Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja fragmentów RNA powstałych w wyniku degradacji enzymatycznej za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63720

⸱

11 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

W tym artykule

Podsumowanie

MALDI-TOF został użyty do scharakteryzowania fragmentów uzyskanych z reaktywności pomiędzy utlenionym RNA a egzorybonukleazą Xrn-1. Niniejszy protokół opisuje metodologię, która może być stosowana do innych procesów z udziałem RNA i/lub DNA.

Streszczenie

RNA jest biopolimerem obecnym we wszystkich dziedzinach życia, a jego interakcje z innymi cząsteczkami i/lub reaktywnymi gatunkami, np. DNA, białkami, jonami, lekami i wolnymi rodnikami, są wszechobecne. W rezultacie RNA przechodzi różne reakcje, które obejmują jego rozszczepienie, degradację lub modyfikację, co prowadzi do biologicznie istotnych gatunków o różnych funkcjach i implikacjach. Jednym z przykładów jest utlenianie guaniny do 7,8-dihydro-8-oksoguaniny (8-oxoG), które może zachodzić w obecności reaktywnych form tlenu (ROS). Ogólnie rzecz biorąc, procedury, które charakteryzują takie produkty i transformacje, są w dużej mierze cenne dla społeczności naukowej. W tym celu szeroko stosowaną metodą jest spektrometria mas z desorpcją laserową i jonizacją wspomaganą matrycą (MALDI-TOF). Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób scharakteryzować fragmenty RNA powstałe po leczeniu enzymatycznym. Wybrany model wykorzystuje reakcję między RNA a egzorybonukleazą Xrn-1, w której trawienie enzymatyczne zostaje zatrzymane w miejscach utlenionych. Dwie sekwencje RNA o długości 20 nukleotydów [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] i [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] uzyskano w drodze syntezy w fazie stałej, określono ilościowo za pomocą spektroskopii UV-vis i scharakteryzowano za pomocą MALDI-TOF. Otrzymane nici zostały następnie (1) 5'-fosforylowane i scharakteryzowane za pomocą MALDI-TOF; (2) poddane działaniu Xrn-1; 3) przefiltrowane i odsolone; (4) analizowane za pomocą MALDI-TOF. Ten eksperymentalny układ doprowadził do jednoznacznej identyfikacji fragmentów związanych z zatrzymaniem Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] i [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Opisane eksperymenty przeprowadzono na 200 pikosolach RNA (20 pmol używanych do analiz MALDI); Jednak mniejsze ilości mogą skutkować wykrywalnymi pikami za pomocą spektrometrów wykorzystujących źródła laserowe o większej mocy niż to, które zostało użyte w tej pracy. Co ważne, opisana metodologia może być uogólniona i potencjalnie rozszerzona o identyfikację produktów dla innych procesów z udziałem RNA i DNA, a także może pomóc w charakterystyce/wyjaśnieniu innych szlaków biochemicznych.

Wprowadzenie

MALDI-TOF1,2,3 jest powszechnie stosowaną techniką do charakteryzowania i/lub wykrywania cząsteczek o różnych rozmiarach i cechach. Niektóre z jego zastosowań obejmują różnorodne zastosowania, takie jak wykrywanie garbników z zasobów naturalnych4, obrazowanie metabolitów w żywności5, odkrywanie lub monitorowanie komórkowych celów lub markerów leków6 oraz diagnostyka kliniczna7, by wymienić tylko kilka. Istotne dla niniejszej pracy jest zastosowanie MALDI-TOF z DNA lub RNA, z jego zastosowaniem na oligonukleotydach sprzed ponad trzech dekad8, gdzie zauważono kilka ograniczeń. Technika ta przekształciła się obecnie w niezawodny, powszechnie stosowany sposób charakteryzowania zarówno biopolimerów9 oraz identyfikacji/zrozumienia reakcji chemicznych i biochemicznych, np. charakterystyki miejsc platynowanych w RNA10, identyfikacji fragmentów RNA po rozszczepieniu nici11,12, lub tworzenia wiązań krzyżowych białko-DNA13. Dlatego cenne jest zilustrowanie i podkreślenie ważnych aspektów stosowania tej techniki. Podstawy MALDI-TOF zostały również opisane w formacie wideo14 i nie będą dalej rozwijane w tym artykule. Co więcej, jego zastosowanie w kontekście DNA lub białka zostało wcześniej opisane i zilustrowane we wspomnianym formacie15,16,17.

