Method Article

Oczyszczanie i identyfikacja białek specyficznych dla typu komórki ze złożonych tkanek przy użyciu zmutowanej linii myszy syntetazy tRNA metioniny

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić znakowanie białek specyficznych dla typu komórki za pomocą azydonorleucyny (ANL) przy użyciu linii myszy wyrażającej zmutowaną syntetazę tRNA L274G-metioniny (MetRS*) oraz niezbędne kroki do izolacji białek specyficznych dla znakowanego typu komórki. Przedstawiamy dwie możliwe drogi podawania ANL żywym myszom poprzez (1) picie wody i (2) wstrzyknięcia dootrzewnowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie homeostazy białek in vivo jest kluczem do poznania jak działają komórki zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i chorobowych. Niniejszy protokół opisuje znakowanie in vivo, a następnie oczyszczanie nowo zsyntetyzowanych białek przy użyciu zmodyfikowanej linii myszy w celu skierowania znakowania białek do określonych populacji komórkowych. Jest to linia indukowana przez ekspresję syntetazy tRNA L274G-metioniny (MetRS*) przez rekombinazę Cre, umożliwiającą włączenie azydonorleucyny (ANL) do białek, co w przeciwnym razie nie nastąpi. Za pomocą opisanej tutaj metody możliwe jest oczyszczenie proteomów specyficznych dla typu komórki znakowanych in vivo i wykrycie subtelnych zmian w zawartości białka spowodowanych zmniejszeniem złożoności próbki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowa homeostaza białek jest spowodowana brakiem równowagi w syntezie i degradacji białek. Kilka chorób jest związanych ze zmianami w homeostazie białek. Cechą charakterystyczną niektórych chorób jest obecność agregatów w różnych lokalizacjach subkomórkowych i obszarach mózgu. Homeostaza białek jest nie tylko ważna w chorobie, ale także odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu narządów i komórek1. Na przykład synteza białek jest niezbędna dla wielu form plastyczności neuronalnej2,3, zgodnie z zastosowaniem chemicznych inhibitorów, które blokują syntezę białek4. Jednak nie jest jasne, w których typach komórek proteom jest zmieniany w celu wspierania uczenia się i pamięci, ani nie wiadomo, które specyficzne białka w każdym typie komórki zwiększają lub zmniejszają swoją syntezę lub degradację. W związku z tym kompleksowe badanie homeostazy białek wymaga zdolności do różnicowania proteomów pochodzących z określonych typów komórek. Rzeczywiście, identyfikacja proteomów specyficznych dla typu komórki w celu badania procesów komórkowych zachodzących w środowisku wielokomórkowym była ważną przeszkodą w proteomice. Z tego powodu opracowaliśmy technikę wykorzystującą ekspresję MetRS* w połączeniu z metodami bioortogonalnymi, która okazała się skutecznym sposobem identyfikacji i oczyszczania proteomów specyficznych dla typu komórki, wypełniając tę lukę5,6,7.

Ekspresja zmutowanego MetRS* (MetRS L274G) pozwala na załadowanie niekanonicznego analogu metioniny ANL do odpowiedniego tRNA8,9 i jego późniejsze włączenie do białek. Gdy ekspresja MetRS* jest regulowana przez promotor specyficzny dla typu komórki, niekanoniczny aminokwas zostanie włączony do białek w sposób selektywny dla komórki. Po włączeniu ANL do białek, może być selektywnie funkcjonalizowany za pomocą chemii kliknięć, a następnie wizualizowany za pomocą obrazowania (FUNCAT) lub Western Immunoblot (BONCAT). Alternatywnie, białka mogą być selektywnie oczyszczane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas (MS). Korzystając z tej technologii, stworzyliśmy linię myszy wyrażającą białko MetRS* pod kontrolą rekombinazy Cre. Biorąc pod uwagę rosnącą liczbę dostępnych linii Cre-mys, system MetRS* może być używany w dowolnej dziedzinie do badania dowolnego typu komórki z dowolnej tkanki, dla której istnieje istniejąca linia Cre. Znakowanie białek za pomocą ANL jest możliwe in vitro lub in vivo i nie zmienia zachowania myszy ani integralności