Artykuł metodologiczny

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63709

⸱

25 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano, 2Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Streszczenie

Mikroskopia wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS) jest nieliniową techniką optyczną do obrazowania chemicznego bez znaczników. To narzędzie analityczne dostarcza mapy chemiczne z dużą prędkością i wysoką rozdzielczością przestrzenną cienkich próbek poprzez bezpośrednie badanie ich drgań molekularnych. W swojej standardowej implementacji mikroskopia SRS jest wąskopasmowa i tworzy obrazy z tylko jedną częstotliwością drgań na raz. Jednak takie podejście nie tylko utrudnia chemiczną specyficzność SRS, ale także zaniedbuje bogactwo informacji zakodowanych w widmach oscylacyjnych.

Te ograniczenia mogą być pokonane przez szerokopasmowy SRS, implementację zdolną do równoległego wyodrębniania widma drgań na piksel obrazu. Dostarcza to danych hiperspektralnych, które w połączeniu z analizą chemometryczną maksymalizują ilość informacji pobieranych z próbki. W ten sposób szerokopasmowy SRS poprawia specyficzność chemiczną systemu, umożliwiając ilościowe określenie stężenia różnych składników próbki. W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania chemicznego z szerokopasmową mikroskopią SRS, oparty na domowym mikroskopie SRS działającym z niestandardową różnicową detekcją wielokanałowego wzmacniacza typu lock-in. Omówiono w nim przygotowanie próbki, ustawienie aparatury SRS i analizę chemometryczną. Uzyskując wibracyjne widma Ramana, protokół ilustruje, w jaki sposób identyfikować różne związki chemiczne w mieszaninie, określając ich względne stężenia.

Wprowadzenie

Mikroskopia Ramana to potężna technika obrazowania, która dostarcza bogatych map chemicznych poprzez pomiar rozpraszania Ramana1, nieelastyczny proces promieniowania, który pochodzi od cząsteczek wibrujących w odpowiedzi na padające światło2,3. Każdy piksel mapy Ramana zawiera widmo, które przenosi bezpośrednie informacje o składzie chemicznym i strukturze próbki, co skutkuje obrazami o wewnętrznym kontraście drgań. Do tej pory mikroskopia Ramana jest punktem odniesienia dla badań mikrospektroskopii drgań molekularnych, ponieważ żadna inna technika obrazowania nie jest w stanie uzyskać obrazów o wysokiej specyficzności chemicznej i wysokiej rozdzielczości przestrzennej4. Pomimo wyjątkowej specyficzności chemicznej, wydajność generowania rozpraszania Ramana jest niska, co wymaga wydłużenia czasu przebywania pikseli lub wzbudzenia o dużej mocy, co prowadzi odpowiednio do niskich wskaźników akwizycji i niekompatybilności z wrażliwymi próbkami.

Ten pojedynczy niedociągnięcie mikroskopii Ramana skłoniło badaczy do zastosowania spójnego rozpraszania Ramana 5,6,7,8,9 jako źródło kontrastu dla mikroskopii. Jest to nieliniowy proces optyczny, który zwiększa odpowiedź wibracyjną o kilka (do siedmiu) rzędów wielkości, umożliwiając w ten sposób szybkie obrazowanie chemiczne10,11,12,13. W szczególności dwie najczęściej stosowane techniki koherentnego rozpraszania Ramana to koherentne rozpraszanie Ramana przeciwko Stokesowi (CARS)14 i stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS)15. W przeciwieństwie do CARS, SRS wykazuje liniową zależność od stężenia cząsteczek rezonansowych. Jest odporny na nierezonansowe tło, nieliniowy efekt niezwiązany z żadnym przejściem wibracyjnym, ale zniekształcający kształty Lorentza charakterystyczne dla widm Ramana drgań molekularnych16,17. W ten sposób mikroskopia SRS dostarcza autentycznych informacji ramanowskich, które umożliwiają bezpośrednią ilościową analizę obrazu.

SRS to nieliniowy, optyczny proces trzeciego rzędu, który dostarcza bezpośrednich informacji o wiązaniach chemicznych próbki. Wywodzi się z czasoprzestrzennej superpozycji dwóch pól optycznych ogólnie w obszarze widma bliskiej podczerwieni, a mianowicie pompy i Stokesa o częstotliwości ωpu i ωS, odpowiednio10,11,18. Ta superpozycja generuje dudnienie przy odstrojeniu częstotliwości pompy-Stokesa Ω = ωpu-ω S. Kiedy Ω pasuje do wibracji molekularnej ΩR, cząsteczka rezonuje, powodując spójny transfer energii między polami świetlnymi a cząsteczką. W rezultacie cząsteczka osiąga stan wzbudzenia wibracyjnego. Proces ten może być monitorowany poprzez pomiar anihilacji fotonów pompy (sygnał znany jako wymuszona utrata Ramana [SRL]) lub jednoczesnego wzmocnienia fotonów Stokesa (proces znany jako wymuszone wzmocnienie Ramana [SRG]). SRG i SRL to małe sygnały (ΔI), które znajdują się na intensywnym i zmiennym tle (I). Ponieważ typowe wartości sygnału SRS (ΔI/I) mieszczą się w zakresie 10-6-10-4, szum lasera może go łatwo zasłonąć. Aby złagodzić szkodliwy wpływ szumu laserowego na stosunek sygnału do szumu (SNR), a w konsekwencji na szybkość obrazowania, detekcja SRS opiera się na technikach przenoszenia modulacji (np. wzmacniacze typu lock-in, obwody rezonansowe lub uśredniacze typu box-car) przy wysokich częstotliwościach modulacji (>1 MHz), gdzie szum laserowy osiąga swoje minimalne wartości15,19,20.

Konwencjonalna mikroskopia SRS wykorzystuje wąskopasmową (≈10 cm−1) pompę i impulsy Stokesa do wytwarzania obrazów chemicznych o pojedynczej częstotliwości drgań, umożliwiając obrazowanie z szybkością wideo z czasami przebywania pikseli tak niskimi jak ≈100 ns21,22. Ponieważ jednak wąskopasmowa mikroskopia SRS tworzy mapy chemiczne poprzez sekwencyjne skanowanie próbki przy zaledwie kilku częstotliwościach drgań, informacje o niej zawarte są ograniczone23. Obrazy SRS z jednym lub dwoma kontrastami oscylacyjnymi mogą nie wystarczyć do rozróżnienia związków chemicznych z nakładającymi się pasmami Ramana, zwłaszcza w obrębie układów heterogenicznych. W związku z tym paradygmatyczny wąskopasmowy mikroskop SRS nie wykorzystuje w pełni potencjału SRS, ponieważ badanie kilku częstotliwości drgań utrudnia jego specyfikę chemiczną i zaniedbuje bogactwo informacji zakodowanych w widmach oscylacyjnych. Co więcej, sekwencyjne skanowanie próbki z różnymi częstotliwościami skutkuje wydłużonymi czasami przebywania pikseli, co może wywołać fotouszkodzenia i uniemożliwić rygorystyczną korejestrację przestrzenną między kolejnymi obrazami, co prowadzi do artefaktów ruchu.

W przeciwieństwie do swojego wąskopasmowego odpowiednika, szerokopasmowa mikroskopia SRS pobiera widmo drgań na piksel przy każdym skanowaniu próbki10,12,24. W ten sposób szerokopasmowy SRS zapewnia obrazowanie hiperspektralne ze ścisłą przestrzenną korejestracją różnych kontrastów wibracyjnych, umożliwiając rygorystyczną analizę danych. To nie tylko ujawnia składniki chemiczne próbki za pomocą widm Ramana, ale także pomaga określić ich względne stężenia. W zależności od sposobu pozyskiwania widm, szerokopasmowa mikroskopia SRS jest klasyfikowana jako hiperspektralna SRS lub multipleksowa SRS. W hiperspektralnym SRS widmo SRS na zeskanowany punkt próbki jest pozyskiwane sekwencyjnie (tj. Jest odzyskiwane przez przemiatanie Ω odstrojenia częstotliwości), budując widmo SRS poprzez układanie sygnałów SRS przy kolejnych przesunięciach Ramana. Widmo Ramana jest mierzone jednocześnie w kilku modach wibracyjnych w multipleksie SRS. Tak więc podejście multipleksowe SRS łączy modulowany impuls wąskopasmowy z impulsem szerokopasmowym w celu kierowania sygnałem SRS na różnych częstotliwościach i wykorzystuje detektor wielokanałowy o czułości porównywalnej z wąskopasmowym SRS do wykrywania widm SRS.