Protokół wykrywania fragmentów RNA powstałych po hydrolizie enzymatycznej jest opisany tutaj. Model eksperymentalny został wybrany na podstawie niedawnego odkrycia opublikowanego przez naszą grupę18, gdzie MALDI-TOF został użyty do określenia unikalnej reaktywności między egzorybonukleazą Xrn-1 a oligonukleotydami RNA zawierającymi zmianę oksydacyjną 8-oxoG. Długie nici 20-nukleotydowe uzyskano w drodze syntezy w fazie stałej19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] i [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], podczas gdy Xrn-1 został wyrażony i oczyszczony zgodnie z wcześniej opisanym raportem20. W skrócie, Xrn-121 to egzorybonukleaza o rozmiarach 5'-3' o różnych kluczowych rolach biologicznych, które degradują wiele typów RNA, w tym utlenione RNA22. Stwierdzono, że procesywność enzymu zatrzymuje się po napotkaniu 8-oxoG, co doprowadziło do powstania fragmentów RNA zawierających 5'-fosforylowane końce [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] i [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

Na koniec, ważne jest, aby zauważyć, że spektrometria mas to potężna metoda, która dzięki różnym metodologiom może być dostosowana do innych celów23,24; dlatego wybór odpowiedniej metody jonizacji, jak również innych eksperymentalnych ustawień jest niezwykle ważny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ultra czysta woda wolna od RNaz (Tabela 1) została użyta do niniejszego badania.

