Artykuł metodologiczny

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

DOI:

10.3791/63718

⸱

8 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naciek lipidowy w mięśniach szkieletowych, znany jako miosteatoza, wzrasta wraz z otyłością i starzeniem się. Miosteatoza została również niedawno odkryta jako negatywny czynnik prognostyczny dla kilku innych zaburzeń, takich jak choroby sercowo-naczyniowe i nowotwory. Nadmierna infiltracja lipidów zmniejsza masę mięśniową i siłę. Powoduje to również lipotoksyczność i insulinooporność w zależności od całkowitej zawartości lipidów wewnątrzmięśniowokomórkowych, morfologii kropelek lipidów (LD) i dystrybucji subkomórkowej. Rodzaj błonnika (oksydacyjny lub glikolitologiczny) jest również ważny, ponieważ włókna oksydacyjne mają większą zdolność do wykorzystywania lipidów. Ze względu na ich kluczowe implikacje w patofizjologii, uzasadnione są dogłębne badania nad dynamiką LD i funkcją w sposób specyficzny dla rodzaju włókien.

Tutaj, przedstawiono kompletny protokół do ilościowego oznaczania zawartości lipidów wewnątrzkomórkowych oraz analizy morfologii LD i dystrybucji subkomórkowej w sposób specyficzny dla typu włókna. W tym celu seryjne kriosekcje mięśni barwiono barwnikiem fluorescencyjnym Bodipy i przeciwciałami przeciwko izoformom łańcucha ciężkiego miozyny. Protokół ten umożliwia jednoczesne przetwarzanie różnych mięśni, oszczędzając czas i unikając ewentualnych artefaktów, a dzięki spersonalizowanemu makrowi stworzonemu na Fidżi możliwa jest również automatyzacja analizy LD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naciek lipidowy w mięśniach szkieletowych, znany jako miosteatoza, wzrasta wraz z otyłością i starzeniem się. Miosteatoza jest ujemnie skorelowana z masą i siłą mięśni oraz z wrażliwością na insulinę1. Co więcej, ostatnie badania wskazują, że stopień miosteatozy może być wykorzystany jako czynnik prognostyczny dla innych schorzeń, takich jak choroby układu krążenia2, niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby3, lub rak4. Lipidy mogą gromadzić się w mięśniach szkieletowych między włóknami mięśniowymi jako lipidy zewnątrzkomórkowe lub we włóknach, jako lipidy wewnątrzmięśniowokomórkowe (IMCL). IMCL są głównie przechowywane jako trójglicerydy w kropelkach lipidów (LD), które są wykorzystywane jako paliwo metaboliczne podczas ćwiczeń fizycznych5,6. Jednakże, gdy podaż lipidów przewyższa popyt lub gdy mitochondria stają się dysfunkcyjne, IMCL będą zaangażowane w insulinooporność mięśni, co obserwuje się u metabolicznie niezdrowych, otyłych osób i u pacjentów z cukrzycą typu 27. Co ciekawe, sportowcy wytrzymałościowi mają podobny, jeśli nie wyższy, poziom IMCL do tych występujących u otyłych pacjentów z cukrzycą typu 2, przy jednoczesnym utrzymaniu wysokiej wrażliwości na insulinę. Zjawisko to jest opisane jako "paradoks sportowca"8,9 i jest wyjaśnione przez bardziej zniuansowaną ocenę LD mięśni, związaną z ich rozmiarem, gęstością, lokalizacją, dynamiką i składem gatunkowym lipidów.

Po pierwsze, rozmiar LD jest odwrotnie skorelowany z wrażliwością na insulinę i sprawnością fizyczną10,11. W rzeczywistości mniejsze LD wykazują stosunkowo większą powierzchnię działania lipazy, a zatem potencjalnie mają większą zdolność do mobilizacji lipidów12. Po drugie, gęstość LD (liczba/powierzchnia) odgrywa kontrowersyjną rolę w działaniu insuliny8,10; Wydaje się jednak, że jest on zwiększony u sportowców. Po trzecie, subkomórkowa lokalizacja LD jest ważna, ponieważ LD znajdujące się tuż pod błoną powierzchniową (podsarkolemmalną lub obwodową) wywierają bardziej szkodliwy wpływ na wrażliwość na insulinę niż centralne8,9,13. Te ostatnie dostarczają paliwo do centralnych mitochondriów, które mają większą aktywność oddechową i są bardziej wyspecjalizowane, aby zaspokoić wysokie zapotrzebowanie na energię wymaganą do skurczu14. Natomiast obwodowe LD zaopatrują mitochondria subsarkolemmalne, które biorą udział w procesach związanych z błoną8. Wreszcie, poza trójglicerydami, specyficzne złożone lipidy w mięśniach mogą być bardziej szkodliwe niż inne. Na przykład diacyloglicerol, długołańcuchowy acylo-CoA i ceramidy mogą gromadzić się w mięśniach, gdy szybkość obrotu trójglicerydów jest niska, upośledzając w ten sposób sygnalizację insuliny9,15. Wracając do "paradoksu sportowca", sportowcy wytrzymałościowi mają dużą liczbę mniejszych centralnych LD z podwyższonymi wskaźnikami rotacji we włóknach typu I (oksydacyjnych), podczas gdy pacjenci otyli i chorzy na cukrzycę mają większe obwodowe LD z niskimi wskaźnikami rotacji we włóknach typu II (glikolitycznych)8,15,16. Oprócz swojej roli w magazynowaniu i uwalnianiu energii, LD poprzez pochodne kwasy tłuszczowe (FA) i białko płaszcza (perylipina 5) mogą również funkcjonować jako kluczowi gracze zaangażowani w transkrypcyjną regulację utleniania FA i biogenezy mitochondriów8. Ze względu na ich kluczowe implikacje w fizjologii i patofizjologii, uzasadnione są dogłębne badania dynamiki i funkcji LD.