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia map chemicznych próbek heterogenicznych za pomocą multipleksowej mikroskopii SRS. Schemat mikroskopu SRS zastosowanego w tym protokole jest przedstawiony w Rysunek 1 i szczegółowo opisany w innym miejscu25,26,27. Krótko mówiąc, komercyjny laser światłowodowy Yb z blokadą trybu, wytwarzający impulsy 140 fs wyśrodkowane pod kątem 1040 nm, o średniej mocy 10 W i częstotliwości powtarzania 80 MHz, napędza szerokopasmowy mikroskop SRS. Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej (PBS) rozdziela wiązkę podstawową na dwie gałęzie. Aby wytworzyć wąskopasmowe impulsy Stokesa, jedna gałąź z 4 W wiązki podstawowej jest wysyłana do etalonu, który generuje wiązkę wąskopasmową (≈15 cm-1), która jest następnie modulowana z częstotliwością 1,6 MHz za pomocą akustycznego modulatora optycznego (AOM). Pozostała frakcja o mocy 6 W wiązki podstawowej jest podwajana częstotliwościowo za pomocą kryształu trybboranu litu (LBO) o grubości 2,8 mm, oszlifowanego w celu dopasowania fazowego typu I (θ = 90°, φ = 13,8°). Powstała w ten sposób generacja drugiej harmonicznej przy długości fali 520 nm przemieszcza się do wnęki złożonej w kształcie litery X w celu przepompowania optycznego oscylatora parametrycznego (OPO), urządzenia, które wykorzystuje kryształ LBO o grubości 3,0 mm (dopasowanie fazowe typu I, θ = 90°, φ = 9,8°) jako medium aktywne, aby dostarczyć szerokopasmowe promieniowanie optyczne przestrajalne w zakresie widmowym 680-910 nm (Rysunek 2). Te impulsy szerokopasmowe służą jako pompa w eksperymentach SRS i rozchodzą się do kompresora pryzmatycznego w celu wstępnej kompensacji efektów dyspersji indukowanych przez obiektyw mikroskopu.

Po etapie kompresji, płytka falowa λ/2, w połączeniu z płytką dwójłomną YVO4, tworzy dwie ortogonalnie spolaryzowane repliki, których elektroniczne odejmowanie w płaszczyźnie detekcji anuluje szum pompy szerokopasmowej. Lustro dichroiczne łączy pompę i wiązki Stokesa i wysyła je do pionowego mikroskopu. Obiektyw zanurzeniowy w wodzie z aperturą numeryczną (NA) 1,27 skupia światło na próbce, podczas gdy obiektyw zanurzeniowy z olejkiem o NIE 1,4 je zbiera. Przed etapem detekcji filtr krótkoprzepustowy (SPF) usuwa modulowany Stokes, natomiast siatka dyfrakcyjna działająca w konfiguracji Littrow rozprasza transmitowaną pompę szerokopasmową. Drugi PBS2 oddziela repliki pomp, a soczewka skupia je na dwóch układach fotodiod. Sygnały z tych matryc fotodiodowych są elektronicznie odejmowane i przesyłane do zbudowanego w domu wielokanałowego wzmacniacza typu lock-in (M-LIA). Zdemodulowany sygnał jest następnie normalizowany przez odczyty prądu stałego (DC) jednej z matryc fotodiod, wytwarzając w ten sposób widmo SRL.

Jako przykładowy eksperyment, wyobrażamy sobie mieszaniny kilku dobrze znanych rozpraszaczy Ramana, z których każdy ma unikalne widmo Ramana. W związku z tym protokół rozpoczyna się od opisania sposobu przygotowania próbek referencyjnych. Po wykryciu SRL kontynuujemy wyjaśnianie, jak uzyskać wąskopasmowe impulsy Stokesa i skonfigurować źródło optyczne, które dostarcza szerokopasmowe (≈250 cm-1) impulsy pompy, a mianowicie domowe OPO. Protokół pokazuje wyrównanie i optymalizację wiązek optycznych, opisując krytyczne parametry, takie jak moc i widma wąskopasmowego Stokesa i pompy szerokopasmowej. Protokół szczegółowo opisuje ścieżkę optyczną pompy szerokopasmowej, ponieważ wymaga specjalnych elementów optycznych. Wyjaśnia również, jak znaleźć czasoprzestrzenne nakładanie się impulsów Pumpa-Stokesa i pokazuje praktyczny sposób określania szumu o względnym natężeniu (RIN), co z kolei pomaga zdefiniować najlepszą częstotliwość modulacji dla eksperymentów SRS. Następnie wyjaśniamy zasadę działania i kalibrację łańcucha detekcji. Na koniec protokół pokazuje proces akwizycji danych, chemometrię i potok przetwarzania obrazu.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje sposób uzyskiwania map stężeń oraz charakterystycznych widm SRS w przypadku mieszanin chemicznie heterogenicznych.

  1. Aby przygotować próbkę, należy wyekstrahować 2 µL z wodnej zawiesiny mikrokulek polimetakrylanu metylu (PMMA) (patrz) Tabela materiałów) i wlej 2 µL frakcję na szkiełko nakrywkę do mikroskopu.
    1. Za pomocą czystego końcówki pipety należy pobrać 2 µL z wodnej zawiesiny mikrokulek polistyrenowych (PS) i połącz ją z zawiesiną PMMA na szkiełku podstawowym. Za pomocą końcówki pipety delikatnie wymieszaj zawiesinę i pozostaw do wyschnięcia na 24 h.
      UWAGA: Ważne jest, aby dokładnie dopasować stężenie zawiesin mikrokulek, aby uniknąć nieproporcjonalnej ilości mikrokulek na powierzchni próbki. Średnice kulek PS i PMMA wynoszą odpowiednio 10 i 6 µmodpowiednio. Wymiary te pozwalają na zademonstrowanie wysokiej rozdzielczości przestrzennej mikroskopu bez ograniczania wydajności generowania sygnału SRS.
  2. Na płaską, białą warstwę kulek, która pojawi się po odparowaniu wody, należy nanieść 20 µL dimetylosulfotlenku (DMSO), a następnie 20 µL czystej oliwy z oliwek.
  3. Nanieś lakier do paznokci na krawędzie drugiego szkiełka nakrywki. Połóż szkiełko na mieszaninie stroną z lakierem do dołu, dociskając je wystarczająco mocno, aby zapewnić szczelność. Pozostaw do wyschnięcia.
    UWAGA: Rycina 3 przedstawia przykładowe wyniki uzyskane przy zastosowaniu tych etapów. Przy prawidłowym zamknięciu próbka ta powinna zachować trwałość do trzech miesięcy.