1. Oznaczanie stężenia roztworu RNA

  1. Przygotuj próbkę RNA, wykonując poniższe czynności.
    1. Za pomocą probówki do mikrowirówki (0,6 ml) przygotować roztwór RNA, rozcieńczając 1 μl roztworu podstawowego (otrzymanego w drodze syntezy w fazie stałej)19 w 159 μl H2O. Mieszać roztwór, wielokrotnie pipetując mieszaninę w górę i w dół (10x).
      UWAGA: Ponieważ na rynku dostępna jest szeroka gama kuwet, wymagane objętości mogą się różnić. W pracy wykorzystano kuwety o długości ścieżki 1 cm i zmniejszonej objętości (150 μl).
    2. Przepłucz kuwetę UV-vis metanolem (2x), a następnie wodą (ultraczystyH2O, 3x, patrz Tabela materiałów). Użyj strumienia azotu, aby dokładnie wysuszyć kuwetę.
    3. Za pomocą pipety przenieś roztwór (krok 1.1.1) do kuwety, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Zakręć kuwetę i odłóż ją na bok, aż będzie potrzebna.
  2. Oznaczyć stężenie przygotowanego roztworu RNA za pomocą spektrofotometru UV-vis.
    1. Włącz spektrofotometr UV-Vis, przestawiając przełącznik znajdujący się z tyłu urządzenia. Poczekaj, aż przyrząd zakończy procedurę uruchamiania i kliknij ikonę UV WinLab, aby otworzyć okno obsługi/kontroli przyrządu.
    2. Włącz spektrofotometr kontrolera temperatury Peltiera za pomocą przełącznika znajdującego się po prawej stronie przyrządu.
    3. W obszarze Metody podstawowe kliknij opcję Skanowanie - Lambda 365. Otworzy się kolejny ekran i poprosi użytkownika o upewnienie się, że uchwyty na komórki są puste. Kliknij OK i pozwól instrumentowi przeprowadzić kontrolę systemu. System wyświetli następnie listę testów, upewnij się, że wszystkie są "Powodzone" i kliknij OK.
      UWAGA: Zaleca się wykonanie kroków 1.2.1-1.2.3 w podanej kolejności; Zmiana tej sekwencji zdarzeń może prowadzić do nieprawidłowego działania oprogramowania.
    4. Dostosuj parametry skanowania, wybierając opcję Zbieranie danych. W nowym oknie w Ustawieniach skanowania zmień Start na 350 nm i Koniec na 215 nm.
    5. Aktywuj ogniwo Peltiera, wybierając przycisk + po lewej stronie akcesorium. Kliknij Wielokomórkowy Peltier, zmień temperaturę °C na 25 i kliknij Peltier włączony.
    6. Przejdź do karty Informacje o próbce i wprowadź liczbę próbek, nazwy i pozycję komórki zgodnie z potrzebami.
    7. Kliknij Autozero i włóż kuwetę zawierającą roztwór tła. Upewnij się, że kuweta jest umieszczona w tym samym miejscu, w którym będą przeprowadzane pomiary.
    8. Kliknij Start i włóż kuwetę (krok 1.1.3) do żądanej komórki. Upewnij się, że okienko kuwety jest zorientowane równolegle do przedniej powierzchni instrumentu. Kliknij OK, aby rozpocząć pierwsze skanowanie w temperaturze 25 °C.
    9. W przypadku pomiarów w wyższych temperaturach należy powtórzyć kroki 1.2.5–1.2.8 i zmienić temperaturę na żądaną temperaturę próbki (w tym przypadku 90 °C).
    10. Kliknij Plik > Eksportuj i wybierz żądaną lokalizację pliku. Wybierz Dane XY, aby uzyskać .txt plik.
      UWAGA: Ilustrację do kroku 1.2 można znaleźć w Pliku uzupełniającym 1 (S1-S7).
  3. Wykonaj akwizycję danych w celu określenia stężenia RNA.
    1. Znajdź plik dla każdego widma na karcie Wyniki. Aby uzyskać absorbancję, najedź kursorem na linię, przejdź do 260 nm i zapisz wyświetlane absorbancje. Alternatywnie, za pomocą kaskady Plik > eksport, wyeksportuj dane jako plik .txt do dalszej analizy graficznej przy użyciu innego oprogramowania do drukowania.
      UWAGA: Jeżeli 0,1 < A ≥ 1, konieczne będzie rozcieńczenie lub zwiększenie stężenia próbki RNA przygotowanej w kroku 1.1.1.
    2. Użyj prawa Beera-Lamberta, aby obliczyć stężenie roztworu.
      UWAGA: Prawo piwa: A = εcl, gdzie:
      A: Absorbancja (w tym przypadku przy 260 nm, od kroku 1.3.1)
      ε: Współczynnik ekstynkcji. Dla sekwencji użytej w niniejszym dokumencie 208 000 L mol-1 cm-1 jest wartością uzyskaną z narzędzia OligoAnalyzer.
      l: Długość ścieżki, 1 cm
      C: Stężenie próbki
    3. Skorzystaj z tych obliczeń, aby przygotować pożądany roztwór RNA, który zostanie wykorzystany w kolejnych eksperymentach. W niniejszej pracy zastosowano roztwory o [RNA] = 200 μM.

