rolę w identyfikacji bakterii.

Istnieją bezpośrednie i pośrednie metody wykrywania ruchliwości bakterii6. Ponieważ bakterie z wiciami wykazują ruchliwość, możliwe jest wykrycie, czy bakterie są ruchliwe pośrednio, wykrywając obecność lub brak wici. Na przykład możliwe jest pośrednie wykrycie ruchliwości za pomocą mikroskopii elektronowej i barwienia wiciowego, aby wskazać, że bakterie są ruchliwe. Możliwe jest również wykrycie metodami bezpośrednimi, takimi jak kropla zawiesiny i metody nakłuwania półstałego.

Metoda semisolid punkture powszechnie stosowana w laboratoriach mikrobiologicznych do wykrywania ruchliwości bakterii wprowadza bakterie do nakłucia w półstałym podłożu agarowym zawierającym 0,4-0,8% agaru, zgodnie z kierunkiem rozwoju bakterii. Jeśli bakterie rosną wzdłuż linii nakłucia, aby się rozprzestrzeniać, pojawiają się ślady wzrostu przypominające chmury (przypominające szczotki), wskazujące na obecność wici, a tym samym ruchliwość. Jeśli nie ma śladów wzrostu na linii nakłucia, bakteria nie jest ani wiciowa, ani ruchliwa.

Jednak ta metoda ma swoje wady: bakterie są bezbarwne i przezroczyste, na aktywność wiciowców wpływają fizjologiczne cechy żywych bakterii i inne czynniki, a także stężenie agaru i mała średnica probówki. Co więcej, bakterie tlenowe nadają się do wzrostu tylko na powierzchni agaru, wpływając na obserwację ruchliwości bakterii. Stąd, aby ulepszyć ten eksperyment, chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) (bezbarwny) został dodany do pożywki, aby ustalić bardziej wiarygodną i intuicyjną metodę określania ruchliwości bakterii niż obecna metoda bezpośredniego nakłuwania wykorzystująca dehydrogenazy wewnątrzkomórkowe do katalizowania tworzenia czerwonego produktu TTC7,8,9,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podłoża półstałego

  1. Tradycyjny agar półstały
    1. Przygotuj tradycyjny półstały agar zgodnie z recepturą pożywki do badania ruchliwości bakterii, używając podstawowych składników11. Rozpuścić 10 g tryptozy, 15 g NaCl, 4 g agaru w wystarczającej ilości wody destylowanej, dostosować pH do 7,2 ± 0,2 i uzupełnić końcową objętość do 1000 ml.
    2. Autoklawować agar w temperaturze 121 °C przez 20 minut i dozować go do probówek o pojemności 10 ml jako półstałe podłoże o wysokości 3 cm.
  2. Tradycyjny agar półstały z TTC
    1. Po autoklawowaniu konwencjonalnej pożywki półstałej, schłodzić ją do 50 °C, dodać 5 ml sterylnego 1% roztworu TTC do 100 ml pożywki, wymieszać i dozować do probówek o pojemności 10 ml, aby utworzyć półstałe podłoże o wysokości 3 cm.

2. Szczepy bakteryjne

UWAGA: Osiemdziesiąt szczepów zostało wyizolowanych ze środowiska wodnego i zidentyfikowanych za pomocą automatycznego narzędzia do identyfikacji bakterii (zobacz Tabelę Materiałów), w tym Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae i Aeromonas hydrophila (Tabela 1). Staphylococcus aureus (patrz tabela materiałów) zastosowano jako ujemną kontrolę nieruchomą; Jako szczepy kontroli pozytywnej wykorzystano Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Salmonella typhimurium (patrz tabela materiałów).

  1. Zidentyfikuj testowe szczepy bakterii, które zostaną wykorzystane do analizy ruchliwości.
  2. Obejmują ujemne nieruchome kontrole i ruchliwe dodatnie szczepy kontrolne.

3. Obserwacja ruchliwości bakterii wzmocniona TTC

  1. Pobrać pojedyncze kolonie badanych bakterii z płytek agarowych i zaszczepić je w powyższych dwóch półstałych pożywkach (kroki 1.1.2 i 1.2.1) przez nakłucie za pomocą igieł do zaszczepiania.
  2. Hodować probówki w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 24-48 godzin w celu obserwacji wyników.
  3. Obserwuj stan wzrostu: scharakteryzuj bakterie jako nieruchome (-), jeśli tylko linia nakłucia jest czerwona. Scharakteryzuj bakterię jako ruchliwą (+), jeśli czerwony kolor rozprzestrzenia się lekko na zewnątrz wzdłuż linii nakłucia12.

4. Wpływ różnych stężeń agaru na ruchliwość bakterii

  1. Przygotować pożywki półstałe zawierające 0,3%, 0,5% i 0,8% agaru i zaszczepić je przez nakłucie, jak opisano powyżej. Obserwuj wyniki po 24-48 godzinach inkubacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarówno standardowe szczepy, jak i izolowane szczepy zostały porównane pod kątem wykrywania ruchliwości, a wyniki są pokazane w Tabeli 1. Ze względu na brak wici, Staphylococcus aureus i Klebsiella pneumoniae rosły tylko wzdłuż zaszczepionej linii zarówno na pożywkach tradycyjnych, jak i półstałych TTC. W przeciwieństwie do tego, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i Salmonella typhimurium wykazały wzrost we wszystkich kierunkach wokół inokulowanej linii ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na wykrywanie ruchliwości bakterii metodą pożywki półstałej wpływa wiele czynników13,14. Warunki rozwoju bakterii, takie jak tlen (tlenowy na powierzchni agaru, nietlenowy na dnie probówki z pożywką półstałą), pH i temperatura, mogą wpływać na żywotność wici bakteryjnych, co może prowadzić do zmniejszenia ruchliwości, a nawet utraty ruchliwości15. Ponadto na niektóre bakterie śluzowe, jak ich ruchliwość, może wpływać produkcja podokoniugat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (PAPD) oraz Projekt Badawczy Reformy Nauczania Chińskiego Uniwersytetu Farmaceutycznego (2019XJYB18).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bacto AgarDifco
Escherichia coliATCCATCC25922Kontrola pozytywna
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC27853Kontrola pozytywna
Salmonella typhimuriumATCCATCC14028Kontrola pozytywna
Staphylococcus aureusATCCATCC25923Ujemna kontrola nieruchoma
Tryptoza  OXOID
TTCSigma298-96-4
VITEK 2 zautomatyzowany system identyfikacji mikrobiologicznejBio Mé rieux
powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. Bacterial motility. Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).
  2. Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
  3. Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
  4. Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
  5. Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
  6. Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
  7. Ball, R. J., Sellers, W. Improved motility medium. Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).
  8. An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
  9. Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2(2016).
  10. McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
  11. Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
  12. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575(1936).
  13. Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
  14. Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511(2020).
  15. Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).
  16. Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
  17. Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
  18. Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Agar TTCpod o e p p ynnewykrywanie ruchliwo cibakterie patogenneekspresja wicitworzenie biofilmutechnika inokulacjiaktywno dehydrogenazy

Powiązane artykuły