2. Optymalizacja wiązek pompowania i Stokesa

  1. Włącz laser i poczekaj, aż osiągnie równowagę termiczną. Zastosuj ujemną dyspersję prędkości grupowej (GDD) o wartości GDD = -6,000 fs2 dla wiązki fundamentalnej.
    UWAGA: Ta wartość GDD jest krytyczna dla skutecznego wzbudzenia OPO i jest optymalna dla tej konfiguracji, jednak może się różnić w zależności od systemu. Ujemną GDD można wprowadzić za pomocą par siatek, kompresorów pryzmatycznych lub kształtowaczy impulsów opartych na przestrzennych modulatorach światła28.
  2. Podziel wiązkę lasera fundamentalnego za pomocą polaryzacyjnego dzielnika wiązki (PBS1) na dwie gałęzie. Aby uzyskać wąskopasmowe impulsy Stokesa, skieruj jedną gałąź o mocy 4 W do etalonu. Powoli obracaj etalon, aż zostanie uzyskana wąska linia widmowa wycentrowana na szczycie widma impulsu (patrz czerwona krzywa na Rysunku 2).
    UWAGA: Ten etalon posiada efektywną dobroć (finesse) wynoszącą 29 i wolny zakres widmowy (FSR) o szerokości 29,8 nm przy 1,040 nm.
  3. Aby uzyskać modulowane impulsy Stokesa, skieruj wiązkę wąskopasmową do modulatora akustooptycznego.
    UWAGA: Jak pokazano na Rysunku 4A, wiązka dyfrakcyjna pierwszego rzędu ulega 100% modulacji, natomiast wiązka rzędu zerowego tylko w 50%. Dlatego preferowane jest zastosowanie pierwszego rzędu, aby uniknąć oświetlania próbki silną, niemodulowaną wiązką, która może wywołać fotouszkodzenia próbki bez generowania sygnału SRS.
    1. Aby zoptymalizować wydajność modulacji, zmień odległość między soczewkami f1 i f2 (Rysunek 4B). Zmierz modulowaną wiązkę za pomocą fotodiody i zarejestruj jej profil oscyloskopem.
    2. Zmieniaj odległość między f1 i f2 aż do uzyskania maksymalnego kontrastu między amplitudą a linią bazową odczytów z oscyloskopu.
      UWAGA: Ta para soczewek nie działa jako kolimator, lecz tworzy efektywną plamkę ogniskową na krysztale AOM.
    3. Umieść trzecią soczewkę f3, aby precyzyjnie dostroić przetalie wiązki Stokesa, co pozwoli na zmianę objętości oddziaływania w płaszczyźnie ogniskowej mikroskopu i w konsekwencji na optymalizację sygnału SRS.
      UWAGA: W niniejszym protokole wiązka Stokesa była modulowana z częstotliwością 1,6 MHz.
  4. Skoncentruj pozostałe 6 W mocy optycznej wiązki fundamentalnej na krysztale triboranu litu (LBO) (LBO1, θ = 90°, φ = 13,8°), aby podwoić częstotliwość wiązki fundamentalnej poprzez generację drugiej harmonicznej (SHG) (Rysunek 5A).
    1. Aby zmaksymalizować wydajność SHG, powoli obracaj kryształ, zmieniając kąt φ (Rysunek 5B). Zoptymalizuj LBO1, aby uzyskać co najmniej 2,5 W SHG.
  5. Dostosuj kąt φ kryształu LBO2, aby zmaksymalizować wydajność generowania wiązki sygnałowej.
    UWAGA: Ogniskowe soczewek f1, f2 i f3 zostały starannie dobrane w celu dopasowania modu wiązki SHG do wnęki OPO. W związku z tym ogniskowe tych soczewek będą się różnić w zależności od konfiguracji. Ze względu na resztkową dyspersję we wnęce OPO, niewielka zmiana długości wnęki powoduje przesunięcie widma wiązki sygnałowej.
    1. Dostosuj długość wnęki tak, aby uzyskać widmo pompy, które wraz z wąskopasmową wiązką Stokesa przy 1,040 nm pozwoli uzyskać odstrojenie częstotliwości w zakresie 1,373-5,090 cm-1. Zakres ten obejmuje drgania w widmowym obszarze rozciągania wiązań CH (2,800-3,050 cm-1). Patrz niebieskie widma na Rysunku 2.
  6. Aby skompensować efekty dyspersji indukowane przez obiektyw mikroskopu wzbudzającego, skieruj szerokopasmową pompę do kompresora pryzmatycznego. Wprowadź pompę do pryzmatu A przez jego wierzchołek i skieruj rozproszoną pompę w stronę wierzchołka pryzmatu B. Określ wymaganą wartość ujemnej dyspersji, a następnie odpowiednio ustaw odległość L między wierzchołkami pryzmatów.
    UWAGA: Rysunek 6 przedstawia układ pryzmatów29. W tym przypadku kompensacja została ustawiona na GDD ≈ -12,800 fs2; zatem L = 1,26 m.
    1. Użyj pryzmatów ciętych w kącie Brewstera.
      1. Upewnij się, że polaryzacja wiązki pompy znajduje się w płaszczyznach trójkątnych pryzmatów (niepolerowane powierzchnie górna/dolna).
      2. Upewnij się, że kąt padania θin wiązki pompy odpowiada kątowi Brewstera.
      3. Upewnij się, że powierzchnia wylotowa pryzmatu A jest równoległa do powierzchni wlotowej pryzmatu B.
    2. Aby oszacować GDD szerokopasmowego impulsu do skompensowania, zmierz sygnał SRS przy pojedynczej długości fali λ1, rejestrując opóźnienie czasowe τ1 między pompą a wiązką Stokesa, przy którym uzyskano maksimum SRS(λ1). Powtórz tę procedurę dla drugiej długości fali λ2, ponownie rejestrując opóźnienie czasowe τ2 , przy którym SRS(λ2) było maksymalne.
      UWAGA: Ponieważ GDD jest definiowane jako pochodna opóźnienia grupowego po częstotliwości kątowej, wspomniane pomiary pozwalają na oszacowanie GDD wiązki szerokopasmowej (Równanie [1]).
      Równanie GDD; równanie; dyspersja opóźnienia grupowego w systemach optycznych, zmienne czasu i częstotliwości.    (1)
  7. Za pomocą płytki λ/2 ustaw polaryzację wiązki pompy pod kątem 45°. Skieruj spolaryzowaną pompę na płytkę YVO4 o długości 13,3 mm, ustawiając oś szybką tego kryształu dwójłomnego pionowo.
    UWAGA: Po przejściu przez płytkę YVO4 impulsy pompy zostaną rozdzielone na dwie ortogonalnie spolaryzowane repliki propagujące koliniarnie, ale z zachowaniem opóźnienia Δt ≈ 10 ps między nimi. Opóźnienie to jest funkcją grubości i współczynników załamania kryształu dwójłomnego. Dalej repliki pompy o tym samym stanie polaryzacji co impulsy Stokesa będą nazywane „sygnałem”, a te o stanie ortogonalnym „referencją”. Szczegóły tej techniki, zwanej zrównoważoną detekcją w linii (inline balanced detection), zostały opisane wcześniej30.
  8. Połącz wiązki pompy i Stokesa za pomocą lustra dichroicznego i starannie je wyrównaj, używając pary fluorescencyjnych otworków (pinholes), upewniając się, że obie propagują koliniarnie. Osłab wiązki i użyj soczewki, aby skupić je na szybkiej fotodiodzie (o pasmie przenoszenia co najmniej 100 MHz).
    1. Zablokuj pompę i zmierz pojedyncze impulsy Stokesa za pomocą cyfrowego oscyloskopu o szerokim pasmie przenoszenia. Jako źródło taktowania dla pomiarów oscyloskopem wykorzystaj sygnał wyzwalający lasera. Wyznacz średnią wartość, przy której napięcie fotodiody osiąga maksimum.
    2. Zablokuj wiązkę Stokesa i powtórz tę procedurę dla impulsów pompy. Zwiększaj lub zmniejszaj drogę optyczną wiązki pompy (Stokesa), aż jej impulsy będą docierać mniej więcej w tym samym czasie co impulsy Stokesa (pompy).
      UWAGA: Powinno to zagwarantować precyzję dopasowania różnicy dróg optycznych między dwoma ramionami z dokładnością do kilku milimetrów maksymalnie.
    3. Usuń fotodiodę i umieść kryształ nieliniowy z odpowiednim kątem cięcia dla generacji sumy częstotliwości (SFG) między fotonami pompy i Stokesa.
      UWAGA: Kryształ nieliniowy użyty tutaj był cięty dla dopasowania fazowego typu I, θ = 90°, φ = 9,8°. Oś optyczna kryształu nieliniowego powinna być równoległa do polaryzacji impulsów Stokesa i sygnałowych.
    4. Ustaw wiązki pompy/Stokesa tak, aby były lekko niekoliniarne i przesuwaj linię opóźnienia, aż pojawi się SFG – sygnał, który ze względu na dopasowanie fazowe znajduje się między SHG wiązek pompy i Stokesa. Jeśli sygnał nie zostanie znaleziony, zweryfikuj przestrzenne nakładanie się obu wiązek na krysztale.
      UWAGA: SFG jest przesunięte w stronę niebieską i powinno być łatwo widoczne gołym okiem.
    5. W przypadku nieoczekiwanych trudności umieść filtr dolnoprzepustowy, aby usunąć pompę, wiązkę Stokesa oraz ich odpowiednie SHG i zmierz SFG za pomocą spektrometru (Rysunek 7A). Znajdź opóźnienie czasowe, przy którym SFG osiąga maksymalną intensywność – wartość ta określa idealne nakładanie się czasowo-przestrzenne wymagane do generacji sygnału nieliniowego – i tam ustal linię opóźnienia (Rysunek 7B).
  9. Zmierz profile wiązek za pomocą skalibrowanej kamery. Alternatywnie użyj karty podczerwieni i oszacuj średnice „na oko”. Użyj dwóch teleskopów, jednego dla pompy i drugiego dla wiązki Stokesa. Za pomocą tych teleskopów staraj się dopasować średnice wiązek do tylnej apertury obiektywu wzbudzającego.
    UWAGA: Procedura ta zagwarantuje maksymalną rozdzielczość przestrzenną układu.
    1. Po uzyskaniu sygnału SRS użyj teleskopu na wiązce pompy, aby dostroić jej średnicę, zmieniając jej zasięg Rayleigha, a w konsekwencji objętość oddziaływania w ognisku mikroskopu. Przestań, gdy zostanie osiągnięte maksymalne SRS.
  10. Użyj fotodiody do pomiaru intensywności wiązki pompy (Stokesa) i, znając czułość fotodiody, oblicz średnią moc Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, analiza sił, rozkład wektorów, narzędzie edukacyjne z fizyki. padającą na aktywny obszar detektora.
    1. W przypadku użycia fotodiody o szerokim pasmie przenoszenia podłącz elektroniczny filtr dolnoprzepustowy, aby uzyskać tylko stałą składową DC. Aby zmierzyć δP(f), podłącz wyjście fotodiody o szerokim pasmie (odłączając filtr dolnoprzepustowy) do wejścia wzmacniacza lock-in. Zapisz wyjście lock-in w Spektralna gęstość szumu napięcia; równanie; V/√Hz; analiza sygnałów elektrycznych; pomiar naukowy. przy różnych częstotliwościach demodulacji i użyj czułości fotodiody do przeliczenia V na W.
      UWAGA: Komercyjne wzmacniacze lock-in posiadają wbudowane narzędzia do pomiaru δP(f) (np. firma Zurich Instruments zintegrowała w programie LabOne funkcję Frequency Sweeper31).
    2. Po zmierzeniu RIN wiązek wyłącz laser i zmierz szum elektroniczny (tj. RIN obliczony bez żadnego światła na detektorach).
      ​UWAGA: Zakładając, że RIN jest ograniczony przez fluktuacje lasera, a nie przez szum śrutowy, ten pomiar w ciemności pomoże zdiagnozować aparaturę pomiarową; jeśli szum elektroniczny jest tak wysoki jak RIN lasera, nie można go użyć do pomiaru RIN lasera; w celu redukcji szumu elektronicznego może być konieczne zastosowanie wzmacniaczy ultraniskoszumowych.
    3. Jeśli RIN jest ograniczony przez szum śrutowy, a nie przez fluktuacje lasera, skieruj większą moc optyczną na detektor. Patrz Rysunek 8.