Chociaż istnieje kilka technik do badania IMCL, nie wszystkie są odpowiednie do dokładnego ilościowego określenia rozmiaru, gęstości i rozkładu LD w sposób specyficzny dla światłowodów. Na przykład ocena IMCL za pomocą spektroskopii rezonansu magnetycznego, choć nieinwazyjna, oferuje poziom rozdzielczości, który nie jest wystarczający do zbadania rozmiaru i dokładnej lokalizacji LD w światłowodzie i nie jest specyficzny dla typu światłowodu17,18. Podobnie, techniki biochemiczne wykonywane na homogenatach całych mięśni19 nie mogą ocenić lokalizacji i wielkości lipidów. W związku z tym najbardziej odpowiednią metodą analizy morfologii i lokalizacji LD jest ilościowa transmisyjna mikroskopia elektroniczna13, ale ta technika jest kosztowna i czasochłonna. Dlatego konfokalne obrazowanie fluorescencyjne preparatów z barwnikami takimi jak Oil Red O (ORO)20,21, monodansylpentan (MDH)22, lub Bodipy23,24,25, okazało się najlepszym narzędziem do tych badań.

Tutaj opisany jest kompletny protokół, w tym pobieranie i przetwarzanie tkanek, barwienie Bodipy oraz konfokalne pozyskiwanie i analiza obrazu w celu ilościowego określenia rozmiaru, liczby i lokalizacji LD w kriosekcjach mięśni myszy. Ponieważ IMCL nie są równomiernie rozmieszczone wśród włókien oksydacyjnych i glikolitycznych, a każdy typ włókna inaczej reguluje dynamikę LD, badanie IMCL musi być specyficzne dla typu włókna16,25,26,27. Dlatego protokół ten wykorzystuje immunofluorescencję na odcinkach szeregowych do identyfikacji izoformy (izoform) łańcucha ciężkiego miozyny (MyHC) wyrażonej przez każde włókno. Kolejną zaletą tego protokołu jest jednoczesne przetwarzanie mięśnia glikolitycznego (prostownik długiego palca, EDL) i mięśnia oksydacyjnego (płaszczkowatego) umieszczonych obok siebie przed zamrożeniem (Ryc. 1). To jednoczesne przetwarzanie nie tylko oszczędza czas, ale także pozwala uniknąć zmienności spowodowanej oddzielnym przetwarzaniem próbek.

Schemat protokołu zamrażania tkanek i kriosekcji; Schemat z immunohistochemią i mikroskopią.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury. Po rozbiorze mięśni (1) wybrane mięśnie o podobnej wielkości są przygotowywane i zamrażane razem (2). Seryjne przekroje poprzeczne 10 μm uzyskuje się za pomocą kriostatu i montuje bezpośrednio na szkiełkach adhezyjnych (3). Z dwóch szkiełek seryjnych, pierwszy (4A) jest znakowany immunologicznie na lamininę i barwiony Bodipy w celu rozpoznania LD, a drugi (4B) jest barwiony immunologicznie przeciwciałami przeciwko MyHCs w celu rozpoznania typów włókien mięśniowych. Obrazy są pozyskiwane za pomocą mikroskopu konfokalnego dla Bodipy (5A) i mikroskopu epifluorescencyjnego dla typów włókien mięśniowych (5B). Obrazy są analizowane na Fidżi poprzez zastosowanie progu i ilościowe określenie cząstek (6A) w celu uzyskania liczby, średniej wielkości, gęstości i procentu całkowitej powierzchni zajmowanej przez LD (7) lub zliczanie komórek (6B) w celu uzyskania procentu włókien każdego rodzaju w sekcji (7). Skróty: LDs = kropelki lipidów; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = izoformy łańcucha ciężkiego miozyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury przeprowadzone na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach z Sektora Medycznego na Université Catholique de Louvain (2019/UCL/MD/013).

1. Sekcja i przygotowanie próbek do zamrożenia

  1. Oznacz kawałek korka o grubości 3 mm dla każdej pary mięśni.
  2. Przez małe nacięcie wykonane ostrzem na środku korka, włóż prostopadle prostokątny kawałek sztywnego tworzywa sztucznego (0,5 cm szer., 1 cm wys.), który posłuży jako podpora (Rysunek 2B).
    UWAGA: Rozmiar prostokątnego plastikowego elementu będzie zależał od wielkości mięśnia. Tutaj opisane wymiary są dostosowane do wielkości mięśnia płaszczkowatego (~9 mg, 1 cm dł., 2-3 mm szer.) i EDL (~5 mg, 1 cm dł., 2-3 mm szer.) 3-miesięcznego samca myszy C57BL/6J.
  3. W momencie rozwarstwienia należy usunąć płaszczkowaty i EDL tylnej kończyny myszy. Aby zapobiec wysychaniu próbek podczas sekcji, należy umieścić je na kompresie lekko zwilżonym roztworem soli fizjologicznej na szalce Petriego umieszczonej na lodowisku.
    UWAGA: Zobacz Wang et al.28, aby dowiedzieć się, jak rozciąć te dwa mięśnie kończyn.
  4. Umieść niewielką kroplę środka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na złączu korek/plastik, unikając pęcherzyków powietrza.
  5. Wyeliminuj nadmiar wilgoci z próbek, delikatnie osuszając je ręcznikiem papierowym (Rysunek 2A) i umieść oba mięśnie na plastiku prostopadle do korka (Rysunek 2C).
  6. Sprawdź orientację włókien mięśniowych mięśni pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 2D).
    UWAGA: Ważne jest, aby nie pokrywać mięśnia OCT, ponieważ jego działanie izolacyjne zapobiegłoby szybkiemu zamarznięciu i spowodowałoby artefakty zamarzania.