2. Hydroliza oligonukleotydów RNA przez Xrn-1

  1. Wykonaj fosforylację 5' RNA, wykonując poniższe czynności.
    1. Za pomocą probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml przygotuj następujący roztwór (całkowita objętość 50 μl).
      1. Dodać H2O bez RNaz (33,5 μL); objętości mogą się różnić w zależności od [RNA].
      2. Następnie dodać roztwór A (5 l, tabela 1).
      3. Dodać wodny roztwór trifosforanu adenozyny (ATP, patrz tabela materiałów) (6 l, 10 mM, 60 nmol).
      4. Dodać wodny roztwór RNA (1 μl, 200 μM, 200 pmol).
      5. Dodać roztwór kinazy polinukleotydowej (enzym PNK, patrz tabela materiałów) (4,5 l, 45 jednostek). Delikatnie wymieszaj, pipetując mieszaninę w górę i w dół (10x).
    2. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, umieszczając ją w łaźni wodnej.
    3. Dezaktywować enzym, umieszczając probówkę reakcyjną w podgrzanym bloku grzewczym (65 °C) i inkubując roztwór przez 10 minut.
    4. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej (fosforylację RNA scharakteryzowano za pomocą analizy MALDI-TOF, patrz reprezentatywne wyniki), aby otrzymać końcowy 5'-fosforylowany roztwór RNA (4 μM, 50 μL).
  2. Wykonaj hydrolizę RNA przez Xrn-1, wykonując poniższe czynności.
    1. Używając roztworu (50 μl) z kroku 2.1.4, wykonaj następujące czynności.
      1. Dodać roztwór B (5 l, tabela 1).
      2. Dodać roztwór Xrn-1 (0,5 l, 1 ng, 30 fmol). Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując w górę i w dół (10x).
      3. Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    2. Przenieść mieszaninę reakcyjną (etap 2.2.1.3) do urządzenia odśrodkowego o wielkości porów 10 kDa (patrz tabela materiałów) i przefiltrować enzymy przez odwirowanie (700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej).
    3. Przenieść filtrat do probówki wirówkowej o pojemności 0,6 ml.
    4. Przemyć resztki RNA na probówce odśrodkowej (krok 2.2.2) dodając H2O (20 l) wolne od RNaz, a następnie odwirować (700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej).
    5. Połączyć filtrat z filtratem otrzymanym w kroku 2.2.3.
    6. Probówkę z otrzymanym roztworem należy przechowywać w zamrażarce (0 °C) lub wysłać do analizy.

3. Odsalanie roztworu RNA, plamienie płytki MALDI-TOF

  1. Odsolić i zagęścić próbkę za pomocą dostępnych w handlu końcówek do pipet C18 z kationowymiennikiem (patrz tabela materiałów).