3. Konfiguracja detekcji spektralnej dla obrazowania SRS

  1. Kieruj wiązki pompową oraz Stokesa do mikroskopu.
  2. Umieść próbkę omówioną w sekcji 1 i znajdź obszar bez kulek, aby ułatwić ustawienie wiązki pompową. Używając kamery, zmierz profil odbicia wiązki Stokesa (pompową), blokując jednocześnie wiązkę pompową (Stokesa). Dostosuj pozycje plamek laserowych za pomocą luster znajdujących się bezpośrednio przed mikroskopem.
    UWAGA: Aby uzyskać najwyższą generację SRS, wiązki powinny idealnie na siebie nachodzić. Rycina 9 przedstawia (A) wiązkę pompową, (B) wiązkę Stokesa oraz (C) obie wiązki idealnie nałożone na siebie w płaszczyźnie ogniskowej mikroskopu.
  3. Ustaw obiektywy wzbudzające i zbierające w konfiguracji konfokalnej.
    UWAGA: Zastosowanie obiektywów korygowanych do nieskończoności sprawia, że ogniskowanie wiązki pompową w płaszczyźnie próbki spowoduje uzyskanie wiązki kolimowanej w tylnej aperturze obiektywu zbierającego.
    1. Zastosuj filtr krótkoprzepustowy, aby usunąć modulowaną wiązkę Stokesa, i skieruj wiązkę pompową na siatkę dyfrakcyjną. Umieść soczewkę za siatką, aby skupić rozproszoną wiązkę na detektorach.
      UWAGA: Równanie siatki pomoże określić dyspersję liniową (tj. ile nm na mm w płaszczyźnie detektora przy soczewce o danej ogniskowej f32). Równanie siatki wiąże okresowość rowków d siatki, kąt padania α, kąt dyfrakcji β, długość fali dyfrakcyjnej λ oraz rząd dyfrakcji m (Równanie [2]).
      Równanie siatki dyfrakcyjnej mλ=d(sinα+sinβ), schemat, układ spektroskopii optycznej. (2)
  4. W celu detekcji zrównoważonej zmierz widmo replik referencyjnej i sygnałowej rozchodzących się wzdłuż wiązki pompową.
    UWAGA: Profil przestrzenny wiązki pompową za siatką jest linią składającą się z różnych komponentów widmowych szerokopasmowej wiązki pompową wzdłuż jej długości. Każdy komponent widmowy linii pompową zostanie skupiony w odległości f przez soczewkę sferyczną (patrz kroki 3.1-3.2).
    1. Aby uniknąć ucięcia rozproszonej wiązki pompową, umieść soczewkę sferyczną jak najbliżej siatki. Umieść PBS bezpośrednio za soczewką sferyczną, aby rozdzielić repliki pompową.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano polaryzacyjny dzielnik wiązki w kostce, ponieważ ten rodzaj polaryzatora nie zaburza polaryzacji wiązki pompową. Skutecznie rozdziela on również różne repliki pompową i może być wystarczająco duży, aby uniknąć ucięcia szerokopasmowej wiązki pompową. PBS odbije replikę sygnałową (polaryzacja s) i przepuści replikę referencyjną (polaryzacja p).
    2. Za pomocą pary luster kierowniczych skieruj sygnał i referencję do ich odpowiednich detektorów (Rycina 1).
      UWAGA: W idealnej konfiguracji zrównoważonej repliki sygnałowa i referencyjna powinny mieć taką samą moc optyczną.
    3. Aby usunąć szum w wiązce pompową, skoreluj kanały macierzy fotodiod mierzącej sygnał z ich odpowiednikami w detektorze referencyjnym. Upewnij się zatem, że nta fotodioda w macierzach fotodiod sygnałowej i referencyjnej mierzy moc optyczną tego samego komponentu widmowego replik sygnałowej i referencyjnej.
      UWAGA: Rycina 8 przedstawia przykładowe widma RIN.
  5. Aby zagwarantować dopasowanie widmowe między dwiema macierzami fotodiod, umieść małą szczelinę lub przysłonę między siatką a PBS, aby przestrzennie przefiltrować rozproszoną wiązkę pompową. Odetnij wszystkie poza jednym komponentem widmowym replik pompową, aby wycentrować promienie przechodzące na ntym detektorze macierzy fotodiod referencyjnej i sygnałowej. Użyj wspomnianych luster kierowniczych, aby dostosować korelację różnych kanałów detekcji.
  6. W tym momencie rozpocznij mikroskopię SRS. W tym celu moduluj wiązkę Stokesa, wykonaj skan rastrowy próbki i zarejestruj transfer modulacji w widmie pompowym (ΔI) wraz z odpowiadającym mu widmem DC (I), aby uzyskać znormalizowane widmo SRS (ΔI/I) dla każdego piksela. Wygeneruj trójwymiarowe macierze, których wiersze (x) i kolumny (y) zawierają przeskanowane pozycje próbki. W każdym wektorze (z) prostopadłym do płaszczyzny x-y zapisz widmo SRS.
    UWAGA: Rycina 12 przedstawia strukturę hiperspektralnych danych SRS.
    1. Ustaw moc wiązki Stokesa na 65 mW, a moc szerokopasmowej wiązki pompową na 20 mW. Dobierz optymalny czas integracji dla eksperymentów.
      UWAGA: W tym przypadku czas integracji wynosił 44 µs; jednak czas przebywania na pikselu wynosił 1 ms ze względu na wolny skaner piezoelektryczny.