białka6. Przedział czasowy znakowania można dostosować do pytania naukowego każdego badacza, znakując nowo zsyntetyzowane białka (krótsze czasy znakowania) lub całe proteomy (dłuższe czasy znakowania). Zastosowanie tej techniki jest ograniczone liczbą komórek typu, który badacz jest skłonny zbadać; W związku z tym izolacja białek z typów komórek o niskiej liczbie lub niskim tempie metabolizmu nie jest możliwa tą metodą. Celem przedstawionej metody jest identyfikacja specyficznych dla typu komórki białek/proteomów znakowanych in vivo. W tym protokole opisujemy, jak znakować proteomy specyficzne dla typu komórki za pomocą ANL u żywych myszy i oczyszczać znakowane białka. Po oczyszczeniu białka można zidentyfikować za pomocą rutynowych protokołów spektrometrii mas5,10. Zmniejszenie złożoności próbki osiągnięte w tej metodzie poprzez selektywne oczyszczanie białek z określonych populacji komórkowych pozwala eksperymentatorowi wykryć subtelne zmiany w proteomach, na przykład w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Oczyszczanie znakowanych białek można osiągnąć w ciągu ~10 dni, nie wliczając analizy MS ani okresu znakowania. W tym miejscu opisujemy dwie metody podawania ANL myszom z ekspresją MetRS*, a mianowicie (1) dodanie aminokwasu do wody pitnej i (2) wprowadzenie ANL przez wstrzyknięcia dootrzewnowe. Niezależnie od wybranej metody podawania ANL, etapy izolacji i oczyszczania są takie same (od kroku 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą lokalnych urzędów rządowych w Niemczech (RP Darmstadt; protokoły: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) lub Hiszpanii (Komitet Eksperymentów na Zwierzętach przy UCM i Poradnictwie Środowiskowym Comunidad de Madrid, numer protokołu: PROEX 005.0/21) i są zgodne z zasadami Towarzystwa Maxa Plancka i hiszpańskimi przepisami oraz są zgodne z wytycznymi UE dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

1. Znakowanie metaboliczne in vivo za pomocą ANL

  1. woda pitna:
    1. Rozpuść ANL i maltozę w zwykłej wodzie pitnej myszy. Zalecane stężenie maltozy wynosi 0,7% (wag./obj.). Maksymalna ilość ANL dodawana do wody pitnej wynosi 1% (wagowo/obj.). Gdy mieszanina jest gotowa, wysterylizuj ją przez filtrację i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    2. Dostarczyć myszom mieszaninę przygotowaną w kroku 1.1. Często zmieniaj butelki (np. co 3 dni), aby uniknąć zanieczyszczeń, i sprawdzaj je codziennie, aby sprawdzić, czy nie ma ewentualnego zanieczyszczenia lub zatkania. Monitoruj ilość wypijanej wody dziennie, ważąc ją, aby poznać spożycie ANL przez myszy.
      UWAGA: Maksymalny oceniany tutaj okres znakowania wynosi 3 tygodnie przy stężeniu ANL wynoszącym 1% w wodzie pitnej, co spowodowało dobrze wykrywalne znakowanie w mózgu. Dobre oznakowanie można również osiągnąć w ciągu 2 tygodni. Ani krótsze czasy znakowania, ani dłuższe punkty czasowe, ani inne ilości ANL nie były przez nas badane przy użyciu tej metody podawania, co nie oznacza, że powyższe nie zadziała. Szybkość inkorporacji ANL może się różnić w zależności od badanej tkanki lub typu komórki. Czas etykietowania może się różnić w zależności od kwestii naukowej; Na przykład, jeśli proteomy miałyby być znakowane, to czas znakowania powinien być obliczany w funkcji średniego okresu półtrwania białek w badanej tkance. Jeśli zainteresowanie polega tylko na identyfikacji nowo zsyntetyzowanych białek, czasy te można skrócić. Okresy znakowania i dawki ANL muszą być empirycznie przetestowane dla każdego warunku eksperymentalnego i typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania.
  2. Podawanie dootrzewnowe:
    1. Rozpuścić ANL w fizjologicznym roztworze NaCl do 400 mM, buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) lub wodzie.
    2. Upewnij się, że osmolarność roztworu mieści się w zakresie fizjologicznym. Tutaj myszom podaje się 10 ml/kg masy ciała roztworu ANL.