2. Zamrażanie próbek mięśni szkieletowych do kriosekcji

UWAGA: Zamrożenie mięśni musi odbywać się pod kapturem chemicznym, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Użyj kubka ze stali nierdzewnej (~8 cm wys., 6 cm Ø) z przymocowanymi do niego dwoma bocznymi paskami o długości co najmniej 25 cm (Rysunek 2F) i napełnij kubek izopentanem do 2/3 jego pojemności.
  2. Chwytając kubek za paski, zanurz go delikatnie w styropianowym pudełku wypełnionym ciekłym azotem, tak aby poziom azotu na zewnątrz pojemnika był wyższy niż poziom izopentanu wewnątrz (Rysunek 2F,G).
    UWAGA: Gdy kubek wejdzie w kontakt z azotem, szok termiczny może spowodować zawirowanie. Upewnij się, że kubek jest wystarczająco zanurzony, ale unikaj przedostawania się azotu, ponieważ spowodowałoby to wytrącanie się izopentanu. Jeśli tak się stanie, pozwól izopentanowi ostygnąć, napełnij kubek nowym izopentanem i zacznij od nowa.
  3. Gdy wnętrze kubka jest całkowicie pokryte białą, stałą warstwą izopentanu, wyjmij go z pudełka z ciekłym azotem (Rysunek 2H).
    UWAGA: Temperatura topnienia izopentanu wynosi -159 °C, krawędzie kubka zmienią kolor na biały, gdy będzie wystarczająco zimno.
  4. Delikatnie wymieszaj stałe kawałki izopentanu z pozostałym płynnym izopentanem za pomocą kleszczy, aż cała objętość ponownie stanie się płynna.
  5. Ponownie zanurz kubek w ciekłym azocie, aż izopentan utworzy białe kamyki na całym dnie i krawędziach kubka (Rysunek 2G,H).
    UWAGA: Ten drugi etap chłodzenia zapewnia odpowiednią temperaturę zamarzania izopentanu.
  6. Wyjmij kubek z ciekłego azotu i szybko zanurz mięśnie na dnie kubka, przytrzymując korek pęsetą do zębów szczura. Obracaj korek przez 15 sekund w izopentanie i przechowuj go w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia (Rysunek 2I).
    UWAGA: W przypadku krótkotrwałego przechowywania próbki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Pełny protokół szybkiego zamrażania mięśni szkieletowych został już opublikowany w innym miejscu. Aby uzyskać szczegółowe informacje i informacje na temat rozwiązywania problemów, zobacz: Meng et al.29, Kumar et al.30 oraz Leiva-Cepas et al.31.

3. Kriosekcja

  1. Przenieść próbki do komory kriostatu uprzednio schłodzonego do temperatury -20 °C i temperatury łopatki ustawionej na -25 °C.
    UWAGA: Próbki należy transportować z zamrażarki w temperaturze -20 °C/-80 °C do kriostatu w styropianowym pudełku wypełnionym suchym lodem i przed pocięciem pozostawić próbki do równowagi przez co najmniej 20-30 minut do temperatury komory.
  2. Usuń plastik z korka za pomocą cienkiej pęsety i umieść krążek próbki kriostatu na płycie do szybkiego zamrażania, aby ostygł. Gdy talerz osiągnie temperaturę -50 °C, umieść trochę OCT na krążku i szybko umieść korek na wierzchu dysku, mocno dociskając. Poczekaj, aż OCT zestali się, a korek zostanie dobrze zamocowany na dysku.
  3. Umieść tarczę na głowicy przedmiotu w żądanej orientacji cięcia (Rysunek 2J,K) i przyciąć blok mięśniowy poza co najmniej 1/3 długości mięśni i do momentu, gdy oba przekroje mięśni będą widoczne.
  4. Ustaw grubość cięcia na 10 μm i umieść jedną sekcję na szkiełku adhezyjnym, aby sprawdzić prawidłową orientację włókien pod mikroskopem jasnego pola.
    UWAGA: Sprawdzenie poprzecznej orientacji włókien ma kluczowe znaczenie. Jeśli włókna nie są odpowiednio zorientowane, wyreguluj kąt głowicy przedmiotu, wytnij kolejny odcinek i sprawdź ponownie.
  5. Umieść dwa szeregowe przekroje poprzeczne na dwóch wstępnie oznaczonych szkiełkach adhezyjnych: jeden szkiełko do określenia rodzajów włókien, drugi do ilościowego określenia zawartości lipidów (Rysunek 2L).
    UWAGA: Dodatkowe seryjne przekroje czynne można uzyskać i utrzymywać w temperaturze -80 °C dla innych badań histologicznych. Jednak, aby uniknąć zmiany zawartości lipidów i morfologii wewnątrzkomórkowej24, konieczne jest przetworzenie pierwszych dwóch szkiełek natychmiast po cięciu, aby zapobiec wysuszeniu na powietrzu. Zamrażanie i rozmrażanie szkiełek w celu oznaczania ilościowego LD miałoby taki sam skutek i dlatego jest wysoce niewskazane.