4. Chemometria danych hiperspektralnych SRS

  1. Zastosuj wielowymiarową analizę rozdzielczą krzywych (MCR), aby wyodrębnić poszczególne składniki chemiczne próbki. Pobierz interfejs graficzny (GUI) z łącza podanego w pracy Taulera, de Juana i Jaumota33.
    UWAGA: W tym przypadku wykorzystano program MATLAB do wielowymiarowej rozdzielczej analizy krzywych z zastosowaniem naprzemiennych najmniejszych kwadratów (MCR-ALS), opracowany przez Taulera i współpracowników34,35. W kwestii zastosowania MCR-ALS do danych SRS należy odnieść się do pozycji 36,37; szczegółowe omówienie algorytmu znajduje się w pozycji 38.
  2. W programie MATLAB przekształć hiperspektralny sześcian danych SRS w macierz D, której wiersze zawierają widma SRS. Przyjmij, że rozłożony hiperkostkowy zestaw danych SRL D jest kombinacją liniową stężeń C oraz profilów spektralnych S składników chemicznych próbki (tj. D = CS T + E, gdzie E jest macierzą zawierającą błąd pomiarowy, a indeks górny T oznacza transpozycję macierzy).
  3. Wyznacz główne komponenty danych, aby oddzielić C i S. Ponieważ z góry wiadomo, że próbka omówiona w sekcji 1 zawiera cztery substancje, mianowicie DMSO, olej oliwkowy, PMMA oraz PS, skonfiguruj program tak, aby szukał czterech gatunków oraz dodatkowego komponentu uwzględniającego szum tła. W przypadku innej próbki z większą lub mniejszą liczbą składników, skonfiguruj program odpowiednio.
    UWAGA: Program wykonuje rozkład według wartości osobliwych danych spektralnych, wykorzystując je jako wartości początkowe dla czystych widm S.
    1. Alternatywnie, wprowadź do programu macierz zawierającą znane ślady spektralne (np. spontaniczne widma Ramana badanych substancji).
      UWAGA: Korzystając z początkowych oszacowań czystych widm, program obliczy C = DS(STS)−1 oraz ST = (CTC)−1CTD. Nowe wartości C i S są optymalizowane za pomocą algorytmu naprzemiennych najmniejszych kwadratów.
  4. Ponieważ sygnał SRS jest nieujemny, ogranicz algorytm naprzemiennych najmniejszych kwadratów tak, aby zwracał wyłącznie wartości dodatnie.
    UWAGA: Zoptymalizowane C i S pozwolą na zbudowanie nowej macierzy D*= CST, która jest zestawem danych porównywanym przez program z oryginalnymi danymi D. Program automatycznie powtarza te kroki do momentu, gdy różnica między D* a D będzie mniejsza niż zdefiniowana wartość progowa.
  5. Wykreśl C i S, aby uzyskać obrazy chemiczne oraz charakterystyczne widma składników chemicznych próbki.

Wyniki

Rycina 3 przedstawia przykładowe wyniki uzyskane przy zastosowaniu tego protokołu dla PS, PMMA oraz oliwy z oliwek. Taki obrót LBO1 zmieni współczynnik załamania światła dla pola SHG, co bezpośrednio zmodyfikuje jego prędkość fazową. Gdy prędkość fazowa pola SHG zrówna się z prędkością polaryzacji nieliniowej indukowanej w LBO1, nieliniowo generowane pole i polaryzacja nieliniowa będą w fazie, co doprowadzi do intensywnego promieniowania SHG. Innymi słowy, regulacja kąta φ kryształu LBO1 pozwoli użytkownikowi na osiągnięcie idealnego warunku dopasowania fazowego dla SHG. Ponieważ zastosowano tutaj kryształ z dopasowaniem fazowym typu I, polaryzacja wiązki SHG będzie prostopadła do polaryzacji wiązki fundamentalnej (Rycina 5B).

Rycina 8 przedstawia RIN źródeł optycznych wykorzystanych w tym protokole oraz limit szumu śrutowego, który wynika z kwantowej natury elektronów i fotonów, ustalając fundamentalną granicę szumu laserowego. RIN ograniczony szumem śrutowym oblicza się za pomocą Analiza sygnału elektromagnetycznego, równanie dB/Hz, wykres widma częstotliwości. zgodnie z równaniem (3).

Równanie analizy szumu dla systemów laserowych, wzór: RIN_shot = 10log₁₀(2hv/P̅), pojęcie optyki. (3)

Gdzie h to stała Plancka, a ν to częstotliwość optyczna. W związku z tym szum śrutowy dostarcza przydatnych wytycznych dla projektowania elektroniki.

Rycina 11A oraz Rycina 11C przedstawiają przykładowe dane widm zrównoważonych i niezrównoważonych. Naturalnie, efekty zrównoważonej detekcji wpływają na końcowe wyniki eksperymentów, a mianowicie na mapy chemiczne. Rycina 11B oraz Rycina 11D pokazują odpowiednio obrazy kompozytowe w warunkach niezrównoważonych i zrównoważonych. Pomyślna implementacja opisanego protokołu pomoże zidentyfikować i zlokalizować różne składniki chemiczne heterogenicznej próbki oraz wyekstrahować ich charakterystyczne widma SRS. Poddanie danych hiperspektralnych z Ryciny 12 analizie chemometrycznej pozwala otrzymać Rycinię 13. Rycina 13A przedstawia kompozycję map stężeń różnych składników chemicznych próbki, natomiast Rycina 13B pokazuje ich charakterystyczne widma SRS. Należy zauważyć, że dane przedstawione na Rycini 13A pozwalają użytkownikowi nie tylko na łatwą identyfikację różnych składników próbki, ale także na przeprowadzenie bardziej ilościowej analizy. Na przykład, korzystając z map stężeń, można obliczyć średnią frakcyjną koncentrację każdego gatunku chemicznego: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS i 22% oliwy z oliwek.