      UWAGA: Dobre znakowanie w neuronach pobudzających mózgu można z powodzeniem uzyskać przez jedno codzienne wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) z 400 mM ANL przez 1 tydzień. W tym badaniu nie przetestowano ani niższych stężeń ANL, ani innych okresów znakowania za pomocą iniekcji IP, co nie oznacza, że nie zadziałają. ANL jest dostarczany w postaci chlorowodorku przez niektóre firmy. W takim przypadku pH roztworów należy dostosować do odpowiedniego pH (w zależności od drogi podawania). ANL może być również syntetyzowany zgodnie z metodą opublikowaną przez Link et al.11 z pewnymi modyfikacjami5. Znakowanie ANL można przeprowadzić przy użyciu innych stężeń ANL, przedziałów czasowych i dróg podawania. W przypadku tkanek/typów komórek o niskim tempie metabolizmu można zastosować dietę o niskiej zawartości metioniny, zawsze rozpoczynając 1 tydzień przed podaniem ANL. Gdy stosuje się 400 mM ANL, może on wytrącać się podczas przechowywania w temperaturze 4 °C; podgrzanie do 37 °C powoduje powrót ANL do roztworu. Pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową przed wstrzyknięciem. W większości regionów świata podawanie ANL myszom jest eksperymentem na zwierzętach i musi zostać zatwierdzone przez odpowiednie władze.

2. Pobieranie tkanek, liza i ekstrakcja białek

  1. Sekcja tkanki: Wypreparuj obszar tkanki zawierającej typ komórki będący przedmiotem zainteresowania i zanotuj wagę pobranego kawałka tkanki.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy (punkt zatrzymania). W niniejszym protokole rozbiorowano korę i hipokamp myszy.
  2. Liza tkanek: Homogenizuj tkankę w temperaturze pokojowej, dodając objętość 12-15 razy większą niż mokra masa tkanki buforu do lizy (PBS pH 7,4, 1% wag./obj. SDS, 1% (obj./obj.) Triton X-100, benzonaza (1:1000 obj./obj.), inhibitor proteazy (PI) (wolny od EDTA 1:4000)). Na przykład w przypadku fragmentu tkanki o wielkości 20 mg dodaj 240-300 μl buforu do lizy. Rozcierać tkankę, aż do jej homogenizacji.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy (punkt zatrzymania). Do bezpośredniej homogenizacji w probówkach o pojemności 1,5 ml zaleca się stosowanie ręcznego homogenizatora zasilanego bateryjnie, zwłaszcza gdy przetwarzane są małe kawałki tkanki. W przypadku większych kawałków można użyć homogenizatora Dounce. Do każdego buforu, w którym znajdują się inhibitory proteazy (PI), należy je dodać bezpośrednio przed użyciem, a nie wcześniej.
  3. Denaturacja białek: Podgrzewać homogenat do temperatury 75 °C przez 15 minut i odwirowywać przy 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 10 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki.
  4. Pomiar zawartości białka: Zmierzyć stężenie białka w każdej próbce i dostosować wszystkie próbki, które mają być porównane, do tego samego stężenia białka; dostosować stężenie, dodając bufor do lizy. Optymalny zakres stężeń wynosi od 2 do 4 μg/μL,
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy (punkt zatrzymania).
  5. Alkilowania
    1. Rozcieńczyć homogenizowane próbki 2-3 razy w PBS (pH 7,8) + PI (bez EDTA 1:4000).
    2. Dodać jodoacetamid (IAA) do końcowego stężenia 20 mM (roztwór podstawowy 500 mM).
    3. Pozostawić próbki na 1-2 godziny w temperaturze 20 °C w ciemności. Wykonaj kroki 2.5.2-2.5.3 dwukrotnie.
      UWAGA: W przypadku niektórych tkanek, jeśli niespecyficzne kliknięcie w kontroli ujemnej pozostaje wysokie, może być konieczne wykonanie etapu redukcji przed alkilacją12. Przygotuj wywar IAA na świeżo tuż przed dodaniem go do próbek. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy (punkt zatrzymania).
  6. Wymiana buforu: Równoważenie kolumn wymiany za pomocą bufora wymiany chemicznej typu click (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 i PI (1:4000)). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Wymień wszystkie próbki alkilowane.
