Method Article

Oczyszczanie i identyfikacja białek specyficznych dla typu komórki ze złożonych tkanek przy użyciu zmutowanej linii myszy syntetazy tRNA metioniny

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić znakowanie białek specyficznych dla typu komórki za pomocą azydonorleucyny (ANL) przy użyciu linii myszy wyrażającej zmutowaną syntetazę tRNA L274G-metioniny (MetRS*) oraz niezbędne kroki do izolacji białek specyficznych dla znakowanego typu komórki. Przedstawiamy dwie możliwe drogi podawania ANL żywym myszom poprzez (1) picie wody i (2) wstrzyknięcia dootrzewnowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie homeostazy białek in vivo jest kluczem do poznania jak działają komórki zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i chorobowych. Niniejszy protokół opisuje znakowanie in vivo, a następnie oczyszczanie nowo zsyntetyzowanych białek przy użyciu zmodyfikowanej linii myszy w celu skierowania znakowania białek do określonych populacji komórkowych. Jest to linia indukowana przez ekspresję syntetazy tRNA L274G-metioniny (MetRS*) przez rekombinazę Cre, umożliwiającą włączenie azydonorleucyny (ANL) do białek, co w przeciwnym razie nie nastąpi. Za pomocą opisanej tutaj metody możliwe jest oczyszczenie proteomów specyficznych dla typu komórki znakowanych in vivo i wykrycie subtelnych zmian w zawartości białka spowodowanych zmniejszeniem złożoności próbki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowa homeostaza białek jest spowodowana brakiem równowagi w syntezie i degradacji białek. Kilka chorób jest związanych ze zmianami w homeostazie białek. Cechą charakterystyczną niektórych chorób jest obecność agregatów w różnych lokalizacjach subkomórkowych i obszarach mózgu. Homeostaza białek jest nie tylko ważna w chorobie, ale także odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu narządów i komórek1. Na przykład synteza białek jest niezbędna dla wielu form plastyczności neuronalnej2,3, zgodnie z zastosowaniem chemicznych inhibitorów, które blokują syntezę białek

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą lokalnych urzędów rządowych w Niemczech (RP Darmstadt; protokoły: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) lub Hiszpanii (Komitet Eksperymentów na Zwierzętach przy UCM i Poradnictwie Środowiskowym Comunidad de Madrid, numer protokołu: PROEX 005.0/21) i są zgodne z zasadami Towarzystwa Maxa Plancka i hiszpańskimi przepisami oraz są zgodne z wytycznymi UE dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

1. Znakowanie metaboliczne in vivo za pomocą ANL

  1. woda pitna:
    1. Rozpuść ANL i maltozę w zwykłej wodzie pitnej myszy. Zalecane stężenie ma....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z opisanym protokołem (podsumowanym w Rysunek 1), ANL podawano myszom albo przez codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) przez 7 dni, albo przez wodę pitną (0,7% Maltozy, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) przez 21 dni. Po znakowaniu odpowiednie obszary mózgu zostały wypreparowane, poddane lizie, alkilowane i kliknięte. Reakcje na kliknięcia analizowano za pomocą SDS-PAGE i Western Immunoblot. Reprezentatywne obrazy eksperymentów są pokaza.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowymi aspektami protokołu są; włączenie kontroli ujemnych, posiadanie wystarczającej liczby kontrprób biologicznych, droga, ilość i czas podania ANL, alkilowanie próbek, stężenie alkinów i eliminacja β-merkaptoetanolu w przypadku stosowania alkinu DST.

Kluczowe znaczenie ma uwzględnienie próbek kontroli ujemnej pochodzących od zwierząt znakowanych ANL bez czynnika Cre, a zatem bez ekspresji MetRS*. Próbki te muszą być poddane każdemu etapowi opisanemu w protokole równolegle z próbkami od .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.A-C jest finansowany przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), przez Wspólnotę Autonomiczną Madrytu (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) oraz granty MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P jest finansowany przez Wspólnotę Autonomiczną Madrytu (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. jest finansowany przez Towarzystwo Maxa Plancka, Nagroda Advanced Investigator przyznana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostassis, oraz DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Dziękujemy D.C. Dieterichowi i P. Landgrafowi za ich dora....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% Akrylamidowe żeleGenScriptSurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-MerkaptoetanolSigmaM6250Toxic; używać fartucha laboratoryjnego, rękawiczek i dygestorium.
Wodorowęglan amonuSigma9830Toksyczny; używać fartucha laboratoryjnego, rękawic i dygestorium
ANLSyntetyzowany zgodnie z wcześniejszym opisem dla AHA (patrz referencje 5 i 11)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
Biotyna alkinaThermo,B10185
Przeciwciało kurczaka anty-GFPAves1020
Kompletny inhibitor proteazy wolny od EDTARoche4693132001Toxic; używać fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.
Bromek miedzi (I)Sigma25418599,999% (wag./wag.)
Znacznik dwusiarczkowy (DST)-alkinSyntetyzowany zgodnie z numerem referencyjnym 15, w którym jest określany jako sonda 20
DMSOSigma276855
FiltersMerkSCGP00525
Acetamid jodo (IAA)SigmaI1149
IR anty kurczak 800LI-CORIRDye 800CWOsioł Przeciwciało wtórne przeciwko kurczakowi
IR anty rabit 680LI-CORIRDye 680RDKozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG Mieszalnik ręczny
MaltozaSigmaM9171
BioSpecProducts1083
NaClSigmaS9888
N-etylomaleimidSigma4259Toksyczny; Używaj fartucha laboratoryjnego, rękawic i dygestorium.
Koraliki NeutrAwidinPierce29200
Membrana nitrocelulozowaBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7,8Preparat opisany w numerze referencyjnym 5
Kolumny PD SpinTrap G-25GE HealthcareWymiana
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo,23225Odczynniki w zestawie do oznaczania białek Pierce BCA są toksyczne dla organizmów wodnych.
Poliklonalne królicze przeciwciało antybiotynoweSygnalizacja komórkowa5597
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE  Bufor biegowy MOPSGenScriptM00138
SYPRO Bejca rubinowaSigmaS4942
Stół automatyczny VortexerEppendorfMixmate
Triazoleligand Sigma678937
Triton X-100SigmaT9284
WaterSigmaW4502Klasa biologii molekularnej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PurificationCell Type SpecificMethionine tRNA SynthetaseIn Vivo LabelingAzidonorleucine IncorporationClick ChemistryMass SpectrometryWestern BlotProtein HomeostasisProteome Analysis

Related Articles