4. Typowanie włókien i barwienie Bodipy

  1. Immunohistochemiczne wykrywanie włókien mięśniowych typu
    UWAGA: Dla poniższego protokołu całkowita objętość roztworu wynosząca 250 μl jest wystarczająca do pokrycia całej sekcji mięśniowej otoczonej okręgiem narysowanym hydrofobowym pisakiem o przybliżonej wielkości monety 1 centa.
    1. Otocz skrawki konturem narysowanym hydrofobowym pisakiem i płucz lodowatym 0,1 M roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT). Umieścić szkiełko w wilgotnej komorze i blokować przez 90 minut w temperaturze 37 °C w roztworze blokującym (10% normalna surowica kozia (NGS) i odczynnik blokujący 1:30 mysz na myszy (MOM) w PBS).
    2. Usunąć roztwór blokujący i inkubować szkiełka przez 90 minut w temperaturze 37 °C z roztworem zawierającym przeciwciała pierwszorzędowe (5% NGS, odczynnik blokujący MOM 1:30, mysie przeciwciała pierwszorzędowe do rozpoznania typu I (IgG2b, w stosunku 1:10), typu IIa (IgG1, w stosunku 1:10) i typu IIx (IgM, w stosunku 1:5) oraz włókna antylamininy szczura (łańcuch α2, 1:1,000) w PBS.
    3. Umyj szkiełka za pomocą PBS 3 x 5 min w temperaturze pokojowej.
    4. Inkubować szkiełka w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem zawierającym przeciwciała drugorzędowe (kozie anty-IgG2b AF405 (1:500), kozie anty-IgG1 AF488 (1:500), kozie anty-IgM AF568 (1:1,000) i kozie anty-laminina AF647 (1:500) w PBS).
      UWAGA: W pozostałej części protokołu upewnij się, że szkiełka są trzymane z dala od światła, aby zachować fluorescencję.
    5. Umyć ponownie 3 x 5 min w PBS, spłukać w podwójnie destylowanymH2O, usunąć nadmiar wody i zamontować odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu.
      UWAGA: Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, aby zachować fluorescencję do momentu uzyskania obrazu. Ponieważ szkiełka nie są zamocowane, zaleca się używanie świeżo przygotowanych roztworów do każdego eksperymentu, autoklawowanie PBS i jak najszybsze uzyskanie obrazów, aby uniknąć zanieczyszczenia sekcji.
  2. Barwienie LD za pomocą Bodipy
    UWAGA: Podobnie jak w kroku 4.1., całkowita objętość roztworu wynosząca 250 μl jest wystarczająca do pokrycia całej sekcji mięśniowej otoczonej okręgiem narysowanym hydrofobowym pisakiem o przybliżonej wielkości monety o nominale 1 centa.
    1. Otocz sekcje konturem narysowanym hydrofobowym pisakiem i płucz lodowatym 0,1 M PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyj lodowatego PBS do wszystkich płukań i prań.
    2. Utrwalić zimnym 4% paraformaldehydem (PFA) bez metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po pierwszym szybkim spłukaniu umyj szkiełka środkiem PBS 3 x 5 min w temperaturze RT.
      UWAGA: Wykonaj ten krok pod maską chemiczną.
    3. Umieść szkiełko w wilgotnej komorze i blokuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 5% NGS w PBS.
    4. Inkubować szkiełka przez 90 minut w temperaturze 37 °C z roztworem pierwszorzędowego przeciwciała (2% NGS i antylamininy szczura (łańcuch α2, 1:1,000) w PBS). Umyj szkiełka za pomocą PBS 3 x 5 min w RT.
      UWAGA: W pozostałej części protokołu upewnij się, że szkiełka są trzymane z dala od światła, aby zachować fluorescencję.
    5. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem przeciwciała drugorzędowego zawierającym kozie przeciwciało anty-szczurzo-AF647 (1:500) w PBS. Umyj szkiełka za pomocą PBS 3 x 5 min w temperaturze pokojowej.
    6. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z roztworem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI, 0,5 μg/ml) i BODIPY (1 μg/ml) w PBS.
      UWAGA: Aby przygotować roztwór podstawowy BODIPY, należy go rozpuścić w DMSO w stężeniu 1 mg/ml. Na rynku dostępne są różne preparaty Bodipy do barwienia LD. W zależności od dokonanego wyboru metoda barwienia jest taka sama (te same kroki, stężenie i czas inkubacji); Sposób akwizycji będzie jednak nieco inny.
    7. Po pierwszym szybkim płukaniu umyj szkiełka PBS 3 x 5 min w temperaturze pokojowej, spłucz w podwójnie destylowanymH2O, usuń nadmiar wody i zamontuj odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu.
      UWAGA: Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, aby zachować fluorescencję do momentu uzyskania obrazu.

5. Akwizycja obrazów

UWAGA: Po zakończeniu procedur barwienia, ważne jest, aby natychmiast przystąpić do akwizycji obrazu (w ciągu następnych 24 godzin), nie tylko w celu uniknięcia zanieczyszczenia, ale także w celu zachowania morfologii, rozmiaru i liczby LDs.