    1. Umieścić końcówkę pipety C18 o pojemności 10 l (końcówka pipety wypełniona łożem pożywki chromatograficznej C18 zamocowanym na jej końcu) na pipecie o pojemności 10 μl, a następnie wykonać następujące czynności:
      1. Umyj końcówkę C18 50% wodnym roztworem acetonitrylu (10 μl) dwa razy. Zużyte objętości należy za każdym razem wyrzucać do osobnej tuby na odpady.
      2. Zrównoważyć końcówkę C18 wodnym roztworem kwasu trifluorooctowego (0,1% TFA, 10 μL) dwa razy. Zużyte objętości należy za każdym razem wyrzucać do osobnej tuby na odpady.
      3. Ręcznie wyjmij końcówkę C18 z pipety i przymocuj ją do pipety o pojemności 200 μl zawierającej końcówkę do pipety P200 (końcówka C18 zostanie teraz przymocowana do końcówki pipety P200).
      4. Zanurz końcówkę C18 w roztworze (krok 2.2.6) i dziesięć razy uwolnij roztwór przez końcówkę C18.
        UWAGA: Próbka RNA wiąże się z żywicą kationitową wewnątrz końcówki.
      5. Odłącz końcówkę C18 od pipety P200 i umieść ją na pipecie o pojemności 10 μl.
      6. Umyj końcówkę C18 dwukrotnie roztworem wodnym 0,1% TFA (10 μl). Zużyte objętości należy za każdym razem wyrzucać do osobnej tuby na odpady.
      7. Umyj końcówkę C18 wodą bez RNaz (10 μl) dwa razy. Zużyte objętości należy za każdym razem wyrzucać do osobnej tuby na odpady.
  2. Umieść na płycie MALDI, wykonując poniższe czynności.
    1. Eluować oligonukleotyd RNA z końcówki C18 (etap 3.1.1.7), zanurzając próbkę w żądanej matrycy (10 μl, roztwór C i D w stosunku 1:1, tabela 1), a następnie dozując roztwór z powrotem do probówki. Powtórz ten proces dziesięć razy.
    2. Odpipetować roztwór z ppkt 3.2.1 na dwa oddzielne miejsca na płytce (po 1 μl każdy, 20 pmol). Pozostaw miejsca do wyschnięcia na powietrzu (Rysunek 1A i Wideo 1).
      UWAGA: Proces ten można powtórzyć w tym samym miejscu, aby zwiększyć stężenie próbki w każdym miejscu.
    3. Odpipetować żądany kaliber (1 l) w dwóch oddzielnych miejscach fizycznie w pobliżu miejsca próbki i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Standard testowy zastosowany w niniejszym badaniu został uzyskany ze źródeł komercyjnych (patrz Tabela materiałów).
    4. Przykryj [całkowicie wysuszony] kaliberat żądaną matrycą (1 l). Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Ważne jest, aby śledzić pozycję, w której próbki i kalibranty są wykrywane przed włożeniem do instrumentu. Zanotuj to za pomocą układu współrzędnych płyty, np. próbka 1 znajduje się w pozycji (C,3)