Schemat spektroskopii ultraszybkiej: układ lasera światłowodowego do analizy wzbudzenia i emisji optycznej.
Rysunek 1: Schemat szerokopasmowego mikroskopu SRS zastosowanego w tym protokole. Skróty: PBSx = polaryzacyjny dzielnik wiązki; SHG = moduł generowania drugiej harmonicznej; OPO = optyczny oscylator parametryczny; AOM = modulator akustyczno-optyczny; SPF = filtr dolnoprzepustowy; M-LIA: wielokanałowy wzmacniacz synchroniczny; DM = lustro dichroiczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres analizy widmowej, regulowane linie pompy i Stokesa, intensywność w funkcji długości fali, spektroskopia Ramanowska.
Rycina 2: Widma regulowanej szerokopasmowej pompy (niebieski) i wąskopasmowych (czerwony) wiązek Stokesa. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy dyspersji koloidalnej; oznaczenia PS, PMMA, DMSO, olej; analiza agregacji cząstek.
Rycina 3: Obraz w polu jasnym chemicznie niejednorodnej próbki. Należy zauważyć, że konwencjonalna mikroskopia nie pozwala na rozróżnienie poszczególnych składników. Pasek skali = 100 µm. Skróty: PS = polistyren; PMMA = polimetakrylan metylu; DMSO = dimetylosulfotlenek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres spektroskopii przejściowej absorpcji oraz układ AOM do analizy pomiarów wzbudzenia optycznego.
Rysunek 4Modulacja wąskopasmowych impulsów Stokesa. (A) Przezroczysta niebieska krzywa przedstawia 0th wiązka dyfrakcyjna, podczas gdy czarna pokazuje odpowiadający jej 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. kolejność. (B) Układ optyczny do optymalizacji wydajności modulacji 1st rząd wiązki dyfrakcyjnej oraz precyzyjne dostrojenie rozmiaru plamki wiązki Stokesa przed dotarciem do obiektywu wzbudzającego. Skróty: AOM = modulator akustyczno-optyczny; fProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. = ogniskowa soczewki X. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat generacji drugiej harmonicznej (SHG) i generacji różnicy częstotliwości (DFG) w optyce nieliniowej.
Rysunek 5: Nieliniowe procesy optyczne wymagane do zasilania OPO. (A) Geometria oddziaływania SHG. Dwa fotony podstawowe o częstotliwości ω1 wprowadzają system materiałowy na wysokoenergetyczny poziom wirtualny, z którego system przeskakuje do stanu podstawowego, emitując foton o częstotliwości ωSHG. (B) Schemat eksperymentu SHG. (C) Schemat układów SHG i OPO. (D) Geometria oddziaływania DFG. Foton ωSHG zostaje rozdzielony na foton sygnałowy (ωSignal) i foton idler (ωIdler). Wzmocnienie wiązki sygnałowej uzyskuje się poprzez sprzężenie zwrotne fotonów sygnałowych i doprowadzenie ich do rezonansu w wnęce. (E) Schemat eksperymentu DFG. Skróty: SMx = lustro sferyczne (R = 75 mm); OPO = optyczny oscylator parametryczny; SHG = moduł generacji drugiej harmonicznej; DFG = generacja różnicy częstotliwości; LBO = tryboran litu; OC = kondensator olejowy; DM = lustro dichroiczne; fx = ogniskowa soczewki X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Diagram dyspersji pryzmatycznej, pomiary kątów, konfiguracja drogi optycznej, analiza odchylenia wiązki.
Rysunek 6: Geometria kompresora pryzmatycznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Generowanie sumy częstotliwości; wykres SFG i układ spektroskopowy do wzbudzania optycznego i analizy danych.
Rysunek 7: Generowanie sumy częstotliwości w celu optymalizacji nakładki czasoprzestrzennej. (A) SFG pomiędzy wiązką pompową a wiązką Stokesa oraz ich odpowiednie SHG padające na ekran. Tutaj soczewka skupia wiązkę pompową i wiązkę Stokesa na kryształ, podczas gdy filtr dolnoprzepustowy usuwa te wiązki. (B) Intensywność SFG pomiędzy wiązką pompową a wiązką Stokesa w funkcji opóźnienia czasowego. Ustaw zero czasu w układzie SRS w pozycji maksymalizującej SFG. Asymetria korelacji wzajemnej na rysunku B wynika z profilu czasowego spowodowanego przez etalon na wiązce Stokesa. Skróty: SFG = generowanie sumy częstotliwości; SHG = moduł generowania drugiej harmonicznej; SRS = spektroskopia stymulowanego rozproszonego promieniowania Ramanowskiego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres analizy szumów rozproszenia Ramanowskiego Stokesa; RIN dB/Hz w funkcji częstotliwości, szerokość pasma SRS, badania fizyczne.
Rycina 8: Widma RIN. Pasmo zaznaczone na zielono wskazuje najlepszy obszar widmowy dla eksperymentów SRS. Modulowanie wiązki Stokesa przy dowolnej częstotliwości w obrębie tego pasma gwarantuje najniższy możliwy wpływ szumu laserowego na sygnał SRS. Skróty: RIN = względny szum intensywności; SRS = spektroskopia stymulowanego rozproszenia Ramanowskiego. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzory wzbudzenia optycznego, schemat oddziaływania laserów pompa, Stokes i pompa+Stokes.
Rysunek 9: Profile wiązki. (A) Pompa, (B) Stokes oraz (C) pompa i Stokes. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat spektroskopii optycznej, ustawienie detektora liniowego, kąt β, ogniskowa f, badanie z dziedziny fizyki.
Rysunek 10: Przyjęta geometria dla siatki dyspersyjnej i detektora w postaci matrycy fotodiod. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy analizy widmowej i obrazy mikroskopowe danych SRS dla niezrównoważonej i zrównoważonej liczby falowej.
Rycina 11. Efekty detekcji zrównoważonej. Efekty w odniesieniu do widm (A, C) i obrazów chemicznych (B, D). Kompozyty przedstawione w panelach (B) i (D) stanowią końcowe wyniki eksperymentów (tj. po analizie chemometrycznej danych hiperspektralnych; szczegóły znajdują się w sekcji 4 protokołu). Paski skali = 10 µm. Skrót: SRS = spektroskopia stymulowanego rozpraszania Ramanowskiego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat obrazowania spektralnego 3D, analiza pików liczb falowych, wizualizacja danych mikroskopowych.
Rysunek 12: Reprezentatywny hiperkostka SRS pozyskana za pomocą szerokopasmowej mikroskopii SRS. Płaszczyzna x-y przechowuje współrzędne skanowanych pozycji, podczas gdy każdy wektor wzdłuż osi z rejestruje widmo SRS. Skrót: SRS = spektroskopia stymulowanego rozpraszania Ramanowskiego. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dane mikroskopowe i widmowe; analiza optyczna, wykres przedstawia wyniki dopasowania widma dla różnych długości fal.
Rysunek 13: Analiza chemometryczna hiperspektralnych danych SRS. (A) Kompozyt map stężeń różnych składników próbki. (B) Widma charakterystyczne gatunków chemicznych. Na obu panelach: żółty: oliwa z oliwek, niebieski: DMSO, cyjan: PS, pomarańczowy: PMMA. Pasek skali = 20 µm (A). Skróty: SRS = spektroskopia stymulowanego rozpraszania Ramanowskiego; PS = polistyren; PMMA = polimetakrylan metylu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Mikroskopia szerokopasmowa SRS jest potężną techniką obrazowania, która zapewnia autentyczny kontrast chemiczny pozwalający na identyfikację i rozdzielenie składników chemicznych w próbce heterogenicznej. Potencjał tego narzędzia analitycznego może być przydatny w wielu dziedzinach badawczych, od nauki o materiałach po histopatologię. Wadą mikroskopii szerokopasmowej SRS jest fakt, że jest ona wymagająca pod względem technicznym; eksperymentator musi nie tylko posiadać wiedzę na temat szerokopasmowych źródeł laserowych, ale także potrafić manipulować impulsami laserowymi w celu efektywnego generowania sygnału SRS, który z kolei musi być mierzony za pomocą zaawansowanych układów detekcji. Niniejsza praca przedstawia protokół opisujący schemat tworzenia map chemicznych mieszanin związków chemicznych przy użyciu multipleksowego mikroskopu szerokopasmowego SRS. Chociaż opisana praca może wydawać się trywialna dla niektórych fizyków laserowych i specjalistów od mikroskopii nieliniowej, może tak nie być w przypadku czytelników zainteresowanych zaletami mikroskopii szerokopasmowej SRS, których wiedza naukowa wykracza poza te dziedziny. Dlatego staraliśmy się szczegółowo opisać każdy krok, aby pomóc szerokiemu gronu odbiorców zainteresowanych szerokopasmową mikroskopią SRS.

Przedstawiony protokół rozpoczął się od pokazania, jak przygotować prostą, a jednocześnie bogatą spektroskopowo próbkę składającą się z kilku silnych i dobrze znanych rozpraszaczy Ramanowskich. Omówiliśmy sposób uzyskania szerokopasmowej wiązki pompowania oraz wąskopasmowej wiązki Stokesa, które są niezbędne do skonstruowania mikroskopu SRS. Rysunek 5C przedstawia schemat układów SHG i OPO. Należy zauważyć, że soczewka f1 skupia wiązkę podstawową na krysztale LBO1 w celu wygenerowania SHG, podczas gdy lustro dichroiczne odbija promieniowanie SHG i przepuszcza pozostałą wiązkę podstawową. Druga soczewka f2 kolimuje wiązkę SHG. Ponieważ f2 > f1, wiązka SHG zostaje rozszerzona o czynnik równy f2/f1. Trzecia soczewka f3 skupia rozszerzoną wiązkę SHG na drugim krysztale LBO typu I (LBO2) ciętym pod kątami θ = 90° i φ = 29,0°. Poprzez pompowanie LBO2 wspomnianym sygnałem SHG (520 nm), z LBO2 w wyniku generacji różnicy częstotliwości (DFG) wyłoni się promieniowanie w zakresie 680-910 nm, tworząc dwie wiązki: sygnałową (signal) i wolną (idler)27 (Rysunek 5D,E). Ta druga jest odrzucana, natomiast pierwsza jest wzmacniana w rezonatorze OPO, aby dostarczyć impulsy pompowania wykorzystywane w eksperymentach SRS. Pompowania OPO przy 520 nm, czyli wiązki SHG, nie należy mylić z pompowaniem w eksperymentach SRS (tj. wiązką sygnałową OPO).