  1. Akwizycja obrazów w celu oceny typów włókien każdego mięśnia, z którego pobierana jest próbka
    UWAGA: Ten krok można osiągnąć za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu skaningowego na całym szkiełku lub konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego. W tym drugim przypadku należy wykonać ręczne lub automatyczne zszywanie obrazów, aby zrekonstruować sekcję.
    1. Do rozpoznawania typu światłowodu należy użyć mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem 10x/0,3. Wybierz filtry wzbudzenia dla DAPI (405 nm), FITC, TRITC i Cy5, aby wykryć odpowiednio włókna typu I, IIa, IIx i lamininę.
      UWAGA: Włókna typu IIb nie będą znakowane immunologicznie. Zostaną rozpoznane jako włókna zabarwione lamininą na granicach sarkolemmy z czarną sarkoplazmą.
    2. Dostosuj odpowiedni czas ekspozycji dla każdego kanału.
    3. Korzystając z konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego, zawsze uzyskuj obrazy całego mięśnia w tej samej kolejności, aby ułatwić rekonstrukcję mięśni. Upewnij się, że włókna znajdujące się na prawej krawędzi jednego obrazu pojawiają się również na lewej krawędzi następnego obrazu. To samo dotyczy górnej i dolnej części obrazów (Rysunek 3A).
      UWAGA: Jako odniesienie, dla sekcji EDL lub płaszczkowatego wypreparowanego od 3-miesięcznej myszy, średnio odpowiednio sześć i osiem obrazów pokryje cały przekrój mięśnia.
    4. Po zeskanowaniu mięśnia prześlij przechwycone obrazy cyfrowe do dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu rekonstrukcji (zszycia), w oparciu o morfologię włókien (laminina) i histologię odcinka mięśniowego, a następnie zapisz je jako plik TIFF, PNG lub JPG ze scalonymi wszystkimi kanałami (kolorami) ( Rysunek 3A).
  2. Akwizycja obrazów z lamininą i współbarwieniem Bodipy
    UWAGA: Aby rozpoznać typ włókna i oszacować liczbę włókien dla każdego wychwyconego typu, konieczne jest już zeskanowanie przekroju włókna i zrekonstruowanie mięśni przed rozpoczęciem akwizycji obrazu Bodipy-lamininy (Rysunek 3B).
    1. Do obserwacji i akwizycji obrazu Bodipy należy użyć mikroskopu konfokalnego z 40-krotną soczewką obiektywową z olejkiem i aperturą numeryczną 1,4.
    2. Użyj następujących ustawień: otwórka przy 1 AU, rozdzielczość 2 048 pikseli x 2 048 pikseli, rozmiar piksela 0,08 μm, tryb jednokierunkowy, prędkość skanowania 4 (~4 μs/piksel), uśrednianie linii ustawione na 4x i zoom cyfrowy ustawiony na 1.
    3. Aby uniknąć przesłuchów między Bodipy-558/568 i lamininą-AF647, użyj trybu skanowania sekwencyjnego w oprogramowaniu konfokalnym.
      UWAGA: Gdy wybrany barwnik to Bodipy-493/503, możliwe jest jednoczesne konfokalne skanowanie laserowe bez przesłuchu między kanałem Bodipy a kanałem lamininy-AF647. Przyspieszy to pozyskiwanie obrazów.
    4. Wzbudz Bodipy-493/503 za pomocą linii laserowej 488 nm lub linii lasera argonowego i wzbudz Bodipy-555/568 za pomocą linii lasera diodowego 561 nm. Na koniec wykryj lamininę-AF647 za pomocą linii lasera diodowego 640 nm.
      UWAGA: Należy pamiętać, że cząsteczki Bodipy są bardzo wrażliwe na fotowybielanie, więc unikaj niepotrzebnego skanowania laserowego. Aby rozpoznać włókna, używaj tylko lasera do lamininy.
    5. W zależności od wybranego barwnika ustaw zakresy emisji na 570-650 nm dla Bodipy-493/50324 i na 565-620 nm dla Bodipy-558/568. Ustawić zakres emisji lamininy na 656-700 nm.
    6. Ustaw odpowiednio wzmocnienie i wzmocnienie cyfrowe, aby na wskaźniku zasięgu nie zostały wykryte żadne nasycone piksele. Popraw sygnał tła, dostosowując offset.
      UWAGA: Dobór filtra i inne wyżej wymienione parametry skanowania muszą być zoptymalizowane dla każdego mikroskopu konfokalnego. Ważne jest, aby wszystkie wyżej wymienione ustawienia były utrzymywane na stałym poziomie dla wszystkich obrazów zarejestrowanych z próbek, które mają być porównywane.
    7. Aby zidentyfikować rodzaj włókna wśród tych uwidocznionych pod mikroskopem konfokalnym, użyj osobistego laptopa, na którym sprawdzany jest obraz przekroju zrekonstruowanego po immunodetekcji typu włókna (Rysunek 3B).
    8. Gdy grupa włókien zostanie poprawnie zidentyfikowana, uzyskaj obraz za pomocą kanałów Bodipy i lamininy.
      UWAGA: Zaleca się zanotowanie nazwy obrazu bodipy-lamininy w obszarze mięśnia, w którym znajdują się te włókna, na obrazie uzyskanym w celu rozpoznania MyHC, aby ułatwić późniejszą analizę LD specyficzną dla włókien.