4. Akwizycja i przetwarzanie danych

UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, THAP wymaga większej mocy lasera do osiągnięcia jonizacji. Ponadto oligonukleotydy mogą być trudne do jonizacji bez fragmentacji. W związku z tym zwykle konieczne jest użycie jak najmniejszej mocy lasera i zwiększenie wzmocnienia detektora i/lub obniżenie częstotliwości lasera, aby zmaksymalizować wykrywalność i zminimalizować fragmentację.

  1. Wykonaj akwizycję danych, wykonując poniższe czynności.
    UWAGA: Pomiary masy cząsteczkowej wykonano przy użyciu spektrometru mas (patrz tabela materiałów) w trybie jonów dodatnich, liniowym z napięciem źródła jonów 20 kV, wzmocnieniem detektora ~2,8 kV i częstotliwością lasera 20 Hz. Zakresy skanowania ustalono na podstawie oczekiwanej masy cząsteczkowej. Zostały one obliczone i wyrażone jako masa nad ładunkiem (m/z), gdzie ładunek wynosił 1. Kalibrację zewnętrzną przeprowadzono przy użyciu mieszaniny kalibracyjnej białek (Bakteryjny wzorzec testowy, patrz Tabela materiałów) w miejscu przylegającym do próbki. Surowe dane zostały następnie przetworzone w oprogramowaniu flexAnalysis (patrz tabela materiałów).
    1. Otwórz "Oprogramowanie Flexcontrol" do obsługi. Naciśnij zielony przycisk wchodzenia/wyłączania instrumentu, poczekaj, aż cel stage się poruszy i odkurz, aby odpowietrzyć. Otwórz pokrywę, umieść całkowicie wysuszoną płytkę celowniczą w instrumencie. Upewnij się, że wyrównałeś we właściwej orientacji (Rysunek 1B).
    2. Delikatnie opuść pokrywę, a następnie naciśnij zielony przycisk wsiadania/wyłączania. Poczekaj, aż płyta zostanie wsunięta, a instrument zostanie ponownie odpompowany. Gdy na pasku stanu (prawy dolny róg okna oprogramowania) pojawi się komunikat "Gotowy", kontynuuj kalibrację.
    3. Aby skalibrować przyrządy za pomocą oprogramowania, wykonaj następujące czynności.
      1. Wybierz żądaną metodę, klikając Plik > Wybierz metodę lub naciskając przycisk Wybierz obok załadowanej metody. Kliknij współrzędne dla miejsca kalibru. Przejdź do zakładki Kalibracja i upewnij się, że wybrano właściwy kaliber. Upewnij się, że opcja Losowy spacer jest wyłączona (na karcie Sample Carrier).
      2. Naciśnij Start i ręcznie skieruj laser wzdłuż kryształu (klikając strzałkę myszy w żądanym miejscu w widoku kamery). W razie potrzeby dostosuj moc lasera. Gdy będziesz zadowolony z ustawień, naciśnij Start, aby zebrać widma i dodać je do bufora sumy.
      3. Dodawaj widma do sumy, aż do osiągnięcia wystarczającej intensywności. Przełącz, aby wyświetlić tylko bufor sumy, odjąć linię bazową i wygładzić. Następnie kliknij Automatyczne przypisywanie. Sprawdź każdy przypisany szczyt i zanotuj błąd ppm. Jeśli jesteś zadowolony z przypisań i błędów, kliknij Zastosuj.
      4. Wyczyść bufor sumy i przejdź do pozycji pierwszej próbki.
      5. Potwierdź żądany zakres skanowania (zakładka 'Wykrywanie'). Dostosuj słupki w "Zakresie masy" tak, aby zielony obszar był reprezentatywny dla oczekiwanej masy.
      6. Kliknij bezpośrednio na okno Powiększenie, tak aby krzyż nitkowy był zorientowany na żądany skrystalizowany fragment (większe kryształy często dają najlepsze wyniki, Rysunek 2).
      7. Zbierz kilka widm wzdłuż dużych kryształów, dostosowując moc lasera w razie potrzeby. Prawidłowe ustawienie to 5%-10% powyżej mocy, przy której pojawiają się szczyty.
    4. Aby uzyskać widma, wykonaj następujące czynności.
      1. Kliknij Start, aby obserwować błysk lasera w połączeniu ze zwiększającym się natężeniem widma (pokazanym w oknie w prawym górnym rogu). Przesuń laser wzdłuż kryształu, klikając strzałkę myszy w górę iw dół kryształu (Wideo 2).
      2. Kliknij Dodaj bezpośrednio pod przyciskiem Start.
      3. Powtórz to kilka razy, aż zostanie osiągnięta pożądana intensywność/liczba ujęć (odbita na osi y okna widmowego)