Kontrast w mikroskopii SRS wynika z nieliniowego sygnału generowanego w punkcie ogniskowania mikroskopu; sygnał ten wymaga skupienia dużej liczby fotonów w płaszczyźnie próbki w danym czasie. Skupienie fotonów to uzyskuje się dzięki obiektywowi mikroskopu o wysokiej aperturze numerycznej (NA), który jest układem soczewek określającym również rozdzielczość przestrzenną systemu: im wyższa NA, tym wyższa rozdzielczość przestrzenna. Jednak obiektywy o wysokiej NA zawierają gęsto upakowane szkło, co wprowadza dodatnią GDD do promieniowania impulsowego, czyli chirp częstotliwości, który ostatecznie poszerza profil czasowy impulsów39. W związku z tym GDD wprowadzona przez obiektyw mikroskopu może zwiększyć czas trwania szerokopasmowych impulsów pompowania, czyniąc go dłuższym niż czasowa obwiednia Stokesa i redukując efektywną, dostępną szerokość pasma sygnału Ramana. Co więcej, to poszerzenie może również wprowadzić zniekształcenie profilu widmowego pomierzonego widma SRS.

W spektroskopii CARS sygnał istotny spektroskopowo pojawia się przy długościach fal różniących się od tych pól wzbudzenia. Do całkowania sygnału CARS w czasie można użyć zwykłej fotopowielaczowej lampy lub kamery CCD (charge-coupled device), sumując tysiące impulsów w celu uśrednienia szumu laserowego. Z kolei sygnał SRS przejawia się jako słaba modulacja transferu osadzona w silnym i fluktuującym tle laserowym. Ponieważ modulacja ta jest słaba, szum laserowy może ją łatwo zagłuszyć, co obniża zarówno szybkość obrazowania, jak i czułość mikroskopu SRS. Dlatego przed obrazowaniem konieczne jest pomiar szumu intensywności względnej (RIN), aby ustalić, czy laser nadaje się do szybkiego obrazowania SRS i wybrać częstotliwość modulacji z najniższym poziomem szumu. RIN definiuje się jako gęstość widmową mocy szumu [δP(f), w jednostkach W2/Hz] lasera znormalizowaną przez średnią moc optyczną (Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, analiza sił, rozkład wektorów, narzędzie edukacyjne z fizyki.)40,41. Innymi słowy, RIN opisuje znormalizowane fluktuacje lasera przy różnych częstotliwościach (Równanie [4]).

Równanie względnego szumu intensywności, RIN=10log₁₀(δP(f)/P̅²)[dB/Hz], formuła analizy szumów. (4)

Zatem RIN jest parametrem systemu SRS, który określa idealny zakres częstotliwości modulacji dla przeprowadzanych eksperymentów. Na przykład oliwkowy słupek na Ryc. 8 przedstawia idealny zakres częstotliwości modulacji dla obrazowania SRS. W przypadku wąskopasmowego SRS użytkownik powinien zmierzyć RIN zarówno wiązki pompowania, jak i wiązki Stokesa, aby wybrać, która wiązka wymaga modulacji w celu osiągnięcia optymalnej wydajności. Z Rysunku 8 wynika na przykład, że wiązka Stokesa ma nieco wyższy RIN niż wiązka pompowania, co oznacza, że pomiary SRG byłyby bardziej zaszumione niż ich odpowiedniki SRL. W przypadku szerokopasmowego SRS wiązką, którą należy modulować, jest wiązka wąskopasmowa.

Dyspersja kątowa D siatki wyraża kąt dyfrakcji jako funkcję długości fali i jest definiowana jako pochodna równania siatki. Dla konfiguracji Littrowa dyspersja kątowa jest określona przez równanie (5).

Równanie dyspersji różnicowej D=dβ/dλ=2/λtanβ; wzór optyczny dla analizy widmowej. (5)

Aby otrzymać równanie (5), przyjęliśmy założenie α = β, rozwiązane równ. (2) dla m/d i wstawiono wynik do dβ/ dλ. Należy zauważyć, że w konfiguracji Littrowa β = sin-1(mλ/2d). W ramach przybliżenia małych kątów zmiana położenia w widmie wynosi fdβ ≈ dl (Rysunek 10). W ten sposób, poprzez wprowadzenie dβ do równania (5), możemy obliczyć dyspersję liniową, której jednostką jest nm mm-1 korzystając z równania (6):

Wzór na statyczną równowagę spektroskopową dλ/dl=1/Df. (6)

Dla siatki dyfrakcyjnej pracującej w konfiguracji Littrowa z 1 851,85 szczelinami/mm, d = 540 nm. Przy zastosowaniu dyfrakcji światła pierwszego rzędu o długości fali ~789 nm, D = 0,0027 rad nm-1. Przy soczewce o f = 750 mm otrzymujemy dyspersję liniową ≈ 0,5 nm mm-1, co przekłada się na ≈ 7,8 cm-1mm-1. Zatem ogniskowa soczewki determinuje „gęstość” nm na mm w płaszczyźnie detektora: im dłuższa ogniskowa, tym mniej nm na mm uzyskuje się, co zwiększa odstęp między liniami widmowymi szerokopasmowej pompy. Odwrotnie, przy krótszych ogniskowych w płaszczyźnie detektora pojawi się więcej nm na mm, co zmniejszy przestrzeń zajmowaną przez zdyspergowaną pompę.

Detekcja zrównoważona poprawia jakość obrazu i czułość w układach z dużym poziomem szumów. Na przykład, zgodnie z widmami RIN przedstawionymi na Rysunku 8 i przy założeniu typowego SRS o amplitudzie 1 x 10-5, niezrównoważony stosunek sygnału do szumu (SNR) wynosi ≈60. Stosując detekcję zrównoważoną (tj. zbliżoną do szumu śrutowego), możliwe jest osiągnięcie SNR ≈145. Rysunek 11 przedstawia widma i obrazy złożone w warunkach zrównoważonych i niezrównoważonych. Naturalnie efekty detekcji zrównoważonej wpływają na końcowe wyniki eksperymentów, a mianowicie na mapy chemiczne. W oparciu o te wyniki podkreślamy, że detekcja zrównoważona jest potężną techniką przeciwdziałania szkodliwym wpływom fluktuacji laserowych na jakość obrazu. Warto wspomnieć, że detekcja zrównoważona jest najlepiej dostosowana do laserów szumiących, takich jak oscylatory światłowodowe. Mikroskopy SRS pracujące z cichymi źródłami światła optycznego (np. laserami półprzewodnikowymi) mogą nie wymagać detekcji zrównoważonej.

Protokół wyjaśnia również podejście oparte na optyce nieliniowej w celu znalezienia czasoprzestrzennego pokrycia impulsów tych wiązek. Opisano zalety wykorzystania 1.szego zamiast 0.ego rzędu dyfrakcji AOM jako modulowanej wiązki Stokesa. Ponadto opisano szkodliwe efekty dyspersji na wydajność generowania SRS wraz z sugestiami dotyczącymi sposobów ich łagodzenia za pomocą kompresora pryzmatycznego. Dodatkowo protokół wyjaśnia, jak ustawiać pryzmaty i wyróżnia trzy krytyczne aspekty, które należy wziąć pod uwagę w celu uzyskania optymalnych parametrów. Omawiamy nie tylko znaczenie RIN dla mikroskopii SRS, ale pokazujemy również, jak zmierzyć go za pomocą wzmacniacza lock-in i, na podstawie widma RIN, określić najlepszą częstotliwość modulacji. Na konkretnym przykładzie niniejsza praca wyjaśnia, w jaki sposób równanie siatki pomaga w projektowaniu łańcucha detekcji. Na koniec protokół ilustruje, na podstawie rzeczywistych danych SRS, strukturę hiperkostki SRS oraz sposób jej analizy przy użyciu powszechnie stosowanego naukowego języka programowania.