6. Analiza obrazów

  1. Analiza rodzajów włókien w każdej próbce mięśniowej
    1. W Fiji (lub ImageJ)32 otwórz plik TIFF, PNG lub JPG ze zrekonstruowanym mięśniem uzyskanym ze połączenia wszystkich kanałów używanych do wykrywania izoform włókien.
    2. Aby uruchomić narzędzie do liczenia komórek, kliknij Wtyczki | Analizowanie | Licznik komórek | Licznik komórek.
    3. W oknie Licznik komórek kliknij Akcje | Zainicjuj.
    4. W obszarze Liczniki w tym samym oknie wybierz pozycję Typ 1.
    5. W oknie głównym Fidżi wybierz narzędzie Różdżka.
    6. Aby określić ilościowo liczbę włókien każdego typu, kliknij każde włókno tego samego typu, aby program zarejestrował liczbę klikniętych włókien.
    7. Po zakończeniu wybierz następny rodzaj włókna i powtórz te same kroki.
    8. Gdy wszystkie włókna obrazu zostaną przypisane do danego typu włókna, kliknij na Wyniki w oknie Licznik komórek, aby wyświetlić wyniki w tabeli.
    9. Zapisz tę tabelę jako tabelę arkusza kalkulacyjnego, klikając Plik | Zapisz jako w oknie Wyniki.
    10. Zapisz i ponownie załaduj zaznaczenia na tym samym obrazie w dowolnym momencie, klikając odpowiednio Zapisz znaczniki lub Załaduj znaczniki w oknie Liczenie komórek.
  2. Analiza kropelek lipidów w sposób zależny od rodzaju włókien
    1. Przeanalizuj obrazy Bodipy i lamininy uzyskane na konfokalnym przy użyciu Fidżi w celu ilościowego określenia LDs.
      UWAGA: Autorzy zaprojektowali niestandardowe makro, aby zautomatyzować analizę. To makro, wraz z wyjaśnieniem krok po kroku, jak z niego korzystać, jest dostępne odpowiednio jako Plik uzupełniający 1 i Plik uzupełniający 2.
    2. Otwórz każdy obraz za pomocą importera formatów biologicznych z Fidżi. W obszarze opcji Wyświetl stos z wybierz pozycję Hyperstack | Tryb koloru, domyślny. Upewnij się, że wybrano okno Autoskalowanie.
      UWAGA: Poniższe kroki opiszą protokół analizy jednego włókna na obrazie, ale należy go powtórzyć tyle razy, ile całych włókien pojawia się na obrazie.
    3. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby ręcznie wybrać sarkolemmę włókna na podstawie kanału lamininy (Rysunek 4A) i naciśnij T na klawiaturze, aby zarejestrować zaznaczenie lub obszar zainteresowania (ROI) w oknie ROI.
    4. Przejdź do głównego okna Fidżi i kliknij Analizuj | Ustaw Pomiary, a następnie w wyskakującym oknie wybierz Obszar i Średnica Feret. Pozostaw pozostałe pola niezaznaczone, a inne parametry tak, jak są wyświetlane domyślnie.
    5. Kliknij Zmierz w oknie ROI, aby uzyskać powierzchnię i minimalną średnicę Fereta (MF) wybranego włókna i zanotować je do późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: Analizując LD, należy pamiętać, że ich rozmiar i gęstość różnią się między środkiem a obrzeżem (obszar podsarkolemalny - SS) włókna. Dlatego analizę należy przeprowadzić osobno.
    6. Oblicz wartość 1/6 MF, aby wyznaczyć środkową część włókna.
      UWAGA: W makrze domyślna wartość MF jest ustawiona na 6, co oznacza, że zastosowana redukcja zostanie ustawiona na 1/6 MF. Wartość ta została wybrana na podstawie danych empirycznych uzyskanych z mięśnia płaszczkowatego zwierząt karmionych dietą wysokotłuszczową. Jednak każdy badacz musi zmienić tę liczbę na podstawie danych empirycznych i analizowanych mięśni, rodzaju włókna i kondycji zwierzęcia.
    7. W oknie ROI kliknij Dodaj, aby uzyskać duplikat pierwszego ROI i wybierz drugi ROI, który pojawi się w oknie.
    8. W oknie głównym Fidżi kliknij Edytuj | Selekcja | Powiększ i wprowadź wcześniej obliczoną wartość (z kroku 6.2.6.) ze znakiem minus przed liczbą i kliknij OK. W oknie ROI kliknij Dodaj [t] (musi pojawić się trzeci ROI) i Usuń, aby usunąć drugi ROI.
      UWAGA: Badacz może sprawdzić wyniki, klikając pole Pokaż wszystko w oknie ROI. W tym momencie muszą pojawić się dwa ROI, jeden, który otacza cały obwód światłowodu (Rysunek 4B), a drugi, który jest umieszczony w środku (Rysunek 4C).
    9. Wybierz oba ROI w oknie ROI i kliknij Więcej | XOR | Add[t]. Poczekaj, aż pojawi się trzeci zwrot z inwestycji, który odpowiada obrzeżom światłowodu (Rysunek 4D).
    10. Zapisz zwrot z inwestycji, klikając Więcej | Zapisz, aby zapisać zwrot z inwestycji na wypadek, gdyby konieczna była późniejsza ponowna analiza tych samych włókien.
    11. Wybierz kanał Bodipy i otwórz narzędzie Próg, klikając Obraz | Dostosuj | Próg w głównym oknie Fidżi.
    12. W oknie podręcznym Próg ustaw wartości na 70/255, wybierz pozycję Jen | Metoda czarno-biała i kliknij Ciemne tło | Apply.
      UWAGA: Wartości zastosowane na progu mogą się różnić w zależności od warunków eksperymentu, a próg musi być odpowiednio ustawiony, aby zoptymalizować analizę. Musi pojawić się czarno-białe okno z sygnałem Bodipy powyżej limitu progowego pokazanym na biało i tłem w kolorze czarnym (porównaj oryginalny obraz Bodipy w Rysunek 4E z tym w Rysunek 4F).
    13. Przejdź do głównego okna Fidżi i kliknij Analizuj | Ustaw Miary i w wyskakującym oknie wybierz Obszar, Ułamek powierzchni i Ogranicz do progu. Pozostaw pozostałe pola niezaznaczone, a inne parametry tak, jak są wyświetlane domyślnie.
      UWAGA: Jeśli badacz chce przeanalizować "okrągłość" LD, która jest indeksem morfologii sferycznej, który waha się od 1 dla idealnej kuli do 0 dla linii, kliknij pole Deskryptory kształtu w wyskakującym oknie Ustaw miary.
    14. Przejdź do okna ROI i wybierz pierwszy ROI. W oknie głównym Fidżi kliknij Analizuj | Narzędzie do analizy cząstek.
      UWAGA: To narzędzie określa ilościowo liczbę, rozmiar, pokryty obszar i procent całkowitego obszaru pokrytego cząstkami w każdym zaznaczeniu i zapisuje wyniki jako plik arkusza kalkulacyjnego.
    15. Ustaw wartości od 2 do Nieskończoność (2-Nieskończoność) w oknie Analizuj cząstki, zaznacz pole Piksele, zachowaj domyślne wartości cykliczności, wybierz Sumuj i kliknij OK.
      UWAGA: Aby sprawdzić wyniki na światłowodzie, w opcji Pokaż wybierz dowolną z dostępnych opcji. Aby informacje o każdym LD zostały rozpoznane w zaznaczeniu w tabeli, zaznacz opcję Wyświetl wyniki w oknie Analizuj cząstki. Wyniki analizy całkowitej powierzchni włókna są uśredniane i podsumowywane w tabeli z kilkoma kolumnami (Liczba, Powierzchnia całkowita, Średnia wielkość, % powierzchni; odpowiadają one liczbie cząstek [LDs], powierzchni zajmowanej przez te cząstki, ich średniej wielkości oraz procentowi całkowitej powierzchni selekcji zajmowanej przez cząstki, odpowiednio). Aby obliczyć gęstość, podziel liczbę cząstek przez całkowitą powierzchnię każdego zaznaczenia.
    16. Aby uzyskać wartości środka i obwodu światłowodu, powtórz kroki 6.2.14 i 6.2.15, wybierając za każdym razem drugi (środek) i trzeci ROI (obrzeża).
    17. Zapisz wyniki, klikając Plik | Zapisz jako w oknie Podsumowanie.
      UWAGA: Dołącz typ włókna, stan i nazwę obrazu do przypisanej nazwy wyników, aby ułatwić późniejsze ujednolicenie i analizę statystyczną danych. Aby przeanalizować pozostałe włókna na tym samym obrazie, powtórz kroki od 6.2.3 do 6.2.17. Do analizy statystycznej należy przeanalizować co najmniej 10-15 włókien każdego rodzaju na zwierzę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany tutaj zapewnia skuteczną metodę łatwego ilościowego oznaczania LD w sposób specyficzny dla typu światłowodu i subkomórkowego. Pokazuje, w jaki sposób, poprzez zamrożenie razem dwóch mięśni o podobnej wielkości, takich jak EDL i płaszczkowaty, czas i zasoby poświęcone na kolejne kroki są zmniejszone o połowę.