    UWAGA: Wymyte próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy (punkt zatrzymania). W tym kroku IAA jest eliminowany, a bufor jest wymieniany przez bufor chemiczny klik. Białko można ponownie zmierzyć po etapie wymiany buforu, aby upewnić się, że białka nie zostały utracone podczas procesu wymiany buforu. W zależności od rodzaju kolumn używanych do wymiany, białko może być masowo tracone. Używaj zalecanych kolumn, aby uniknąć utraty białka. Do przechowywania próbek zaleca się przygotowanie podwielokrotności.
  7. Kliknij reakcję, aby ocenić włączenie ANL do eksperymentu
    1. Pobrać 40 μl eluowanych próbek z kroku 2.6 i dodać PBS (pH 7.8) do końcowej objętości 120 μl.
    2. Aby uruchomić reakcję chemiczną typu click, dodaj następujące odczynniki w podanej kolejności i wiruj przez 20 s po każdym dodaniu: 1,5 μl ligandu triazolowego (zapas 40 mM), 1,5 μl alkinu biotyny (zapas 5 mM) i 1 μl bromku Cu(I) (zapas 10 mg/ml, rozpuszczony w DMSO przez ostrożne pipetowanie w górę iw dół, nie wirować). Dodaj odczynniki tak szybko, jak to możliwe.
    3. Próbki należy inkubować przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C z ciągłą rotacją.
    4. Odwirować próbki w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 17 000 x g. Widoczny będzie lekko turkusowy pellet. Przenieść supernatant do nowej probówki.
      UWAGA: Przygotuj bulion bromku Cu (I) bezpośrednio przed użyciem, aby uniknąć utleniania miedzi. Utrzymanie stałego stosunku objętości między próbką poddawaną lizie a PBS między próbkami jest niezbędne do zapewnienia tego samego końcowego stężenia detergentu w każdej probówce. Aby przyspieszyć montaż reakcji chemii kliknięć, zalecany jest wirownik stołowy ze stojakami na rurki. Pobrane próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy lub w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni do czasu dalszego przetwarzania (punkt zatrzymania).
  8. Analiza Western blot w celu oceny włączenia ANL do eksperymentu
    1. Uruchom SDS-PAGE z 20-40 μl supernatantu z reakcji chemicznej typu click (krok 2.7). Użyj 12% żeli akrylowych, uruchom w 1% SDS, 250 mM Tris-HCl, 2 mM glicyny. Biegnij, aż przód wyjdzie z żelu.
    2. Przenieś białka do membrany nitrocelulozowej lub PVDF13.
    3. Inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem GFP (1:500, białko GFP ulega kotranslacji z MetRS*5) i przeciwciałem biotyny (1:1000) w celu wykrycia klikanej alkinu, która jest sprzężona z biotyną.
    4. Przemyj przeciwciało pierwszorzędowe 2 razy przez 10 minut i dodaj przeciwciało drugorzędowe przez 1,5 godziny.
    5. Umyj przeciwciało drugorzędowe 2 razy przez 10 minut i zeskanuj (jeśli używasz przeciwciał sprzężonych z fluoroforem) lub wystaw na działanie filmów (jeśli używasz przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanową).
    6. Określ ilościowo sygnał biotyny za pomocą ImageJ lub podobnego oprogramowania, oceń ogólne oznakowanie każdej próbki eksperymentu i wykryj możliwe wartości odstające. Ocenić stosunek sygnału do szumu (znakowanie próbki ANL do tła z kontroli ujemnych) doświadczenia i wykryć ewentualne zwierzęta, które nie przyjęły/nie włączyły ANL.
      UWAGA: W przypadku próbek o wysokim włączeniu ANL oczyszczanie białek jest teoretycznie możliwe przy użyciu nierozszczepialnych alkinów, takich jak ten użyty w tej sekcji do oceny inkorporacji ANL. Korzystając z próbek mózgu, tło uzyskane w kontrolach ujemnych przez MS po oczyszczeniu białek przy użyciu nierozszczepialnych alkinów jest zbyt wysokie14. Dlatego tylko łatwiejsze w obsłudze, nierozszczepialne alkiny zostały użyte do pierwszej ogólnej oceny próbki i eksperymentu. Niezależnie od rodzaju alkinu przeznaczonego do oczyszczania białek, zaleca się wykonanie kroków optymalizacji dawkowania alkinów opisanych w poniższej sekcji (krok 2.9).