Protokół ten posiada trzy niewielkie ograniczenia. Po pierwsze, zastosowany w niniejszej pracy schemat detekcji składa się z niekonwencjonalnego, wielokanałowego detektora lock-in, zaprojektowanego i zbudowanego wewnętrznie przez Sciortino i współpracowników26. Jak wykazano wcześniej25, detektor ten można zastąpić standardową zrównoważoną fotodiodą. Chociaż modyfikacja ta dotyczy wyłącznie detektora i pozostawia protokół praktycznie niezmienionym, przy zastosowaniu pojedynczej fotodiody konieczne jest skanowanie każdego składnika widmowego na detektorze zamiast jednoczesnego pomiaru wszystkich składników. Po drugie, protokół ten wykorzystuje detekcję zrównoważoną w linii, co wymaga wstawienia kilku elementów optycznych na drodze wiązki. Elementy optyczne te zwiększają złożoność układu i prowadzą do strat mocy optycznej oraz poszerzenia impulsu.

Detekcja zrównoważona w układzie szeregowym wymaga również, aby dwie repliki pompy przechodziły przez próbkę, co może nie być idealne dla próbek światłoczułych, takich jak żywe komórki, lub dla próbek silnie dwójłomnych, w których dwie repliki pompy mogą napotkać różne właściwości optyczne, co zniesie efekt detekcji zrównoważonej. Po trzecie, protokół opiera się na własnoręcznie zbudowanym OPO, urządzeniu, które może nie być łatwo dostępne. Niemniej jednak, alternatywą dla szerokopasmowych widm dostarczanych przez OPO są superkontinua generowane przez nieliniowe włókna optyczne lub kryształy objętościowe. Te ostatnie mogłyby być zastosowane wyłącznie z laserami o niskiej częstotliwości repetycji (do 5 MHz). Zatem, podobnie jak w każdym projekcie eksperymentalnym, niniejszy protokół posiada pewne ograniczenia. Są one jednak minimalne i nie wpływają negatywnie na skuteczność tego podejścia.

Choć w niniejszej pracy opisano próbkę referencyjną, protokół ten może z powodzeniem rozdzielać gatunki chemiczne wewnątrz komórek oraz tkanek zwierzęcych i roślinnych, takie jak celuloza, lipidy czy białka, znajdując praktyczne zastosowanie w różnych badaniach biochemicznych lub jako narzędzie diagnostyczne w histopatologii. Podobnie, protokół ten może być wartościowym narzędziem w naukach o materiałach. Na przykład, stosując ten protokół, można badać skład molekularny i stężenie gatunków polimerowych42. Co więcej, metodologia ta jest kompatybilna z innymi technikami mikroskopii nieliniowej, takimi jak mikroskopia szerokopasmowa oparta na układzie pompa-sonda43 oraz heterodynowy CARS44 – procesy mieszania czterofalowego, które, podobnie jak SRS, wymagają dwóch wiązek światła wzbudzającego i pomiarów transferu modulacji. Wreszcie, niektóre informacje zawarte w niniejszej pracy można zastosować w technikach obrazowania nieliniowego, które nie opierają się na technikach transferu modulacji, lecz wymagają zestawienia dwóch lub więcej wiązek laserów impulsowych, takich jak konwencjonalna mikroskopia CARS45 i SFG46.

Podsumowując, niniejszy protokół opisuje potężną metodologię opartą na szerokopasmowej mikroskopii SRS, służącą do wyodrębniania map chemicznych oraz ich charakterystycznych widm SRS z mieszanin chemicznie heterogenicznych, dostarczając zestawy danych umożliwiające prostą ilościową analizę danych. Wszechstronność i prostota tej metody dają zainteresowanemu czytelnikowi możliwość dostosowania jej do różnych technik nieliniowych.

Oświadczenia

G. C. deklaruje zaangażowanie w firmę Cambridge Raman Imaging, której celem jest komercjalizacja technologii szerokopasmowej mikroskopii SRS. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

D. P. potwierdza finansowanie z projektu Unii Europejskiej CRIMSON na podstawie Umowy o Grant nr 101016923 oraz projektu Regione Lombardia NEWMED na podstawie Umowy o Grant No. POR FESR 2014-2020. G. C. potwierdza finansowanie projektu GRAPHENE Core3 z Unii Europejskiej na podstawie umowy o grant nr 881603. G. C. potwierdza również finansowanie z Uniwersytetu Nauki i Technologii Króla Abdullaha, numer grantu: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cel kolekcjonerskiNikonCFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, NikonOil immersion
obiektyw Szkiełka nakrywkoweThermo Fisher043211-KJQuartz, szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Linia opóźniającaPhysik Instrumente (PI)M-406.6PDPrecyzyjny stolik do mikrotranslacji, zakres przesuwu 150 mm
DMSOMerckD8418-500MLMetylosulfinylmetan, klasa biologii molekularnej DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
EtalonSLS Optics LtdWykonana na zamówieniepowłoka antyrefleksyjna przy 1,040 nm, zamontowana w ogniwie ze stali nierdzewnej o średnicy 38 mm x długości 35,5 mm z ochronnymi osłonami przeciwpyłowymi i średnicy 50 mm ' zacisk zaciskowy" pierścień montażowy
Obiektyw wzbudzeniaNikonCFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, NikonObiektyw zanurzeniowy w wodzie
KrataLightSmythT-1850-800sSeries High Efficiency Transmission Krata Seria T-1850-800s
LaserCoherentCustom madeFidelity, HP
λ/2ThorlabsSAHWP05M-1700Zamontowany superachromatyczny płyta półfalowa
PBSThorlabsCM5-PBS203/M16 mm Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki montowany w kostce 16 mm,
koraliki PMMAMerckMFCD00198073Mikrocząsteczki na bazie pryzmatów polimetakrylanowych
Crisel320-8218LASEROWE PRYZMATY DYSPERSYJNE w SF11
Koraliki PSMerck72986-10ML-FMikrocząsteczki na bazie polistyrenu
YVO4 kryształDr. Sztatecsny GmbHWykonane na zamówienie  Grubość 8 mm, średnica 1,00 cm, 1 689,00 689,00 Nadaje się do montażu 1", powlekany dla 850 - 1,100 nm

Bibliografia

  1. Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
  2. Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
  3. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  4. Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
  5. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  6. Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
  7. Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
  8. Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
  9. Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
  10. Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020(2018).
  11. Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101(2018).
  12. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  13. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  14. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  15. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363(2009).
  17. Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305(2020).
  18. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent Raman scattering microscopy. , CRC press. Boca Raton. (2012).
  19. Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
  20. Blume, R. J. Boxcar'' integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
  21. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  22. Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378(2019).
  23. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  24. De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
  25. Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
  26. Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
  27. Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545(2017).
  28. Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer's guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001(2010).
  29. Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150(1984).
  30. Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475(2017).
  31. Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , https://www.zhinst.com/europe/en/blogs/noise-spectral-density-measured-lock-amplifiers (2021).
  32. Palmer, C., Loewen, E. G. Diffraction grating handbook. , (2005).
  33. Tauler, R., de Juan, A., Jaumot, J. Multivariate curve resolution homepage. , Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021).
  34. Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
  35. de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
  36. Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
  37. Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
  38. Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , Elsevier. (2020).
  39. Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397(1997).
  40. Paschotta, R. RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise.". , Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021).
  41. Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101(2020).
  42. Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
  43. Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
  44. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241(2006).
  45. Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363(2002).
  46. Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891(2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia SRSszerokopasmowa SRSmikroskopia hiperspektralnawidmo wibracyjneanaliza chemometrycznadetekcja zr wnowa onaoptyczny oscylator parametrycznydiagnostyka tkanek

Powiązane artykuły