Dostępny jest kompletny protokół do barwienia immunologicznego, pozyskiwania obrazów i analizy różnych izoform MyHC wyrażanych w mięśniach dorosłych myszy. Protokół ten je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowo opisany tutaj protokół opisuje skuteczną metodę ilościowego oznaczania LD oznaczonych Bodipy na podstawie specyficznej dla rodzaju włókien i subkomórek. W ostatnich latach klasyczne barwniki lipidowe, takie jak ORO lub Sudan Black B, zostały zastąpione nową gamą przepuszczalnych dla komórek, lipofilowych, fluorescencyjnych barwników, które wiążą się z obojętnymi lipidami (np. Bodipy). Dostępny w postaci różnych koniugatów, Bodipy okazał się bardzo skuteczny w znakowaniu LD w celu zbadania ich morfologii, dyna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) i Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. jest laureatem stypendium doktoranckiego od FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. otrzymał stypendium w ramach Międzynarodowego Programu Doskonałości Walonia-Bruksela.

Autorzy dziękują Alice Monnier za jej wkład w rozwój tego protokołu oraz Caroline Bouzin za jej wiedzę i pomoc techniczną w procesie pozyskiwania obrazów. Dziękujemy również platformie obrazowania 2IP-IREC za dostęp do kriostatu i mikroskopów (Platforma Obrazowania 2IP-IREC, Instytut Badań Eksperymentalnych i Klinicznych, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruksela, Belgia). Na koniec autorzy pragną podziękować Nicolasowi Dubuissonowi, Romainowi Versele i Michelowi Abou-Samrze za konstruktywną krytykę rękopisu. Niektóre z figur w tym artykule zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
AxioCam 506 mono 6 Mpix kameraZeiss
AxioCam MRm 1,4 MPix CCD Kaptur chemiczny Zeiss
Potteau LaboEN-14175
Mikroskop konfokalnyZeissLSM800
Krążki korkowe (ø 20 mm, grubość 3 mm) Mikroskopia elektronowa Sciences63305
Rękawice kriogeniczneTempshield16072252
Cryostat Thermo Scientific Microm Cryo Star HM 560
Preparacyjny mikroskop stereoskopowy SMZ745Nikon
Suchy lód
Dumont KleszczeFST11295-10
Mikroskop epifluorescencyjnyZeissAxioImage-Apotome Z1
Bardzo cienkie nożyczki BonnFST14084-08
FisherBrand Jednorazowe Formy bazowe (0,7 x 0,7 cm)ThermoFisher22-363-552Służy do wycinania kawałka do przytrzymywania mięśnia na korku do zamrażania
Szklana szalka Petriego (H 25  mm, & oslash; 150  mm)MARKOWA szalka Petriego, MERKBR455751Służy do umieszczania mięśni na lodzie podczas sekcji
ImmEdge Bariera hydrofobowa PAP Pen VectorLabsH-4000Służy do tworzenia bariery hidropobowej wokół odcinków mięśniowych
InkubatorMMM MedcenterIncucell 707 
Okulary nakrywkowe do mikroskopu (24x50 mm)Assistent 
Pudełka na szkiełka mikroskopowe Kartell278Używany jako wilgotne komory do immunohistochemii
Uchwyt na szyjęLinie zwoSB-035X-02Używany jako pasek do trzymania kubka ze stali nierdzewnej
Nr 15 Sterylne ostrze skalpela ze stali węglowejSwann-Morton0205
Pędzle malarskieVan BleiswijckAmazon B07W7KJQ2XSłuży do obsługi kriosekcji
Marker permanentny w pisakuKlinipath/VWR98307-RSłuży do etykietowania prowadnic
Kleszcze mocujące do przebijaniaFST18155-13
Pudełko z polistyrenu H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, używany jako pojemnik na ciekły azot oraz do transportu próbek do kriostatu
Rękojeść skalpela, 125 mm (5"), nr 3AesculapBB073R
Kubek ze stali nierdzewnej 10 uncji EboxerB07GFCBPFHKubek do wypełnienia izopentenem do zamrażania mięśni
Prowadnice Superfrost Ultra PlusThermoFisherJ1800AMNZ
Pęseta chirurgiczna 1/2 zębaMedische Vakhandel1303152Nazywana również "Pęsetą do zębów szczura"
Nożyczki sprężynowe Vannas - 3 mm Krawędź tnącaFST15000-00
Łodzie wagoweVWR międzynarodowy611-2249
Skaner całego szkiełka do fluorescencjiZeissAxio Scan.Z1
Odczynniki
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2bSigma-AldrichSAB4600477Stosowany w końcowym stężeniu 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1ThermoFisherA-21121Używany w końcowe stężenie 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgMAbcamab175702Stosowany w końcowym stężeniu 1:1,000
Alexa Fluor 647 kozie przeciwciało anty szczurzo-IgG (H+L) drugorzędoweThermoFisherA-21247Stosowany w końcowym stężeniu 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)ThermoFisherD3922Stosowany w końcowym stężeniu 1 &mikro; g/ml
BODIPY-558/568 C12 (4,4-difluoro-5-(2-tienylo)-4-Bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-dodekanowy)ThermoFisherD3835Stosowany w końcowym stężeniu 1 &mikro; g/ml
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)ThermoFisherD1306Stosowany w końcowym stężeniu 0,5 &mikro; g/ml
dimetylosulfotlenku (DMSO)Sigma-AldrichD-8418Służy do roztworu Bodipy na roztwór podstawowy 1 mg/ml. UWAGA: Toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.
Roztwór formaldehydu 4%, buforowany, pH 6,9Sigma-Aldrich1004969011UWAGA: Może powodować reakcję alergiczną skóry. Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne. Może powodować raka. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.
Isopentan GPR RectaPurVWR international24872.298CAUTION: Skrajnie łatwopalna ciecz i para. Może być śmiertelne w przypadku połknięcia i dostania się do dróg oddechowych. Może powodować senność lub zawroty głowy. Powtarzające się narażenie może powodować wysuszenie lub pękanie skóry. Nosić rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy.