  9. Reakcja kliknięcia w celu optymalizacji dawkowania rozszczepialnego alkinu
    1. Przygotować cztery probówki z 40 μl jednej reprezentatywnej próbki (otrzymanej w kroku 2.6 i ocenianej w kroku 2.8) i dodać PBS (pH 7.8) do końcowej objętości 120 μl.
    2. Ustaw reakcję chemiczną kliknięcia, jak wyjaśniono w kroku 2.7, ale tym razem dodaj cztery różne ilości alkinu DST. W przypadku wspomnianego alkinu zaleca się badanie 5 μM, 15 μM, 30 μM i 60 μM.
    3. Powtórz krok 2.8, aby zdecydować, która dawka alkinu jest najbardziej odpowiednia dla konkretnego badanego pytania eksperymentalnego, w oparciu o najwyższą skuteczność etykietowania przy najniższym sygnale tła.
      UWAGA: Przed poddaniem pozostałych próbek reakcji kliknięcia należy określić optymalną ilość dowolnego alkinu. Istnieje kilka opcji dostępnych na rynku alkinów, które można stosować. Różnią się one sposobem łupliwości (np. światłem lub środkami redukującymi). Możliwa jest również chemia bez użycia odczynników wspomaganych szczepem (np. odczynników DBCO). Niewielkie zmiany w ilości alkinów lub odczynników DBCO często znacznie zwiększają sygnał w kontroli ujemnej (tle). W tym miejscu opisano oczyszczanie białek za pomocą alkinu z mostkiem dwusiarczkowym rozszczepialnym za pomocą środków redukujących (alkina dwusiarczkowa biotyna lub DST-alkine15). Korzystając z DST-alkine, do uruchamiania SDS-PAGE (krok 8.1), unikaj ładowania silnymi środkami redukującymi, takimi jak DTT lub β-merkaptoetanol, aby zapobiec rozszczepieniu alkinów. W tym badaniu ogrzewanie w temperaturze 72 °C przez 5 minut przy użyciu 5 mM N-etylomaleimidu (NEM) w buforze ładującym nie wpływa na stabilność DST-alkinu. Krok 2.9.2 można powtórzyć, testując bardziej szczegółowe dawki w zakresie najlepszej zaobserwowanej.
  10. Preparatywna reakcja klikowa do oczyszczania białek
    1. Kliknij wszystkie próbki uzyskane w kroku 2.6 z optymalną dawką alkinu określoną w kroku 2.9 i przeanalizuj frakcję za pomocą SDS-PAGE i Western blot (krok 2.8).
      UWAGA: Upewnij się, że pipety są prawidłowo skalibrowane, aby zapewnić dokładność skalowania próbki. Kliknięte próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy (punkt zatrzymania).

3. Oczyszczanie białka

  1. Wymiana
    1. Wszystkie kliknięte próbki należy poddać procedurze wymiany buforu opisanej w kroku 2.6, ale jako bufor równoważący należy użyć buforu wiążącego neutrawidynę (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 i PI (1:2000)).
      UWAGA: Wymyte próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy (punkt zatrzymania). Na tym etapie niekliknięty wolny alkin jest eliminowany, a bufor jest wymieniany przez bufor wiążący Neutrawidynę.
  2. Wiązanie z kulkami Neutrawidyny
    1. Przepłukać kulki Neutrawidyny o dużej pojemności buforem wiążącym Neutrawidynę (patrz krok 3.1); wymieszać kulki z buforem i odwirowywać mieszaninę przez 5 minut przy 3000 x g, a supernatant wyrzucić. Powtórz trzy razy.
    2. Przygotować zawiesinę kulek Neutrawidyny w stosunku 1:1, dodając taką samą objętość suchych kulek i buforu wiążącego Neutrawidynę.
    3. Odłożyć 20-40 μl każdej próbki w postaci wstępnie oczyszczonego lizatu i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Zmierzyć stężenie białka (patrz krok 2.4) i zmieszać 100 μg białka z 4 μl zawiesiny z kulek otrzymanej w kroku 3.2.2.
    5. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z ciągłą rotacją, umożliwiając znakowane białka związanie się z kulkami.