      4. Dostosuj moc i/lub prędkość lasera i/lub wzmocnienia detektora, jeśli początkowe skany są niezadowalające. W razie potrzeby powtórz kroki 4.1.4.1-4.1.4.3.
      5. Jeśli widmo jest zadowalające, kliknij Zapisz jako, aby zapisać widmo pod określoną nazwą. Następnie, jeśli potrzebne są inne próbki, kliknij Wyczyść sumę i powtórz kroki w kroku 4.1.4.
  2. Przetwarzanie danych.
    UWAGA: Krok 4.2 opisuje jeden ze sposobów analizowania danych za pomocą oprogramowania flexAnalysis.
    1. Otwórz żądane oprogramowanie. Następnie otwórz widmo (a), wybierając Plik. Z menu rozwijanego wybierz opcję Otwórz.
    2. Zostanie wyświetlone nowe okno. Kliknij Przeglądaj, aby zlokalizować pliki zapisane w kroku 4.1.4. Zaznacz pola obok żądanych plików, a następnie kliknij Otwórz po lewej stronie. Jeśli tylko jedno widmo wymaga analizy, po prostu przeciągnij i upuść plik w oknie oprogramowania.
    3. Zaznacz załadowane pliki do analizy zbiorczej. Przejdź do zakładki Proces na pasku narzędzi. Z listy rozwijanej wybierz pozycję Odejmij linię bazową widma mas.
      UWAGA: Algorytm używany do odejmowania zostanie określony przez metodę wybraną w kroku 4.1.3.
    4. Przejdź do zakładki Proces na pasku narzędzi. Z listy rozwijanej wybierz pozycję Smooth Mass Spectrum.
      UWAGA: Algorytm zastosowany do wygładzania zostanie określony przez metodę wybraną w kroku 4.1.3.
    5. Kliknij zakładkę Lista masowa, a następnie z listy rozwijanej wybierz opcję Znajdź. To polecenie automatycznie oznacza piki ich masami; Lista mas zostanie wyświetlona na ekranie po prawej stronie.
    6. Aby dodać lub usunąć szczyty, przejdź do zakładki Lista masowa. Z listy rozwijanej kliknij Edytuj.
    7. Najedź kursorem na oś x widma; pionowa linia reprezentuje położenie widma, w którym znajduje się kursor.
      UWAGA: Ikona z wykresem i kursorem pojawi się, gdy nową masę będzie można dodać przez kliknięcie. Ta ikona pojawi się po najechaniu kursorem na szczyty, które można usunąć, klikając (patrz krok 4.2.7 w Pliku uzupełniającym 1).
    8. Powtórz kroki 4.1.3-4.1.7 dla dodatkowych widm. Wyeksportuj listę mas dla wszystkich widm, klikając i przeciągając, aby podświetlić pliki po lewej stronie, a następnie wykonaj następujące menu: kaskadowo Plik > Eksportuj > listy mas do programu Excel.
    9. Aby wyeksportować widma, jak pokazano na ekranie, zrób zrzut ekranu lub wyeksportuj go jako raport. W tym drugim przypadku przejdź do menu Raport. Z listy rozwijanej wybierz opcję Zapisz jako PDF.
      UWAGA: Można zmienić sposób wyświetlania widm za pomocą trzech zakładek poniżej widm i/lub zmieniając podświetlone pliki. Pojawi się ekran. Nazwij dokument PDF zgodnie z potrzebami, dostosuj ustawienia/układ i kliknij Zapisz, aby wygenerować obraz widma.
    10. Wygenerowany obraz będzie odzwierciedlał widok spektralny w oprogramowaniu. Aby manipulować widokiem, wykonaj następujące czynności.
      1. Powiększanie: Kliknij przycisk Powiększ na pasku narzędzi.
      2. Najedź kursorem na oś x i klikaj, aż zostanie osiągnięty żądany zakres.
      3. Pomniejszanie/cofanie: Kliknij przycisk Pomniejsz i kliknij w dowolnym miejscu spektrum, aby powrócić do pełnego widoku.
        UWAGA: Pomoc ilustracyjną dla kroków 4.1 i 4.2 można znaleźć w pliku uzupełniającym 1 (odpowiednio str. S8-S23 i S24-S30).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oligonukleotydy użyte w tej pracy zostały zsyntetyzowane, scharakteryzowane i ilościowo określone przed zastosowaniem. Stężenie wszystkich oligonukleotydów wyznaczono via spektroskopię UV-vis przy temperaturze 90 °C, aby uniknąć błędnych odczytów wynikających z potencjalnego tworzenia się struktur drugorzędowych. Rysunek 3 przedstawia widma modelowych oligonukleotydów RNA użytych w tej pracy, zarejestrowane w temperaturze pokojowej oraz po podgrzaniu.