Ciekły azotUWAGA:  Ekstremalnie zimno. Nosić rękawice. Obchodź się powoli, aby zminimalizować gotowanie i rozpryskiwanie oraz w dobrze wentylowanych pomieszczeniach. Używaj pojemników przeznaczonych do płynów o niskiej temperaturze.
Mysz na myszy Odczynnik blokujący Vector LabsMKB-2213-1Stosowany w stężeniu 1:30
ciężkiego miozyny typu I (przeciwciało pierwotne BA-D5-s): MYH7, monoklonalny bydlęcy anty mysi IgG2bDSHB University of IowaBA-D5-supernatantStosowany w końcowym stężeniu 1:10
ciężki typu IIA (SC-71-s Pierwotne przeciwciało) Gen:  MYH2, Monoklonalny bydlęcy anty mysi IgG1DSHB University of IowaSC-71-supernatantStosowany w końcowym stężeniu 1:10
Łańcuch ciężki miozyny typu IIX (przeciwciało pierwotne 6H1-s), Gen:  MYH1, Monoklonalny królik anty mysieIgM Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa6H1-supernatantStosowany w końcowym stężeniu 1:5
Normalna surowica kozia (NGS)Vector LabsS-1000
PBS 0,1 MPowszechnie stosowany w laboratoriach histologicznych
ProLong Gold Antiblade MountantInvitrogen P36930
Szczurze przeciwciało pierwszorzędowe anty-Laminin-2 (łańcuch alfa;-2) (monoklonalne)Sigma-AldrichL0663Stosowane w końcowym stężeniu 1:1,000
Związek Tissue-Tek OCTSakura 4583
Software
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.Służy do projektowania figur
Adobe PhotoshopAdobe Inc.Oprogramowanie konfokalne
BioRenderhttps://biorender.com/Służy do projektowania figur
Fidżi/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/Służy do analizy pozyskanych obrazów
Microsoft PowerPointMicrosoftSłuży do rekonstrukcji histologii całego mięśnia po zeskanowaniu typów włókien
Zen Blue 2.6ZeissSłuży do rekonstrukcji histologii całego mięśnia po zeskanowaniu typów włókien
40990151 Gen łańcucha Miozyna łańcuch

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
  2. Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
  3. Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
  4. Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839(2020).
  5. Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
  6. van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
  7. Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
  8. Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
  9. Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
  10. Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
  11. Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
  12. Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
  13. Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
  14. Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
  15. Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
  16. Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete's paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
  17. Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
  18. Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
  19. De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
  20. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
  21. Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
  22. Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
  23. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
  24. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774(2013).
  25. Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
  26. Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
  27. Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
  28. Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
  29. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586(2014).
  30. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793(2015).
  31. Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
  34. Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
  35. Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327(2018).
  36. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
  37. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273(2012).
  38. Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
  39. Askinas, C., et al. Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , JTu3A.4 (Optical Society of America) (2018).
  40. Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
  41. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  42. de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168(2021).
  43. Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
  44. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
  45. Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
  46. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24 (Unit 24.22) (2007).
  47. Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
  48. Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415(2020).
  49. Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2(2018).
  50. Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239(2010).
  51. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  52. Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
  53. Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852(2021).
  54. Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Skeletal MuscleLipid DropletsFiber Type AnalysisMyosteatosisIntramyocellular LipidConfocal MicroscopyBodipy StainingSubcellular DistributionImmunohistochemistryMuscle Cryosection

Powiązane artykuły