      UWAGA: Jeśli chodzi o reakcję chemiczną kliknięcia, podstawowa reakcja oczyszczania powinowactwa opisana w kroku 3.2.4 może być przeskalowana. Na przykład, w celu oczyszczenia białek z neuronów pobudzających hipokampa, 1 mg lizatu białkowego miesza się z 40 μl kulek neutrawidyny (zawiesina 1:1). Ilość kulek neutrawidyny może być skalowana w górę lub w dół w zależności od ilości znakowanych białek na mg białka całkowitego, która będzie zależeć od wybranego typu komórki i okresu znakowania i musi być określona empirycznie.
  3. Płukanie kulkami neutrawidyny i elucja białek
    1. Zebrać supernatanty przez odwirowanie (patrz krok 3.2.1). Odstawić 20-40 μl podwielokrotności każdego supernatantu do późniejszej analizy, a resztę zamrozić w temperaturze -80 °C.
    2. Przepłukać kulki schłodzonym buforem płuczącym Neutrawidyna 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (mt/obj.) SDS, 1% (obj.) Triton X-100 i PI (1:2000)) dodając bufor, sedymentując kulki i odrzucając supernatant. Powtórz ten krok trzy razy.
    3. Następnie dodać ten sam bufor i inkubować kulki przez 10 minut w ciągłym obracaniu w temperaturze 4 °C przed odrzuceniem supernatantu. Powtórz ten krok trzy razy.
    4. Umyć kulki zgodnie z opisem w krokach 3.3.2-3.3.3, ale przy użyciu buforu płuczącego Neutrawidyna 2 (1x PBS, pH 7,4 i PI 1:2000).
    5. Umyć kulki zgodnie z opisem w krokach 3.3.2-3.3.3, ale przy użyciu buforu płuczącego Neutrawidyna 3 (50 mM wodorowęglanu amonu i PI 1:2000).
    6. Eluować kliknięte białka przez inkubację kulek przez 30 minut w temperaturze 20 °C z objętością buforu elucyjnego neutrawidyny (5% (obj.) β-merkaptoenolu i 0,03% (wag./obj.) SDS) odpowiadającą jednej objętości użytych suchych kulek.
    7. Utrzymuj kulki w zawiesinie podczas elucji przez ciągłe mieszanie (1000 obr./min) w wytrząsarce termoblokowej. Eluować dwukrotnie i połączyć oba eluaty.
      UWAGA: Wirowanie ustawione do oddzielania frakcji stałej gnojowicy (kulek) i fazy wodnej (supernatantu), jak wyjaśniono w kroku 3.2.1, ma zastosowanie do stopni 3.3.1-3.3.7. Ilość SDS można zwiększyć, jeśli elucja białek nie jest kompletna. Jednak przy ilościach powyżej 0,08%-0,1% SDS, białka niespecyficznie związane z kulkami zaczynają być eluowane. β-merkaptoetanol jest lotny i toksyczny; Zaleca się użycie kaptura w krokach 3.3.6-3.3.7. Próbki pobrane w krokach 3.2.3 i 3.3.1 powinny zostać poddane próbie SDS-PAGE i ocenione za pomocą metody Western blot (patrz krok 2.8) w celu oceny skuteczności oczyszczania powinowactwa (etap 3.3).
  4. Ocena eluowanych białek
    1. Załaduj 1/3 eluowanych próbek do SDS-PAGE (patrz krok 2.8.1).
    2. Wybarwić żel, aby uwidocznić białka za pomocą metody o wysokiej czułości, takiej jak barwienie srebrem lub metoda fluorescencyjna.
    3. Jeśli próbki mają oczekiwaną jakość, co oznacza, że w próbkach znakowanych ANL jest 3-4 razy więcej białka w porównaniu z kontrolą negatywną, eluowane białka można zidentyfikować za pomocą rutynowych metod spektrometrii mas, takich jak ta opisana w reference5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z opisanym protokołem (podsumowanym w Rysunek 1), ANL podawano myszom albo przez codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) przez 7 dni, albo przez wodę pitną (0,7% Maltozy, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) przez 21 dni. Po znakowaniu odpowiednie obszary mózgu zostały wypreparowane, poddane lizie, alkilowane i kliknięte. Reakcje na kliknięcia analizowano za pomocą SDS-PAGE i Western Immunoblot. Reprezentatywne obrazy eksperymentów są pokaza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowymi aspektami protokołu są; włączenie kontroli ujemnych, posiadanie wystarczającej liczby kontrprób biologicznych, droga, ilość i czas podania ANL, alkilowanie próbek, stężenie alkinów i eliminacja β-merkaptoetanolu w przypadku stosowania alkinu DST.