Cał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównym wyzwaniem w tym procesie pracy było zakończenie eksperymentów i przeprowadzenie analiz spektrometrycznych mas. Eksperymenty zostały przeprowadzone i zakończone na Uniwersytecie Kolorado w Denver i wysłane (w nocy) do obiektów Uniwersytetu Stanowego Kolorado. Akwizycja danych odbywała się po ich otrzymaniu, zgodnie z wygodą. Kilka nieoczekiwanych okoliczności doprowadziło do opóźnień w procesie. W jednym przypadku nieoczekiwane awarie urządzeń wymagały zamrożenia próbek (jednorazowo na 21 dni) przed wykryciem i po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ważne jest, aby zauważyć, że ta praca była wspólnym wysiłkiem trzech instytucji, dwóch grup badawczych i jednego głównego obiektu. Rozkład i obciążenie pracą przeprowadzono w następujący sposób: Ekspresję białka (Xrn-1) przeprowadzono na Uniwersytecie w Denver (Denver, CO). Syntezę, kwantyfikację i eksperymenty oligonukleotydów (głównie degradację enzymatyczną) przeprowadzono na Uniwersytecie Kolorado w Denver (Denver, Kolorado). Tam również przeprowadzono optymalizację. Wykrywanie, akwizycję i analizę MALDI-TOF przeprowadzono w Analytical Resources Core Facility na Uniwersytecie Stanowym Kolorado. (Fort Collins, Kolorado). SS pragnie podziękować za wsparcie przyznane nagrodzie UROP (CU Denver) oraz grantom Eureca (CU Denver). E. G. C. potwierdza wsparcie ze strony NIGMS, za pośrednictwem R00GM115757. MJER potwierdza wsparcie ze strony NIGMS, za pośrednictwem 1R15GM132816. K. B. potwierdza identyfikator zasobu: SCR_021758. Prace zostały również wsparte nagrodą Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, przyznaną przez Fundację Henry'ego Dreyfusa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,6 ml MCT z podziałką VioletFisher Scientific05-408-127
6'-trihydroksyacetofenon, monohydrat 98%Sigma Aldrich480-66-0
Acetonitryl 99,9%, klasa HPLCFisher Scientific75-05-8
Adenozynotrifosforan, 10 mMNew Englang BioscienceP0756S
Cytrynian amonu, dwuzasadowy 98% Sigma Aldrich3012-65-5
Fluorek amonu 98,0%, klasa ACSAlfa Aesar12125-01-8
Standard testu bakteryjnego Bruker8255343Daltonics
Komercyjne źródło Xrn-1New England BioLabsM0338S
Pirowęglan dietylu, 97%ACROS OrganicsA0368487
Analiza Flex oprogramowanieBruker daltonicsFlexAnalysis wersja oprogramowania 3.4, spektrofotometr UV-vis Bruker Daltonics
Lambda 365Perkin Elmer
Płytka MALDI: tarcza ze stali szlifowanej MSP 96Bruker Daltonics280799
Spektrometr masowyBrukerMicroflex LRFTOF (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000System Milipore SigmaA Mili-Q został użyty do oczyszczenia całej wody użytej w tej pracy Urządzenia
odśrodkowe Nanosep z membraną OmegaTM 10 K, niebieskie (24 / opakowanie)Pall CorporationOD010C33media filtracyjne, Omega (modyfikowany polieterosulfon) 10 K wielkość porów
NEBuffer 3New England BiolabsB7003STo jest roztwór B
Narzędzie do analizowania oligoIDT-DNAhttps://www.idtdna.com/calc/analyzer
Końcówki do pipet P10Fisher Scientific02-707-441
Końcówki do pipet P200Fisher Scientific02-707-419
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11
Kinaza polinukleotydowa T4New England BioLabsM0201S
T4 Bufor reakcyjny kinazy polinukleotydowejNowość Anglia BioLabsB0201STo jest roztwór
Kwas triflourooctowyAlfa Aesar76-05-1
Xrn-1 egzorybonukleazaWyrażona w domuPatrz ref. 20
Końcówki do pipet ZipTip do przygotowania próbkiMilliporeZTC 18S 09610 µ Końcówki do pipet L wyposażone w standardową C18 0,6 i mikro; Łóżko L
Spektrometr masowy

Bibliografia

  1. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  2. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  3. Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73(2003).
  4. Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516(2021).
  5. Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
  6. Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
  7. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
  8. Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
  9. Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
  10. Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
  11. Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
  12. Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2(2013).
  13. Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124(2021).
  14. JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
  15. Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176(2016).
  16. Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862(2018).
  17. Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).
  18. Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).
  19. Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).
  20. Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
  21. Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
  22. Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).
  23. Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
  24. Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).
  25. Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
  26. Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
  27. Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521(2022).
  28. Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Utlenianie RNA8 oksoguaninatrawienie Xrn 1synteza w fazie sta ejspektroskopia UV Vischromatografia C18
Identyfikacja fragmentów RNA powstałych w wyniku degradacji enzymatycznej za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.