Kluczowe znaczenie ma uwzględnienie próbek kontroli ujemnej pochodzących od zwierząt znakowanych ANL bez czynnika Cre, a zatem bez ekspresji MetRS*. Próbki te muszą być poddane każdemu etapowi opisanemu w protokole równolegle z próbkami od ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.A-C jest finansowany przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), przez Wspólnotę Autonomiczną Madrytu (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) oraz granty MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P jest finansowany przez Wspólnotę Autonomiczną Madrytu (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. jest finansowany przez Towarzystwo Maxa Plancka, Nagroda Advanced Investigator przyznana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostassis, oraz DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Dziękujemy D.C. Dieterichowi i P. Landgrafowi za ich doradztwo techniczne i syntezę DST-Alkyne. Dziękujemy E. Northrupowi, S. Zeisslerowi, S. Gilowi Mastowi oraz zwierzęcemu ośrodkowi MPI for Brain Research za ich doskonałe wsparcie. Dziękujemy Sandrze Goebbels za podzielenie się linią myszy Nex-Cre. Dziękujemy Antonio G. Carroggio za pomoc w redagowaniu tekstu angielskiego. B.A-C. projektował, przeprowadzał i analizował eksperymenty. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. i S. t. D. przeprowadzał i analizował eksperymenty. B.A-C i E.M.S. zaprojektowali eksperymenty i nadzorowali projekt, B.A-C napisał artykuł. Artykuł został zredagowany przez wszystkich autorów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% Akrylamidowe żeleGenScriptSurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-MerkaptoetanolSigmaM6250Toxic; używać fartucha laboratoryjnego, rękawiczek i dygestorium.
Wodorowęglan amonuSigma9830Toksyczny; używać fartucha laboratoryjnego, rękawic i dygestorium
ANLSyntetyzowany zgodnie z wcześniejszym opisem dla AHA (patrz referencje 5 i 11)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
Biotyna alkinaThermo,B10185
Przeciwciało kurczaka anty-GFPAves1020
Kompletny inhibitor proteazy wolny od EDTARoche4693132001Toxic; używać fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.
Bromek miedzi (I)Sigma25418599,999% (wag./wag.)
Znacznik dwusiarczkowy (DST)-alkinSyntetyzowany zgodnie z numerem referencyjnym 15, w którym jest określany jako sonda 20
DMSOSigma276855
FiltersMerkSCGP00525
Acetamid jodo (IAA)SigmaI1149
IR anty kurczak 800LI-CORIRDye 800CWOsioł Przeciwciało wtórne przeciwko kurczakowi
IR anty rabit 680LI-CORIRDye 680RDKozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG Mieszalnik ręczny
MaltozaSigmaM9171
BioSpecProducts1083
NaClSigmaS9888
N-etylomaleimidSigma4259Toksyczny; Używaj fartucha laboratoryjnego, rękawic i dygestorium.
Koraliki NeutrAwidinPierce29200
Membrana nitrocelulozowaBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7,8Preparat opisany w numerze referencyjnym 5
Kolumny PD SpinTrap G-25GE HealthcareWymiana
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo,23225Odczynniki w zestawie do oznaczania białek Pierce BCA są toksyczne dla organizmów wodnych.
Poliklonalne królicze przeciwciało antybiotynoweSygnalizacja komórkowa5597
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE  Bufor biegowy MOPSGenScriptM00138
SYPRO Bejca rubinowaSigmaS4942
Stół automatyczny VortexerEppendorfMixmate
Triazoleligand Sigma678937
Triton X-100SigmaT9284
WaterSigmaW4502Klasa biologii molekularnej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
  3. Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939(2020).
  4. Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
  5. Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
  6. Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
  7. Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
  8. Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
  9. Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
  10. Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
  11. Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
  12. Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
  13. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  14. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
  15. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
  16. Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
  17. van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
  18. O'Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, Clifton, N.J. 309-321 (2004).
  19. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  20. Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
  21. tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
  22. McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
  23. Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377(2016).
  24. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
  25. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  26. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PurificationCell Type SpecificMethionine tRNA SynthetaseIn Vivo LabelingAzidonorleucine IncorporationClick ChemistryMass SpectrometryWestern BlotProtein HomeostasisProteome Analysis

Related Articles